universidad central del ecuador facultad de medicina veterinaria y
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UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR FACULTAD DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA CARRERA DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA “DETERMINACIÓN DE PRESENCIA DE HEMOPARÁSITOS EN SERPIENTES EN VIDA SILVESTRE, UBICADAS EN LAS RESERVAS COTA 70, COTACACHI CAYAPAS Y SUMACO NAPO GALERAS” Trabajo de Grado presentado como requisito para obtener el Grado o Título de Médico Veterinario Zootecnista AUTOR: ERIKA MARGARITA MEDRANO TUPIZA TUTOR: MVZ BYRON HUMBERTO PUGA TORRES Quito, Mayo, 2015 ii DEDICATORIA Dedico este logro a quién lo inspiró, a mi Lu, juntos empezamos este camino, y sé que desde dónde está me ha acompañado hasta su culminación. A mis padres, Margarita y Sebastián, por ser el pilar de mi vida, porque sin ellos, sin su constancia, sin su apoyo y sin su ayuda, no sería la persona que hoy soy. A mi hermana, Adriana, para quién siempre quise ser un ejemplo y terminó siendo un ejemplo para mí. A Bryan, quien no dejó de alentarme y creer en mí, que pese a las dificultades, siempre estuvo en mi esquina. A Duma y Niwa, porque al salvarles, ellos me salvaron a mí. A Pinocho, Valentina, Momo, y tantos otros animales silvestres que merecieron algo mejor, que la vida que lamentablemente les obligó a vivir el ser humano, y por los que jamás dejaré de luchar. A la niña que fui, a la niña que junto a su mejor amigo, un día tuvo un sueño, y jamás dejó de luchar para volverlo realidad, a esa niña que sé, estaría muy orgullosa de mí. iii AGRADECIMIENTOS A mis padres, por su todo su esfuerzo, por apoyarme y ayudarme en toda la locura que ha sido cumplir este sueño, por darme la fortaleza para vencer cualquier obstáculo. A mi familia por estar siempre ahí, por acompañarme en buenos y malos momentos, por ayudarme cuando más necesité de ellos... por ser la mejor familia. A Bryan, por su paciencia, por su comprensión, por su apoyo, por su ayuda, por recordarme que nada es fácil en la vida y que todo tiene una solución, por luchar a mi lado cada día. A Lore, por toda su ayuda en este proceso, por su maravillosa amistad, por ser un excelente ser humano, por ser siempre incondicional. A mis amigos, a ellos que siempre creyeron, que siempre confiaron, que buscaron la manera de alentar mis sueños, a los de siempre, a los de hoy ¡a los de verdad! Agradezco a mi tutor, MVZ Byron Puga, por haber aceptado este reto y guiarme en el proceso, aún sin saber a dónde nos iba a llevar. Agradezco su confianza y su buena disposición en todo momento. Agradezco al Dr. Leonardo Arias, por impulsarme a seguir en este camino, por haber confiado y creído en mí, incluso antes de saber lo que podía lograr. Agradezco a mis amigos, René Silva, Jonathan Proaño y Andy Proaño por ayudarme en la parte práctica, por las ideas, por dedicarle su tiempo y su esfuerzo a mi sueño. A mi amigo MVZ Miguel Jervis, que sigue manteniendo mi fe en la humanidad, que no deja de ayudarme aunque esté a miles de kilómetros de distancia. A cada una de las personas que sin conocer mi nombre, ni mi historia, se unieron a este sueño: doña Soledad, don Carlos, doña Alicia, don Manuel, Amparito, don César, Sara y cada uno de los personajes anónimos que me extendieron una mano para que este trabajo sea posible. iv AUTORIZACIÓN DE LA AUTORÍA INTELECTUAL Yo, ERIKA MARGARITA MEDRANO TUPIZA en calidad de autora de la tesis “DETERMINACIÓN DE PRESENCIA DE HEMOPARÁSITOS EN SERPIENTES EN VIDA SILVESTRE, UBICADAS EN LAS RESERVAS COTA 70, COTACACHI CAYAPAS Y SUMACO NAPO GALERAS”, por la presente autorizo a la UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR, hacer uso de todos los contenidos que me pertenecen o de parte de los que contienen esta obra, con fines estrictamente académicos o de investigación. Los derechos que como autora me corresponden, con excepción de la presente autorización, seguirán vigentes a mi favor, de conformidad con el establecimiento en los artículos 5, 6, 8, 19 y demás pertinentes de la Ley de Propiedad Intelectual y su Reglamento. En la ciudad de Quito, al 5 de Mayo de 2015. Erika Margarita Medrano Tupiza CI: 1717763310 E-mail: [email protected] v INFORME DE APROBACIÓN DEL TUTOR En mi carácter de Tutor del Trabajo de Grado, presentado por la señorita: ERIKA MARGARITA MEDRANO TUPIZA, para optar por el Título o Grado de Médico Veterinario y Zootecnista, cuyo título es “DETERMINACIÓN DE PRESENCIA DE HEMOPARÁSITOS EN SERPIENTES EN VIDA SILVESTRE, UBICADAS EN LAS RESERVAS COTA 70, COTACACHI CAYAPAS Y SUMACO NAPO GALERAS”. Considero que dicho trabajo reúne los requisitos y méritos suficientes para ser sometido a la presentación pública y evaluación por parte del jurado examinador que se designe. En la ciudad de Quito, a los cinco días del mes de Mayo de 2015. MVZ. Byron Puga CI: 1713758827 vi APROBACIÓN DEL TRABAJO/TRIBUNAL TÍTULO DEL TRABAJO DE GRADO “DETERMINACIÓN DE PRESENCIA DE HEMOPARÁSITOS EN SERPIENTES EN VIDA SILVESTRE, UBICADAS EN LAS RESERVAS COTA 70, COTACACHI CAYAPAS Y SUMACO NAPO GALERAS” El tribunal constituido por: Dr. Edison Encalada Presidente Dra. María Inés Baquero Vocal Principal Dra. Nivia Luzuriaga Vocal Principal Dr. Richar Rodríguez Vocal Suplente. Luego de receptar la presentación del trabajo de grado, previo a la obtención del título o grado de Médico Veterinario Zootecnista, presentado por la señorita Erika Margarita Medrano Tupiza. Con el título: “DETERMINACIÓN DE PRESENCIA DE HEMOPARÁSITOS EN SERPIENTES EN VIDA SILVESTRE, UBICADAS EN LAS RESERVAS COTA 70, COTACACHI CAYAPAS Y SUMACO NAPO GALERAS” Ha emitido el siguiente veredicto: APROBADO Fecha: 20 de mayo de 2015, para constancia de lo actuado firman: PRESIDENTE: Dr. Edison Encalada VOCAL PRINCIPAL: Dra. María Inés Baquero VOCAL PRINCIPAL : Dra. Nivia Luzuriaga VOCAL SUPLENTE : Dr. Richar Rodríguez vii ÍNDICE DE CONTENIDO DEDICATORIA ........................................................................................................... ii AGRADECIMIENTOS ............................................................................................... iii AUTORIZACIÓN DE LA AUTORÍA INTELECTUAL ........................................... iv INFORME DE APROBACIÓN DEL TUTOR ............................................................ v APROBACIÓN DEL TRABAJO/TRIBUNAL........................................................... vi TÍTULO DEL TRABAJO DE GRADO ...................................................................... vi ÍNDICE DE CONTENIDO......................................................................................... vii ÍNDICE DE GRÁFICOS ............................................................................................. ix ÍNDICE DE TABLAS .................................................................................................. x RESUMEN................................................................................................................... xi ABSTRACT ................................................................................................................ xii INTRODUCCIÓN ........................................................................................................ 1 REVISIÓN DE LA LITERATURA ............................................................................. 3 Antecedentes ............................................................................................................. 3 Generalidades ............................................................................................................ 3 Hemoparásitos ........................................................................................................... 4 Hemogregarinas ..................................................................................................... 5 Hematología de los reptiles ..................................................................................... 10 Morfología normal de las células rojas de la sangre de los reptiles .................... 10 Morfología normal de las células blancas de la sangre de los reptiles ................ 10 Inclusiones y parásitos de los glóbulos blancos................................................... 15 MATERIALES Y MÉTODOS ................................................................................... 16 Área de estudio ........................................................................................................ 