MYC Break Apart DNA-FISH Probe VC s wF

MYC Break Apart DNA-FISH Probe
Sonda de Translocación de Dos Colores
h13-008
Instrucciones de uso
VC
s wF
-20oC
Uso previsto
La sonda DNA-FISH de separación de MYC de Cancer Genetics Italia está
diseñada para detectar translocaciones que involucran al gen MYC en el
cromosoma 8q24, mediante hibridación in situ con fluorescencia (FISH).
[1]
El desplazamiento más frecuente, t(8,14)(q24;q32), se encuentra en 6080% del linfoma de Burkitt (LB) y es el sello distintivo de la citogenética
LB.[2,3] El t(8;14)(q24;q32) en LB se asocia con un curso clínico agresivo, que
responde bien a los tratamentos de alta intensidad y breve duración, los
regímenes de medicamentos con un resultado global favorable.[3,4] La
translocación de MYC a menudo se detecta como una anomalía genómica
secundaria en las frecuencias bajas en alta grado de linfomas de células
B, como Linfoma B difuso de células grandes (LBDCG) y la leucemia linfocítica crónica (LLC) (0,1-2%).[2,4-6] En LBDCG, la presencia de la translocación
MYC se asocia con una enfermedad agresiva, con un pronóstico y un resultado desfavorables.[5] Translocación de MYC también se ha observado en
4-6% de la leucemia linfoblástica aguda (LLA).[7]
8q24
MYC
5’
centrómero
~647kb
3’
telómero
~594kb
MYC
8
Representación esquemática de la sonda DNA-FISH MYC Break Apart:
Las barras horizontales roja y verde indican las regiones que están cubiertas por las
sondas (aproximadamente a escala GRCh37/Hg19/2009). Las sondas 5’ MYC (roja)
y 3’ MYC (verde) directamente marcadas bordean los puntos de ruptura comunes
dentro del gen MYC.
Almacenamiento
Al recibir el producto, guardarlo a -20 °C protegido de la luz hasta la fecha de
caducidad.
Para almacenar el portaobjetos a largo plazo, se lo puede guardar a -20°C, protegido de la luz directa.
Nota: Las condiciones de almacenamiento se aplican tanto a los productos sin
abrir como a los productos abiertos. El número de ciclos de congelamiento-descongelamiento no debeŕa exceder el número recomendado de
pruebas por vial. El producto debe ser almacenado en el recipiente original.
Los viales que se guarden bajo otras condiciones podrían no funcionar de
manera óptima y por lo tanto afectar el resultado del ensayo.
Manipulación
»» Manipular todos los reactivos como capaces de transmitir agentes infecciosos. Desechar todos los materiales despúes de su uso de acuerdo con la ley
nacional vigente.
»» Manipular todos los reactivos y portaobjetos que contengan fluoŕoforos en
condiciones de luz ambiental reducida para evitar el fotoblanqueado.
Advertencias y precauciones
Lea las instrucciones antes de proceder.
»» El transporte o almacenamiento inadecuado puede destruir o afectar el funcionamiento del producto.
»» En caso de recibir un paquete o vial alterado, de que el dispositivo falle (cuando
se lo utilice de acuerdo con las instrucciones de uso) o de lesión al usuario, comuníquese con el fabricante.
»» Se deberá desechar cualquier vial alterado de acuerdo con la ley nacional vigente
y no realizar ensayos con el mismo.
»» Manipule todos los reactivos con cuidado y use equipo de protección personal
adecuado.
»» La formamida, el tampon citrato salino de sodio (SSC) y el dodecil sulfato de sodio (SDS) pueden tener efectos teratogénicos y mutagénicos: Evite la inhalación,
la ingestión o el contacto con la piel.
»» La DAPI es un irritante. Para más información sobre seguridad, consulte la Material Safety Data Sheet (MSDS).
Reactivos suministrados
Sonda DNA-FISH lista para usar: 100 μl por vial (10 pruebas).
Sonda marcada con fluoróforo para el locus 5’ MYC (rojo) y sonda marcada
con fluoróforo para el locus 3’ MYC (verde), premezcladas con ADN de bloqueo y tampon de hibridación (formamida, sulfato de dextrán, SSC y SDS).
Reactivos y materiales necesarios pero no suministrados
Materiales
Reactivos
Frasco de coplin
Microcentrífuga
Etanol 100%
Cubreobjetos (22x22 mm y Tubo de microcentrífuga
PBS 10X
25x25 mm)
(0,5 ml)
HCl 1N
Microscopio de constraste Micropipetas (1-200 ml)
MgCl2 1M
de fase
Peachímetro
NaOH 1M
Pinzas
Pegamento de caucho
SSC 20X
Campana extractora
Bandeja portaobjetos
Formalina 10%
Guantes
Placa caliente
DAPI y AntiCámara húmeda
Termómetro calibrado
fade
Aceite de inmersión
(37oC to 80oC)
Agua distilada
Incubadora
Placa caliente
Pepsina
Lámpara de mercurio
Baño de agua
Tween 20
(100 vatios)
Preparación de reactivo
Nota: Utilizar agua destilada para preparar todas las soluciones madre y de trabajo.
