Cadenas Ligeras Libres y Proteínas de Bence Jones
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Cadenas Ligeras Libres y Proteínas de Bence Jones L. Massaro, R. Scaringi New Scientific Company - Cormano (Milano) 1ª Revisión - en ocasión de I Reunión sobre “Catene Leggere Libere e Proteine di Bence Jones” Forlì, 28 mayo 1993 2ª Revisión - en ocasión de XIV Curso de Bioquímica Clínica - Hospital de la Sta. Creu i Sant Pau Barcelona, 23 - 26 noviembre 1994 3ª Revisión - en ocasión de V Reunión sobre “Catene Leggere Libere e Proteine di Bence Jones” Forlì, 26 mayo 1995 4ª Revisión - en ocasión de Encuentro “Proteine Urinarie - Clinica e Diagnostica” Pesaro, 23 junio 1999 5ª Revisión - en ocasión de Curso CEFAR “ Le Proteine: dal Laboratorio alla Clinica” Desenzano, 13 – 15 octubre 1999 © New Scientific Company S.r.l. Via Dante Alighieri, 35 - I - 20032 Cormano (MI) (ITALIA) Tel. +39 02 61 52 021 - Fax +39 02 61 52 154 www.newscientific.com [email protected] New Scientific Company España, S.r.l. c/ Valencia, 558 - 08026 Barcelona (ESPAÑA) Tel. +34 93 244 82 94 - Fax +34 93 244 82 95 [email protected] ** trad-SP - rev. 07.06.01 ** ( h:\of_2001\immun...\cll-y-bjp_r5\*.doc ) Prefacio La primera edición de este escrito se preparó en ocasión de la primera reunión organizada con el Dr. Palloti, en Forlì, el 28 de mayo de 1993; reunión que, como respuesta a las solicitudes recibidas de distintas partes, tuvo características atípicas; intentando ser un momento de agrupación para expresar libremente dudas, problemas, opiniones, sensaciones, resultados y cualquier otra cuestión relacionada con el tema propuesto. Se han efectuado nueve reuniones, hasta la última del pasado 18 de junio, y la “comisión” que se constituyó expontaneamente ha trabajado en la evaluación de los métodos para la determinación de las Cadenas Ligeras Libres (CLL) y de las Proteínas de Bence Jones (BJP) en orina. Los primeros resultados concretos fueron publicados en Biochimica Clinica en 1995, vol. 19, n. 5, en la rúbrica "L'angolo dell'Elettroforesi" de F. Aguzzi con el título "Valutazione Multicentrica di metodi e protocolli per le Catene Leggere Libere e Proteine di Bence Jones in urine - Primi risultati". En 1997 las Secciones de Liguria de la SIBioC – AIPAC – SIMEL decidieron emprender conjuntamente una iniciativa análoga también coordinada organizativamente por NSC. Desde entonces la Comisión Liguria ha celebrado tres reuniones, la última el 1 de julio de 1999. Las comisiones continuan su trabajo con los siguientes objetivos: definición de muestras de control para las Proteínas de Bence Jones, evaluación epidemiológica, evaluación de las correlaciones clínicas, estandarización de la estrategia para la comunicación del resultado (informe). Predispuse la segunda revisión en ocasión de la reunión organizada en Barcelona por el Dr. Cortés al que agradezco, así como también a los asistentes, el haberme dado la posibilidad de discutir sobre las BJP y las CLL aportando los resultados y experiencias italianas. Sobre el argumento específico de las CLL y las BJP y, más genericamente en proteinología, la experiencia y las competencias de nuestros Laboratorios de base se colocan, en nuestra opinión, en la vanguardia internacional. La tercera edición fué en ocasión de la reunión de Forlì del 26 mayo de 1995. La cuarta edición fué en ocasión de la reunión de Pesaro del 23 de junio de 1999 "Proteine urinarie - Clinica e Diagnostica" y agradezco al Dr. Acetoso la oportunidad que nos quiso brindar. Esta quinta edición se efectuó en ocasión del Curso CEFAR “Le proteine: dal Laboratorio alla Clinica” VIII edición; agradezco a Francesco Aguzzi el haber posibilitado nuestra participación. Indice de los temas Prefacio ...................................................................................................................................... 1 Indice de los temas ..................................................................................................................... 1 Indice de las figuras y tablas...................................................................................................... 2 Abreviaturas ............................................................................................................................... 2 Capítulo I Introducción - Historia - Terminología 3 Introducción....................................................................................................................................................... 3 Historia .............................................................................................................................................................. 3 Terminología...................................................................................................................................................... 4 Capítulo II Inmunoglobulinas y Cadenas Ligeras 7 Introducción....................................................................................................................................................... 7 Estructura........................................................................................................................................................... 7 Multiplicidad y Heterogeneidad ........................................................................................................................ 8 Antisueros.......................................................................................................................................................... 9 Capítulo III Cadenas Ligeras Libres: Metabolismo y Fisiopatología 13 Introducción..................................................................................................................................................... 13 Metabolismo de las CLL.................................................................................................................................. 13 Síntesis de las Cadenas Ligeras Libres ............................................................................................................ 15 Eliminación de las CLL ................................................................................................................................... 15 Concentración de CLL en el sujeto normal ..................................................................................................... 16 Producción diaria de Ig y CLL......................................................................................................................... 16 Hemivida de Ig y CLL ..................................................................................................................................... 16 Alteraciones del metabolismo de las CLL ....................................................................................................... 16 Capítulo IV Cadenas Ligeras Libres: Patologías relacionadas 19 Introducción..................................................................................................................................................... 19 CLL Monoclonales o Proteínas de Bence Jones .............................................................................................. 19 Cadenas Ligeras Libres Policlonales ............................................................................................................... 19 Contraindicaciones al uso de medios de contraste........................................................................................... 19 New Scientific Company © Página: 1 Capítulo V Introducción al Estudio de las Proteínas 21 Introducción .....................................................................................................................................................21 Metodología de Estudio de las Proteínas..........................................................................................................21 Variabilidad y Anormalidades de las Proteínas - Técnicas de rutina ...............................................................21 Técnicas de Estudio de las Proteínas - Generalidades......................................................................................22 Capítulo VI Técnicas y Protocolos de Estudio de las CLL 25 Introducción .....................................................................................................................................................25 Procedimiento lógico de selección de métodos y protocolos ...........................................................................25 Selección de Métodos y Protocolos a la luz de las peculiaridades de las CLL: Composición, Distribución, Concentración .....................................................................................................26 Termo-Test - Tiras - Proteínas Totales.............................................................................................................28 Electroforesis zonal (EF)..................................................................................................................................28 InmunoFijación (IFE).......................................................................................................................................30 InmunoPrecipitación en fase líquida (IPL) Indirecta, con antisueros anti Cadenas Ligeras Totales Nefelometría y Turbidimetría...........................................................................................................................31 InmunoPrecipitación en fase líquida (IPL) Directa, con antisueros anti Cadenas Ligeras Libres Nefelometría y Turbidimetría...........................................................................................................................33 Capítulo VII Contrastografías y BJP 35 Introducción .....................................................................................................................................................35 Bibliografía: análisis y reflexiones...................................................................................................................35 Las Circulares Ministeriales.............................................................................................................................36 Folletos ilustrativos de las especialidades medicinales ....................................................................................36 Protocolo PreContrastográfico .........................................................................................................................36 Hallazgos accessorios.......................................................................................................................................37 Referencias Bibliográficas................................................................................................................... 39 Resumen de Bibliografía ..................................................................................................................... 41 Indice de las figuras y tablas Figura 1 Figura 2 Figura 3 Figura 4 Figura 5 Figura 6 Figura 7 Figura 8 Figura 9 Figura 10 - Esquema Estructura Inmunoglobulina ........................................................................... 7 - Multiplicidad y Heterogeneidad de las Inmunoglobulinas............................................. 8 - Esquema de IFE en orina de muestras con CM IgG-k + k libre (BJP-k) ............... 10, 31 - Antisueros anti Cadenas Ligeras – esquema de reacción ............................................. 11 - Metabolismo de las CLL y sus alteraciones ................................................................. 14 - Anomalías cuali y cuantitativas de las CLL en orina Resultado analítico e Interpretación ............................................................................. 15 - Cadenas Ligeras Libres y Patologias relacionadas....................................................... 20 - Esquema de la Reacción de InmunoPrecipitación........................................................ 23 - Comparación de técnicas para el estudio de las BJP (y CLL) ..................................... 27 - De Monoclonal a Policlonal - Simulación por Ordenador ........................................... 