Ácido Acético BOEHRINGER MANNHEIM / R-BIOPHARM Enzymatic BioAnalysis/Food Analysis Método UV Para uso in vitro solamente Para la determinación de ácido acético en alimentos y otros materiales Esta traducción en español has sido realizada por R−Biopharm Latinoamérica con el objeto de ayudar a los usuarios a entender el procedimiento, pero no se actualizan regularmente por lo que no pueden remplazar las instrucciones en inglés. Las instrucciones de uso que son válidas, son aquellas incluidas en cada kit en Alemán y en Inglés, dado que están escritas e impresas por el fabricante (Roche). Refiérase siempre a las instrucciones incluidas en cada kit. Cat. No. 10 148 261 035 Test-Combinado para 3 x 11 determinaciones Principio (Ref. 1) El ácido acético (acetato) se convierte en acetil-CoA en presencia de 1 la enzima acetil-CoA sintetasa (ACS) , adenosina-5’-trifosfato (ATP) y coenzima A (CoA) (1). (1). 2 (1) Acetato+ ATP + CoA ⎯ ACS → acetil-CoA + AMP + pirofosfato Acetil-CoA reacciona con oxalacetato a citrato en presencia de citrato sintetasa (CS) (2). (2) Acetil-CoA+ Oxaloacetato + H2O ⎯ CS → citrato + CoA El oxalacetato requerido para la reacción (2) se forma a partir de LMalato y nicotinamida-adenina dinucleótido (NAD) en presencia de Lmalato deshidrogenasa (L-MDH). En esta reacción el NAD es reducido a NADH. (3) L-Malato + NAD + ⎯ L-MDH → Oxalacetato + NADH + H + La determinación se basa en la formación de NADH medido por el aumento de la absorción de luz a 340, 334 ó 365 nm. Debido al equilibrio de la reacción indicadora precedente, la cantidad de NAD formado no es linealmente (directamente) proporcional a la concentración de ácido acético (para los cálculos, ver mas adelante). El test combinado contiene 1 Botella 1: con aprox. 32 ml de solución conteniendo: Buffer trietanolamina, pH aprox. 8.4; ácido L-Málico, aprox. 134 mg; cloruro de magnesio x 6 H2O, aprox. 67 mg 2 Botella 2: con aprox. 280 mg de liofilizado, que consiste de: ATP, aprox. 175 mg; CoA, aprox. 18 mg; NAD, aprox. 86 mg 3. Botella 3 con aprox. 0.4 ml suspensión, que consiste de: L-malato deshidrogenasa, aprox. 1100 U; citrato sintetasa, aprox. 270 U 4. Tres Botellas 4 con acetil-CoA sintetasa liofilizada, aprox. 5 U c/una 5. Botella 5: Solución control de Ácido acético para control del ensayo (la medición de la solución control no es necesaria para el cálculo de los resultados). Usar la solución control sin diluir (fecha de vencimiento: ver etiqueta del frasco) Preparación de las soluciones para 10 determinaciones 1. Usar la solución de la Botella 1 sin diluir 2. Disolver el contenido de la Botella 2 con 7 ml de agua bidestilada. 3. Usa la suspensión de la Botella 3 sin diluir. 4. Disolver el contenido de una Botella 4 con 0.25 ml de agua bidestilada. Estabilidad de los reactivos La solución 1 es estable a 2-8ºC (ver etiqueta). Llevar la Solución 1 a 20-25ºC antes de su uso. El contenido de la Botella 2 es estable a 2-8ºC (ver etiqueta). La solución 2 es estable por 4 semanas a 2-8ºC ó por 2 meses de – 15 a -25ºC. El contenido de la Botella 3 es estable a 2-8ºC (ver etiqueta). Los contenidos de las Botellas 4 son estables a 2-8ºC (ver etiqueta). La solución 4 estable por 5 días a 2-8ºC. Procedimiento 3 Longitud de onda : 4 Cubeta de vidrio : Temperatura: Volumen final: Leer contra aire Soluc. de muestra: 1 340 nm, Hg 365 nm ó Hg 334 nm 1.00 cm de paso de luz 20-25ºC 3.230 ml (sin cubeta en el paso de luz) ó contra agua 5 0.3-30 ug de ácido acético/ensayo (en 0.1002.000 ml de volumen de muestra Almacenar a 2-8° C 2 AMP = adenosina-5’-monofosfato 3 La máxima absorción del NADH es a 340 nm. Si se usan fotómetros con lámpara de vapor, las mediciones se hacen a 365 nm ó 334 nm. 4 Si se desea se pueden utilizar cubetas descartables en lugar de las de vidrio. 