Series de diluciones de etanol (70%, 85% y 100%): Preparar diluciones v/v de
etanol 100% usando agua destilada. Guardar a TA.
HCl 0,01N (Ácido clorhídrico): Añadir 0,5 ml de HCl 1 N a 49,5 ml de agua
destilada. Guardar a TA.
Solución madre de pepsina 0.4% (4 mg/mL): Disolver 100 mg de pepsina en
25 ml de HCl 0,2N. Guardar alícuotas de 500 μl a -20 °C.
Formaldehído 1%: Añadir 12,5 mL de formalin 10% (formaldehído 4%) a 37
ml de PBS 1X. Añadir 500ml de MgCl2 box. Guardar a 4oC hasta una emana.
SSC 0,5X (Citrato salino de sodio)/Tween 20 0,1%: Añadir 25 ml de SSC 20X y
1 ml de Tween 20 a 974 ml de agua destilada. Mezclar bien con movimientos giratorios. Guardar a TA.
PBS 1X (Tampón fosfato salino): Mezclar 100 ml de PBS 10X con 900 ml de
agua destilada. Ajustar el pH a 7,4. Guardar a TA.
SSC 2X: Mezclar 100 ml de SSC 20X con 900 ml de agua destilada. Ajustar el pH
a 7,0. Guardar a temperatura ambiente (TA).
SSC 2X/Tween 20 0,1%: Añadir 100 ml de SSC 20X y 1 ml de Tween 20 a 899 ml
de agua destilada. Mezclar bien con movimientos giratorios. Guardar a TA.
100X MgCl2 (Cloruro de magnesio) en PBS 1X: Añadir 50 ml de MgCl2 y 450
ml de PBS 1X.
Procedimiento
Pretratamiento de portaobjetos con pepsina (Opcional)
1. Precalentar 50 ml de la solución de HCl 0,01N a 37°C.
Nota: Producto listo para usar. No reconstituir ni diluir. Sólo para uso profesional.
»» El ensayo únicamente puede ser realizado por un tecnólogo que esté fa- 2. Añadir 25 μl de la solución madre de pepsina 0.4% a los 50 ml precalentados de HCl 0,01N y incubar el portaobjetos durante 5-10 minutos a 37 °C
miliarizado con los métodos citogenéticos y capacitado para realizar la
en la dilución de pepsina.
técnica FISH. Se deberá calibrar todo el equipo antes de realizar el ensayo.
Nota sobre el procedimiento: Algunas muestras pueden requerir una digestión en
»» El tejido a usarse es sangre periférica y médula ósea. Preparar los portaobpepsina más prolongada.
jetos de acuerdo con las recomendaciones para los métodos citogenéticos
3. Lavar el portaobjetos 2 veces durante 5 minutos en PBS 1X a TA.
estándares del laboratorio que realiza el ensayo.
4. Incubar el portaobjetos durante 5 minutos en formaldehído 1% a TA.
Preparación de portaobjetos
Todos los portaobjetos recientemente preparados se deberán dejar reposar 5. Lavar el portaobjetos 2 veces durante 5 minutos en PBS 1X a TA.
1,5 horas a 45-50°C antes de la hibridación. Si no va a hacer la hibridación 6. Deshidratar el portaobjetos en etanol 70%, 85% y 100% a TA, cada uno
durante 1 minuto.
el mismo día en que se preparan los portaobjetos, guárdelos a 4°C o -20°C.
Es posible que se necesite pretratar los portaobjetos que contengan células 7. Secar el portaobjetos al aire.
con citoplasma visible con una enzima proteolitica, tal como pepsina (ve al
Nota sobre el procedimiento: Controle la morfología de la muestra con un microscopretratamineto opcional con pepsina).
pio de contraste de fase antes de la hibridación. No hibridice si la morfología
nuclear está alterada.
(Continúa en la página siguiente)
Procedimiento
Lavado posthibridación
Nota sobre el procedimiento: No permita que el portaobjetos se seque antes los lavados
Desnaturalización/hibridación de la sonda DNA-FISH
están completos.
1. Mezclar brevemente la sonda DNA-FISH usando un vórtex y sedimentarla
1.Precalentar las soluciones SSC 2X/Tween 20 0,1% y SSC 0.5X/Tween 20
en una microcentrífuga durante 30 segundos.
0,1% a 45 °C.
2. Aplicar 10 μl de sonda DNA-FISH al área seleccionada en el portaobjetos y
2.Quitar el pegamento de caucho del portaobjetos usando pinzas.
cubrir con un cubreobjetos (22 x 22 mm).