28 Abreviaturas Las abreviaturas se relacionan en orden alfabético; muchas de ellas son "no estandard". IFE = Inmunofijación Ab = Anticuerpo Ig = Inmunoglobulinas en general Ag = Antígeno IPL = Inmunoprecipitación en Fase Líquida As = Antisuero IPS = Inmunoprecipitación sobre Soporte BJP = Proteínas de Bence Jones IR = Insuficiencia Renal BM = Banda Monoclonal IRA = Insuficiencia Renal Aguda CL = Cadenas Ligeras en general IRC = Insuficiencia Renal Crónica CLL = Cadenas Ligeras Libres IN = Inmunonefelometria CLLM = Cadenas Ligeras Libres monoclonales IT = Inmunoturbidimetria CLLBM = Cadenas Ligeras Libres Banda Multiple LCR = Líquido Céfalo Raquídeo CLLP = Cadenas Ligeras Libres policlonales MdC = Medio de Contraste CLLT = Cadenas Ligeras Totales, Libres y Ligadas UC = Orinas Concentradas CM = Componente Monoclonal UNC = Orinas No Concentradas EF = Electroforesis (zonal) IEP = Inmunoelectroforesis Página: 2 New Scientific Company © Capítulo I Introducción – Historia - Terminología Introducción Muchos laboratorios en Italia y algunos en España efectúan en rutina, desde 1988, la determinación "directa" de las Cadenas Ligeras Libres (CLL) por Inmunoturbidimetría o Inmunonefelometría. Son, sin embargo, Tillyer et al. [1], de Londres, que en junio de 1991 publican, en la prestigiosa revista "Journal of Clinical Pathology", la propuesta del método inmunoturbidimétrico "directo" para la determinación de las CLL y de las Proteínas de Bence Jones (BJP) y su cuantificación. La necesidad de este debate nace de la incertidumbre y de las dudas que la determinación cotidiana de las CLL y las BJP ha hecho surgir en los últimos años, desde que se dispone en rutina de métodos electroforéticos e inmunológicos mucho más sensibles y específicos que el clásico "Termo-Test". A continuación intento relacionar dichas dudas: a) Fase preanalítica - tipo de muestra: · orina de 24 horas · orina de la primera o segunda micción de la mañana · orina extemporánea b) Unidades de medida · mg/dl (o g/l, o mg/l) - concentración absoluta en la muestra examinada · mg/24 horas - concentración x diuresis · mg/creatinina urinaria, etc. c) Valores de referencia normales para las CLL policlonales (CLLP) d) Definición de un estandard de referencia e) Sensibilidad necesaria f) Anomalías: · cualitativas: monoclonales, oligoclonales · cuantitativas · sus correlaciones clínicas g) Técnicas y Protocolos de búsqueda h) Modelos Organizativos Este escrito es un intento de formalizar mis reflexiones sobre el tema de las CLL y las BJP. El escrito se complementa con una "Relación Bibliográfica", citas y Abstracts de artículos al respecto. Historia: desde Henry Bence Jones hasta hoy << Saturday, Nov. 1, 1845 >> << Dear Dr. Jones, >> << The tube contains urine of very high specific gravity. >> << When boiled, it becomes slightly opaque. >> << On addition of nitric acid, it effervesces assumes a reddish hue, and becomes quite clear, but as it cool, assumes >> << the consistency and appearance which you see. Heat reliquifies it. What is it ? [2, 3] >> El uno de noviembre de 1845 el Dr. Henry Bence Jones, notable "Patólogo" de Londres (el mismo osaba definirse "The best 'Chemical Doctor' in London" [4]), recibía del Dr. Thomas Watson primero y poco después del Dr. William MacIntyre, ambos notables "Clínicos", una muestra de orina de un paciente (un importante y rico comerciante de Londres) afectado por "Mollities Ossium". La muestra le fue enviada porque en los test químico-físicos de la época había mostrado un comportamiento desconocido. La autopsia del paciente evidenció las típicas lesiones del Mieloma Múltiple [5]. La carta que el Dr. Watson envió al Dr. Jones junto a la muestra de orina no tiene únicamente un valor histórico sino que, sobre todo, evidencia cual era el nivel de colaboración entre clínico y patólogo y de qué importancia pueden llegar a ser los resultados de dicha colaboración. En 1847 H.B. Jones describía las particulares características químico-físicas de la muestra, hipotetizaba que fuesen debidas a la presencia de una proteína anómala, un "Deutosido Hidrato de Albúmina", y, intuición genial, sugería buscar tal proteína en los pacientes con sospecha clínica de "Mollities Ossium" [2, 3]. Jones había descubierto el primer marcador tumoral New Scientific Company © Página: 3 En 1955 experimentos In Vitro con células plasmáticas demostraron que aminoácidos marcados con isótopos radioactivos eran incorporados en las BJP y las proteínas mielomatosas. En 1962 Edelman y Gally demostraron que las CL obtenidas de las proteínas del suero de un mieloma IgG y las BJP del mismo paciente tenían idénticas características químico-físicas. Edelman formuló la teoría de que las BJP y las CL eran la misma cosa. En 1963 Porter proponía para la IgG el modelo estructural de cuatro cadenas; dos cadenas pesadas y dos cadenas ligeras. En 1966 y 1967 Putnam et al. publicaban la secuencia aminoacídica completa de una BJP. Hoy están demostrados los siguientes puntos fundamentales: a) En el sujeto normal hay presentes CLL en la sangre, la orina y el líquido cefalorraquídeo y es posible determinarlas cuantitativamente con métodos oportunos. b) Las CLL del sujeto normal (por simplicidad CLL) y las BJP son sintetizadas "de novo" y no se trata de productos de degradación de las Inmunoglobulinas. c) Las BJP, las CLL y las Cadenas Ligeras de las Inmunoglobulinas son la misma individualidad molecular en todos los líquidos biológicos. d) Las BJP y las CLL existen en forma de monómeros, dímeros y polímeros de mayor peso molecular en todos los líquidos biológicos. e) Las BJP, las CLL y las CL de las Ig, al igual que las Ig enteras y las Cadenas Pesadas, constituyen un “pool” extremadamente heterogéneo debido a las variaciones estructurales que todas estas proteínas presentan tanto en el sujeto normal, ligadas a tipo, alotipo e idiotipo, como, con mayor razón, en el caso de patologías de la producción, que determinan, en el ámbito de una substancial homogeneidad: · variaciones del punto isoeléctrico y por tanto de la movilidad electroforética. · variaciones de algunos determinantes antigénicos y por ello de su reactividad en las técnicas inmunológicas. · variaciones del metabolismo y de la función. La heterogeneidad de su homogeneidad es el hilo conductor del estudio y la clave del análisis de las Ig y de las CL. Más de 100 años han transcurrido entre la individualización de una proteína anómala y su caracterización estructural, metabólica y fisiopatológica. La historia de las BJP es un ejemplo de como la metodología de estudio típica de una ciencia o de uno de sus sectores puede ser desviada por una intuición accidental. Hoy, después de 150 años de su identificación, estamos todavía ocupados en discutir sobre las BJP (y las CLL) y veremos que hay todavía elementos no definidos, empezando por su metodología de estudio en la práctica cotidiana. Hay además otros interrogantes que esperan respuesta: ¿porqué existen dos tipos de Cadenas Ligeras? ¿porqué producimos y catabolizamos 170 mg/día de CLL? [6] ¿cuál es la función de las CLL? A la genial intuición de H.B. Jones es de imputar, al menos en parte, el haber relegado el estudio de las CLL únicamente al ámbito del "Mollities Ossium". Terminología Tanto en la bibliografía como en el uso corriente hay confusión; los términos "Proteínas de Bence Jones", "Cadenas Ligeras" y "Cadenas Ligeras Libres" son incorrectamente usados de manera intercambiable, casi como si fuesen sinónimos, incluso en el ámbito de un mismo artículo. Dada la complejidad del argumento es necesario definir una terminología clara y unívoca. Terminológía de uso corriente y empleada en este escrito A continuación probaremos a definir los términos de uso corriente que utilizaremos en este escrito. Banda Monoclonal (BM) o Componente Monoclonal (CM): Banda electroforética estrecha que reacciona con un sólo tipo de antisuero anti Cadena Pesada y/o un sólo tipo de antisuero anti Cadena Ligera. Las BM pueden estar constituidas por Inmunoglobulinas Enteras, por sólo las Cadenas Pesadas, por sólo las Cadenas Ligeras (Cadenas Ligeras Libres) o por una combinación de ellas. Ejemplos: BM o CM IgG-κ = Banda electroforética estrecha que reacciona exclusivamente con los As anti γ y anti κ. BM o CM CLL-λ = Banda electroforética estrecha que reacciona exclusivamente con el As anti CLL-λ. Excepciones: una CM puede estar constituida por dos Ig o por una Ig y una CLL. Ejemplo: BM IgG-λ + CLL-κ. En una muestra pueden estar presentes dos y hasta excepcionalmente tres CM del mismo tipo o de tipos distintos. Advertencia: la monoclonalidad no se expresa necesariamente con la típica "banda estrecha"; un Clon maligno de células-B puede producir una banda larga que, eso si, reacciona sólo con el antisuero de una de las dos clases de cadenas ligeras [7]. Página: 4 New Scientific Company © Proteínas de Bence Jones (BJP) o Cadenas Ligeras Libres Monoclonales (CLLM): Banda electroforética estrecha que reacciona exclusivamente con un tipo de antisuero anti Cadena Ligera Libre o, por vía indirecta, que reacciona con un sólo tipo de antisuero anti Cadena Ligera Libre y Ligada (Antisuero anti Cadenas Ligeras Totales - CLT) y no reacciona con ninguno de los antisueros anti Cadena Pesada. En una muestra pueden estar presentes dos o más Bandas de BJP, en general del mismo tipo. Cadenas Ligeras Libres Policlonales (CLLP): Banda electroforética larga que reacciona con ambos antisueros anti CLL. Las CLLP pueden coexistir con las BJP. Cadenas Ligeras Libres Bandas Múltiples (CLLBM) y “Ladders”: Múltiples Bandas electroforéticas estrechas que reaccionan con uno o ambos tipos de As anti CLL; pueden tomar un aspecto característico llamado "ladder" (escalera de peldaños) [4, 8]. Pueden coexistir con una BJP. La opinión personal Hoy en día está determinada la estructura, incluso como secuencia aminoacídica, el metabolismo, la fisiología de las CLL y de las Ig, y es también conocida y sistematizada una amplia patología y mecanismos patogenéticos ligados a estas proteínas; están disponibles y son utilizados, incluso en rutina, métodos y procedimientos de estudio enormemente más sofisticados que el "Termo Test" de Bence Jones y sucesivas modificaciones. Por ello, en mi opinión, sin con eso pretender quitar ningún mérito a la genial intuición de H.B. Jones, pero tomando nota de la evolución de los conocimientos adquiridos en los siguientes 150 años, el término "Proteínas de Bence Jones" debería ser substituido por el de "Cadenas Ligeras Libres" seguido, si es necesario, por el atributo "monoclonales", "oligoclonales" y "policlonales" según su aspecto después de la separación electroforética. A propósito de estos atributos espero que me sea permitida una reflexión. La ciencia médica raramente permite procedimientos experimentales rigurosos, positivos y prospectivos, típicos de las "ciencias exactas" (por ejemplo, no podremos someter a una inyección de medios de contraste a un número estadísticamente suficiente de pacientes afectados por mieloma, con el objeto de establecer con certeza si el mieloma es un factor de riesgo para las contrastografías), sino que permite sólo la asociación lógica de observaciones que inducen deducciones probables. El laboratorio no puede asegurar la relación entre el aspecto electroforético de las Ig y la "clonalidad" de su producción; por ello sería prudente limitarse a describir aquello que se ve, substituyendo los términos "banda monoclonal" o "componente monoclonal" por el de "banda anómala estrecha" y el término "policlonal" por el de "mancha difusa", u otros términos análogos. Debe considerarse que, como se ha señalado, la monoclonalidad no se expresa necesariamente con la típica "banda estrecha"; un clon maligno de células-B puede producir una banda larga que, sin embargo, reacciona con sólo el antisuero de una de las dos clases de Cadenas Ligeras [7]. New Scientific Company © Página: 5 Página dejada intencionadamente en blanco Página: 6 New Scientific Company © Capítulo II Inmunoglobulinas y Cadenas Ligeras Introducción – Estructura – Multiplicidad y Heterogeneidad - Antisueros Introducción Las Inmunoglobulinas difieren de las demás proteínas por un conjunto de características peculiares sintetizables en: multiplicidad: Clases, Tipos, Subtipos. heterogeneidad: en el ámbito de una misma Clase, Tipo y Subtipo. especificidad anticorpal. En efecto, una ciencia entera, la Inmunoquímica, se ha desarrollado sobre las interacciones entre antígeno y anticuerpo, sobre el mecanismo de la biosíntesis de los anticuerpos, sobre la naturaleza de la especificidad del anticuerpo y sobre la identificación y cuantificación de proteínas y otras substancias, tanto de alto como de bajo peso molecular, con métodos inmunológicos. Las Inmunoglobulinas (Ig) se definen como proteínas de origen animal con reconocida actividad anticorpal; en el término de Ig se incluyen también algunas proteínas relacionadas con los anticuerpos por su estructura química y especificidad antigénica, entre las cuales tienen una particular dignidad las Cadenas Ligeras Libres (CLL). Todas estas proteínas son producidas por el sistema de las Células Linfoides de los vertebrados y circulan normalmente por su sangre, pero se encuentran también en muchos otros líquidos biológicos. Las Ig migran electroforéticamente en zona γ hasta la zona β. Su característica química más importante es la heterogeneidad. Las Ig del plasma normal y la mayor parte de los anticuerpos purificados muestran características heterogéneas para los distintos parámetros testados: físico-químicos, biológicos y estructurales. Una heterogeneidad tan exagerada habría hecho muy difícil el estudio de las Ig; los progresos reales de los conocimientos sobre las Ig y las CLL se han basado en el estudio y el análisis de las BJP y de las Ig mielomatosas, aprovechando su relativa homogeneidad. Podemos decir que los pacientes mielomatosos, un desafortunado experimento de la naturaleza, han permitido el progreso de los conocimientos sobre la estructura y las demás características de las Ig. Recomendando el estudio de la bibliografía para una profundización, es necesario subrayar, y continuaremos haciéndolo en este escrito, la multiplicidad y la heterogeneidad de las Ig y sus componentes. Basta pensar que Putnam, entre las muchas BJP e Ig monoclonales estudiadas, no ha encontrado nunca dos estructuras idénticas. Estructura La unidad estructural monomérica de las Figura: 1 Esquema Estructura Inmunoglobulina Inmunoglobulinas está compuesta por: dos Cadenas Pesadas (Cad. H = Heavy) (CP) idénticas, del mismo tipo. dos Cadenas Ligeras (Cadena L = Light) (CL) idénticas, del mismo tipo. Son conocidos cinco tipos de Cadenas Pesadas (CP), convencionalmente denominadas: γ, α, µ, δ, ε, y algunos Subtipos. Dichas Cadenas Pesadas caracterizan las cinco Clases de Inmunoglobulinas: IgG, IgA, IgM, IgD e IgE. Son conocidos dos tipos de Cadenas Ligeras (CL) convencionalmente denominadas: κ y λ. Dichas Cadenas Ligeras caracterizan los dos Tipos de Inmunoglobulinas: Ig-κ e Ig-λ. Las IgG son típicamente monómeros. Las IgA están presentes como monómeros, dímeros o polímeros de mayor coeficiente de sedimentación. Las IgM están presentes como pentámeros o polímeros de mayor coeficiente de sedimentación. Las Cadenas Ligeras Ligadas a las Cadenas Pesadas formando la Inmunoglobulina, tienen algunos determinantes antigénicos "ocultos" ("hidden"), es decir determinantes que no son capaces de reaccionar con el antisuero, porque están esterificadamente enmascarados. Las Cadenas Ligeras Libres (CLL) tienen "expuestos", es decir capaces de reaccionar con el antisuero, incluso aquellos determinantes