5 Ver instrucciones para el desarrollo del ensayo Pipetear en la cubeta Blanco Muestra solución 1 1.000 ml 1.000 ml solución 2 0.200 ml 0.200 ml SN de Muestra* - 0.100 ml agua bidestilada 2.000 ml 1.900 ml Mezclar** y leer las absorbancias de las soluciones (A0). Adicionar: suspensión 3 0.010 ml 0.010 ml Mezclar** y leer las absorbancias de las soluciones (A1) luego de aprox. 3 min. Iniciar la reacción por el agregado de: solución 4 0.020 ml 0.020 ml Mezclar**, esperar hasta que la reacción se detenga (aprox. 10-15 min) y leer las absorbancias de las soluciones (A2). Si la reacción no se ha detenido luego de 15 min, continuar leyendo las absorbancias a intervalos de 2 min hasta que el aumento de la absorbancia sea constante por 2 min. *Enjuagar el tip de la pipeta con solución de muestra antes de dispensar la solución de muestra. ** Por ejemplo, con una espátula plástica ó por agitación después de cubrir la cubeta con Parafilm (marca registrada de la American Can Company, Greenwich, Ct., USA). Si la absorbancias A2 aumenta constantemente, extrapolar la absorbancias al tiempo de la adición de la solución 4 (ACS) (ver también pto. 7). Determinar la diferencia de absorbancias (A1 – A0) y (A2-A0) para el blanco y las muestras. Con el equilibrio de la reacción indicadora precedente, no hay proporcionalidad linear (directa) entre la diferencia de absorbancia medida y la concentración de ácido acético. La siguiente fórmula, que debe ser utilizada generalmente para reacciones indicadoras como la precedente, sirve para calcular ∆Aá. acético (ver Ref. 1.2): 2 2 (A1-A0) muestra (A1-A0) blanco ∆Aá. acético = [(A2-A0)muestra – ------------------] – [(A2 – A0)blanco – -------------] (A2-A0)blanco (A2-A0)muestra La diferencia de absorbancias medida debe, como regla, ser mayor a 0.100 unidades de absorbancia para obtener resultados suficientemente precisos (ver “Instrucciones para el desarrollo del ensayo” y “Sensibilidad y Límite de detección” pto. 4). Cálculos De acuerdo a la ecuación general del cálculo de las concentraciones: c V v MW d ε V x PM x ΔA (g/l) ε x d x v x 1000 = volumen final (ml) = volumen de muestra (ml) = peso molecular de la sustancia a ensayar (g/mol) = paso de luz (cm) = coeficiente de extinción del NADH a: -1 -1 340 nm = 6.3 (l x mmol x cm ) -1 -1 Hg 365 nm = 3.4 (l x mmol x cm ) -1 -1 Hg 334 nm = 6.18 (l x mmol x cm ) = ACS, también conocido como acetato tiokinasa 2013-10 1/4 Corresponde para ácido acético: 3.230 × 60.05 1.940 c = ----------------------------------- x ∆A = ------------ x ∆A (g acético / l ε x 1.00 x 0.100 x 1000 ε de sol. de muestra) Si la muestra se ha diluido durante la preparación, los resultados deben multiplicarse por el factor de dilución F. Cuando se analizan muestras sólidas ó semisólidas que se pesan para la preparación de la muestra, los resultados se calculan a partir de la cantidad pesadas: c ác. acético (g/l de sol. ) Contenido ác. acético = ------------------------------------------ x 100 (g / 100g) peso muestra en g/l sol. 1. Instrucciones para el funcionamiento del kit La cantidad de ácido acético presente en el ensayo debe ser entre 0.6 ug y 30 ug (medido a 365 nm) ó 0.3 ug y 