Expresion en medula osea murina de Bcl

Resumen: M-084
UNIVERSIDAD NACIONAL DEL NORDEST E
Comunicaciones Científicas y Tecnológicas 2004
Expresion en medula osea murina de Bcl-xL, Bax y del receptor de eritropoyetina
durante la recuperacion post-ciclofosfamida
Juaristi, Julián A. - Alvarez, Mirta A. - Aguirre, María V.
Todaro, Juan S. - Sanabria, Oscar - Brandan, Nora C.
Cátedra de Bioquímica. Facultad de Medicina. UNNE.
Moreno 1240. C.P : 3400. Corrientes. Argentina.
Tel-fax:03783-435378. E-mail: [email protected]
La hematopoyesis es un sistema en estado estacionario, intensamente estudiado cuyos mecanismos regulatorios son
todavía pobremente comprendidos. Se acepta que una intrincada red de citoquínas , liberadas en parte por las mismas
células que se diferencian, actuando en forma sinérgica, redundante, pleiotrópica y hasta antagónica, regulan estos
procesos, conformando un sistema de interacciones azarosamente interferidas que han dado en llamarse “cross-talk”
(1,2,3) Cuando el sistema es perturbado, por ejemplo por acción de citotóxicos, aunque los modos de acción difieran,
se activan mecanismos comunes intentando restablecer el equilibrio. Clásicamente se han descrito dos tipos de
efectos, la necrosis o muerte celular pasiva , donde median procesos inflamatorios y la apoptosis o muerte celular
programada. Respecto al primero, se sabe que la injuria producida por estas drogas induce la expresión de moléculas
proinflamatorias ( TGF β, TNF alfa e Il-1) y secundariamente citoquinas que pueden afectar diferencialmente el
crecimiento de los progenitores.(4,5,6). La apoptosis en cambio, es un activo proceso fisiológico que puede ser inducido
por una variedad de estímulos. Implica una serie de cambios morfológicos y metabólicos que culminan con la
activación de endonucleasas que van a fragmentar de manera típica el ADN a nivel internucleosomal. En su regulación,
cumplen un papel central las Bcl 2, una familia de proteínas tanto pro como antiapoptóticas. Mientras algunos
miembros de esta familia bloquean la apoptosis (Bcl 2, Bcl-xL) otros la activan (Bax, Bad) . El balance entre ellas
determina la sobrevivencia o la muerte apoptótica (7). Por otro lado Bcl-xL está particularmente implicada en la
maduración del compartimiento eritroideo. Su expresión es Epo dependiente y está ubicada corriente abajo en el camino
por el cual Epo previene la apoptosis. Por otro lado forzando la expresión de Bcl-xL en las células deprivadas de Epo se
inhibe la apoptosis . Además la expresión de Bcl-xL está regulada en alza durante la maduración eritroidea terminal.
De manera que ambas, Epo y Bcl-xL, parecen esenciales para la normal diferenciación eritroidea dentro de las células
rojas maduras. (8,9)
Asumiendo que la acción del citostático implica un reordenamiento de las relaciones entre los elementos en juego,
destinado a reestablecer la homeostasia, esto significa, entre otras cosas, cambios cuantitativos y cualitativos en la
celularidad medular, expansión de los compartimentos por incremento de la proliferación o restricción de la apoptosis,
cambios en la expresión génica. Nosotros nos proponemos analizar la recuperación de la médula ósea murina tras una
única dosis de Ciclofosfamida (200 mg/kg de peso) correlacionando la celularidad, la apoptosis y la expresión de
proteínas relacionadas (Bcl-xL y Bax) durante 5 días post-tratamiento.
Materiales y métodos
ANIMALES: Se utilizaron ratones adultos jóvenes isogénicos de la cepa Swiss CF 1(peso aproximado 26-28 g
INBIFAR Fac de Medicina UNNE ) que fueron dadores de médula ósea y sangre periférica.
ADMINISTRACION DE LA DROGA Y OBTENCION DE MUESTRAS: Ciclofosfamida (CPA) (Endoxan
Asta,Labinca 1g ) fue administrado en una única dosis i.p. a una concentración de 200 mg /kg.
Los grupos tratados y el control fueron anestesiados con pentobarbital al 3% obteniéndose sangre periférica por punción
cardíaca y posteriormente sacrificados por dislocación cervical para la obtención de células de médula ósea a cada
tiempo del periodo experimental (0, 6, 12 hs- 1, 2, 3, 4 y 5 días).
DETERMINACIÓN DE CELULARIDAD MEDULAR: Se obtuvieron muestras médula ósea (MO) a cada día del
esquema experimental por flusheo de los fémures con 500µl de buffer PBS. El recuento celular se realizó en cámara de
Nebauer. Todas las determinaciones se realizarán por triplicado. Los resultados se expresan como promedio de células
nucleadas por fémur x 106 ± SEM. Las determinaciones se realizaron por triplicado en dos experiencias independientes.