que están "ocultos" cuando están ligadas a la Cadena Pesada. Esta característica permite obtener antisueros que reaccionan sólo con los determinantes "ocultos" ("hidden") de las Cadenas Ligeras y por lo tanto evidencian directa y específicamente las Cadenas Ligeras Libres. New Scientific Company © Página: 7 Multiplicidad y Heterogeneidad La multiplicidad y heterogeneidad de las Inmunoglobulinas se puede formalizar como sigue: A) Clase, Subclase y Tipo Los tipos y subtipos de las Cadenas Pesadas caracterizan la Clase y Subclase de la Inmunoglobulina, mientras que las Cadenas Ligeras caracterizan su Tipo. Por ejemplo con "IgG1-κ" entendemos una Ig que monta Cadenas Pesadas Tipo "γ", Subtipo "γ1" y Cadenas Ligeras Tipo "κ". B) Isotipo Con este término se entienden aquellos determinantes antigénicos que caracterizan los tipos y subtipos de las Cadenas Pesadas y de las Cadenas Ligeras y que son comunes a todos los individuos de la misma especie y específicos y exclusivos de ella. Los determinantes isotípicos permiten obtener los antisueros comerciales utilizados en las técnicas inmunológicas de rutina para el estudio cualitativo y cuantitativo de las Ig y de las CL. C) Alotipo Las Cadenas Pesadas y las Cadenas Ligeras de los individuos de una misma especie tienen, además de grupos antigénicos comunes, también grupos antigénicos que no son comunes a toda la especie sino sólo a un grupo de individuos de la misma. D) Ideotipo Las Inmunoglobulinas de la misma Clase y Tipo del mismo individuo tienen, además de los grupos antigénicos comunes a todos los individuos de la misma especie y los grupos antigénicos comunes a los individuos con idéntico alotipo, también grupos antigénicos específicos del "Sito Combinatorio Anticorpal". El Sito Combinatorio está constituido por la parte terminal de la Cadena Pesada y de la Cadena Ligera acopladas. La especificidad anticorpal está determinada por la variabilidad de la estructura de esta parte terminal de la Inmunoglobulina. Un Clon plasmacelular es capaz de producir Inmunoglobulinas con una sóla especificidad anticorpal y, por lo tanto, con el sito combinatorio idéntico. Si es cierto que la característica principal, bajo cualquier punto de vista, de las Ig es su heterogeneidad resulta obvio que la alteración de tal característica, la presencia de Ig homogéneas, se corresponde a una situación anómala, patológica. Figura: 2 Multiplicidad y Heterogeneidad de las Inmunoglobulinas - Putnam, Vol. III, pag. 36 Página: 8 New Scientific Company © Efectos de la Heterogeneidad Los efectos de la heterogeneidad de las Inmunoglobulinas son múltiples y complejos, pero aquí nos interesa resaltar dos: posibilidad de obtener antisueros específicos a diversos niveles, de los cuales los mas utilizados lo son a nivel de Isotipo. efectos sobre las técnicas de laboratorio. A continuación ampliaremos este segundo punto mientras que de los antisueros se hablará más adelante en un próximo capítulo. Efectos sobre las técnicas de laboratorio Electroforesis Zonal (EF) La típica mancha difusa que caracteriza la "zona gamma" de la EF de las proteínas séricas del sujeto normal es la expresión de la heterogeneidad de las Inmunoglobulinas y más precisamente expresa: Clase, Subclase y Tipo Ideotipo. Puesto que tal heterogeneidad expresa la multiplicidad de los clones plasmacelulares, las Inmunoglobulinas que constituyen la zona gamma de una EF normal son llamadas "Inmunoglobulinas Policlonales", término que se contrapone al de "Inmunoglobulinas Monoclonales", es decir Ig con una reducida heterogeneidad, producidas por un solo clon, cuya expresión electroforética recibe la denominación de "Banda Monoclonal" (BM) o Componente Monoclonal" (CM). La Banda Monoclonal, característica peculiar pero no exclusiva de los Mielomas y de la Macroglobulinemia de Waldenström, es la expresión electroforética de la prevalencia de un clon respecto a los demás. La EF y las técnicas basadas en ella, como la IFE, son las únicas disponibles en rutina para valorar la heterogeneidad de las Inmunoglobulinas; por otra parte suministran una información sólo semicuantitativa y su sensibilidad decrece desde una distribución monoclonal a una policlonal (como se detalla más adelante). Inmunoprecipitación en fase líquida (IPL) - nefelometría y turbidimetría Estas técnicas que en un primer análisis podrían considerarse "precisas" y "exactas" no proporcionan ninguna información sobre la heterogeneidad de las Ig o dan una información sólo indirecta, por ejemplo en el caso de un importante aumento cuantitativo de una Ig contemporáneo a una disminución de las demás. Sin embargo, en el caso de una reducida heterogeneidad de las Ig, pueden resultar inexactas por la falta de paralelismo entre la heterogeneidad de composición de la muestra y la del calibrador. Antisueros La posibilidad de obtener antisueros contra las distintas Clases y Subclases de Ig y de CL está ligada a los determinantes antigénicos isotípicos de las Cadenas Pesadas, de las Cadenas Ligeras y de los fragmentos de Ig: Fc, Fab, etc. Los animales más utilizados son la cabra, la oveja y el conejo. Los antisueros están disponibles comercialmente en varias "preparaciones"; las más comunes son: Antisuero Estándar o Total: es el suero entero, sólo deslipemizado, del animal inmunizado. Antisuero Fracción Ig o IgG: es la fracción Ig o IgG obtenida del suero del animal inmunizado; por ejemplo, Antisuero IgG de cabra anti IgG humanas. Estos antisueros, por estar constituidos por sólo la fracción Ig o IgG del suero animal, dan un “fondo” inferior respecto a los antisueros Totales, ventaja evidente sobre todo en las técnicas de inmunoprecipitación en gel seguidas de coloración: IFE, etc. Antisueros anti Inmunoglobulinas Los antisueros anti clases y subclases de las Inmunoglobulinas se obtienen inmunizando al animal con la Cadena Pesada de las Ig humanas. Por lo tanto un antisuero anti IgG se obtiene inmunizando con la Cadena Pesada γ humana y reaccionará con todas las IgG tanto κ como λ. Además de los antisueros específicos para las distintas clases y subclases de Ig hay disponibles antisueros polivalentes: trivalente para las tres clases principales de Ig: IgA+IgG+IgM pentavalente para las cinco clases de Ig: IgA+IgG+IgM+IgD+IgE. Antisueros anti Cadenas Ligeras La posibilidad de obtener antisueros contra los dos Tipos de Cadenas Ligeras humanas está ligada a sus determinantes antigénicos isotípicos. Con los procedimientos oportunos son realizables dos tipos de antisuero anti Cadenas Ligeras: Antisuero anti Cadenas Ligeras Libres y Ligadas o Cadenas Ligeras Totales (CLT) - κ y λ Antisuero anti Cadenas Ligeras Libres (CLL) - κ y λ. Veámoslo más detalladamente con la ayuda de la Figura: 4. New Scientific Company © Página: 9 Antisuero anti Cadenas Ligeras Libres y Ligadas o Cadenas Ligeras Totales (CLT) Son dos antisueros, anti κ y anti λ, que se obtienen inmunizando al animal con las CLL humanas κ y λ respectivamente. El animal producirá anticuerpos contra todos los determinantes antigénicos de las CLL, tanto aquellos "ocultos" como aquellos "no ocultos". Estos antisueros reaccionan indiferentemente con: las Ig enteras, puesto que reaccionan con los sitos antigénicos "no ocultos" de las CL que las constituyen las CLL, puesto que reaccionan con todos sus determinantes "no ocultos" y "ocultos". Antisuero anti Cadenas Ligeras Libres Se obtiene eliminando de los antisueros anti CLT los anticuerpos dirigidos contra los sitos antigénicos "no ocultos" de la CL; para ello se hace reaccionar el As anti CLT con Ig enteras y se recuperan los anticuerpos que no han reaccionado; estos anticuerpos están evidentemente dirigidos únicamente contra los sitos antigénicos "ocultos" de la CL. Un antisuero así obtenido reacciona con las CL sólo si están Libres (CLL) puesto que sólo en este caso están expuestos los determinantes "ocultos". Comparación entre As anti CLT y As anti CLL Para el estudio inmunológico de las CLL a menudo se prefieren utilizar As anti CLT y procedimientos indirectos en lugar de usar As anti CLL y procedimientos directos. Las críticas a los antisueros anti CLL son: baja reactividad reactividad inespecífica con las CL de las Ig coste más elevado respecto a los As anti CLT Por lo que respecta a los dos primeros puntos desde hace ya algunos años hay más de un productor capaz de suministrar antisueros anti CLL que, utilizados para la IEF y la IFE, tienen una reactividad muy buena y no evidencian ninguna reacción inespecífica con las CL de las Ig. Excepcionalmente sucede que tales antisueros, en la IFE, dan reacciones tenues (aunque visibles) debido al hecho de que una BJP puede tener un número muy pequeño de epítopes reconocidos por el antisuero. Para la inmunoprecipitación en fase líquida (IPL), turbidimetría y nefelometría, son necesarios algunos ajustes para obtener resultados satisfactorios con los As anti CLL, tanto en términos de especificidad como en términos de reactividad. En relación al coste, veremos también más adelante que, si no se considera únicamente el "Ahorro de Caja", es decir el coste por ml de antisuero, sino el "Ahorro de Gestión", es decir el coste conjunto de la determinación de las CLL o de las BJP, la conveniencia del uso de los As anti CLT respecto a los As anti CLL puede resultar a favor de estos últimos, sin contar con que su resultado es más fiable. Anticipando lo que se dirá mejor a continuación, no podemos compartir la opinión de que, para la búsqueda de las BJP en la orina con la IFE, sea suficiente el uso de los As anti CLT. Esta opinión se apoya sobre la hipótesis de que, en el caso no infrecuente de eliminación urinaria tanto de la Ig monoclonal como de la CLL monoclonal (BJP), la BJP migre de manera distinta respecto a la Ig y por lo tanto resulte evidente como una banda separada, autónoma, que reacciona sólo con el As anti CLT, bien diferenciada de la banda que reacciona tanto con el As anti CLT como con el As anti Cadena Pesada. Contrariamente, sucede frecuentemente que la BJP está perfectamente superpuesta a la Ig monoclonal y por ello no es distinguible con el As antiCLT mientras queda claramente evidenciada con el As anti CLL (Figura: 3). En la Figura 4 se esquematiza la reacción de los dos tipos de antisueros anti CL. Página: 10 New Scientific Company © Figura: 3 Esquema de IFE urinaria de muestra con CM IgG-k + k libre (BJP k) Ref IgG IgA IgM CLT-κ CLT-λ Izquierda IFE "tipo s uero" con A s anti CLT, s in A s anti CLL. Informe: CM IgG-k - B JP ausente Ref Ig CLT-κ CLT-λ CLL-κ CLL-λ Derecha IFE con A s anti Ig (polivalente Cadenas Pes adas ) y A s anti CLT y CLL. Informe: CM IgG-k + B JP-k Las BJP presentes en la muestra tienen la misma velocidad de migración que la Ig entera y por lo tanto no se evidencian si no es con el uso de As anti Cadenas Ligeras Libres. New Scientific Company © Página: 11 Figura: 4 Antisueros anti Cadenas Ligeras – Esquema de reacción Se esquematiza la distinta reacción de los dos tipos de antisuero anti Cadenas Ligeras: As anti Cadenas Ligeras Totales y As anti Cadenas Ligeras Libres. Página: 12 New Scientific Company © Capítulo III Cadenas Ligeras Libres: Metabolismo y FisioPatología Introducción La referencia bibliográfica fundamental para este capítulo es la revisión de Sölling [6]. La concentración de las CLL (y de cualquier otro metabolito) en los distintos líquidos biológicos, o compartimentos, es la resultante de: volumen del compartimento cantidad del elemento en entrada en el compartimento: · por producción en elementos estructurales del compartimento · por entrada desde otro compartimento cantidad del elemento en salida del compartimento: · por el paso a otro compartimento · por transformación en otro elemento dentro del mismo compartimento. La contemporánea "normalidad" de la concentración en los distintos compartimentos depende de la "normalidad" de los flujos, que a su vez son función de la "normalidad" de: estructuras mecanismos funcionales interferencias compensaciones. Por lo tanto si, por simplicidad, en general medimos la concentración de un analito, esta, por su propia estaticidad, no puede ser una expresión exhaustiva del complejo mecanismo dinámico que la determina y para una mejor interpretación será necesario tener presentes los elementos detallados. Concretamente, para interpretar la concentración y la calidad: mono, oligo o policlonal de las CLL en la orina (y en los otros líquidos biológicos: sangre, LCR, etc.) deberemos tener presente: las estructuras y los mecanismos de síntesis y entrada en círculo las estructuras y los mecanismos de eliminación en la orina los tiempos: expresados por la hemivida los volúmenes: volemia y diuresis las interferencias y las compensaciones. En las páginas siguientes se describen esquemáticamente las estructuras y los mecanismos implicados para determinar la concentración de las CLL en la sangre y la orina. Metabolismo de las Cadenas Ligeras Libres Las Cadenas Ligeras Libres (CLL), al igual que las Inmunoglobulinas (Ig), son producidas e inmersas en círculo por las células plasmáticas. La producción de CLL (kappa+lambda), es decir de Cadenas Ligeras no incorporadas en las Inmunoglobulinas completas, es de alrededor de 170mg/24h y constituye el 10-20% de la producción diaria total de Cadenas Ligeras (CL)[6]. El catabolismo de las CLL se realiza casi enteramente en el riñón. La concentración de CLL en la sangre del sujeto normal es muy baja (≈2mg/dl) [6] aún siendo importante la cantidad inmersa en círculo puesto que, por su bajo peso molecular (22.000 para el monómero), pasan rápidamente al Filtrado Glomerular (FG). Igualmente baja es la concentración en la orina (≈5mg/24h) [6] dado que las CLL presentes en el FG son reabsorbidas y catabolizadas por el Túbulo Proximal. Desde el punto de vista renal el comportamiento de las CLL es análogo al de las demás Microglobulinas: β2-micro, α1micro, etc. [6]. En el sujeto con Filtrado Glomerular normal, la hemivida de las