15 ug (medido a 340 nm, 334 nm) respectivamente. Para obtener una diferencia de absorbancias suficiente, la solución de muestra debe diluirse para dar una concentración de ácido acético entre 0.06 y 0.3 g/l ó 0.03 y 0.15 g/l respectivamente. Tabla de dilución Cantidad estimada de ácido acético por litro Dilución con agua Dilución factor F medido a 340 ó 334 nm 365 nm < 0.15 g 0.3 g - 1 0.15-1.5 g 0.3-3.0 g 1+9 10 1.5-15 g 3.0-30 g 1 + 99 100 > 15 g > 30 g 1 +999 1000 Si la medida de la diferencia de absorbancias (∆A) es muy pequeña (ej. < 0.100), debe prepararse nuevamente la solución de muestra (pesar mas cantidad de muestra ó diluir menos la muestra) ó el volumen de muestra que se pipetea en la cubeta puede aumentarse hasta 2.000 ml. El volumen de agua agregada debe, en ese caso, disminuirse para obtener el mismo volumen final en el ensayo para la muestra y el blanco. El nuevo volumen de muestra v debe tomarse en cuenta en los cálculos. muestra, volumen de muestra v = 2.000 ml) hasta 30 ug de ácido acético/ensayo (0.3 g de ácido acético/l de solución de muestra, volumen de muestra v = 0.100 ml). 6. Precisión En una determinación por duplicado de una solución de muestra, se puede obtener una diferencia de 0.005 a 0.010 unidades de absorbancia. Con un volumen de muestra de v = 0.100 ml y medido a 340 nm, esto corresponde a una concentración de ácido acético aprox. de 1.5-3 mg/l. (Si la muestra se diluye durante la preparación de la misma, el resultado se debe multiplicar por el factor de dilución F. Si la muestra se pesa para su preparación, ej. usando 1 g muestra/100 ml = 10 g/l, se puede obtener una diferencia de 0.015-0.03g/100 g). En la literatura se han publicado los siguientes datos: CV = 0.6-1.6 % soluciones de ácido acético CV = 1.5-1.8 % vino blanco CV = 1.7-2.1 % vino tinto CV = 2.3-2.8 % yogur (Ref. 1.3) Salchicha de cerdo cocida finamente picada: x = 0.3 g/100 g r = 0.017 g/100 g s(r) = ± 0.006 g/100 g R = 0.023 g/100 g s(R) = ± 0.008 g/100 g Ketchup de tomate: r = 0.05 g/100 g s(r) = ± 0.02 g/100 g R = 0.07 g/100 g s(R) = ± 0.02 g/100 g Pan: x = 131.89 mg/100 g r = 7.53 mg/100 g R = 21.12 mg/100 g x = 204.55 mg/100 g r = 7.41 mg/100 g R = 19.35 mg/100 g s(r) = ± 2.66 mg/100 g s(R) = ± 7.46 mg/100 g s(r) = ± 2.62 mg/100 g s(R) = ± 6.84 mg/100 g (Ref. 2.1) 7. Interferencias / fuentes de error Los ésteres de ácido acético se puede saponificar bajo las condiciones del ensayo (ej. etilacetato en vino, ácido acetilsalicílico en farma). El ácido acético formado por hidrólisis lenta es responsable de las reacciones “creep” que deben tomarse en consideración cuando se calculan los resultados (extrapolación de A2 al tiempo de adición de la solución de muestra). El límite de detección de 0.15 mg/l deriva de la diferencia de absorbancia de 0.010 (medida a 340 nm) y un máximo de volumen de muestra de v = 2.000 ml. 8. Reconocimiento de interferencia durante el procedimiento del ensayo 8.1 Si la conversión de ácido acético se ha completado en el tiempo estipulado en “Procedimiento”, se puede concluir, en general, que no han ocurrido interferencias. 8.2 Al completarse la reacción, la determinación puede reiniciarse con el agregado de ácido acético ó acetato de sodio (cualitativa ó cuantitativamente): si la absorbancia se altera posteriormente al agregado del material estándar, esto también es una indicación que no ha ocurrido interferencia. 