16 Materiales ................................................................................................................ 20 viii Técnicas y recolección de la información ............................................................... 21 Fase de campo ...................................................................................................... 22 Fase de laboratorio ............................................................................................... 25 Análisis de datos ..................................................................................................... 25 RESULTADOS Y DISCUSIÓN ................................................................................ 26 CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES .......................................................... 29 REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS ........................................................................ 30 ANEXOS .................................................................................................................... 33 Anexo A. Permiso de captura y muestreo del MAE ............................................... 33 Anexo B. Imágenes del proceso de captura, muestreo y laboratorio. ..................... 35 Anexo C. Resultados del hemograma ..................................................................... 36 Anexo D. Individuos hallados en el muestreo ........................................................ 37 Anexo E. Recuento de glóbulos blancos ................................................................. 39 Anexo F. Certificado de traducción ........................................................................ 43 ix LISTA DE GRÁFICOS Gráfico 1 Ciclo biológico de Hepatozoon aegyti dentro de serpientes y mosquitos (Culex pipiens). ............................................................................................................. 7 Gráfico 2 Mapa Reserva Cota 70 ................................................................................ 16 Gráfico 3 Mapa de la Reserva Cotacachi - Cayapas ................................................... 17 Gráfico 4 Mapa de la Reserva Sumaco - Napo - Galeras ........................................... 19 Gráfico 5 Diagrama de muestreo en transectos........................................................... 23 Gráfico 6 Captura de colúbridos ................................................................................. 35 Gráfico 7 Captura de elápido con gancho ................................................................... 35 Gráfico 8 Sujeción adecuada de elápido ..................................................................... 35 Gráfico 9 Captura del individuo en bolsa de tela ........................................................ 35 Gráfico 10 Pesaje de individuos.................................................................................. 35 Gráfico 11 Toma de muestra sanguínea por punción cardiaca ................................... 35 Gráfico 12 Heterófilo .................................................................................................. 36 Gráfico 13 Acidófilo ................................................................................................... 36 Gráfico 14 Linfocito .................................................................................................... 36 Gráfico 15 Heterófilos (2), monocito .......................................................................... 36 Gráfico 16 Monocito ................................................................................................... 36 Gráfico 17 Trombocitos .............................................................................................. 36 Gráfico 18 Atractus major .......................................................................................... 37 Gráfico 19 Oxyrhopus petolarius ................................................................................ 37 Gráfico 20 Oxyrhopus petola digitalis ........................................................................ 37 Gráfico 21 Atractus dunni ........................................................................................... 37 Gráfico 22 Sibon nebulata .......................................................................................... 37 Gráfico 23 Dipsa elegans ............................................................................................ 37 Gráfico 24 Phynonax polylepis ................................................................................... 38 Gráfico 25 Boa constrictor constrictor ....................................................................... 38 Gráfico 26 Micrurus surimanesis surinamensis ......................................................... 38 Gráfico 27 Mastigodryas pulchriceps ......................................................................... 38 Gráfico 28 Frecuencia relativa de presentación de los diferentes glóbulos blancos en serpientes ..................................................................................................................... 40 x LISTA DE TABLAS Tabla 1 Valores sanguíneos en Boa (Constrictor constrictor) y Pitón Real (Python regius) ......................................................................................................................... 10 Tabla 2 Ubicación Reserva Cota 70 ............................................................................ 17 Tabla 3 Ubicación Reserva Cotacachi - Cayapas ....................................................... 18 Tabla 4 Ubicación Reserva Sumaco - Napo - Galeras ................................................ 19 Tabla 5 Tiempo de muestreo ....................................................................................... 22 Tabla 6 Recolección de datos del muestreo ................................................................ 28 Tabla 8 Recuento de glóbulos blancos ........................................................................ 39 Tabla 9 Tabla de frecuencias de la presentación de glóbulos blancos ....................... 40 Tabla 10 Rangos de referencia y de resultados en Boa constrictor ............................ 41 xi UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR FACULTAD DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA CARRERA DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA “DETERMINACIÓN DE PRESENCIA DE HEMOPARÁSITOS EN SERPIENTES EN VIDA SILVESTRE, UBICADAS EN LAS RESERVAS COTA 70, COTACACHI CAYAPAS Y SUMACO NAPO GALERAS” Autora: Erika Margarita Medrano Tupiza Tutor: MVZ. Byron Puga Fecha: Mayo, 2015 RESUMEN El objetivo de esta investigación fue determinar la presencia o ausencia de hemoparásitos en serpientes de vida silvestre en las reservas Cota 70, Cotacachi – Cayapas y Sumaco – Napo – Galeras, ubicadas en el Ecuador continental. Las muestras de sangre se colectaron de la vena caudal o por punción cardiaca dependiendo del tamaño de la serpiente. Los frotis sanguíneos fueron secados, fijados con metanol y coloreados con solución Giemsa. Las muestras fueron examinadas al microscopio con un lente de aumento de 100x en búsqueda de hemoparásitos y con el fin de realizar el conteo de los glóbulos blancos de cada individuo. Se capturó un total de 14 individuos: 9 colúbridos (Dipsa elegans, Atractus dunni, Sibon nebulata, Mastigodryas heathii, Oxyrhopus petola digitalis, Atractus major, Oxyrhopus petolarius, Phrynonax polylepis, Mastigodryas pulchriceps), 3 boidos (Corallus hortolanus, 2 Boa constrictor), 1 vipérido (Bothrops asper) y 1 elápido (Micrurus surinamensis, surinamensis). Todas las muestras obtenidas dieron negativo a la presencia de hemoparásitos. En el conteo de glóbulos blancos se obtuvo alta presencia de linfocitos como patrón para la mayor parte de especies. Palabras claves: serpientes en vida silvestre / hemoparásitos / glóbulos blancos / linfocitos / Giemsa . xii ABSTRACT The objective of this study was to demonstrate presence or absence of haemoparasites in wildlife snakes in Cota 70 Reserve, Cotacachi Cayapas Ecological Reserve and Sumaco Napo Galeras National Park, located in continental Ecuador. Blood samples were collected by ventral tail venipuncture or cardiac puncture, depending on snake size. Blood smears were dried, fixed with methanol and stained with Giemsa solution. The slides were microscopically examined with 100x magnification looking for haemoparasites and to count white cells. There were captured 14 snakes: 9 colubrids (Dipsa