Nota sobre el procedimiento: Tenga cuidado para evitar la formación de burbujas 3.Remojar brevemente el portaobjetos en SSC 2X a TA. Quitar el cubreobjetos.
de aire al aplicar la sonda. Se puede utilizar cubreobjetos más pequeños o más
4.Lavar el portaobjetos 2 veces, 5 minutos cada una, en SSC 2X/Tween 20
grandes cambiando proporcionalmente el volumen de la sonda DNA-FISH.
0,1% a 45 °C.
3. Sellar muy bien los bordes del cubreobjetos con pegamento de caucho.
4. Desnaturalizar conjuntamente el portaobjetos y la sonda DNA-FISH du- 5.Lavar el portaobjetos 2 veces, 5 minutos cada una, en SSC 0.5X/Tween 20
0,1% a 45 °C.
rante 3 minutos a 80°C en una placa caliente de temperatura controlada.
5. Incubar durante 12-18 horas en una cámara húmeda a 37°C, protegido 6.Enjuagar brevemente el portaobjetos en agua destilada.
7.Secar el portaobjetos al aire, protegido de la luz directa.
de la luz directa.
8.Aplicar 20 μl de DAPI/Antifade al área hibridizada y cubrir con un cubreobjetos (25 x 25 mm).
Accessorios de microscopía
»» Filtros
»» Objetivos
Fluoróforo
Para explorar el área seleccionada es adecuado usar un objetivo 10X. Se requiere una magnificación mayor para analizar la señal y deberá realizarse con un
Verde
objetivo 63X o 100X de inmersión en aceite.
»» Aceite de inmersión
Rojo
El aceite de inmersión deberá ser adecuado para microscopía de fluorescenDAPI
cia.
»» Lámpara
Se recomienda usar una lámpara de mercurio de 100 vatios, con una vida
máxima de 200 horas. Reemplazar la lámpara antes de que exceda 200 horas.
Visualización e interpretación de la señal
Se deberá visualizar la señal con un microscopio de epifluorescencia equipado con los filtros adecuados.
Nota sobre el procedimiento: Las señales pueden estar en distintos planos focales,
por eso es importante enfocar arriba y abajo en la muestra para asegurarse de
contar todas las señales.
»» En los núcleos diploides normales en metafase e interfase, la sonda DNAFISH de separacion de MYC genera dos señales de fusion (roja/verde o
amarilla) que corresponde a los dos cromosomas 8 normales.
»» En las células con redisposicion cromosómica que involucran al gen MYC,
el patrón mas frecuentemente observado es una señal de fusión que reprensenta al cromosoma 8 normal y una señal roja y una verde que representan a los cromosomas derivados.
Glosario de símbolos
g
Código de lote
V
Dispositivo medico para diagnóstico
in vitro
FRiesgo biológico
w
Mantener fuera de la luz del sol
h
Número de catálogo
M
Fabricante
YPrecaución, consultar los documentos
adjuntos
s Límite de temperatura máxima
CMarca CE de conformidad
H Úsese para
XContenido suficiente para 10 pruebas
Excitación max
Emisión max
496 nm
520 nm
580 nm
603 nm
360 nm
460 nm
Recomendaciones y limitaciones
»» Este producto ha sido optimizado para usarse en portaobjetos preparados a partir de muestras de sangre periférica, y médula ósea, de acuerdo
con los métodos citogenéticos de rutina. El fabricante asegura que este
producto cumple con las características de rendimiento analítico (sensibilidad, especificidad, reproducibilidad e intervalo informable) establecidas
en sangre periférica normal o el tejido en el que se intenta usarlo.
»» Con cada lote nuevo de la sonda DNA-FISH, se deberá probar la especificidad del locus en una muestra de sangre periférica normal y del tejido deseado para verificar el funcionamiento correcto del reactivo. El laboratorio
es responsable de establecer los intervalos informables con muestras de
control positivo y negativo del tejido deseado.
»» El uso de filtros con características de espectro distintas a las especificadas puede afectar adversamente la potencia de la señal. Por ejemplo, el
fluoróforo rojo es visible a través de un filtro Anaranjado, pero las señales
aparecen débiles.
»» Se recomienda usar el ensayo FISH en metafase para caracterizar variantes en los patrones de señales así como patrones de señales anormales.
»» Se considera que el ensayo FISH es suplementario a la citogenética clásica
(estudio del cariotipo). Los resultados de estos ensayos deben interpretarse teniendo en cuenta toda la historia clínica del paciente. No se puede
tomar una decisión médica exclusivamente sobre la base del resultado
del ensayo FISH.
M
Cancer Genetics Italia S.r.l.
Viale Luigi Majno, 17
20122 Milano - Italia
www.cancergeneticsitalia.com
[email protected]
Sonda DNA-FISH fabricada en EU por Cancer Genetics Italia S.r.l.
Bibliografía
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
Huret, J. L., et al. www.AtlasGeneticsOncology.org.
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Moorman, A. V., et al. Blood, 2010. 115(2): p. 206-14.
© 2012 Cancer Genetics Italia S.r.l.
Version: 06.07.12