8.3 Se pueden reconocer errores del operador ó interferencia en la determinación por la presencia de sustancias contenidas en la muestra, realizando una doble determinación utilizando dos volúmenes diferentes de muestra (ej. 0.100 ml y 0.200 ml): las diferencias en las mediciones de las absorbancias deben ser proporcionales a los volúmenes de muestra utilizados. Cuando se analizan muestras sólidas, se recomienda que se pesen diferentes cantidades (ej. 1g y 2g) en recipientes de 100 ml. Las diferencias de absorbancias medidas y los pesos de la muestra utilizados deben ser proporcionales para volúmenes idénticos. 8.4 Se pueden reconocer posibles interferencias causadas por sustancias contenidas en la muestra utilizando un estándar interno como control: además de las determinaciones de la muestra, el blanco y el estándar, se lleva a cabo otra determinación con la muestra y el control juntos en el mismo ensayo. La recuperación se puede calcular de la diferencia de absorbancias medidas. 8.5 Posibles pérdidas durante la determinación se puede reconocer por medio de ensayos de recuperación: la muestra debe prepararse y analizarse con y sin el agregado de material estándar. Dicha adición debe recuperarse cuantitativamente dentro del rango del error del método. 5. Linealidad La linealidad de la determinación es desde aproximadamente 0.3 ug de ácido acético/ensayo (0.15 mg de ácido acético/l de solución de 9. Riesgo de los reactivos Los reactivos utilizados en la determinación de ácido acético no son materiales riesgosos de acuerdo a las Regulaciones de Sustancias 2. Información técnica 2.1. En la determinación de ácido acético (muestras ácidas) debe tenerse en cuenta que, al llevar a cabo la preparación de la muestra, el analito volátil no se pierda. Esto puede evitarse alcalinizando la muestra, el acetato resultante no es volátil. 2.2. Al hacer los cálculos de los resultados, debe indicarse claramente si los resultados se expresan como ácido acético (masa molar 60.05 g/mol) ó como acetato (masa molar 59.04 g/l). (En determinaciones enzimáticas, se mide el ion acetato). 3. Especificidad (Ref. 1) El método es específico para ácido acético. Al analizar ácido acético comercial (ác. Acético glacial), se obtienen resultados de > 100% (cuando se elaboran soluciones de ácido acético, hay que tener en cuenta la volatilidad del ácido acético); en el análisis de acetato de sodio anhidro comercial, se esperan resultados < 100 % porque la sustancia absorbe agua. 4. Sensibilidad y límite de detección (Ref. 1.3) La mínima diferencia en absorbancia para el procedimiento es de 0.005 unidades de absorbancia. Este valor corresponde a un volumen máximo de v = 2.000 ml y medición a 340 nm de una concentración de ácido acético de aprox. 0.1 mg/l de solución de muestra (si se utiliza un v = 0.100 ml, esto corresponde a 1.5 mg/l de solución de muestra). 2013-10 2/4 Peligrosas, las Leyes Químicas ó la Regulación 67/548/EEC de la CEE y subsecuentes Guías de alteraciones, suplementos y adaptaciones. Aún así, deben cumplirse todas las medidas de seguridad generales que se aplican a todas las sustancias químicas. Luego de su utilización, los reactivos deben desecharse con el descarte del laboratorio, pero deben observarse siempre las regulaciones locales. El material de empaque puede desecharse en recipientes destinados al reciclado. 