elegans, Atractus dunni, Sibon nebulata, Mastigodryas heathii, Oxyrhopus petola digitalis, Atractus major, Oxyrhopus petolarius, Phrynonax polylepis, Mastigodryas pulchriceps), 3 boids (Corallus hortolanus, 2 Boa constrictor), 1 viper (Bothrops asper) and 1 elapid (Micrurus surinamensis, surinamensis). All samples tested negative for presence of blood parasites. Keyword: wildlife snakes / haemoparasites / white blood cells / lymphocyte / Giemsa 1 INTRODUCCIÓN La medicina en especies silvestres es relativamente nueva en el Ecuador, sin embargo, el interés en su práctica y aprendizaje ha ido creciendo en el país por lo que es necesario conocer más acerca de estos animales, sus características, las amenazas a las que se encuentran expuestos y su desarrollo con el entorno (Carrillo, 2005). Carillo y sus colaboradores, en base a criterios establecidos por la Unión Internacional para la Conservación de la Naturaleza (UICN), realizaron en el año 2005, la primera evaluación del estado de conservación de reptiles del Ecuador. Pese a que aún queda mucho por estudiar, respecto a las especies de reptiles en el país, se pudo establecer categorías para las especies reportadas. Así, los resultados fueron: 1 especie extinta en estado silvestre (EW), 9 especies en peligro crítico (CR), 41 especies en peligro (EN), 57 especies vulnerables (VU), 80 especies amenazadas (NT), 115 especies con baja preocupación (LC), 93 especies con datos insuficientes (DD), y 3 especies no evaluadas (NE) (Valencia, Toral, Morales, Betancourt & Barahona, 2008, p14-15). Según Carrillo y sus colaboradores (2005) en su obra “Lista Roja de Reptiles del Ecuador”, se presentan 16 especies de serpientes consideradas en peligro de extinción en el país, 21 especies vulnerables y 4 en situación casi crítica. Son varias las causas del incremento de especies en riesgo de desaparecer, y entre ellas se puede mencionar a las enfermedades, muchas de las cuales, han ganado espacio debido a la intervención del ser humano (Zamudio & Ramírez, 2007; Jacobson, 2007). En los últimos años se han hecho importantes hallazgos respecto a los ciclos de vida de los parásitos, con ello se ha obtenido información acerca de la bioseguridad que se debe tener para prevenir la transmisión de enfermedades (Erzinger, 2013). Dentro del género Hepatozoon, de la familia Hepatozoidea encontramos más de 50 especies de hemoparásitos intracelulares. Se presentan con frecuencia en grupos de 1 2 vertebrados y algunos invertebrados. Representantes de este género pueden parasitar leucocitos en aves y mamíferos (incluyendo perros y gatos), también glóbulos rojos en reptiles, anfibios y peces. Se considera que todos los animales vertebrados infectados con hemoparásitos son hospedadores intermediarios (Korzh & Zarodozhnyaya, 2013). Los hemoparásitos en serpientes, afectan al organismo de diferentes maneras: formación de quistes, en varios órganos del cuerpo incluyendo el hígado, bazo, riñón y cerebro, los cuales pueden contener depósitos de pigmento o se pueden rodear por células inflamatorias, variación de la hemoglobina, alteraciones de las proteínas del suero o del plasma y en casos de abundante infección o inmunosupresión se puede presentar anemia hemolítica, esto en hospedadores naturales, en los que los cambios mencionados son infrecuentes o nulos. En animales jóvenes, la presencia de hemoparásitos, sumada a situaciones de estrés u otras patologías, pueden conllevar a la muerte del individuo. En hospederos intermedios puede presentarse enfermedad inflamatoria significativa (Zamudio & Ramírez, 2007). Los resultados de éste trabajo serán de importancia por su originalidad, los datos obtenidos en esta investigación hacen referencia a una población no estudiada, que sentará precedentes para posteriores investigaciones. Se espera que se dé continuidad al estudio de serpientes de vida silvestre en el país, las poblaciones de estos animales ha disminuido considerablemente en los últimos años, y se requiere mayor atención de la comunidad científica para abordar tan preocupante situación. Los objetivos de este estudio fueron determinar la presencia o ausencia de hemoparásitos en serpientes en vida silvestre en las reservas naturales: Cota 70, Cotacachi – Cayapas y Sumaco – Napo – Galeras, la identificación del género al que pertenecen los mismos y correlacionar su presencia con factores ambientales y características de los individuos. 2 3 REVISIÓN DE LA LITERATURA Antecedentes Se han realizado varios estudios para la determinación de hemoparásitos en reptiles, la mayoría en cautiverio. En Portugal y Romania se encontraron Hemogregarinas en lagartijas y tortugas (Roca & Galdón, 2009; Mihalca, Racka, Gherman & Ionescu, 2008), en República Checa se determinó la presencia de Hepatozoon en pitones (Sloboda, Kamler, Bulantová, Votýpka & Modrý, 2007); en Louisiana, Lowichik & Yaeger (1987) describieron los aspectos ecológicos de serpientes infectadas con Haemogregarinas, en Panamá se determinó la prevalencia de hemoparásitos en lagartijas (Guerrero, Rodríguez & Ayala, 1974), en Colombia se evaluó a las serpientes del Centro de Atención y Valoración de fauna silvestre del área metropolitana del Valle de Aburrá (Zamudio & Ramírez, 2007). En Brasil se realizó un estudio de la prevalencia de Hepatozoon spp. en serpientes recién capturadas (O’Dwyer, Moço, Barrella, Vilela & Silva, 2003). En Ecuador, en el año 2011 un estudio realizado en la ciudad de Guayaquil demostró la presencia de Haemogregarina y Hepatozoon en iguanas que habitan el Parque histórico y el Parque Seminario (Balón, 2011). Generalidades “El suborden Serpentes, del orden Squamata, cuenta con aproximadamente 2500 especies. Este suborden incluye a su vez tres infraórdenes, con un total de dieciséis familias” (Orós, 2008). Ecuador cuenta con aproximadamente tres especies de reptiles por cada 2000 kilómetros cuadrados, lo que le convierte en el líder de la lista de los 10 países con mayor diversidad de reptiles tomando en cuenta su área. Los últimos registros muestran 445 especies de reptiles, que incluyen 31 especies de tortugas, 5 cocodrilos y caimanes, 3 anfisbénidos, 187 lagartijas y 219 culebras (Torres Carvajal, SalazarValenzuela, & Merino-Viteri, 2014). 3 4 Un reporte revelado por World Wildlife Fund – Australia, en 2003, estima que 89 millones de reptiles mueren cada año como resultado de la desaparición de la vegetación a gran escala en Queensland. Alrededor del mundo, se pierde un sinnúmero de reptiles debido a la destrucción de su hábitat. La colecta de serpientes para consumo humano y para el comercio de la piel y como animales de compañía, debe representar una amenaza menor al compararse con la destrucción del hábitat, sin embargo, puede ser significativa (Mullin & Seigel, 2009). Durante el último siglo, la construcción de carreteras ha afectado el hábitat de las serpientes, incluso, se ha visto afectada hasta el 20% de la superficie total de algunos países densamente poblados. Por esta razón, muchas poblaciones de serpientes son propensas a entrar en contacto con carreteras y se ven potencialmente inclinadas a ser afectadas por las mismas (Mullin & Seigel, 2009). Hemoparásitos La Parasitología es una ciencia interdisciplinaria que combina biología, medicina, farmacología y medicina animal en el estudio de los parásitos terrestres y acuáticos que causan enfermedades en humanos y animales. En los últimos años se han hecho importantes hallazgos respecto a los ciclos de vida de los parásitos y, más importante aún, acerca de su patogenicidad, fisiología, metabolismo, epidemiología y transmisión. Con ello se ha obtenido información acerca de la bioseguridad que se debe tener para prevenir la transmisión de dichas enfermedades (Erzinger, 2013). Ching-Hao Lai y Somasekar, citados por Erzinger (2013) definen al parásito como “un organismo que vive sobre o en un organismo hospedador y consigue su alimento de o a expensas de su hospedador”. La variabilidad morfológica y la alta diversidad de los hemoparásitos, no han sido bien reportadas como en hospedadores mamíferos y aves. Probablemente, está relacionado al gran tamaño de los eritrocitos de los reptiles y a la presencia de un núcleo prominente dentro de ellos, que puede influenciar fuertemente la aparición del parásito dentro de la célula (Telford, 2009). 