-CONTAJE DIFERENCIAL DE CELULAS SANGUINEAS:
Se realizaron en preparaciones de médula ósea teñidos con May Grünwald Giemsa. Los precursores hemopoyéticos se
clasificaron de acuerdo a los criterios standard, contando 500 a 1000 células nucleadas por duplicado. Los resultados se
expresan como porcentaje ± SEM de cada línea. A partir de las celularidades absolutas totales, se obtuvieron las
celularidades absolutas de cada compartimiento a los diferentes días de recuperación post-CPA, expresándose los
resultados como promedio de células por fémur x 106 ± SEM.
OBTENCION DE LISADOS DE TEJIDO HEMOPOYETICO:
Supensiones de médula ósea provenientes de cada lote fueron centrifugadas a 700 rpm por 5 minutos y lavados con
PBS. Los pellets se trataron con buffer RIPA (NaCl 140 nM, TRIS-HCl 1M pH 7,4, EDTA 37,22mg%, NP40 1%, KCl
15 mM, MgCl2 2 mM y PMSF 1 mM) por 20 minutos en baño de hielo. Los extractos se obtuvieron por pasaje a través
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de agujas de diámetro decreciente, realizando por último una centrifugación refrigerada a 14000 rpm por 20 minutos. La
concentración proteica de los sobrenadantes se determinó por el método de Bradford.
ELECTROFORESIS EN SDS PAGE
Se sembraron 45 microgramos de extractos celulares post-CPA en geles de Acrilamida-Bis acrilamida (30:0.8) ,
Dodecil Sulfato de Sodio (SDS) al 12 % . El fraccionamiento proteico se realizó según metodología standard utilizando
el equipo de electroforesis horizontal tipo Miniprotean II Electrophoresis Cell(Bio Rad)
ELECTROTRANSFERENCIA (ELECTROBLOTTING)
Se utilizó para cada electrotransferencia una membrana de nitrocelulosa. La calidad del proceso se evaluó con la tinción
reversible convencional de rojo Pounceau S.
INMUNODETECCION (westernblotting)
Se realizó la secuencia estándar de tratamiento de las membranas: bloqueo, incubaciones y lavados intermedios con
buffer TBS según metodología estándar. Se utilizó como sistema de revelación el kit Opti4CN (Bio Rad). Los
anticuerpos primarios utilizados fueron: anti-bax, anti-bcl-XL, anti Epo R (Santa Cruz Biotechnology Inc; Ca USA) y
los secundarios: IgG goat anti-rabbit , IgG goat anti-rat marcadas con HRP para westernblotting (Jackson
Immunoresearch Inc, Canada)
IMÁGENES Y ANALISIS ESTADISTICO
Los blottings fueron y analizados usando Adobe Photoshop 7.0 y Scion Image 3.0(NHS USA).Los resultados fueron
analizados utilizando el Software INSTAT y PRISM versión 2.0 (Graph Pad Software,San Diego,Ca USA),
considerando estadísticamente significativo un p < 0.05. Los gráficos fueron obtenidos mediante el uso del software
Graph Pad Prism. Para los estudios de correlación se utilizó el test de Spearman.
Discusión de Resultados
Una única dosis de CPA, es suficiente para afectar profundamente la arquitectura de médula ósea , tal como se observa
en la Figura 1, donde la necrosis se visualiza en la destrucción de la membrana plasmática .
El efecto de CPA sobre la celularidad medular es evidente desde la hora 6 y máximo a las 48 horas cuando la
celularidad cae al 13% del valor normal. El citotóxico afecta particular , aunque no significativamente, al
compartimiento eritroide.
Cuando estas celulas son sometidas al western blotting, la expresión de BAX es notoria desde las 0 y hasta las 48
horas, decae entre las 72 y 96 horas, reapareciendo al final de la experiencia. La expresión de Bcl-xL es máxima cuando
la de BaX es mínima, mientras que a las 120 horas es notoria la expresión de Epo R (Figura 2).
Bax y Bcl-xL son dos proteínas de la familia Bcl-2, la primera es proapoptótica y la segunda antiapoptótica, es
razonable que la expresión de ambas muestre relación inversa .BclxL a su vez, está ligada a la sobrevivencia celular y a
la expresión de Epo R. Aunque en líneas celulares está descripta corriente abajo respecto de la activación de EpoR, “in
vivo”, su sobreexpresión anticipa la aparición de este receptor y puede considerarse un indicador del comienzo de la
recuperación eritroide post-injuria.
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Conclusiones:
1. La ciclofosfamida destruye la arquitectura medular y esta no se recupera hasta el fin de la experiencia
2. La recuperación celular en medula osea muestra una relacion inversa en las expresiones de BAX y Bcl-xL .
3. La expresión de Bcl-xL anticipa la expresion del receptor de eritropoyetina ( EPO-R ), garantizando la recuperacion
del compartimento eritroideo
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