10. Información general sobre la preparación de muestra Al llevar a cabo el ensayo: Usar muestras líquidas límpidas, incoloras y prácticamente neutras directamente ó luego de diluirlas de acuerdo a la tabla de dilución, y usar un volumen hasta 2.000 ml. Filtrar soluciones turbias; Desgasear muestras que contengan dióxido de carbono (ej. por filtración); Ajustar muestras ácidas a un pH aproximado de 8-9 por el agregado de una solución de hidróxido de sodio ó de potasio; Ajustar muestras ácidas y levemente coloreadas a un pH aproximado de 8-9 por el agregado de una solución de hidróxido de sodio ó de potasio y posterior incubación durante 15 min; Tratar las muestras “altamente coloreadas” que se usan sin diluir ó en grandes volúmenes con carbón activado, polivinilpolipirrolidona (PVPP) ó con poliamida, (ej. 1 g/100 ml); Moler ú homogeneizar las muestras sólidas ó semisólidas, extraer con agua ó disolver en agua y filtrar si es necesario; respectivamente eliminar turbidez ó colorantes por clarificación de Carrez; Desproteinizar muestras que contengan proteínas con ácido perclórico; alternativamente clarificar con soluciones de Carrez; Extraer muestras que contengan grasa con agua caliente (la temperatura de extracción debe ser mayor que el punto de fusión de la grasa involucrada). Enfriar para permitir que la grasa se separe, colocar el recipiente en baño de hielo por 15 min y filtrar; alternativamente clarificar con soluciones de Carrez luego de la extracción con agua caliente. Clarificación de Carrez: Pipetear la muestra líquida en un recipiente de 100 ml conteniendo aprox. 60 ml de agua bidestilada. Subsecuentemente agregar, lentamente, 5 ml de solución de Carrez I hexaferrocianato de potasio (II) (ferrocianuro), 85 mM = 3.60 g K4[Fe(CN)6] × 3 H2O/100 ml) y 5 ml solución de Carrez-II (sulfato de zinc, 250 mM = 7.20 g ZnSO4 × 7 H2O/100 ml). Ajustar el pH a 7.5-8.5 con hidróxido de sodio (0.1 M; ej. 10 ml). Mezclar luego de cada adición. Llevar a volumen, mezclar y filtrar. 11. Ejemplos de aplicación Determinación de ácido acético en jugos de fruta a) Jugos de fruta con alto contenido de ácido acético (por ej. en el rango aprox de 0.3 g/l): Diluir la muestra con agua 1 + 1; usar 0.100 ml para el ensayo. b) Jugos de fruta con bajo contenido de ácido acético (menos que 0.02 g/l): Decolorar los jugos coloreados: Agregar 1% (p/v) de carbón activado a la muestra, agitar por aprox. 30s y filtrar. Usar 0.500 ml para el ensayo (tomar en consideración la alteración del volumen en el cálculo). En ciertas situaciones (cuando se usan grandes volúmenes de muestra), ajustar los jugos ácidos a pH 8. Determinación de ácido acético en vino (Ref. 3.1) Usar 0.100 ml de vino blanco sin diluir para el ensayo (este volumen puede aumentarse hasta 2.000 ml, si es necesario). Usar 0.100 ml de vino tino que contenga aprox. 0.2 g ácido acético/l sin diluir para el ensayo y sin decolorar. Para vinos tintos que contengan menos que 0.1 g ácido acético/l agregar 1% (p/v)de poliamida ó PVPP, agitar por aprox. 1 min y filtrar. Ajustar una alícuota de la gran muestra decolorada a pH 8 (papel indicador) con hidróxido de sodio (0.1 M), diluir con agua para dar el doble del volumen. Usar hasta 2.000 ml, si es necesario, para el ensayo (tomar en cuenta la dilución y el volumen de muestra alterado para los cálculos). Altas concentraciones de alcohol en la muestra pueden dilatar la reacción del acetato. La absorbancia A2 debe, por lo tanto, leerse luego de 20 min. filtrado a 20-25ºC y diluir de acuerdo a la tabla de dilución si es necesario. Determinación de ácido acético en cerveza (Ref. 3.4, 3.5) Para remover el ácido carbónico, agitar aprox. 