CLL está valorada entre 30 y 60 minutos [6], si se excluye su estacionamiento en la vejiga. Las CLL en la orina expresan el equilibrio entre la síntesis en las Células-B y el catabolismo renal (filtración glomerular y reabsorción tubular) en el período entre la última micción y la actual, o en el período de la toma de muestra [9]. Un aumento de la concentración de CLL en la orina, tal que sea evidenciable con los métodos de rutina de los Laboratorios, puede estar determinado por: aumento de la producción de CLL al que sigue un aumento de su concentración en el Filtrado Glomerular y superación de la capacidad específica actual de reabsorción tubular. reducción de la capacidad específica actual de reabsorción tubular. concurrencia de las dos situaciones precedentes. New Scientific Company © Pagina: 13 Las CLL en la orina serán policlonales (CLLP) o monoclonales (CLLM - Proteínas de Bence Jones - BJP) o las dos contemporáneamente según la calidad de la producción de las Células-B. Algunas técnicas electroforéticas caracterizadas por una alta resolución y sensibilidad muestran las CLLP distribuidas en lugar que en la tradicional mancha difusa, en bandas estrechas y homogéneas, de 3 a 7, organizadas en un esquema característico denominado "ladder" ("escalera de peldaños") [4, 8]. Este fenómeno no tiene por ahora una explicación segura, pero ciertamente crea algunos problemas a la hora de la interpretación diferencial de las CLLP y las BJP, empeorados por la posibilidad de superposición de ambas situaciones [4, 8]. En la Figura 5 se esquematiza el metabolismo de las CLL y sus alteraciones y en la Figura 6 el resultado cuali/cuantitativo de la búsqueda de las CLL en orinas patológicas y sus relativas interpretaciones. Figura: 5 Metabolismo de las CLL y sus alteraciones Pagina: 14 New Scientific Company © Figura: 6 Anomalias cuali/cuantitativas de las CLL en Orina – Resultado analítico e Interpretación Inm unoglobulinas y Cadenas Ligeras Libres en Orina Resultado analítico Interpretación Cadenas Ligeras Libres Monoclonales Bence Jones - Inmunoproliferativas Cadenas Ligeras Libres "Oligoclonales" Bence Jones - Inmunoproliferativas otras situaciones de significado incierto: ej. "Ladders" o "Pseudo-Oligoclonales" Cadenas Ligeras Libres Policlonales Enferm. Hiperinmunes Función Tubular Alterada otras inform aciones Inmunoglobulinas Monoclonales Ig Monoclonal en el suero con Función Glomerular Alterada Inmunoglobulinas Policlonales Función Glomerular Alterada Combinaciones de los casos precedentes Síntesis de las Cadenas Ligeras Libres La célula plasmática sintetiza separadamente las Cadenas Ligeras Libres y las Cadenas Pesadas de las Inmunoglobulinas. El ensamblaje en la unidad estructural monomérica se realiza después de su liberación en las cisternas del retículo endoplasmático. Aunque la síntesis de Cadenas Ligeras y Cadenas Pesadas es un proceso muy bien balanceado, la presencia de Cadenas Ligeras Libres en la sangre del sujeto normal induce a suponer que las Cadenas Ligeras son producidas en ligero exceso respecto a las Cadenas Pesadas. No está claro si este ligero desequilibrio es una característica de todos o sólo de algunos clones plasmacelulares. Las anomalías de la síntesis de las CLL son un reflejo de las anomalías de la síntesis de las Ig, a las que hay que añadir el Mieloma Micromolecular que tiene su equivalente en la “Enfermedad de Cadenas Pesadas”. Dichas anomalías se pueden agrupar como sigue: reducción de la síntesis: hipo y agammaglobulinemia. aumento de la síntesis: · monoclonal: en las enfermedades inmunoproliferativas. · policlonal: en las enfermedades hiperinmunes. Eliminación de las Cadenas Ligeras Libres Las CLL monoméricas tienen un peso molecular de alrededor de 22.000, 44.000 los dímeros y 88.000 los tetrámeros. Por lo tanto, análogamente a como sucede con otras proteínas de bajo peso molecular: beta2-microglobulina, alfa1microglobulina, etc., las CLL filtran fácilmente a través del glomérulo renal y son reabsorbidas por el túbulo proximal donde son catabolizadas a aminoácidos, los cuales son reinmersos en círculo. No parece existir un mecanismo de transporte del túbulo a la sangre. Es necesario recordar que las células y más en general las estructuras, tienen una capacidad de trabajo característica en calidad y cantidad. En el caso de las CLL la célula del túbulo proximal realiza dos operaciones: reabsorve las CLL presentes en el Filtrado Glomerular (FG). cataboliza las CLL reabsorvidas. New Scientific Company © Pagina: 15 Reabsorción Tubular La primera fase de la reabsorción tubular de las CLL (y de las otras proteínas presentes en el filtrado glomerular) es el enlace que se formaría entre los grupos amínicos y guanídicos libres de la proteína (positivos) y los "sitos" negativos de la superficie de la Célula Tubular. Este mecanismo está confirmado por la observación de que la inyección endovenosa de Arginina en un sujeto normal determina el inmediato (al cabo de 2 minutos desde el inicio del suministro) y dosis-dependiente incremento de la excreción urinaria de albúmina, beta2-microglobulina y CLL. La excreción se normaliza al cabo de unos 20-40 minutos después de finalizar el suministro. Experimentos similares realizados con una serie de otras substancias confirman la hipótesis expuesta. Catabolismo Tubular Las CLL reabsorbidas son catabolizadas por las células tubulares. El aumento de la carga en CLL y el consiguiente aumento de su reabsorción pueden determinar la saturación de la capacidad catabólica y el acúmulo de CLL en la célula tubular y por ello sufrimiento celular. La distinta nefrotoxicidad de las CLL podría incidir a este nivel. Concentración de CLL en el sujeto normal La concentración de CLL en la sangre del sujeto normal es muy baja (≈2mg/dl) incluso siendo importante la cantidad inmersa en círculo (≈170mg/24h) dado que, por su bajo peso molecular, pasan rápidamente al Filtrado Glomerular (hemivida de 30-60 minutos excluyendo el almacenamiento en la vejiga [9]). Igualmente baja es su concentración en la orina (≈5mg/24h) dado que las CLL presentes en el FG son reabsorvidas y catabolizadas por el túbulo proximal. Puede concluirse que tanto en la sangre como en la orina del sujeto normal: las CLL estan presentes en cantidades "mínimas". las CLL presentes son “policlonales”. Producción diaria de Ig y de CLL El hecho de que las CLL esten presentes en poca cantidad en el suero y en la orina no significa que la cantidad producida por las células plasmáticas sea igualmente pequeña. El metabolismo de las Ig es de 2-3 g/24 h para la IgG, 0,6-2 g/24 h para la IgA y 0,4 g/24 h para la IgM; esto significa que en 24 h se metaboliza un total de Ig de alrededor de 3-5,4 g. Dado que las CL constituyen alrededor del 30% de las Ig se puede calcular que en 24h se incorporan en las Ig 0,9-1,6 g de CL. Se ha calculado que la cantidad de CLL filtrada por el glomérulo es de alrededor de 170 mg/24h: 110 mg/24h para las κ y 60 mg/24h para las λ. Esto quiere decir que el 10-20% de las CL producidas no es incorporado en las Ig. Esta cantidad no es obviamente despreciable ni en términos absolutos ni en términos relativos e induce a reflexionar sobre cual puede ser la función real de las CLL. Hemivida de Ig y de CLL La hemivida de las IgG es de 21 días para las IgG1, IgG2 e IgG4, y de 7-9 días para las IgG3; la hemivida de las IgA es de 6 días y la de las IgM es de 5 días, mientras la hemivida de las CLL es de alrededor de 1 hora. De ello deriva que las Ig del suero son la expresión de la producción plasmacelular de varios días, digamos unos 15. Las CLL en la orina del sujeto normal (o con filtrado glomerular normal) son la expresión de la producción plasmacelular ocurrida durante el período de estacionamiento en vejiga de la orina o durante el período de la toma de muestra. Parece demostrado que sólo pocos clones están contemporáneamente activos produciendo Ig (y CLL) y por lo tanto en el sujeto normal la "producción instantánea" de Ig (y de CLL) sería "oligoclonal". Si es cierta esta hipótesis, dada la hemivida de Ig y de CLL, las Ig resultan policlonales en la EF del suero (y de la orina) porque son la expresión de la producción de clones de alrededor de 15 días, mientras que las CLL pueden resultar oligoclonales en la EF de la orina porque son la expresión de la producción realizada durante la recogida. Alteraciones del metabolismo de las CLL Una vez definida la estructura e individualizado el lugar y mecanismo de producción y de eliminación de las CLL, podemos esquematizar que sucede en el caso de un incremento de producción o disminución del catabolismo. Aumento de producción causa: aumento del número de células productoras efecto: · aumento de la cantidad de CLL inmersas en círculo Pagina: 16 New Scientific Company © tal incremento no determina un aumento de la concentración hemática de CLL hasta que el Filtrado Glomerular no se reduce hasta los 30ml/min. Puesto que las CLL pasan libremente el Filtro Glomerular. · incremento de la cantidad de CLL en el Filtrado Glomerular · incremento de la cantidad de CLL reabsorvidas por el Túbulo · si la cantidad de CLL en el filtrado glomerular supera la capacidad actual de reabsorción del túbulo las CLL no reabsorvidas seran eliminadas en la orina definitiva. · si la cantidad de CLL reabsorvidas por la Célula Tubular supera la capacidad catabolica actual de la Célula Tubular se tendrá un acúmulo de CLL en la célula y consiguientemente sufrimiento celular. El déficit tubular secundario a la sobrecarga determina el cierre del círculo vicioso. La nefrotoxicidad de las CLL parece estar más ligada a la calidad que a la cantidad; hay pacientes que eliminan pequeñas cantidades de BJP y evidencian un rápido e irreversible compromiso renal, mientras otros eliminan una importante cantidad de BJP durante años sin evidenciar daños renales. En síntesis, el proceso puede esquematizarse como sigue: incremento de la cantidad de CLL en círculo sobrecarga tubular y consiguiente proteinuria daño tubular. Disminución del catabolismo causa: deficit de la reabsorción tubular de las CLL por: · insuficiencia tubular primaria · insuficiencia tubular secundaria por sobrecarga de CLL o o de otras substancias: aminoácidos, fármacos, etc. efecto: · cantidad normal de CLL en círculo y por lo tanto en el Filtrado Glomerular · reducción de la cantidad de CLL reabsorvidas por el Túbulo y eliminación en la orina de las CLL no reabsorvidas. Aumento de las CLL en la Sangre Para que se pueda verificar un aumento de la concentración hemática de CLL es necesario que haya una filtración glomerular insuficiente para la carga actual de CLL. Así, tomemos en examen algunas hipótesis: si aumenta la síntesis de CLL, a menos que tal aumento non sea imponente, la concentración hemática no sufrirá variaciones apreciables mientras que el filtrado glomerular sea suficiente. como incluso en el sujeto normal hay una pequeña cantidad de CLL inmersas en círculo, una reducción del filtrado glomerular determinará un aumento de la concentración de CLL en la sangre. En efecto, en pacientes con Filtrado Glomerular inferior a 5-10 ml/min. y sin presumible aumento de la síntesis de CLL, la concentración de CLL en la sangre resulta entre 5 y 8 veces aumentada respecto a la del sujeto normal [6]. Contrariamente, pacientes con Mieloma Micromolecular y BJP enorme, superior a 400 mg/dl (y 4600 mg/día), pueden presentar una concentración sérica de CLL normal [6]. Aumento de las CLL en la Orina Las causas que determinan el aumento de concentración de las CLL en la orina son esquematicamente: aumento de la síntesis y consiguiente aumento en el filtrado glomerular suficiente para superar la capacidad de reabsorción del túbulo proximal: · si el aumento de síntesis es monoclonal u oligoclonal tendremos en la orina respectivamente CLL monoclonales u oligoclonales. · si el aumento de síntesis es policlonal tendremos en la orina CLL policlonales. reducción de la reabsorción específica del túbulo proximal por: · interferencia y competición de otras substancias presentes en el filtrado glomerular; por ejemplo: aminoácidos tipo arginina, lisina, etc., fármacos, etc. · funcionalidad reducida debida a daño tubular. En ambos casos las CLL en la orina reflejarán el tipo de producción. combinación de ambas situaciones precedentes. New Scientific Company © Pagina: 17 Página dejada intencionadamente en blanco Pagina: 18 New Scientific Company © Capítulo IV Cadenas Ligeras Libres – Patologías Relacionadas Introducción Para profundizar sobre este argumento aconsejamos estudiar el óptimo tratado de Fang [10], que se esquematiza en la Figura 7. En la práctica de Laboratorio la determinación de las CLL asume una validez distinta según se trate de BJP o de CLLP, mientras que tiene un significado completamente aparte en el ámbito de los protocolos precontratográficos. A la importancia, abajo sintetizada, de la investigación entorno a las BJP y a las CLL, no parece, por el momento, corresponderle una adecuada estandarización de métodos, protocolos, referencias, controles y de la expresión del informe, todas ellas exigencias insistente y justamente reclamadas por los operadores. De hecho seria deseable que una muestra resultase, por lo menos, "BJP-positiva" o "BJP-negativa" en todos los Laboratorios. CLL Monoclonales o Proteínas de Bence Jones (BJP) Las Proteínas de Bence Jones (BJP), es decir las CLLM en orina, en el curso de enfermedades linfoproliferativas, debidas al aumento de producción de las plasmacélulas de un clon, a la que sigue y se añade la nefropatía tubular secundaria a la sobrecarga, son históricamente el primer marker tumoral identificado y, después de más de 150 años desde la genial intuición de Henry Bence Jones [2, 3], conservan intacto su valor de significado diagnóstico a veces único, precoz y de hallazgo accidental e inesperado; esto no es todo, sino que han adquirido también valor en el diagnóstico diferencial, en la