4 5 Según Telford (2009), la diversidad de los hemoparásitos en reptiles es mayor que la de los mamíferos y aves tanto en género, como en especie, aunque las tres clases de tetrápodos son hospedadores de los mismos importantes grupos de parásitos unicelulares (ej. Plásmidos, hemogregarinas y tripanosómidos flagelados). La baja capacidad de los reptiles terrestres para diseminarse y sus restringidos o aislados hábitats son fuertes factores en el incremento de la diversidad taxonómica de sus parásitos, probablemente influenciados de manera considerable por la gran edad filética de los reptiles. Fue en la primera década del siglo XX, que los primeros parásitos de malaria en reptiles fueron reconocidos, sumándose a los reportados en humanos y aves dentro de los últimos 20 años (Telford, 2009). Hemogregarinas Las hemogregarinas son los hemoparásitos más comunes en reptiles, más ampliamente distribuidos y con mayor número de especies, e infecta a cada uno de los órdenes de reptiles vivientes. La mayor parte de especies de hemogregarinas fueron descritas como Haemogregarina antes de ser descubiertas, excepto por muy pocos estudios de hemogregarinas, que indican que el patrón esporogónico es esencial para la identificación de género y familia. Éstas incluyen muchas especies de hemococcidias que están lejanamente relacionadas con las hemogregarinas. Las hemococcidias utilizan invertebrados solamente para transmisión, a hospedadores vertebrados en los que se presentan las esporogonias (Telford, 2009). Haemogregarina Los gamontes ingeridos por una sanguijuela al alimentarse de un reptil infectado, sufren gametogénesis y la formación de esporogonias intracelulares dentro de las células del intestino de la sanguijuela (Telford, 2009). Durante la microgametogénesis se da la formación de cuatro microgametos aflagelados. La fecundación del macrogameto, por uno de los microgametos da lugar al cigoto, éste desarrolla un ooquiste carente de esporoquistes, un centro germinal 5 6 produce ocho esporozoitos, así, el oocisto es “monoesporoblástico”. En los tejidos externos de las sanguijuelas los esporozoitos producen merontes primarios que llegan a contener hasta 250 merozoitos. Estos merontes liberan merozoitos, la etapa infecciosa para el reptil, que se concentra cerca de la punta de la probioscis y espera a la siguiente vez que la sanguijuela se alimente de sangre, cuando los merozoitos entrarán en el sistema circulatorio del reptil. Los merozoitos forman merontes preeritrocíticos dentro de las células fijadas al pulmón, hígado y bazo, y producen alrededor de 18 merozoitos. Los merozoitoos entran en los eritrocitos y se convierten en premerontes que se dividen en ocho merozoitos eritrocíticos. En la ruptura de las células del hospedador, estos merozoitos invaden a los eritrocitos y forman más merontes eritricíticos o gametocitos (Telford, 2009). En 1995 Sidall, citado por Telford, reconoció 19 especies de Haemogregarina, todas en tortugas como hospedadores, otros dos géneros que parasitan a peces, Cyrillia y Desseria. El autor sugiere que todas las demás especies de Haemogregarinas s. l. descritas de serpientes, cocodrilos, lagartijas y aves deberían ser consideradas como especies de Hepatozoon (Telfod, 2009). 6 7 Hepatozoon Gráfico 1 Ciclo biológico de Hepatozoon aegyti dentro de serpientes y mosquitos (Culex pipiens). Los esporozoitos son inyectados mediante la inoculación del mosquito hembra y entran en los capilares pulmonares de la serpiente. 3 después del ingreso a las células endoteliales, crecen para convertirse en esquizontes (4), los cuales forman merozoitos(5). (6)Los merozoitos libres ingresan a otras células endoteliales, en donde se repite la formación de esquizontes (3) o ingresa a los eritrocitos y se convierte en gametocitos de diferentes sexos. 7,8. Después de la succión del mosquito, los gametocitos son liberados (7), migran al hemocoel y penetran las células del hospedador donde se asocian en pares, dentro de una vacuola parasitófora. 9. En el día dos después de la infección, ocurre la diferenciación entre macro y microgametos. 10. El núcleo del microgameto se divide. 11. Se da la formación los microgametos no flagelados, se da en el día 3 de la infección. 12, 13. La fertilización se da en el cuarto día después de la infección y el crecimiento del joven ooquiste en los días siguientes. 14. La formación del esporoblasto tiene lugar entre los días 8 y 10. 15. Formación de 15 a 75 esporoblastos, el núcleo de los cuales se divide un sinnúmero de veces. Luego el esporoblasto forma una pared lisa y se convierte en esporoquiste. 16. La formación de esporoquistes se ve interrumpida, lo que lleva a la distribución de esporozoitos en el interior del vector. La principal forma de infección es la mordedura. Fuente: Zamudio & Ramírez. 2007 Los primeros casos de reportes de parásitos leucocíticos y eritrocíticos se dieron en perros y ratones. Posteriormente, el género Hepatozoon fue establecido para parásitos intraleucocíticos cuando el ciclo biológico fue demostrado para roedores y ácaros. En el ácaro, la presencia de grandes oocistos conteniendo muchos esporocistos con esporozoitos formados, fueron el carácter genérico distintivo. Los ácaros infectados, ingeridos por ratas liberaron esporozoitos que ingresaron al sistema circulatorio del 7 8 roedor y formaron merozoitos dentro de las células del hígado, probablemente sólo en el endotelio en lugar de en las células del parénquima hepático. Sus merozoitos, después de varios ciclos dentro de las células hepáticas, invaden los leucocitos o eritrocitos, y los gamontes, en los cuales se desarrolló el estado infeccioso para los ácaros (Telford, 2009). La presencia de Hepatozoon en reptiles no fue demostrada hasta que Hoare en 1932 describió al esporogonio de H. pettiti en moscas tsetse alimentadas de cocodrilos del Nilo infectados. En 1967, se identifica a Hepatozoon rarefaciens en serpientes en México, con una prueba de identidad del ciclo de vida de Hepatozoon. A partir de 1967 un patrón esporogónico carácterísitica del Hepatozoon se ha reportado para otras 23 especies de hemogregarinas (Telford, 2009). La mayoría de ciclos de vida de Hepatozoon de especies de reptiles han sido estudiados usualmente usando, de manera experimental, mosquitos de colonias de laboratorio de varias especies de Culex y Aedes, y raramente, de Anopheles. Aparentemente hay ocho especies de vectores que han sido encontrados naturalmente infectados por oocystos y esporocistos de Hepatozoon de origen reptiliano: la mosca tsetse Golssina palpalis; las garrapatas Amblyomma dissimile y Hyalomma cf. aegyptum; los ácaros Ophionyssus sp. y Hirstiella sp.; los redúvidos Triatoma arthurneivae y Triatoma rubrovaria; y el flebótomo Lutzomyia vexator occidentis, estas especies de Hepatozoon son infecciosas para serpientes y lagartos (Telford, 2009). El patrón del ciclo de vida de las especies de Hepatozoon en reptiles, puede ser descrito de la siguiente manera, teniendo en cuenta que existen desviaciones del patrón para algunas especies, en particular, para aquellas especies que requieren dos hospedadores vertebrados en su ciclo de vida: en las especies H. domerguei, H. sipedon, H. sirtalis, está demostrado que la transmisión al segundo, al hospedador final vertebrado, se da por la ingestión de un hospedador invertebrado infectivo. Estudios de laboratorio han demostrado claramente que muchas especies de Hepatozoon, particularmente de serpientes, son capaces de infectar al hospedador 8 9 vertebrado directamente desde el invertebrado en el que ha ocurrido la esporogonia. Se cree que requeriría la ingestión, ya sea desde la ingestión de un primer hospedador vertebrado infectado o de la ingestión de invertebrados infectados. La mera presencia de quistes monozoicos y dizoicos de Hepatozoon en el tejido de un vertebrado, por sí sola, no es evidencia de que el rol de estos quistes es el de transmitir el parásito al hospedador final vertebrado. Por lo general, estos quistes se encuentran en el hígado y en los pulmones de serpientes que no forman parte de la cadena alimenticia de otras especies de serpientes. Su papel, de hecho, puede proporcionar la continuidad de la infección de la serpiente por la conversión de merontes, cuando las rondas iniciales de la merogonia en los tejidos de las serpientes después de haber terminado la infección, puramente en una parasitemia eritrocítica de gametocitos maduros, disminuyendo en intensidad gradualmente. Su función también puede ser una defensa en contra de la inmunidad, si es que hay una respuesta dirigida a la infección eritrocítica. La historia de vida típica de especies de Hepatozoon estudiadas con el uso experimental de mosquitos como vectores, empieza rápidamente después de la ingestión de gametocitos eritrocíticos en la sangre ingerida. Macro y microgametocitos dejan las células de su hospedador y penetran la pared intestinal, ingresando al hemocoel, en donde el emparejamiento de cromosomas; probablemente la gametogénesis, dentro de las células grasas del hemocoel, produce de dos a cuatro microgametos biflagelados, una de las cuales fertiliza el microgameto; y se forma el cigoto. El cigoto se convierte en un ooquiste que contiene múltiples centros germinales (poliesporoquistes) que forman esporoquistes, que a su vez producen esporozoitos en un rango entre 4 a 50 o más, variando de acuerdo a la especie de Hepatozoon. Los ooquistes pueden formarse en el hemocoel del abdomen y el tórax, o dentro de la cabeza, a mientras algunas especies no muestran preferencia por un sitio, se desarrollan en las tres localizaciones, otros pueden estar restringidos a una porción particular del cuerpo del vector (Telford, 2009). 