5-10 ml de cerveza por 30 s con varilla de vidrio ó filtrar. Se usa la muestra libre de CO2 directamente en el ensayo sin más dilución. Determinación de ácido acético en queso duro Pesar 2 g de queso molido en un recipiente de 100 ml, agregar alrededor de 70 ml de agua e incubar a 60ºC por 20 min. Agitar el recipiente de tiempo en tiempo. Luego de enfriar a 20-25ºC, llevar a 100 ml con agua bidestilada. Para la separación de la grasa, colocar el recipiente en un refrigerador por 20 min, filtrar, descartar los primeros ml del filtrado. Usar la solución clara, que puede ser levemente opalescente, ajustada a 20-25ºC para el ensayo. Determinación de ácido acético en mayonesa ó yogur Pesar 5 g de muestra en un recipiente de 100 ml. Agregar aproximadamente 50 ml de agua bidestilada y calentar por 20 min en baño de agua a 50-60ºC, agitar de tiempo en tiempo. Luego de enfriar a 20-25°C, llevar a 100 ml con agua bidestilada. Para la separación de la grasa, colocar el recipiente en un refrigerador por 20 min, filtrar, descartar los primeros ml del filtrado. Usar la solución clara, que puede ser levemente opalescente, ajustada a 20-25ºC para el ensayo. Determinación de ácido acético en productos cárnicos Pesar 10 g de salchicha molida y homogeneizar con 80 ml de ácido perclórico (1 M) por 10 min usando un homogeneizador (Ultra Turrax ó IKA), centrifugar, decantar el sobrenadante y filtrar. Descartar los primeros ml del filtrado y pipetear 20 ml en un recipiente, ajustar a pH 10.0 con hidróxido de potasio (2M). Medir el volumen de KOH. Para obtener una precipitación cuantitativa del perclorato de potasio formado, colocar en baño de hielo ó refrigerador por 20 min, filtrar. Usar la solución clara diluida, si es necesario (ver tabla de dilución), para el ensayo. Cuando se calcula la dilución, tener en cuenta el contenido de agua de la muestra. Para calcular el contenido (en g/100 g) de acuerdo a la fórmula mencionada (ver cálculos), se necesita el contenido de la muestra en la solución de muestra. Cuando se usa la preparación de muestra como se mencionó anteriormente y se considera el contenido de agua de la muestra, el peso de la muestra se calcula de acuerdo a la siguiente fórmula: A x 1000 x d Peso muestra = ----------------------------- (g/l de solución de muestra) (b + a x w) x (d + e) Donde: a = muestra pesada en g b = volumen de ácido perclórico en ml d = volumen de sobrenadante para ajustar pH e = volumen de KOH para ajustar pH a 8-10 en ml w = contenido de agua de la muestra (%p/p) / 100 1000 = factor para g expresado en mg (La gravedad específica de agua de la muestra a 20-25 ºC es aprox. 1 g/ml. Puede despreciarse para el cálculo). 12. Otras aplicaciones El método puede ser utilizado para el análisis de papel, fármacos (ej. soluciones de infusión, preparación de ácido acetilsalicílico), emulsionantes (luego de la hidrólisis alcalina), así como el análisis de muestras biológicas con fines de investigación. Para detalles del muestreo, tratamiento y estabilidad de la muestra ver Bergmeyer, H. U. & Möllering, H. (1974) in Methods of Enzymatic Analysis (Bergmeyer, H. U., ed.) 2nd ed., vol. 3, p. 1523-1525, Verlag Chemie, Weinheim/Academic Press, Inc. New York and London; Holz, G. & Bergmeyer, H. U. (1974) in Methods of Enzymatic Analysis (Bergmeyer, H. U., ed.) 2nd ed., vol. 3, p. 1530, Verlag Chemie, Weinheim/Academic Press, Inc. New York and London; Lundquist, F. (1974) in Methods of Enzymatic Analysis (Bergmeyer, H. U., ed.) 2nd ed., vol. 3, p. 