prognosis y en el seguimiento de la evolución de la enfermedad. Las BJP están presentes en el 60-80% de los pacientes con Mieloma Múltiple y, en el 15-20% de los Mielomas son el único producto secretado por el clon maligno (Mieloma Micromolecular). BJP se encuentran en el curso de muchas otras neoplasias de las Células-B: Macroglobulinemia de Waldenström, Leucemia Linfoide Crónica, Enfermedad de Cadenas Pesadas µ y otras neoplasias linfoproliferativas. Las BJP, causa de la enfermedad, están presentes en un alto porcentaje de pacientes con Amiloidosis AL y, más raramente, en pacientes con Enfermedad de Depósito de Cadenas Ligeras. Pequeñas cantidades de BJP se encuentran en la orina de pacientes con Componente Monoclonal en el suero no asociada a enfermedad (MGUS). Por otra parte, una cantidad incluso importante de BJP puede estar presente en pacientes que no presentan ninguna enfermedad sistémica: Proteinuria de Bence Jones Idiopática [11], aunque casi siempre en estos casos el seguimiento a largo plazo ha evidenciado la evolución a Mieloma Múltiple o Amiloidosis [12]. Por ello, con raras excepciones, las BJP no sólo indican un proceso maligno, sino que son ellas mismas una “entidad maligna” (el Mieloma Micromolecular no es de per se “más maligno” que otros mielomas) que produce efectos patológicos principalmente sobre el riñón[13]. Cadenas Ligeras Libres Policlonales Un exceso de CLLP en la orina puede ser consecuencia de un aumento de la producción policlonal o de una alteración de la función tubular. Aumento de la producción policlonal El exceso de CLLP en orina es frecuente en enfermedades inflamatorias agudas y crónicas como la Sarcoidosis, la Tuberculosis Pulmonar, el Lupus Eritematoso, la Artritis Reumatoide, etc. Alteración de la función tubular Las CLL policlonales (CLLP) en orina son un índice sensible, al igual que las demás microglobulinas, de insuficiencia de la reabsorción tubular específica. Su hallazgo en el paciente diabético, tanto adulto [14], como niño [15], parece ser signo predictivo de nefropatía incluso en ausencia de albuminuria. La insuficiencia tubular y la consiguiente presencia de CLLP en la orina puede ser transitoria, ligada, por ejemplo, a carga en aminoácidos tipo lisina o arginina o a la toma de algunos fármacos. Contraindicaciones al uso de medios de contraste Un significado aparte tiene la búsqueda de las BJP en el ámbito de las contraindicaciones en el uso de medios de contraste órganoiodados por vía inyectable (y también por Os [16]). Para el surgimiento de la Insuficiencia Renal Aguda, el nexo originario entre Mieloma y Medio de Contraste [17, 18] se ha ido substituyendo por el nexo entre BJP, otras causas concurrentes y Medio de Contraste [10,16,19]. New Scientific Company © Pagina: 19 Los medios de contraste "no iónicos" y aquellos con "baja osmolaridad" parecen menos nefrotóxicos respecto a los clásicos de "alta osmolaridad" en sujetos con alteración de la función renal, mientras que en el sujeto normal no serían evidenciables diferencias [20, 21]. Por lo tanto la relación coste/beneficio no parece por el momento justificar el uso indiscriminado de los medios "no iónicos" y de "baja osmolaridad", más costosos que los tradicionales [22, 23]. Aunque sea teóricamente hipotetizable que en los pacientes con BJP el uso de medios de contraste "no iónicos" pueda reducir el riesgo de Insuficiencia Renal, no hay, por ahora, datos clínicos que lo confirmen[19]. Figura: 7 – Cadenas Ligeras Libres y Patologías Relacionadas Patologías Proteínas de Bence Jones (BJP) Mieloma Múltiple (de los que 15-20% Mieloma Micromolecular) Macroglobulinemia de Waldenström Leucemia Linfoide Crónica Enfermedad de Cadenas Pesadas µ otras neoplasias linfoproliferativas Amiloidosis AL Enfermedad de Depósito de Cadenas Ligeras CM en suero no asociada a enfermedad (MGUS) Proteinuria de Bence Jones Idiopática Las BJP no sólo son índice de un proceso maligno, sino que son ellas mismas una “entidad maligna” (el mieloma micromolecular no es de por si “más maligno” que los otros mielomas) que produce efectos patológicos sobretodo en el riñón. Cadenas Ligeras Libres Policlonales Aumento de la Producción Policlonal Sarcoidosis, Tubercolosis Pulmonar, Lupus Erythematosus, Artritis Reumatoide Alteración de la Función Tubular Síndrome de Fanconi, nefropatía diabética, carga de aminoácidos tipo lisina o arginina, toma de fármacos Pagina: 20 New Scientific Company © Capítulo V Introducción al Estudio de las Proteínas Introducción El estudio de las proteínas en el Laboratorio práctico ha tenido en los últimos 20 años un gran impulso y hoy se dispone de técnicas electroforéticas e inmunológicas sofisticadas y frecuentemente automatizadas. El uso rutinario de tales técnicas tiene: efectos inmediatos: · proporcionar a la clínica importantes elementos en el ámbito diagnóstico, pronóstico y terapeutico. · proporcionar datos epidemiológicos. efectos a medio plazo: · posibilita el continuo progreso en los conocimientos fisiopatológicos · posibilita y estimula la continua mejora de las propias técnicas. Así se cierra el círculo, puesto que progresos en fisiopatología paralelos a la mejora de las técnicas disponibles en rutina ofrecen nuevos elementos para la clínica y la epidemiología. El objetivo de este capítulo es la reflexión sobre las ventajas, desventajas y límites de las técnicas individuales más usadas en proteinología y de los protocolos, es decir del conjunto articulado de técnicas que, formalizados o no, se derivan de la exigencia de superar las limitaciones de una técnica en particular. Metodología de Estudio de las Proteínas Para el estudio de las proteínas los pasos metodológicos en su secuencia lógica pueden esquematizarse como sigue: Identificación: Puede ser fruto de estudios sistemáticos de laboratorio o de la "colaboración" entre clínico y analista como en el caso de las BJP. Aislamiento: Es el paso fundamental para poder producir un antisuero específico. Caracterización químico-física. Definición de la estructura y análisis de la secuencia aminoacídica. Definición de la función. Definición de las relaciones y correlaciones entre función y estructura. Definición del metabolismo. Definición de las relaciones entre función, estructura y metabolismo. Definición de las variaciones de estructura, función y metabolismo, o sea de las variaciones cualitativas y/o cuantitativas, y relaciones entre tales variaciones y enfermedades. Este procedimiento ideal frecuentemente sufre un vuelco. Un ejemplo perfectamente representativo es el "descubrimiento" de las BJP. Variaciones y Anormalidades de las Proteínas – Técnicas de Rutina Las técnicas de rutina disponibles en el Laboratorio permiten afirmar algunas de las posibles variantes y anomalías de las proteínas; para el análisis es útil formalizar tres elementos: Calidad Concentración Función Calidad En el estudio de las variantes y anomalías de las proteínas y en particular de las Inmunoglobulinas, es necesario analizar dos elementos característicos: individualidad antigénica o composición movilidad electroforética o distribución Así las proteínas pueden tener: idéntica individualidad antigénica pero distinta movilidad electroforética idéntica movilidad electroforética pero distinta individualidad antigénica. Deriva de ello que: una técnica sólo separativa, por ej. la EF, puede evidenciar si las fracciones de la muestra en examen son similares por "distribución" a las de la correspondiente muestra "normal", pero no puede evidenciar cuales son las proteínas contenidas en las fracciones, es decir, no es capaz de evidenciar si la "composición" de las fracciones es similar a la de la correspondiente muestra "normal". una técnica sólo inmunológica, por ej. la IPL, puede evidenciar si una proteína o un grupo de proteínas está presente en la muestra en examen y en que concentración, es decir, es capaz de evidenciar la individualidad antigénica New Scientific Company © Pagina: 21 buscada en la muestra y su cantidad, pero no es capaz de preveer la "distribución" de la proteína o grupo de proteínas sometido a una técnica separativa. la valoración exaustiva de variantes y anomalías de las proteínas debe preveer el uso combinado de técnicas separativas y técnicas inmunológicas. Concentración Las consideraciones son en cierta medida analogas a las relativas a la "Calidad": con una técnica separativa, por ej. la EF, podremos valorar exclusivamente la concentración de las "proteínas totales" presentes en las fracciones particulares. con una técnica inmunológica, por ej. la IPL, podremos valorar exclusivamente la concentración en la muestra de una única proteína, es decir de una individualidad antigénica. para valorar la concentración de las proteínas particulares presentes en una fracción deberemos preveer el uso combinado de técnicas separativas y de técnicas inmunológicas. Función Muchas proteínas pueden presentar concentración y movilidad normales pero función alterada; por ejemplo las proteínas de la coagulación, las fracciones del Complemento, etc. En el caso de las CLL todavía no se conoce su función y por lo tanto, por el momento, no tenemos este problema. Técnicas de Estudio de las Proteínas - Generalidades Las técnicas de estudio de las proteínas pueden dividirse en dos grandes categorías: técnicas separativas técnicas inmunológicas Técnicas Separativas Estas técnicas aprovechan las características químico-físicas de las proteínas para separar un grupo o una molécula en particular de las demás presentes en el líquido en examen, por ejemplo el suero. Las técnicas separativas permiten, entre otras cosas, "aislar" y "purificar" las proteínas que nos servirán para inmunizar al animal y así obtener los antisueros específicos a utilizar en las técnicas inmunológicas. Las técnicas más utilizadas son: Técnicas separativas con recuperación de las fracciones: · Cromatografía de intercambio iónico · Cromatografía por filtración en gel · Ultracentrifugación · Electroforesis separativa sobre diversos soportes y en diversas variantes Estos métodos permiten la recuperación de las fracciones separadas que podrán contener o una única proteína o un conjunto de proteínas con características análogas respecto al método de separación empleado. La fracción separada puede ser objeto de ulteriores análisis: · determinación de las proteínas totales: absorvancia a 280 nm, reactivo de Folin, etc. · ulteriores separaciones con o sin recuperación · técnicas inmunológicas · técnicas químico-físicas para la caracterización estructural Técnicas separativas sin recuperacióin de las fracciones: · Electroforesis zonal sobre acetato de celulosa o sobre agarosa · Electroforesis sobre Gel de Poliacrilamida · Isoelectrofocusing sobre diversos soportes. Estas técnicas emplean cantidades mínimas de muestra y no permiten la recuperación de las fracciones aisladas pero permiten sin embargo valorar algunas características estructurales, químico-físicas, funcionales e inmunológicas de las fracciones individuales; por ejemplo: · determinación de los componentes protéicos, glicídicos, lipídicos · determinación de la actividad enzimática: Isoenzimas · caracterización inmunológica: con la Inmunofijación directa o después de “blotting”, la Inmunosubstracción, etc. De dichas técnicas las empleadas en rutina son la Electroforesis Zonal (EF) y la Inmunofijación (IFE). Técnicas Inmunológicas Las técnicas inmunológicas aprovechan la individualidad antigénica de las proteínas que permite obtener antisueros específicos para realizar la reacción antígeno-anticuerpo. La unión In Vitro de un antígeno (Ag) al anticuerpo (Ab) da lugar a un producto de reacción llamado Inmunocomplejo. La reacción inmune se divide a efectos didácticos y descriptivos en dos estadios: primer estadio – se actua: · rapidísimamente · con variaciones de energía · sin alteraciones visibles del medio de reacción Pagina: 22 New Scientific Company © · cualquiera que sea la valencia del antígeno y por ello incluso con Ag monovalentes o con As que "vean" al Ag como monovalente (As monoclonales). · con cualquier relación Ag/Ab · con cualquier salinidad del medio Ejemplos de técnicas que emplean el primer estadio son: · Técnicas Inmunoenzimáticas · Técnicas Radioinmunológicas segundo estadio – se actua: · lentamente · con pequeñísimas variaciones de energía · con alteraciones visibles del medio de reacción: Inmunoprecipitación (IP), Inmunoaglutinación · sólo con Ag polivalentes y con As que vean al Ag como polivalente; por lo tanto no se actua con As monoclonales en sentido estricto. · sólo para determinadas relaciones Ag/Ab según la "curva de precipitación" · sólo en medio salino Ejemplos de técnicas que emplean el segundo estadios son: · Inmunoprecipitación sobre Soporte (IPS): IFE, RID, etc. · Inmunoprecipitación en Fase Líquida (IPL): Inmunoturbidimetría (IT), Inmunonefelometría (IN) De entre estas, Inmunofijación (IFE), Inmunoturbidimetría (IT) e Inmunonefelometría (IN) son las más utilizadas actualmente en la rutina proteinológica. La Figura 8 ilustra el clásico esquema de Reacción de Inmunoprecipitación: de Clerici-Villa, Inmunología General, III Edición Figura: 8 - Esquema de la Reacción de InmunoPrecipitación New Scientific Company © Pagina: 23 Página dejada intencionadamente en blanco Pagina: 24 New Scientific Company © Capítulo VI Técnicas y Protocolos de Estudio de las CLL Introducción A la importancia, apuntada en los capítulos precedentes, del estudio de las BJP y las CLL, no le corresponde una adecuada estandarización de métodos, protocolos, referencias, controles, tipo de muestra a utilizar, unidades de medida y expresión del informe. En este capítulo analizaremos las técnicas y protocolos más comúnmente utilizados para el estudio de las CLL en la orina con particular referencia a las BJP, de hecho actualmente las CLLP son consideradas un hallazgo accesorio a menos que no se pretenda buscarlas específicamente, como índice de proteinuria