9 10 Hematología de los reptiles La morfología celular de la sangre de reptiles, especialmente de los granulocitos reptilianos (heterófilos, eosinófilos y basófilos) y los glóbulos rojos, difieren mucho de los presentes en mamíferos (Reagan & Irizarry, 2008). Morfología normal de las células rojas de la sangre de los reptiles Las células sanguíneas rojas maduras y sanas son elípticas con un núcleo oval, liso con mínimas irregularidades en las membranas nucleares, y cromatina nuclear que se tiñe de coloración obscura. El tamaño varía entre 13 y 25 μm dependiendo de la especie de reptil, la coloración del citoplasma es homogénea de rosada a naranja – roja a causa de la hemoglobina (Reagan & Irizarry, 2008). El núcleo es pequeño, homogéneo, azul, rodeado de inclusiones citoplasmáticas en las células rojas de individuos saludables. Un bajo número de policromatófilos puede ocurrir en reptiles saludables, sobre todo en aquellos que se encuentran en proceso de muda (Reagan & Irizarry, 2008). Morfología normal de las células blancas de la sangre de los reptiles Tabla 1 Valores sanguíneos en Boa (Constrictor constrictor) y Pitón Real (Python regius) Hematología Eritrocitos (x106/μl) Hematocrito (%) Leucocitos (x103/μl) Neutrófilos (%) Heterófilos (%) Linfocitos (%) Monocitos (%) Eosinófilos (%) Basófilos (%) Constrictor constrictor 1,0 – 2,5 24 – 40 4 – 10 Python regius 6 – 12 25 – 40 6 – 12 0 – 15 20 – 50 10 – 60 0–3 0–3 0 – 20 0 – 20 20 – 60 10 – 60 0–3 0–3 0 – 10 Fuente: Martínez, 2007. Hematología y bioquímica en reptiles 10 11 Heterófilos Los heterófilos de la mayoría de los reptiles poseen citoplasma que contiene numeroso gránulos alargados, generalmente ovales o en forma de huso, de color naranja a marrón rojizo, que pueden obscurecer el núcleo parcialmente. El tamaño de los heterófilos varía con la especie de reptil y puede ir de 10 a 23 um de diámetro. En cocodrilianos, quelonios y serpientes, el núcleo de los heterófilos maduros está rodeado por una sombra ovalada (Reagan & Irizarry, 2008). Incremento de los heterófilos -Fisiológico: Estacional (valores máximos en verano y más bajos durante la hibernación) (Martínez, Lavin & Cuenca, 2011). -Patológico: Los heterófilos, son principalmente células fagocitarias y por tanto, incrementos significativos en su recuento, se asocian con enfermedades inflamatorias, especialmente infecciosas o que supongan un daño tisular. Ello se ha descrito en la infección o inflamación hepática, renal, en la inflamación aguda hepática o en la enfermedad renal aguda. Las causas no inflamatorias de la heterofilia también son el estrés (exceso de glucocorticoides) y la presencia de neoplasias (Martínez et al. 2011). Disminución de los heterófilos Se ha observado asociada a infección viral así como tras la administración de fenbendazol en la tortuga Testudo hermanni (Martínez et al. 2011). Linfocitos En animales saludables, los linfocitos son morfológicamente similares a los de los mamíferos. Su tamaño puede variar de 5 a 15 um de diámetro. En una misma muestra pueden encontrarse linfocitos pequeños y grandes. Los linfocitos tienen núcleo único, de localización excéntrica, escaso citoplasma de azul pálido a azul, y alta cantidad de citoplasma nuclear. Estas células pueden ser confundidas con trombocitos y glóbulos rojos inmaduros. Los trombocitos son típicamente ovales, tienen citoplasma de muy pálido a no coloreado y tienden a aglutinarse fácilmente en frotis sanguíneos. Los 11 12 eritrocitos inmaduros redondeados pueden confundirse con los linfocitos (Reagan & Irizarry, 2008). Incremento de linfocitos -Fisiológico: A parte de las variaciones fisiológicas observadas en función del sexo y de la especie, se han observado un incremento del valor de los linfocitos asociado a una edad mayor en tortugas marinas de la especie Caretta caretta (Martínez et al. 2011). -Patológico: Se describe asociado a inflamación, infecciones parasitarias y víricas y neoplasia como la leucemia, así como a situaciones de cicatrización de heridas. La presencia de linfocitos reactivos, con un volumen citoplasmático aumentado y mayor grado de basofilia citoplasmática, sugiere una estimulación del sistema inmune por la presencia de antígenos sistémicos (Martínez et al. 2011). Disminución de linfocitos Se produce de forma secundaria a la presencia de enfermedades asociadas con la inmunosupresión, el estrés y la malnutrición crónica (Martínez et al. 2011). Monocitos Los monocitos de la mayoría de reptiles son similares a los de los mamíferos. Sin embargo, algunos monocitos de reptiles pueden tener una fina granulación rosada del citoplasma similar a polvo. Estas células se conocen como azurófilos o monocitos azurofílicos. Los monocitos son células mononucleares, las más grandes dentro del grupo, poseen gran cantidad de, de citoplasma de color azul a gris azulado. Poseen núcleos ovales a redondos, ocasionalmente dentados o en forma de U. por lo general, los monocitos son células alargadas, tienen menor concentración de cromatina que los linfocitos, pueden tener pocas vacuolas citoplamáticas claras (Reagan & Irizarry, 2008). Incremento de monocitos -Fisiológico: Incremento hibernal – Boa constrictor Edad avanzada – tortuga marina Caretta caretta. 12 13 -Patológico: Enfermedad inflamatoria – estomatitis y nefritis crónica, hepatitis eritro y la leucofagocitosis, pueden ser asociadas con anemia y a la presencia de enfermedades infecciosas (Martínez et al. 2011). Eosinófilos Los eosinófilos tienen citoplasma de incoloro a azul pálido que contiene numerosos gránulos citoplasmáticos redondos, brillantes, de color rosado a rojo anaranjado. El tamaño de los eosinófilos varía de acuerdo a las especie de reptil y se encuentra en un rango aproximado entre 9um y 20 um de diámetro. El núcleo puede ser de redondo, oval a ligeramente dentado. Los eosinófilos con gránulos de rojo anaranjado a rosado pueden ser diferenciados de los heterófilos en la misma muestra sanguínea por la forma (generalmente redonda en los eosinófilos) o por el color (más intenso y brillante en los eosinófilos) de los gránulos (Reagan & Irizarry, 2008). Incremento de eosinófilos -Fisiológico: Normalmente más elevado durante la hibernación. -Patológico: Asociados con infecciones parasitarias y la estimulación del sistema inmune. En aligator, se ha observado un incremento ligado a la presencia de sanguijuelas (Placobdella) (Martínez et al. 2011). Disminución de eosinófilos Relacionado con la estivación. Basófilos Los basófilos son células numerosas con gránulos citoplasmáticos de color violeta obscuro o púrpura que son generalmente redondos y pequeños. El tamaño varía entre 7 y 20 um de diámetro. El citoplasma de los basófilos de los reptiles puede aparecer vacuolado o espumoso; sin embargo, pocos gránulos violeta obscuro estarán presentes y puede ser fácil localizarlos sobre el núcleo (Reagan & Irizarry, 2008). 