1534-1535, Verlag Chemie, Weinheim/Academic Press, Inc. New York and London. Determinación de ácido acético en vinagre Diluir la muestra de acuerdo a la tabla de dilución y usar 0.100 ml para el ensayo. Determinación de ácido acético en aderezos ácidos y salsas Separar los sólidos de la muestra y colocar la muestra en refrigerador por 20 min para obtener la separación de las grasas. Filtrar, ajustar el 2013-10 3/4 Determinación de ácido acético en muestras de fermentación y en medio de cultivo de células Coloque la muestra (luego de centrifugar si es necesario) en un baño de agua a 80ºC por 15 min (cubrir el recipiente por la volatilidad del ácido acético) para detener las reacciones enzimáticas. Centrifugar y utilizar el sobrenadante (diluido de acuerdo a la tabla de dilución si es necesario) para el ensayo. Alternativamente se puede desproteinizar con ácido perclórico. Ver los ejemplos mencionados anteriormente. Homogeneizar medio gelatinoso de agar con agua y proseguir el tratamiento como se ha descrito. Referencias 1.1 Bergmeyer, H. U. & Möllering, H. (1974) in Methoden der enzymatischen Analyse (Bergmeyer, H. U., Hrsg.) 3. Aufl., Bd. 2, S. 1566-1574; Verlag Chemie, Weinheim, and (1974) in Methods of Enzymatic Analysis (Bergmeyer, H. U., ed.) 2nd. ed., vol. 3, p. 1520- 1528, Verlag Chemie, Weinheim/Academic Press, Inc. New York and London 1.2 Bergmeyer, H. U. (1974) in Methoden der enzymatischen Analyse (Bergmeyer, H. U., Hrsg.) 3. Aufl., Bd. 1, S. 119-125; Verlag Chemie, Weinheim and (1974) in Methods of Enzymatic Analysis (Bergmeyer, H. U., ed.) 2nd ed., vol. 1, p. 112-117, Verlag Chemie, Weinheim/Academic Press, Inc. New York and London 1.3 Beutler, H.-O. (1984) in Methods of Enzymatic Analysis (Bergmeyer, H. U., ed.) 3rd ed., vol. VI, pp. 639-645, Verlag Chemie, Weinheim, Deerfield Beach/Florida, Basel 2.1 Amtliche Sammlung von Untersuchungsverfahren nach §35 LMBG; Untersuchung von Lebensmitteln: Bestimmung von Essigsäure (Acetat) in Fleischerzeugnissen, 07.00-14 (November 1981); Bestimmung von Essigsäure (Acetat) in Wurstwaren, 08.00-16 (November 1981); Bestimmung der Essigsäure in Tomatenketchup und vergleichbaren Erzeugnissen, 52.01.01-16 (November 1983); Bestimmung von Essigsäure (Acetat) in Brot einschließlich Kleingebäck aus Brotteigen, 17.00-16 (Juni 1990) 2.2 Gombocz, E., Hellwig, E., Vojir, F. & Petuely, F. (1981) Deutsche LebensmittelRundschau, 77, 13-14 2.3 Brautechnische Analysenmethoden, Band III, S. 568-572 (1982), Methodensammlung der Mitteleuropäischen Brautechnischen Analysenkommission (MEBAK), herausgegeben von F. Drawert im Selbstverlag der MEBAK, Freising 2.4 Niederlande: Warenwet, Uitvoeringsvoorschriften (C II-6), Regeling Onderzoekingsmethoden voor brood; Methode 16: De Bepaling van Calciumacetat (Oktober 1986); Dit voorschrift betrijft een methode voor de bepaling van calciumacetat in het in brood verwerkte meel 2.5 Deutsche Norm DIN EN ISO 11213 (April 1995) Modifizierte Stärke - Bestimmung des Acetylgehaltes - Enzymatisches Verfahren (ISO 11213:1995) Deutsche Fassung EN ISO 11213:1995 Modified Starch - Determination of acetyl content - Enzymatic method 2.6 European Standard EN ISO 11213 (April 1995) Modified Starch - Determination of acetyl content - Enzymatic method 2.7 International Federation of Fruit Juice Producers (IFU, Methods of Analysis, no. 661996) 2.8 Deutsche Norm DIN EN 12632 (April 1999) Frucht- und Gemüsesäfte; Enzymatische Bestimmung des Gehaltes an Essigsäure (Acetat); Spektralphotometrische Bestimmung von NAD 2.9 Europäische Norm / European Standard EN 12632 (April 1999) , Frucht- und Gemüsesäfte: Enzymatische Bestimmung des Gehaltes an Essigsäure (Acetat) Spektralphotometrische Bestimmung von NAD (Fruit and vegetable juices - Enzymatic determination of acetic acid (acetate) content - NAD spectrometric method) 2.10 Deutsche Norm DIN 10 370 (Juni 1998) Material zur Herstellung von Umhüllungen für Zigarettenfilter, Zigaretten und andere Tabakerzeugnisse, Bestimmung des Acetatgehaltes 3.1 Junge, Ch. & Spadinger, Ch. (1979) Die flüchtigen Säuren des Weines, Deutsche Lebensmittel-Rundschau 75, 12-15 3.2 Müller, H. & Horbach, A. (1981) Bestimmung von Acetylendgruppen in Poly-_caprolactam durch Hydrolyse und enzymatische Essigsäure-Analyse, Die Angewandte Makromolekulare Chemie 96, 37-41 3.3 Spicher, G. & Rabe, E. (1981) Die Mikroflora des Sauerteiges; XII. Mitteilung: Der Einfluss der Temperatur auf die Lactat-/Acetatbildung in mit homofermentativen Milchsäurebakterien angestellten Sauerteigen, Z. Lebensm. Unters. Forsch. 172, 2025 3.4 Piendl, A. & Wagner, I. (1983) Physiologische Eigenschaften der organischen Säuren des Bieres; l. Acetat, Brauindustrie 68, 862-866 3.5 Klopper, W, J., Angelino, S.A.G.F., Tuning, B. & Vermeire, H.A. (1986) Organic acids and glycerol in beer, J. Inst. Brew. 92, 225-228 3.6 Saalfeld, U. & Freund, W. (1999) Charakterisierung pulverisierter Sauerteige und Möglichkeiten ihrer qualitativen Bestimmung im Brot - Teil II: Untersuchung der Acetat, Lactose-, Hexanal-, Calcium-, Kalium- und Natriumgehalte und der Thiobarbitursäurereaktiven Substanzen, Deutsche Lebensmittel-Rundschau 95, 297304 Solución control de Ácido acético del ensayo Concentración : ver etiqueta de la botella La Solución control de ácido acético es una solución acuosa estabilizada de ácido acético. Sirve como control del ensayo enzimático para la determinación de ácido acético en alimentos y otros materiales. 3. Estándar interno: La solución control del ensayo puede utilizarse como estándar interno para controlar el correcto funcionamiento del ensayo (errores groseros) y para ver si la solución de muestra está libre de sustancias interferentes. Aplicación: 1. Adición de la solución control de ácido acético a la mezcla de reacción: La solución control se utiliza en el ensayo en el lugar de la solución de muestra. 2. Reiniciar la reacción, cuantitativamente: Luego de finalizada la reacción con la solución de muestra y luego de leída A2 agregue 0.050 ml de solución control del ensayo. Lea la absorbancia A3 al finalizar la reacción (aprox. 20 min.). Se observa un aumento de la absorbancia. No es posible realizar un cálculo debido a la reacción de equilibrio precedente con L-MDH (3). Pipetear dentro Blanco Muestra Estándar Muestra + de la cubeta estándar Solución 1 1.000 ml 1.000 ml 1.000 ml 1.000 ml Solución 2 0.200 ml 0.200 ml 0.200 ml 0.200 ml Solución muestra -0.100 ml -0.050 ml Control ensayo --0.100 ml 0.050 ml Agua destilada 2.000 ml 1.900 ml 1.900 ml 1.900 ml Mezclar, leer las absorbancias de las soluciones (A0). Continuar como se describe en el esquema de pipeteo bajo “Procedimiento”. Seguir las instrucciones dadas en “Instrucciones para el desarrollo del ensayo”·y en los pié de página. La recuperación del estándar se calcula de acuerdo a la siguiente fórmula: 2 x ∆A muestra + estándar - ∆A muestra recuperación = ----------------------------------------------- x 100 (%) ∆A estánda 2013-10 4/4