tubular, y en este caso parece el método de elección la determinación cuantitativa directa con la Inmunoprecipitación en Fase Líquida (IPL), turbidimetría o nefelometría, realizada con Reactivos antisuero específicos para las CLL. Sería deseable que, también para las BJP (y las CLLP), como para cualquier otra situación, un paciente fuese uniformemente encuadrado en cualquier estructura sanitaria a la que se dirigiese y por ello, por lo menos, que una muestra resultase "BJP-positiva" o "BJP-negativa" en cualquier Laboratorio que la examine obviando el método o protocolo, es decir el conjunto de métodos de Screening y de profundización, utilizados [24]. Para ello deberemos definir las "características reales" de cada método determinando su "sensibilidad" y su "precisión" en determinar las "anormalidades de la muestra" que contiene BJP o CLLP. Deberemos definir también un sistema de controles que aunque inicialmente sea imperfecto será sin embargo útil para uniformizar la valoración de la sensibilidad y de la precisión [24]. Deberemos después acordar el "tipo de muestra": muestra de recogida de las 24 horas, muestra extemporánea, etc. y la "expresión del informe": unidades de medida, comentarios, etc. [24]. La exposición se articula en base a los siguientes argumentos: Procedimiento Lógico de selección de Métodos y Protocolos Es un esquema de formalización de los elementos de valoración de métodos y protocolos con particular referencia a las características peculiares de las CLL: Composición, Distribución, Concentración. Análisis de las Técnicas y Protocolos de estudio de las CLL: · Test del Calor, Tira Reactiva, Proteínas Totales · Electroforesis · Inmunofijación · Inmunoprecipitación en Fase Liquida (IPL) – Indices Indirectos Examina algunos "Indices" de "presencia" y de "tipo" de CLL y BJP en la orina, elaborando el resultado de la determinación de otras proteínas. · Inmunoprecipitación en Fase Líquida (IPL) - Directa Presenta la Técnica de determinación directa de las CLL con la IPL, Turbidimetría y Nefelometría, realizada con antisueros específicos para las CLL. Procedimiento Lógico de selección de Métodos y Protocolos En la Gestión del Laboratorio la selección de un método o de un protocolo operativo no puede escapar al modelo lógico general de análisis que prevee: a) identificación de uno o más objetivos. b) valoración de los dos parámetros para alcanzar el objetivo identificado: b.1) eficacia: capacidad de alcanzar el objetivo b.2) eficiencia: calidad del proceso seguido para alcanzar el objetivo. Identificación del Objetivo La identificación puntual del objetivo puede parecer una cosa banal, cuando en realidad su análisis y formalización pueden resultar incluso muy complejos. Frecuentemente es necesario individualizar un “objetivo principal” y “objetivos accesorios”. Además el método o protocolo adoptados pueden proporcionar “informaciones accesorias de manera automática” y el Analista al informar deberá escoger entre: · la respuesta exclusiva y literal a la solicitud específica recibida. · la explicitación de los hallazgos accesorios obtenidos al efectuar el estudio principal. Por ejemplo, si la solicitud es “Determinación de las BJP” y en la muestra se evidencían CLL policlonales podremos escoger entre una respuesta del tipo: ”BJP negativo” y basta, o “BJP negativo – Presencia de Cadenas Ligeras Libres Policlonales”. New Scientific Company © Pagina: 25 En el caso de las CLL los objetivos generales son determinar: su presencia su distribución: monoclonal, oligoclonal, policlonal su concentración. Eficacia La eficacia es la “capacidad de alcanzar el objetivo”: objetivo principal, objetivos accesorios y eventuales hallazgos automáticos. En el caso de las técnicas y protocolos analíticos los elementos que influencían la valoración de este parámetro son: a) Métodos cualitativos Capacidad discriminante, la cualidad buscada Sensibilidad de la capacidad discriminante Reproducibilidad de los parámetros citados · intra-laboratorio: en la serie y entre series · inter-laboratorio. b) Métodos cuantitativos A los elementos de valoración de los métodos cualitativos se añaden: “precisión” y “exactitud”. En el caso de las CLL deberemos buscar la técnica o el conjunto de técnicas (protocolo) que permitan centrar todos los objetivos relacionados o aquella parte que consideremos interesante en base a nuestro modelo operativo. En otras palabras, para las BJP y las CLL el método o el protocolo “perfectamente eficaz” será aquel caracterizado por: a) ningún “falso negativo” – Sensibilidad y Precisión Es la característica principal, e irrenunciable, y en consecuencia para ello se precisa la máxima reproducibilidad intra e inter-laboratorio: se debería definir la “sensibilidad” y la “precisión” de cada método. b) Ningún “falso positivo” – Especificidad de la Señal de Positividad La eficacia disminuye a medida que aumenta el número de "falsos positivos". c) Buena información cuantitativa – Se debería valorar además de la “precisión” también la “exactitud”. La importancia de este elemento depende de la importancia que se le de a la determinación cuantitativa absoluta. Eficiencia La eficiencia es la “calidad del proceso seguido” para alcanzar el objetivo. Su valoración es cosa difícil por la cantidad de elementos a analizar y por su variabilidad ambiental. Los principales parámetros son: coste total para alcanzar el objetivo: coste de los reactivos, calibradores y controles, de los analizadores multiuso o dedicados empleados, tiempo laborativo, semilaborativo y no laborativo de ejecución y su calidad, tiempo laborativo de interpretación del resultado y su calidad. posibilidad de estandarización del método o del protocolo en el propio laboratorio y entre laboratorios. Facilidad para la transmisión de los conocimientos necesarios para una correcta ejecución del método o del protocolo y para una correcta interpretación de los resultados. Selección de Métodos y Protocolos en base a las Peculiaridades de las CLL: Composición – Distribución - Concentración Hemos ya apuntado el hecho de que el estudio de las CLL (y de las Ig), por su heterogeneidad, es más complejo que el de otras proteínas. Hemos visto también (Cap. V) los límites de las técnicas separativas y de las técnicas inmunológicas usadas individualmente y la frecuente necesidad de recurrir al uso combinado de los dos tipos de técnicas para evidenciar las variantes y anomalías de las proteínas en general y de las CLL (y las Ig) en particular. En el estudio de las anomalías de las CLL se deberán tener en una particular consideración los elementos ya apuntados en el Capítulo V que son, precisamente: calidad: · individualidad antigénica o composición La presencia de CLL en la muestra o en la fracción deberá investigarse con técnicas inmunológicas. · movilidad electroforética o distribución: monoclonales, oligoclonales, policlonales. Esta característica deberá ser investigada con técnicas electroforéticas o que prevean una electroforesis. concentración: podrá ser valorada con la IPL directa o métodos indirectos, o con la EF. La verificación contemporanea de ambas características cualitativas es posible sólo con un método que sea al mismo tiempo electroforético e inmunológico, condición cumplida por la Inmunoelectroforesis (IEP) y por la Inmunofijación (IFE) que en realidad son protocolos constituidos por dos técnicas: técnica separativa: Electroforesis (EF) técnica inmunológica: Inmunoprecipitación sobre Soporte (IPS). La alternativa es la de escindir el problema en sus dos componentes, predisponiendo protocolos de dos o más métodos que esten en grado de verificar "composición" y "distribución" separadamente. Pagina: 26 New Scientific Company © New Scientific Company © Turbidez Variación Color Presencia Proteínas Banda sospechosa Banda CL sin Banda CP Banda CLL Presencia medible de CL Positividad del Indice Presencia medible de CLL Termo Test y similares Tiras Reactivas Proteínas Totales en orina Electroforesis IFE con As. anti CLT IFE con As. anti CLL Inmunoprecipitación en Fase Líquida - CLT Inmunoprec. en Fase Líquida - Indices Indirectos (CLT) Inmunoprecipitación en Fase Líquida - CLL Señal de Anormalidad SI SI SI SI Genérica Proteínas SI NO (indirecta) NO (indirecta) SI NO NO NO NO SI / NO Específica de CLL Presencia NO NO NO SI SI SI NO NO NO Monoclonal o Policlonal SI NO (indirecta) NO (indirecta) NO NO NO NO NO NO Especificidad CLL Distribución Concentración Información sobre presencia de CLL en la muestra Posible falta de paralelismo entre muestra y calibrador. Amplificación de los errores (=> Falsos Neg. y Pos.). Posible falta de paralelismo entre muestra y calibradores. Posible falta de paralelismo entre muestra y calibrador. Interferencias con las Inmunoglobulinas. Sensibilidad variable con la distribución. Sensibilidad dependiente del colorante y los antisueros. Poco estandarizable. Falsos Negativos con algunos antisueros. Sensibilidad variable con la distribución. Sensibilidad dependiente del colorante y los antisueros. Poco estandarizable. Sensibilidad variable con la distribución. Sensibilidad dependiente del colorante. Poco estandarizable. Sensibilidad insuficiente. Sensibilidad insuficiente. Reaccionan casi exclusivamente con la Albúmina. Sensibilidad insuficiente. Interferencias. Límites El intento es emplear un test como Screening para una de las dos características seguido, en las muestras positivas a este test, por otro test que verifique la segunda característica, separada o conjuntamente a la primera. Según cual de los dos parámetros se seleccione para el Screening se pueden formalizar dos tipos de protocolos: parámetro de Screening: distribución - test de Screening: Electroforesis. parámetro de Screening: composición - test de Screening: IPL directa, IPL indirecta e “índices”. En las páginas siguientes se detalla la formalización y el análisis de algunos de los métodos y protocolos actualmente empleados en la rutina y, en la Figura 9, una síntesis de su comparación. Figura: 9 - Comparación de técnicas para el estudio de las BJP (y CLL) Pagina: 27 Termo Test – Tiras Reactivas – Proteínas Totales El Termo Test y sus variaciones son test que hoy en día se consideran superados porque no son suficientemente sensibles; en caso de cantidades importantes de BJP estos test pueden considerarse específicos. Las Tiras Reactivas son sensibles a la albúmina, y en menor medida a las IgG, y por ello no son adecuadas para señalar la presencia de CLL y BJP. Las determinación de las Proteínas Totales, con los métodos actualmente empleados, tiene una sensibilidad insuficiente [24] y por ello no es utilizable ni siquiera como primer Screening o como componente de un “índice”. Electroforesis Zonal (EF) Trataremos sobre la EF zonal de rutina efectuada sobre acetato de celulosa o agarosa y revelada con colorantes para las proteínas: desde el Rojo Ponceau al Oro Coloidal. Otras técnicas electroforéticas como la Electroforesis sobre Gel de Poliacrilamida (SDS-PAGE) y el Isoelectroenfoque no son usadas en rutina y por lo tanto escapan al objetivo de este escrito. Introducción La EF es una de las técnicas más empleadas en rutina para el estudio de las proteínas urinarias (PU) y para la búsqueda de las BJP. La EF es una técnica separativa capaz de evidenciar cómo se distribuyen las proteínas (se separan) en un campo eléctrico en base a su punto isoeléctrico (pI) pero no es capaz de dar informaciones seguras y directas sobre las proteínas que componen una "zona"; podemos únicamente decir que las proteínas que componen una zona estrecha (banda) tienen el mismo (aproximadamente ) punto isoeléctrico. Recordemos que la EF está constituida por tres fases: separación, en general en tampón pH alcalino. revelación: con un colorante de las proteínas, desde el Rojo Ponceau al oro. lectura e interpretación: · cualitativa: “a ojo” · cuantitativa: con el Densitómetro Con la excepción de la proteína de Tamm-Horsfall que de cualquier modo después de centrifugación está en el sedimento, todas las proteínas presentes en la orina son de derivación hemática. Por lo tanto la distribución electroforética de las PU expresa la modificación que la distribución de las proteínas hemáticas ha sufrido a causa del riñón. En el caso de la búsqueda de las BJP la “señal de anormalidad” viene dado por la presencia de una “banda sospechosa”. Sensibilidad y sus variaciones La sensibilidad de la EF (y de la IFE), es decir su capacidad de evidenciar la presencia de una proteína en la muestra en examen, depende de la capacidad del sistema de revelado (colorante para la EF, complejo Antígeno-Anticuerpo + colorante para la IFE) para evidenciar la concentración por mmc de soporte que la proteína tiene después de la separación electroforética. Por ello la sensibilidad de la EF varia en relación a la distribución de la proteína en examen; y es tanto más alta cuanto más estrecha es la banda. En otros términos, dada una cierta concentración de proteína en la muestra, la sensibilidad de la EF (y de la IFE) decrece proporcionalmente al aumento de la superficie sobre la que la proteína se distribuye: en el caso de las CLL, desde la banda monoclonal típica de las BJP al aspecto difuso típico de las CLL policlonales. Pagina: 28 New Scientific Company © La Figura 10 muestra el resultado de una simulación por ordenador; se observa el efecto de una misma cantidad total de color distribuida sobre una cierta superficie y sobre una superficie 8 veces mayor. Figura: 10 De Monoclonal a Policlonal - Simulación por Ordenador Efecto de la misma cantidad de color distribuida sobre una cierta superficie asimilable a la banda homogenea de las BJP y escalarmente hasta una superficie 8 veces mayor, asimilable a CLL policlonales. Se demuestra que, para la misma concentración de proteínas, la sensibilidad de la EF y la IFE se reduce proporcionalmente al aumento de la superficie de distribución de las proteínas; en el caso de las CLL, desde