13 14 Incremento de basófilos -Fisiológico: Es normal encontrar un valor alto en las tortugas Trachemys o Chelidra serpentina. Se ha descrito un incremento significativo durante el invierno en los viperinos africanos (Cerastes cerastes y Cerastes vipera). -Patológico: En relación con la presencia de infecciones parasitarias (básicamente parásitos intestinales y ocasionalmente hemoparásitos) e infecciones virales (Martínez et al. 2011). Azurófilos Llamados también granulocitos azurofílicos o, granulocitos neutrófilos. Los escasos azurófilos presentes en quelonios se han denominado también neutrófilos o azurófilos neutrofílicos. Son células de forma irregular, de tamaño menor que el monocito. Poseen núcleo no segmentado y de redondo a oval de forma irregular. El citoplasma es basofílico, de coloración que va de azul a lavando y más oscuro que el monocito; y se encuentra un número pequeño de gránulos azurofílicos mate, de varios tamaños. En el citoplasma puede aparecer vacuolización y material fagocitado (Martínez et al. 2011). Los monocitos y los azurófilos son células del mismo tipo según algunos autores o de distinto tipo según otros (Martínez et al. 2011). Esta célula es más común en el suborden de las serpientes (Martínez et al. 2011). Son células fagocíticas de morfología semejante a la del monocito, y puede desencadenar un daño oxidativo importante, como sucede con los neutrófilos en el ser humano (Martínez et al. 2011). Incremento de los azurófilos -Patológico: Asociado a inflamación, infección y parasitismo. Existe evidencia de azurofilia en lagartos parasitados con el hemoprotozoo Karyolysus y en serpientes con Hepatozoon, posiblemente relacionada con la respuesta inflamatoria frente a los parásitos (Martínez et al. 2011). 14 15 Trombocitos Los trombocitos son células pequeñas, elípticas o fusiformes, de núcleo ovalado y de ubicación central. Su citoplasma es casi transparente, lo que ayuda a diferenciarlos de los linfocitos pequeños. Por lo general tienden a formar agregados. En algunos, puede aparecer el borde citoplasmático poco definido, en serpientes. Probablemente se deba a la edad o a artefactos (Martínez et al. 2011). Los trombocitos son de suma importancia en la formación del trombo, en la coagulación de la sangre y la cicatrización de heridas. Son células con múltiples funciones, así, podrían ser capaces de transportar oxígeno bajo condiciones de anemia, sustituyendo la demanda dada por pérdida de eritrocitos. Bajo ciertas condiciones y ante ciertos agentes quimiotácticos podrían tener capacidad fagocitaria (Martínez et al. 2011). Disminución de trombocitos -Fisiológico: Se ha descrito en invierno en la serpiente Boa constrictor (Martínez et al. 2011). Inclusiones y parásitos de los glóbulos blancos Las inclusiones en los leucocitos reptilianos son hallazgos infrecuentes. Las inclusiones son típicas de origen infeccioso e incluyen bacterias, virus o protozoos. Bacterias en los leucocitos indican severa sepsis o bacteremia y requiere atención inmediata. Las bacterias pueden aparecer dentro de los heterófillos y monocitos. Las inclusiones virales pueden ser causadas por poxvirus e iridovirus. Los protozoos incluyen Saurocytozoon sp., Schellackia sp., y otros. Los linfocitos, monocitos y heterófilos pueden ser afectados (Reagan & Irizarry, 2008). 15 16 MATERIALES Y MÉTODOS Área de estudio El estudio se realizó en tres reservas naturales del Ecuador: Reserva Cota 70 (Portoviejo, provincia de Manabí), Reserva Sumaco Napo Galeras (Napo, provincia de Tena), Reserva Cotacachi Cayapas (Cotacachi, provincia de Imbabura). Reserva Cota 70 Ubicada en la provincia de Manabí en la ciudad de Portoviejo, tras el Jardín Botánico perteneciente a la Universidad Técnica de Manabí Reserva Cota 70 Gráfico 2 Mapa Reserva Cota 70 Fuente: Google maps, 2015 16 17 Tabla 2 Ubicación Reserva Cota 70 Provincia Manabí Cantón Portoviejo Ciudad Portoviejo Sitio Reserva Cota 70 Altitud 53 msnm (promedio) Latitud N 1° 2’ 45.149 Longitud W 80° 27’ 36.081 Fuente: Ecuador-Ministerio del Ambiente, 2014 Elaboración: La autora El clima de la ciudad corresponde a la Región Costa situada en una zona climática lluviosa y tropical, teniendo una temperatura promedio de 22.9°C y un volumen de precipitaciones de 3000 a 4000mm anuales. En la reserva hay guatusas, loros, pericos, ardillas, serpientes, iguanas y otros animales que han sido rescatados o donados por sus dueños al no poder continuar manteniéndolos. Todos se encuentran en libertad. Reserva Ecológica Cotacachi – Cayapas Gráfico 3 Mapa de la Reserva Cotacachi - Cayapas Fuente: www.viajandox.com, 2014 17 18 Tabla 3 Ubicación Reserva Cotacachi - Cayapas Provincia Imbabura Cantón Cotacachi Ciudad Cotacachi Sitio Reserva Cotacachi – Cayapas Altitud 1601 - 4939 msnm Latitud N 0° 33’ 9.046” Longitud W 78° 36’ 41.399” Fuente: Ecuador – Ministerio del Ambiente, 2014 Elaboración: La autora La información del cuadro hace referencia únicamente al lugar que se tomó en cuenta para la realización del muestreo. Según datos del Ministerio del Ambiente del Ecuador, la Reserva Ecológica Cotacachi – Cayapas está ubicada en las provincias de Esmeraldas (Cantones: San Lorenzo, Eloy Alfaro y Río Verde) e Imbabura (Cantones: Cotacachi, Urcuquí e Ibarra) y comprende un extensión de 243638 hectáreas. La Reserva incluye páramos muy ondulados atravesados por ríos y riachuelos rocosos, con extensas áreas de ciénega y decenas de lagunas de tamaño variable ubicadas en zonas mal drenadas. Más al occidente, el terreno desciende bruscamente hacia las extensas llanuras de la costa por una serie de subcordilleras y cuchillas. La temperatura oscila entre los 4 y 24 °C y se presentan entre 1000 y 5000 mm de precipitaciones. La vegetación presente en la reserva comprende: bosque siempreverde de tierras bajas, bosque siempreverde piemontano, bosque siempreverde montano bajo, bosque de neblina montano, bosque siempreverde montano alto, páramo herbáceo y gelidofitia. Se han registrado 139 especies de mamíferos, 500 y 600 especies de aves, y la herpetofauna 235 especies, de las cuales 124 pertenecen a anfibios y 111 a reptiles. (MAE, 2014) 18 19 Reserva Sumaco – Napo – Galeras Gráfico 4 Mapa de la Reserva Sumaco - Napo - Galeras Fuente: especiales.elcomercio.com, 2014 Tabla 4 Ubicación Reserva Sumaco - Napo - Galeras Provincia Napo - Orellana Cantón Cotacachi Ciudad Cotacachi Sitio Reserva Sumaco – Napo – Galeras Altitud 500 - 3732 msnm Latitud S 0° 21’ 57.27” Longitud W 77° 28’ 12.709” Fuente: Ecuador – Ministerio del Ambiente, 2014 Elaboración: La autora La Reserva Sumaco – Napo – Galeras se encuentra al nororiente de Ecuador, entre las provincias de Napo y Orellana, tiene una extensión de 205249 hectáreas, que 19 20 comprenden: la zona del volcán Sumaco y sus áreas adyacentes (190 562 ha) y la zona de la Cordillera de Galeras (14 687 ha). La temperatura varía entre 6–8 °C y 3 400– 3 732 msnm, mientras que en elevaciones menores a los 600 msnm la temperatura alcanza 24 °C. Las investigaciones en el Parque son limitadas y no existen evaluaciones completas de la diversidad biológica del área (Freile y Santander 2005; citados por MAE, 2014). Sin embargo, la biogeografía del Sumaco, la variedad de pisos altitudinales, los nichos ecológicos y hábitats, permiten la concentración de fauna tanto de los trópicos húmedos de la Amazonía como de la vertiente oriental de los Andes, explicándose así la gran riqueza faunística (Valarezo et al. 2002; citado por MAE, 2014). Por otro lado, el cono volcánico del Sumaco constituye una isla ecológica de los bosques montanos, es decir, es una zona que presenta fauna endémica (Valarezo et al. 2002; citado por MAE, 2014). Materiales Suministros de oficina Computadora portátil Libreta de apuntes Impresora Internet Papel para impresora 75g Materiales físicos Toma de muestra Microtubos heparinizados Jeringuillas de 1 y 3 ml Placas portaobjetos 20 21 Guantes de látex Linterna y pilas Recipientes plásticos Algodón Procesamiento de muestras Placas cubreobjetos Guantes de látex Material de limpieza Materiales químicos Toma de muestras Metanol 95%. Poole – Inglaterra. BOH Chemicals. Producto No. 29192. Procesamiento de muestras Colorante Giemsa. Solarbio. Producto No. G8220 Equipos Microscopio binocular Leitz. Modelo HM-LUX. No. 736869 Técnicas y recolección de la información La presente investigación se realizó en dos etapas: fase de campo y fase de laboratorio. 