la banda monoclonal de las BJP al aspecto difuso de las CLL policlonales Como veremos, una variabilidad análoga sufre la sensibilidad de la IFE; mientras que, contrariamente, las técnicas de Inmunoprecipitación en fase líquida no son influenciadas por la distribución de las proteínasy por ello, en el caso de las CLL, la sensibilidad es la misma para las monoclonales y para las policlonales. La búsqueda de las BJP precisa de una sensibilidad de 1 - 10 mg/L (0.1 - 1 mg/dl) [1]. La sensibilidad de la EF de evidenciar la presencia de BJP, es decir de CLL formando una banda estrecha, depende del colorante empleado y, sobre acetato de celulosa se estima como sigue: Ponceau S y amido black: 1000 mg/L (100 mg/dl) [1] Coomassie brilliant blue: 75 - 300 mg/L (7.5 - 30 mg/dl) [1, 25, 26] Oro coloidal: 1 - 6 mg/L (0.1 - 0.6 mg/dl) [1, 25, 26] Por lo tanto, mientras con el Oro coloidal se puede emplear la muestra no concentrada, con los demás colorantes es necesaria una concentración más o menos importante. Algunos consideran que la concentración de la muestra puede comportar la pérdida de una cierta cantidad, no precisable, de CLL; obviamente de alguna manera altera las características de la muestra. En contra de la concentración hay dos consideraciones incluso más inmediatas: su coste y el trabajo manual que representa la imposibilidad de obtener ningún dato cuantitativo a partir de la muestra concentrada. Por otra parte la coloración con Oro coloidal no ha tenido mucha aceptación para la rutina [24]. Recientemente Beckman ha propuesto el kit "Protur HISI" para la EF de las proteínas en orina no concentrada. El kit, aún mostrando una óptima definición y una sensibilidad estimada para las BJP de 2 - 3 mg/dl [24,27], resulta sin embargo insuficiente para la búsqueda de las BJP porque presenta un 6% de "falsos negativos" [27]. No hay datos acerca de la sensibilidad de la EF respecto a las CLL oligo y policlonales, pero este es obviamente insuficiente. Composición de las Bandas La EF no proporciona información sobre qué proteínas constituyen las distintas zonas, tanto homogéneas como difusas. Dada la heterogeneidad del Punto Isoeléctrico de las CLL, una banda homogénea constituida por CLL, es decir una BJP, puede tomar una posición cualquiera comprendida entre la zona gamma y la zona alfa1. Por lo tanto, si la EF evidencía una banda cualquiera distinta de la albúmina es necesario determinar la composición de la banda con técnicas inmunológicas, en general con la IFE. Por ejemplo, si la EF evidencía una banda en posición beta no podremos estar seguros de que se trate de Transferrina (TRF) hasta que no hayamos excluido que no sea una BJP. ¿ Quién puede excluir que una banda atribuible a la TRF sea, o esconda, una BJP ? dado que la TRF está presente frecuentemente en la orina, si usamos únicamente la EF como primer screening tendremos un número importante de “falsos positivos” a confirmar con los test de confirmación; y por otra parte, cuanto mayor sea la sensibilidad de la EF mayor será el número de "falsos positivos". New Scientific Company © Pagina: 29 Determinación Cuantitativa La validez de la EF para obtener de ella datos cuantitativos es estudiada de una manera exaustiva por Tillyer [28]. La conclusión es que la EF es imprecisa e inexacta y por lo tanto es dificilmente utilizable tanto para una valoración cuantitativa absoluta de las BJP, como para seguir en el tiempo las variaciones de concentración en el ámbito de un mismo paciente. La EF no permite la valoración cuantitativa de las CLL policlonales. Conclusiones La eficacia de la EF resulta más bien modesta y, retomando los elementos de valoración: Calidad: · individualidad antigénica o composición: ineficaz para las CLL monoclonales (BJP) u oligoclonales: ineficaz las informaciones son poco precisas (presencia de "banda sospechosa") y pueden determinar tanto "falsos negativos" como "falsos positivos". los "falsos positivos" aumentan con el aumento de la sensibilidad. para las CLL policlonales: ineficaz; no da ninguna información. · movilidad electroforética o distribución: parcialmente eficaz Las informaciones son buenas dentro de los límites de la sensibilidad característica. Concentración: parcialmente eficaz Es bastante imprecisa, y por ello es utilizable sólo si las BJP del paciente presentan variaciones importantes. No es utilizable para las CLL policlonales. InmunoFijación (IFE) Introducción La IFE es considerada la técnica de referencia para la deteminación cualitativa de las BJP en orina aunque no está absolutamente estandarizada y presenta algunas complicaciones o trampas. Se realiza combinando dos tipos de técnicas: Técnica separativa = Electroforesis Técnica inmunológica = InmunoPrecipitación en el soporte (IPS) Esquematicamente las fases operativas son: Separación Electroforética InmunoPrecipitación Eliminación de las proteínas no InmunoPrecipitadas Coloración A las variantes metodológicas de la EF se añaden las ligadas a la IPS, y de una manera particular los antisueros. Sensibilidad La InmunoPrecipitación, si se efectua correctamente, amplifica notablemente el contenido proteíco de una fracción. Por lo tanto, a igualdad de colorante (o, de una manera más general, de sistema de revelado) pueden resultar visibles fracciones (homogéneas o no homogéneas) no evidenciables con la EF. Como ya se ha dicho para la EF, en la que se basa, también para la IFE la sensibilidad varía en relación a la distribución de la proteína en examen, y resulta tanto más elevada cuanto más estrecha es la banda. La sensibilidad de la IFE a igualdad de concentración proteica por mmc está influenciada por: Colorante Antisuero De los antisueros se hablará con profundidad en el próximo párrafo. Para el estudio de las BJP, con los colorantes tradicionales no se alcanza una sensibilidad suficiente como para llegar a evitar la concentración de la orina; con el Oro Coloidal sobre acetato la sensibilidad es de 0,6 mg/l (0,06 mg/dl) [25,26]. En una evaluación multicéntrica efectuada recientemente en Italia el kit “Protur Plus” de Beckman ha demostrado sobre orinas no concentradas una sensibilidad satisfactoria [24]. Antisueros anti CLT y anti CLL Para el estudio inmunológico de las CLL, y por ello también para la IFE, muchos prefieren emplear As anti CLT y procedimientos indirectos en lugar de As anti CLL y procedimientos directos. Sus críticas a los antisueros anti CLL son: baja reactividad reactividad inespecífica con las CL de las Ig costo mayor respecto a los As anti CLT Pagina: 30 New Scientific Company © Por lo que respecta a los dos primeros puntos desde hace ya algunos años hay más de un productor capaz de suministrar antisueros anti CLL que usados en la IEF y la IFE tienen una reactividad muy buena y no evidencian ninguna reacción inespecífica con las CL de las Ig. Excepcionalmente sucede que tales antisueros con la IFE dan una reacción tenue (aunque visible) debido al hecho de que una BJP puede tener un número muy pequeño de epítopes reconocidos por el antisuero. Para la InmunoPrecipitación en Fase Líquida (IPL), turbidimetría o nefelometría, son necesarios oportunos ajustes para obtener resultados satisfactorios con los As anti CLL tanto en términos de especificidad como en términos de reactividad. Por lo que respecta al coste, veremos también más adelante que, si no se considera el "Ahorro de Caja", es decir el coste por ml de As, sino el "Ahorro de Gestión", es decir el coste conjunto del estudio de las CLL o de las BJP, la conveniencia del uso de los As anti CLT respecto a los As anti CLL puede resultar a favor de estos últimos, y ello sin contar con que el resultado es más fiable. Por lo que respecta a la capacidad de evidenciar las BJP, no podemos compartir la opinión de que, para el estudio de las BJP en la orina con la IFE, sea suficiente el uso de los As anti CLT. Esta opinión se apoya en la hipótesis de que, en el caso no infrecuente de eliminación urinaria tanto de las Ig Monoclonales como de las CLL Monoclonales (BJP), estas migren de manera distinta respecto a las Ig y por lo tanto resulten evidentes como banda separada, autónoma, que reacciona sólo con el As anti CLT, bien distinta de la banda que reacciona tanto con el As anti CLT como con el As anti Cadena Pesada. En cambio, sucede frecuentemente que la BJP esté perfectamente superpuesta a las Ig monoclonales y por ello es indistinguible con los As anti CLT mientras se evidencia claramente con los As anti CLL (Figura: 3). Por lo tanto, para el estudio con la IFE de las BJP en la orina es preferibile el uso de esquemas con As anti CLL al objeto de evitar las “trampas” y “complicaciones interpretativas” que determinan también un incremento de los costes generales. Figura: 3 Esquema de IFE de orina de muestra con CM IgG-k + k libre (BJP k) Ref Ig G Ig A Ig M CLT-κ CLT-λ Izq u ierd a IFE " tip o s u ero " co n A s an ti CLT, s in A s an ti CLL. In fo rme: CM IgG-k - B JP ausente Ref Ig CLT-κ CLT-λ CLL-κ CLL-λ Derech a IFE co n A s an ti Ig (p o liv alen te Cad en as Pes ad as ) y A s an ti CLT y CLL. In fo rme: CM IgG-k + B JP -k Las BJP presentes en la muestra tienen la misma velocidad de migración que la Ig entera y por lo tanto no se evidencian si no es con el uso de As anti Cadenas Ligeras Libres. Conclusiones La IFE es la técnica "cualitativa" más eficaz, en particular si se efectua con los As Pentavalente + As anti CLT + As anti CLL; no proporciona ninguna información "cuantitativa". veamos en detalle: New Scientific Company © Pagina: 31 Calidad: · individualidad antigénica o composición:eficaz tanto para BJP como para CLLP (sólo si se usan As anti CLL) · movilidad electroforética o distribución: eficaz tanto para BJP como para CLLP Concentración : ineficaz, ninguna información. Límites Sensibilidad variable debido a: · distribución electroforética variable de las CLL; puede resultar insuficiente para las CLLP. · diferencias entre antisueros · diferencias entre colorantes Problemas de estandarización intra e inter-laboratorio. InmunoPrecipitación en Fase Líquida (IPL) Indirecta, con antisueros anti Cadenas Ligeras Totales Nefelometría - Turbidimetría Introducción Se han formulado distintas propuestas para valorar la presencia de CLL por vía indirecta; es decir determinando con la IPL algunas proteínas y deduciendo mediante un cálculo la presencia de CLL. para un correcto encuadramiento será útil recordar que: un antisuero anti cadenas Ligeras Libres y Ligadas (As anti CLT) reacciona tanto con las CLL como con las CL ligadas a las Cadenas Pesadas junto a las que forman la Inmunoglobulina entera; es decir reacciona indistintamente con las CLL y con las Ig. un antisuero anti CLL reacciona exclusivamente con las Cadenas Ligeras que no estan ligadas a Cadenas Pesadas, es decir no reacciona con las Ig enteras. En algunos calibradores y controles comerciales constituidos por suero humano viene relacionada la concentración de Cadenas Ligeras κ y λ, expresadas en términos de Ig-κ e Ig-λ y obtenida por "estandarización interna". En estos sueros de referencia la suma de las concentraciones declaradas de IgG+IgA+IgM es, por definición, prácticamente igual a la suma de las concentraciones declaradas de Ig-κ+Ig-λ. Examinamos a continuación las propuestas más extendidas: Determinación simple de las Cadenas Ligeras Totales Se realiza la IPL, en general en analizadores automáticos dedicados, con los mismos Antisueros y Calibradores utilizados para la determinación de las CLT en el suero y con un procedimiento modificado con el fin de alcanzar una mayor sensibilidad, necesaria para la orina. Es obvio que todas las muestras con Ig urinaria resultarán positivas y, puesto que las IgG están presentes en la orina incluso en leves alteraciones glomerulares, tendremos un alto porcentaje de "falsos positivos" a controlar sucesivamente para confirmar que las CL señaladas sean CLL y con que distribución. Este método parece tener problemas de sensibilidad y problemas de exceso de antígeno [29]. Además el método, en el caso de las CLL monoclonales, acusará también la falta de paralelismo entre la reacción del calibrador y la de la muestra, indicado a propósito de la IPL directa.. En fin, el test mide una mezcla de componentes y, por ello, no puede dar ninguna información sobre la concentración de uno de los componentes o sobre sus variaciones. Indicador: (IgG+IgA+IgM)-(Ig-κ+Ig-λ) Este índice se propuso para el suero [30] y podría emplearse también para la orina. Se trata de determinar con la IPL las IgG, las IgA, las IgM, las CLT-κ y las CLT-λ. Está claro que: indice > 0 = presencia de Cadenas Pesadas Libres indice < 0 = dos posibilidades: · presencia de Cadenas Ligeras Libres · presencia de IgD o IgE. El método añade, al problema de la falta de paralelismo, la "propagación del error" que afecta a un resultado derivado de un cálculo en el que interviene cinco medidas, cada una con su correspondiente error [28]. Este indicador se ha propuesto en otras formulaciones matemáticas mas complejas que, obviamente, no resuelven el problema de base [31]. Pagina: 32 New Scientific Company © Indice de presencia de CLL: (CLT-κ + CLT-λ)-IgG Indice de BJP y tipificación: CLT-κ - CLT-λ Estos indicadores se han propuesto tanto para el nefelómetro "QM-300" [32] como para el nefelómetro "BNA" [29] para la búsqueda de las CLL en orina y para determinar si se trata de CLL policlonales o de BJP y, en este caso, de que tipo. Se trata de determinar las CLT-κ, las CLT-λ y las IgG y luego calcular dos indicadores: Indicador de presencia de CLL: CLT-κ + CLT-λ - IgG > 0 = presencia de CLL. Indicador de presencia de BJP: CLT-κ - CLT-λ > un cierto rango = BJP y su tipo. Los indicadores se han experimentado con las orinas de 219 pacientes con gammapatía monoclonal y el primer indicador, Indicador de Presencia de CLL, ha evidenciado: sobre el nefelómetro "QM-300" [32] sobre el nefelómetro "BNA" [29] · " falsos negativos " BJP κ : 16% · "falsos negativos" BJP