21 22 Fase de campo La fase de campo se realizó mediante la captura, sujeción y muestreo de las serpientes. Captura Se realizó la búsqueda de los especímenes dentro de las reservas Cotacachi-Cayapas, Sumaco-Napo-Galeras y Cota 70, tanto en la zona antropizada, como en la zona no antropizada. El muestreo fue realizado cubriendo el mayor número de horas posible a lo largo del día, así: de 5h00 a 14h00 y de 17h00 a 2h00, con el fin de cubrir los posibles horarios en los cuales se podrían hallar a los individuos, entre los meses de diciembre a abril (Tabla 5). Tabla 5 Tiempo de muestreo FECHA N° DE HORAS 06/12/2014 12 07/12/2014 16 08/12/2014 16 13/12/2014 14 14/12/2014 16 15/12/2014 16 16/12/2014 16 17/12/2014 10 18/12/2014 10 19/12/2014 14 20/12/2014 12 21/12/2014 14 22/12/2014 14 23/12/2014 14 24/12/2014 10 25/12/2014 12 10/01/2015 10 11/01/2015 12 12/01/2015 12 13/01/2015 10 14/01/2015 14 15/01/2015 12 16/01/2015 10 07/02/2015 14 08/02/2015 12 22 LUGAR Muestreo Reserva SNG Muestreo Reserva SNG Muestreo Reserva SNG Muestreo Reserva SNG Muestreo Reserva SNG Muestreo Reserva SNG Muestreo Reserva SNG Muestreo Reserva SNG Muestreo Reserva CC Muestreo Reserva CC Muestreo Reserva CC Muestreo Reserva CC Muestreo Reserva CC Muestreo Reserva CC Muestreo Reserva CC Muestreo Reserva CC Muestreo Reserva CC Muestreo Reserva CC Muestreo Reserva CC Muestreo Reserva CC Muestreo Reserva CC Muestreo Reserva CC Muestreo Reserva CC Muestreo Reserva SNG Muestreo Reserva SNG 23 20/02/2015 21/02/2015 22/02/2015 06/03/2015 07/03/2015 08/03/2015 21/03/2015 22/03/2015 23/03/2015 03/04/2015 04/04/2015 05/04/2015 10/04/2015 11/04/2015 12/04/2015 13/04/2015 14/04/2015 10 10 8 12 11 9 14 12 13 12 12 10 10 12 12 14 10 Muestreo Reserva Cota 70 Muestreo Reserva Cota 70 Muestreo Reserva Cota 70 Muestreo Reserva CC Muestreo Reserva CC Muestreo Reserva CC Muestreo Reserva Cota 70 Muestreo Reserva Cota 70 Muestreo Reserva Cota 70 Muestreo Reserva Cota 70 Muestreo Reserva Cota 70 Muestreo Reserva Cota 70 Muestreo Reserva Cota 70 Muestreo Reserva Cota 70 Muestreo Reserva Cota 70 Muestreo Reserva Cota 70 Muestreo Reserva Cota 70 Fuente: La autora Elaboración: La autora En la medida de lo posible se aplicó la utilización de transectos para el muestreo, como se indica en la siguiente gráfica. Gráfico 5 Diagrama de muestreo en transectos Fuente: La autora Elaboración: La autora Cada transecto fue repasado cuatro veces, realizando una búsqueda minuciosa, que puso énfasis en las zonas con hojas secas, troncos viejos, árboles caídos, en ramas de árboles, en orificios en el suelo. Después de la captura, los animales que fueron encontrados en zonas antropizadas se transportaron en bolsas de tela hasta el sitio en el cual se tomó la muestra; mientras 23 24 que en zonas no antropizadas, las muestras se colectaron en el mismo sitio en donde fue hallado el animal. Sujeción y muestreo Al encontrar a un animal, se procedió a la manipulación de manera directa en caso de culebras pequeñas; con la ayuda de bastones al tratarse de boas y mediante la ayuda de un gancho herpetológico, para las venenosas. Una vez realizada la captura se procedió a medir, pesar e identificar a los individuos. Un ayudante realizó la contención del individuo, sujetando la cabeza lejos de la persona que tomó la muestra sanguínea. Mientras el ayudante contuvo con un lazo el cuello o la parte anterior del animal, la persona encargada de tomar la muestra sujetó la cola del animal y la estiró. Para la extracción de la muestra de sangre se procedió a realizar punción con jeringuilla heparinizada, el sitio de punción| difirió de acuerdo al tipo de ofidio encontrado: en boidos , la muestra se obtuvo de la vena caudal, así, se tomó con una mano la cola, y con la otra la jeringa con la aguja montada y la misma se introdujo en la extremidad caudal, por detrás de la cloaca, en forma recta hasta que la aguja tocó el hueso, se retiró levemente la aguja y ejerciendo tracción sobre el émbolo se obtuvo la muestra. Cuando los individuos encontrados, fueron colúbridos o vipéridos pequeños, la muestra se obtuvo mediante cardiocentesis, es decir, se ubicó el corazón de la serpiente en el tercio medio ventral del cuerpo, se lo sujetó entre dos dedos y se introdujo la aguja de la jeringuilla en el lugar en el que se observaron los latidos y se procedió a tomar la muestra. Las técnicas mencionadas brindaron mayores garantías, en lo que corresponde a seguridad para el operador, rapidez en la ejecución y bajo riesgo para la integridad del animal, por lo que se considera fueron las adecuadas para la aplicación en esta investigación. La muestra se colectó en tubos heparinizados debidamente identificados. 24 25 Se realizaron frotis sanguíneos y se fijaron con metanol inmediatamente después de la colección, durante cuatro minutos. Se tomaron los datos de identificación del animal y posteriormente fue liberado en el mismo entorno para no causar un impacto negativo en la zona, o en zonas no antropizadas cuando se trató de animales capturaos en sectores antropizados. Fase de laboratorio Una vez que las muestras se transportaron al laboratorio fueron procesadas, se pasó a teñir las placas ya fijadas, mediante la Tinción Giemsa. Tinción de Giemsa Se realiza el frotis sanguíneo y se deja secar deja secar la placa. Se fija con metanol durante tres minutos. Se tiñe con colorante Giemsa al 10% durante cuatro minutos. Se lava con agua durante cuatro minutos. Se deja secar al aire libre y se observa al microscopio con aumento de 100X. (O’Dwyer et al. 2003) Posteriormente se realizó el contaje de células sanguíneas y la búsqueda e identificación de hemoparásitos. Análisis de datos Una vez obtenida la muestra, identificada y contabilizada se digitalizaron los datos. Estos fueron guardados en una base electrónica utilizando Microsoft Excel 2010, realizando las tablas dinámicas y los gráficos correspondientes. 25 26 RESULTADOS Y DISCUSIÓN En total se capturaron 14 serpientes de diversas especies: 6 en la reserva Sumaco – Napo – Galeras, 5 en la reserva Cotacachi – Cayapas y 3 en la reserva Cota 70. Dentro de la muestra capturada el 28,57% correspondió a machos, mientras que el 71,43% restantes fueron hembras. Las 14 muestras tomadas, arrojaron resultados negativos, no se evidenció la presencia de hemoparásitos en las células sanguíneas de los individuos capturados. Tampoco se encontraron vectores (garrapatas, mosquitos) sobre los individuos hallados en el muestreo (Ver Tabla 6). La mayor parte de especímenes encontrados en campo, pertenecen a la familia Colubridae, dato que coincide con la investigación de Moreno y Bolaños realizada en 1977, en dicho estudio, de los 28 ejemplares de colúbridos ninguno se encontró parasitado. El estudio realizado por Moreno y Bolaños evidencia también que las garrapatas encontradas en las serpientes, luego de un análisis histopatológico, demostró que la totalidad de dichos animales fueron positivos a la presencia de hemoparásitos de la familia Haemogregarinidae (Moreno & Bolaños, 1977). Balón (2011) en su estudio realizado en iguanas verdes, en la ciudad de Guayaquil, arroja resultados positivos que asocia a la fuerte presencia de garrapatas en el cuerpo de los reptiles muestreados. Fueron encontradas dos especies de garrapatas Amblyomma dissimile y Amblyomma scutatum, de relevancia para el estudio, pues, ambas especies identificadas pueden parasitar animales silvestres, domésticos y al ser humano, y toman importancia al ser parásitos hematófagos y vectores de enfermedades enzoóticas y zoonóticas. Jacobson (2007), en su obra titulada “Infectious deseases and pathology of reptiles” menciona que se cree que, para la transmisión de Haemoproteus (especie de hemoparásito que infecta a las serpientes) se requiere de la presencia de un vector 26 27 natural, como es el caso reportado de la mosca Crhysops, para la transmisión de Haemoproteus metchnikovi. Cortez (2014) en su estudio “Perfil hemático y presencia de hemoparásitos, en reptiles del Parque Zoológico Nacional, El Salvador”, pudo observar ocho individuos con ectoparásitos, sin embargo, respecto a la aparición de hemoparásitos, únicamente cuatro individuos arrojaron resultados positivos a la presencia de Hepatozoon sp. Así, se evidencia que, aunque no todas las serpientes que presentaban ectoparásitos dieron positivo a hemoparásitos, si se dio el caso contrario, los cuatro individuos afectados con hemoparásitos también evidenciaron la presencia de ectoparásitos. Lo que corrobora lo ya mencionado por Jacobson (2007), que los hemoparásitos protozoarios requieren de la presencia de invertebrados como vectores para su transmisión, entre ellos los artrópodos y los anélidos. En un estudio realizado por Sloboda et al. (2007) mediante la parasitación experimental de serpientes Phyton regius, Boa constrictor y Lamprophis fuliginosus con mosquitos, los resultados positivos para la presencia de hemoparásitos fueron de 78,2%. En los individuos sometidos al estudio, se observó infestación con la garrapata Aponomma latum en el 90,9% de las serpientes de la especie Phyton regius. En dicha investigación, fueron dos los ectoparásitos que propiciaron la infección con hemoparásitos: los mosquitos y las garrapatas. 27 28 Tabla 6 Recolección de datos del muestreo Lugar Reserva Cotacachi Cayapas Zona Antropizada No antropizada Antropizada Reserva Sumaco Napo Galeras Reserva Cota 70 No antropizada No antropizada Datos de los individuos Peso Tamaño Sexo (gr) (cm) # Fecha y hora Especie 2 22/12/14 Dipsa elegans H 32 3 23/12/14 Atractus dunni M 4 24/12/14 Sibon nebulata 14 25/04/15 10 Resultados Microhábitat Vector Hemoparásitos 73,5 Camino N N 6 22,1 Tronco en descomposición N N H 23 60 Camino N N Mastigodryas pulchriceps H 12 46,4 Camino N N 10/03/15 Mastigodryas heathii M 94 103 Matorral N N 1 18/12/14 Oxyrhopus petola digitalis H 52 81 Camino N N 6 12/01/15 Atractus major M 19 40,2 Camino N N 8 12/01/15 Oxyrhopus petolarius H 36 76,5 Camino N N 5 11/01/15 Micrurus surinamensis surinamensis M 11 31 Hojarasca N N 7 12/01/15 Phrynonax polylepis H 21 58,8 Camino N N 9 24/01/15 Corallus hortulanus H 533 141 Matorral N N 11 11/04/15 Boa constrictor H 790 157,5 Ramas N N 12 18/04/15 Boa constrictor H 1685 182,5 Piso N N 13 18/04/15 Bothrops asper H 735 148 Ramas N N #: Número de identificación del individuo N: Resultado negativo/No presencia Elaboración: La autora Fuente: La autora 28 29 CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES CONCLUSIONES Terminada la investigación se concluye que después de la captura de 14 serpientes en vida silvestre en las reservas Cota 70, Cotacachi – Cayapas y Sumaco – Napo – Galeras, mediante la aplicación de tinción de Giemsa para la búsqueda de hemoparásitos, los resultados fueron negativos. No se encontraron hemoparásitos en las placas teñidas. Ante el examen por observación directa, no se encontraron posibles vectores transmisores de hemoparásitos en los individuos capturados, posiblemente debido a que la mayor parte de individuos pertenecía a la familia Colubridae, lo que parece influir debido al escaso espacio existente entre las escamas de los colúbridos, en donde por lo general, se ubican los ectoparásitos. RECOMENDACIONES Se recomienda realizar el estudio comparativo mediante el uso de otras técnicas de captura, técnicas de detección de hemoparásitos más avanzadas y en un periodo de tiempo lineal. Se considera al Ecuador como un país megadiverso, por su riqueza en flora y fauna silvestre, por lo que se debería incrementar el número de investigaciones en el ámbito de la vida silvestre, recopilar datos, abrir campos de investigación. Sin embargo, dichos datos no significarían nada guardados, por lo que cabe recomendar que se publiquen las investigaciones realizadas y las que se realizarán. 29 30 REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS Balón, J. (2011). Detección del género Haemogregarina y Hepatozoon en las especies Iguana iguana en el Parque Histórico y en el Parque Seminario de la ciudad de Guayaquil. Universidad de Guayaquil, Guayaquil, Ecuador. Carrillo, E., Aldás, S., Altamirano, M, Ayala, F., Cisneros, D., Endara, A., Márquez, C., Morales, M., Nogales, F., Salvador, P., Torres M. L., Valencia, J., Villamarin, F., Yánez, M, Zarate, P. (2005). Lista roja de los reptiles del Ecuador. Quito, Ecuador. Novum Milenium Erzinger, G. (Ed.). (2013) Parasites: Ecology, diseases and management. New York: Nova Science Publishers, Inc. Guerrero, S. Rodríguez, C., & Ayala, S. Prevalencia de Hemoparásitos en Lagartijas de la Isla Barro Colorado, Panamá. (1974). The Journal of Parasitology, 9 (2), 118 – 123. Jacobson, Elliott R. (2007). 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Resultados del hemograma Gráfico 13 Acidófilo Gráfico 12 Heterófilo Fuente: La autora Fuente: La autora Gráfico 15 Heterófilos (2), monocito Gráfico 14 Linfocito Fuente: La autora Fuente: La autora Gráfico 16 Monocito Gráfico 17 Trombocitos Fuente: La autora Fuente: La autora 36 37 Anexo D. Individuos hallados en el muestreo Gráfico 18 Atractus major Gráfico 19 Oxyrhopus petolarius Fuente: La autora Gráfico 20 Oxyrhopus petola digitalis Fuente: La autora Gráfico 21 Atractus dunni Fuente: La autora Fuente: La autora Gráfico 23 Dipsa elegans Gráfico 22 Sibon nebulata Fuente: La autora 37 Fuente: La autora 38 Gráfico 24 Phynonax polylepis Gráfico 25 Boa constrictor constrictor Fuente: La autora Gráfico 26 Micrurus surimanesis surinamensis Fuente: La autora Gráfico 27 Mastigodryas pulchriceps Fuente: La autora 38 Fuente: La autora 39 Anexo E. Recuento de glóbulos blancos Tabla 7 Recuento de glóbulos blancos Especie Dipsa Atractus Sibon Mastigodryas elegans dunni nebulata heathii GB (%) Heterófilos Eosinófilos Basófilos Linfocitos Monocitos Azurófilos 50 0 0 42 8 0 39 1 0 51 9 0 23 1 0 73 3 0 41 0 0 55 4 0 Oxyrhopus Micrurus Atractus Oxyrhopus Phrynonax Corallus Boa Boa Bothrops Mastigodryas petola surinamensis pulchriceps major petolarius polylepis hortulanus constrictor constrictor asper digitalis surinamensis 38 0 0 56 6 0 15 0 0 83 2 0 41 1 0 55 3 0 19 0 0 78 3 0 9 3 1 74 13 0 50 0 0 33 17 0 30 0 0 63 7 0 34 0 0 58 8 0 19 1 0 73 7 0 Elaboración: La autora Fuente: La autora 39 54 0 0 43 3 0 40 Tabla 8 Tabla de frecuencias de la presentación de glóbulos blancos Heterófilos Eosinófilos Basófilos Linfocitos Monocitos Azurófilos TOTAL Frecuencia Frecuencia Frecuencia relativa Absoluta Relativa (%) 462 0,3300 33,00 7 0,0050 0,50 1 0,0007 0,07 837 0,5979 59,79 93 0,0664 6,64 0 0,0000 0,00 1400 1 100,00 Elaboración: La autora Fuente: La autora Frecuencia relativa (%) 6.64% 0.00% Heterófilos 33.00% Eosinófilos Basófilos 59.79% 0.50% 0.07% Linfocitos Monocitos Azurófilos Gráfico 28 Frecuencia relativa de presentación de los diferentes glóbulos blancos en serpientes Elaboración: La autora Fuente: La autora Las células con mayor frecuencia de presentación en los hemogramas son los linfocitos, con un 59,79% de aparición, que, al ser comparados con el trabajo de Álvarez et al en 2011 aparecen dentro de los parámetros establecidos, en la mayor parte de las especies encontradas. En su investigación, Álvarez reconoce a los linfocitos como las células de mayor presentación, lo que concuerda también con la 40 41 información otorgada a la comunidad médica por se muestran dentro de los parámetros Por otra parte los de menor presentación son los azurófilos, que no fueron vistos en ninguno de los hemogramas realizados con las muestras obtenidas. La aparición de azurófilos está asociada a la presencia de hemoparásitos en las serpientes, según Martínez-Silvestre et al (2011) en este momento, existe un concenso que indica que los azurófilos corresponden a una población única en las serpientes. Su aparición se ha descrito asociada a la inflamación, infección y al parasitismo, así, en serpientes, se ha evidenciado azurofilia como respuesta inflamatoria ante el hemoparásito Hepatozoon spp. Al realizar un estudio comparativo de rangos obtenidos en hemogramas de Boa constrictor, obtuvimos los siguientes resultados: Tabla 9 Rangos de referencia y de resultados en Boa constrictor Hematología (Martínez, 2007) (Cortez, 2014) (Medrano, 2015) Heterófilos (%) Eosinófilos (%) Basófilos (%) Linfocitos (%) Monocitos (%) Azurófilos (%) 20 - 50 0-3 0 - 20 10 - 60. 0-3 N/D 34 - 52 4 - 7. 3.- 18 21 - 48 0-4 2 - 7. 30 - 34 0 0 58 - 63 7 - 8. 0 N/D No disponible Los valores obtenidos se encuentran ligeramente por encima de los parámetros de referencia que ofrecen Martínez et al y Cortez en el caso de los linfocitos y monocitos, mientras que los heterófilos se hallan en el promedio. No se observaron eosinófilos, ni basófilos en las placas realizadas, lo cual coincide con el dato más bajo de los rangos de referencia. No se evidenciaron azurófilos en las placas observadas, células asociadas a la presencia de hemoparásitos. Los recuentos leucocitarios realizados para cada especie hallada corresponden a datos nuevos, pues no existen datos similares en el país, ni en Sudamérica. Existen muchos 41 42 factores a tomar en cuenta para el análisis de datos. Las comparaciones entre recuentos leucocitarios se han elaborado en base a los datos que la literatura otorga, sin embargo, se debe tener presente que la mayor parte de estudios realizados con serpientes han sido llevados a cabo con animales en cautiverio, lo cual cambia el panorama totalmente. Además, los estudios utilizados por la autora como referencias, tuvieron lugar en otros países, e incluso en otros continentes, por lo que se debe considerar que factores como: ubicación geográfica, clima, vegetación, son relevantes para el desarrollo comportamental y fisiológico de los individuos. 42 43 Anexo F. Certificado de traducción 43 44 44