κ : 27% · " falsos negativos " BJP λ : 24% · " falsos negativos " BJP λ : 20% · " falsos negativos " CLLP : 26%. · " falsos negativos " CLLP: 47%. No se indica nada acerca del número de "falsos positivos". A señalar que en los casos no "falsos negativos" el indicador de BJP y de tipo presenta el 100% de coincidencia con la IFE [29] [30]. Conclusiones IPL indirecta La IPL indirecta con As anti CLT muestra poca eficacia tanto para el Screening como para la cuantificación de las BJP y de las CLLP. veamos el detalle: Calidad: · individualidad antigénica o composición: ineficaz. · movilidad electroforética o distribución: ineficaz. Concentración: ineficaz. Estandarización: buena, tanto intra como inter-laboratorio [24]. InmunoPrecipitación en Fase Líquida (IPL) Directa con antisueros anti Cadenas Ligeras Libres Nefelometría - Turbidimetría Introducción Esta línea es una exclusiva de NSC y es el resultado de la labor de investigación interna. El objetivo de los kits es la determinación cualitativa y/o cuantitativa de las Cadenas Ligeras Libres en orina y Líquido Cefalorraquídeo no concentrados. El método se basa en la reacción de InmunoPrecipitación en Fase Líquida con antisueros específicos anti Cadenas Ligeras Libres. La turbidez producida por la reacción puede ser: medida instrumentalmente: turbidimetría o nefelometría: · determinación cualitativa instrumental: La señal producida por las muestras se compara con la producida por los Calibradores a la dilución seleccionada como mínima concentración significativa (Cut Off). · determinación cuantitativa: La señal producida por las muestras se interpola sobre las curvas obtenidas con los Calibradores. valorada visualmente, “a ojo”, con una iluminación adecuada: · determinación cualitativa no instrumental: La turbidez producida por las muestras se compara con la del "Blanco de Muestra" y con la de los Calibradores a la dilución seleccionada como mínima concentración significativa (Cut Off). Validez del Test La validez del test de InmunoPrecipitación será distinta según el problema: Proteínas de Bence Jones: · primera confirmación diagnóstica: el test tiene una doble validez: · Screening cualitativo cualquiera que sea el motivo del estudio, el test tiene sobre todo valor de Screening cualitativo, puesto que la monoclonalidad deberá ser confirmada con la Electroforesis o con la InmunoFijación. New Scientific Company © Pagina: 33 · indicación cuantitativa la determinación cuantitativa, a pesar de algunos límites, es útil para: · tener una orientación sobre cuanto concentrar la muestra para ulteriores estudios · tener el punto de partida para el control de la evolución. · control de la evolución: el test tiene prevalentemente un significado cuantitativo. Cadenas Ligeras Libres Policlonales: el test tiene un significado cuantitativo. Cadenas Ligeras Libres en Líquido Cefalorraquídeo: el test tiene un significado cuantitativo. Aplicaciones las aplicaciones del test se pueden esquematizar como sigue: Cualitativas: · Test de Screening en el protocolo de estudio de las "Proteínas de Bence Jones". Cuantitativas: · "Proteínas de Bence Jones" - Cadenas Ligeras Libres Monoclonales en orina. · Cadenas Ligeras Libres Policlonales en orina. · Cadenas Ligeras Libres en Líquido Cefalorraquídeo. Características del Método Especificidad Se emplean antisueros adsorbidos que reaccionan exclusivamente con los determinantes"hidden" (ocultos) de las Cadenas Ligeras Libres. La especificidad se demuestra con la ausencia de reacción específica cuando se emplea como muestra un suero humano normal. Muestra no concentrada Se usa la muestra "no concentrada" y sin ningún pretratamiento. Sensibilidad valorada por "estandarización interna" resulta de: · kits sensibilidad normal: 0.5 mg/dl · kits alta sensibilidad (HS): 0,1 mg/dl Automatización Estan disponibles kits y procedimientos operativos: · nefelómetros "BNA" y "BNII" de Dade Behring y similares. · nefelómetros "APS" e "Immage" de Beckman Coulter y similares. · analizadores automáticos de Química Clínica Determinación cuantitativa Los Calibradores de los kits permiten la construcción de las curvas de calibración para efectuar la determinación cuantitativa. Sensibilidad La sensibilidad del kit normal, valorada por "estandarización interna", alcanza e incluso supera los límites considerados "significativos" en la bibliografía para la determinación de las BJP. La sensibilidad del kit HS alcanza e incluso supera los valores considerados "normales" en orina. De las evaluaciones comparativas efectuadas resulta que el kit normal tiene una sensibilidad al menos equivalente a la IFE con el kit Paragon (Beckman) con muestra concentrada 25 veces [33]. Exactitud En la bibliografía la InmunoPrecipitación en Fase Líquida con antisueros específicos anti Cadenas Ligeras Libres se ha descrito con objetivos y procedimientos orientados a la investigación y no a su aplicación en la rutina clínica. En tal ámbito las opiniones son sustancialmente negativas, no porqué la IPL no sea capaz de evidenciar la presencia de las CLL, sino porque su determinación cuantitativa resulta inexacta debido a la presencia de CLL monoméricas, diméricas y tetraméricas [34]. Más recientemente, Tillyer ha propuesto de nuevo la IPL para su uso en rutina con buenos resultados aunque existe un cierto grado de inexactitud en el caso de CLL monoclonales, por la falta de paralelismo entre el calibrador y las muestras [1]. Estamos de acuerdo en la imposibilidad de una exacta cuantificación en el caso de las BJP y ello no sólo por la presencia de distintas formas de agregación sino también, sobre todo, por las características de monoclonalidad de las BJP que hacen que las CLL monoclonales presentes en la muestra puedan reaccionar en un modo cuantitativamente distinto respecto a las CLL del calibrador. Este hecho se evidencia con la falta de paralelismo entre la curva de reacción del Calibrador y la de la muestra. Esto es análogo a lo que sucede en la determinación cuantitativa de una Ig monoclonal sérica o en la determinación de la "relación kappa/lambda" como índice de la presencia y de la evolución de una Ig monoclonal. Pagina: 34 New Scientific Company © La cuantificación es pues, en un sentido absoluto, ciertamente inexacta. Si la IPL en el caso de CM, tanto Ig como CLL, es en un sentido absoluto inexacta, puede sin embargo proporcionar información útil acerca de las variaciones cuantitativas en el ámbito de un mismo paciente. Exceso de antígeno Es necesario distinguir dos tipos de exceso de antígeno: Exceso Relativo: el test resulta positivo pero la cantidad es inexacta por defecto. El kit permite la correcta medida del calibrador a una concentración 10 veces superior al punto más alto de la curva de calibración, es decir más allá de los 200 mg/dl. No es excepcional que las BJP alcancen valores del orden de los 2000 mg/dl. En estos casos, para tener una medida mas exacta, será necesario diluir la muestra. Exceso Absoluto: El test resulta negativo mientras la muestra es en realidad positiva. Esta situación no ha sido nunca reportada incluso en muestras con una enorme cantidad de BJP. Conclusiones La IPL directa con As específicos anti CLL muestra buena eficacia tanto para el Screening como para la cuantificación de las BJP y de las CLLP. Veamos el detalle: Calidad: · individualidad antigénica o composición: eficaz. · movilidad electroforética o distribución: ineficaz, la monoclonalidad debe ser confirmada con la EF o la IFE. Concentración: eficaz, con el límite de la potencial falta de paralelismo en el caso de las BJP. Estandarización: buena, tanto intra como inter-laboratorio [24]. New Scientific Company © Pagina: 35 Página dejada intencionadamente en blanco Pagina: 36 New Scientific Company © Capítulo VII Contrastografías y BJP Introducción Como se apuntó en el Capítulo IV, el estudio de las BJP y las CLL asume un significado aparte en el ámbito de las contraindicaciones al uso de medios de contraste (MdC) por vía inyectada (y también por “os” [16]). El argumento es “difícil” puesto que podríamos fácilmente ser acusados de "Cicero pro domo sua" (“barrer para casa”), a pesar de ello consideramos que podemos aportar alguna contribución, aunque no sea otra que el resultado de la búsqueda bibliográfica y documental específicamente efectuada. El debate se centra en los análisis que deben constituir el protocolo de confirmación de la inexistencia de contraindicaciones al uso de medios de contraste. El interés del radiólogo es conocer cuales son las condiciones del paciente que debe someterse al estudio radiográfico con el uso de medio de contraste, contrastografía, con referencia particular a los factores de riesgo conocidos; es decir, en la parte que nos ocupa, el Mieloma Múltiple y la Macroglobulinémia de Waldenström. Bibliografía: analisis y reflexiones Frecuentemente se nos consulta si existe bibliografía específica sobre las contraindicaciones al uso de los MdC en pacientes con Mieloma; la respuesta es afirmativa como veremos a continuación. La búsqueda bibliográfica fué efectuada por nosotros en 1993 sobre "todos los Bancos de Datos" accesibles por el servicio “Magic On Line” gestionado por Italcable. Efectuamos una serie de interrogaciones con modalidades y "conjuntos de claves" diferentes con el objetivo de extraer todas las referencias disponibles en los Bancos de Datos consultados. McCarthy et al en 1992 efectuaron una búsqueda análoga que es la base de la "review" publicada por ellos [19]. Nuestra búsqueda permitió extraer, además de los artículos citados por McCarthy, otros trabajos inherentes e interesantes. Es necesario precisar que la búsqueda se limitó al 1975; las referencias anteriores a tal fecha se han extraido de la bibliografía citada en los artículos publicados a partir del 1975. La misma búsqueda se ha repetido en Julio de 1999, en este caso sólo en MedLine. En la relación bibliográfica hay una lista de referencias y abstracts de algunos artículos. Análisis y Reflexiones El análisis de la bibliografía permite formular las siguientes reflexiones: En los pacientes afectados por Mieloma la Insuficiencia Renal es, por frecuencia, la segunda causa de muerte después de las infecciones. La Insuficiencia Renal Crónica (IRC) es una causa de muerte más frecuente que la Insuficiencia Renal Aguda (IRA) que sin embargo en el Mieloma tiene una prognosis muy a menudo infausta a pesar de intensivas intervenciones terapeúticas. En los pacientes afectados por Mieloma hay una estrecha correlación entre eliminación de BJP e IRA; causas concurrentes desencadenantes pueden ser la deshidratación, las hipercalcemia, los fármacos nefrotóxicos, las infecciones, los medios de contraste por vía inyectada. La bibliografía relaciona numerosos casos de pacientes que, afectados por Mieloma y en ausencia de otras causas indicadoras de Insuficiencia Renal, "después" de la suministración de medios de contraste organo-iodados han presentado una IRA casi siempre irreversible. En estos pacientes se ha documentado frecuentemente la presencia de BJP en la orina mientras que no se han reportado casos en que se haya estudiado la BJP con resultado negativo. Para la manifestación de la IRA en los pacientes afectados por Mieloma y sometidos a contrastografía, el nexo originario entre Mieloma y Medio de Contraste [17, 18] se ha ido substituyendo por el nexo entre BJP, otras causas concurrentes y Medio de Contraste [10, 16, 19, 38, 39]. La IRA no tiene una definición precisa y por lo tanto los distintos estudios relacionados en la bibliografía son dificilmente comparables. Es razonable considerar que un cierto número de casos de IRA sin oliguria no hayan sido documentados. La Bibliografía, incluso la más reciente, resulta casi unánime en considerar el Mieloma Múltiple, y sobretodo la presencia de BJP, entre los factores de riesgo para el uso de medios de contraste. La incidencia de IRA manifestada a continuación del uso de MdC por vía inyectada en pacientes con Mieloma, ha sido valorada por McCarthy [19] entre un 0.6 – 1.2%, contra un 0,15% en la población de control, y se ha relacionado un caso ocurrido después del suministro del MdC por “os” [16]. Obviamente no se dispone de estudios prospectivos acerca de la incidencia en los pacientes con Mieloma de la IRA después de contrastografía. New Scientific Company © Pagina: 37 Los medios de contraste “no iónicos” y los de “baja osmolaridad” presentan menor nefrotoxicidad respecto a los clásicos de “alta osmaloaridad”, únicamente en los sujetos con alteraciones de la función renal mientras que en sujetos normales no serían demostrables diferencias [20, 21, 41]. Por lo tanto la relación coste/beneficio no parece por el momento justificar el uso indiscriminado de los medios “no iónicos” y de “baja osmolaridad”, más costosos que los tradicionales de “alta osmolaridad” [21, 22, 40]. Aunque se pueda en teoría hipotetizar que en los pacientes con BJP el uso de medios de contraste “no iónicos” pueda reducir el riesgo de Insuficiencia Renal, no hay, por ahora, datos clínicos que lo corroboren [19, 39, 41]. Es interesante, aunque nosotros no podemos compartirla, la propuesta efectuada por Hunter et al. [40]. Un módulo informa al paciente sobre distintos aspectos y riesgos de los estudios que le ha prescrito su médico y le invita a autodeclararse si esta en la lista de pacientes que presentan un alto riesgo de reacciones adversas después del uso de MdC. En la lista se incluye el Mieloma Múltiple. El módulo informa al paciente que, en caso de declaración afirmativa para alguna de las patologías de alto riesgo, se le suministrará un MdC no iónico o de baja osmolaridad con un sobreprecio de alrededor de $100, importe que podría no ser reembolsado por su aseguradora. Debe considerarse el hecho de que el Autor afirma que el coste por ml del MdC de baja osmolaridad era, en 1994, de alrededor de $1.00, es decir 20 veces más caro en comparación con un MdC de alta osmolaridad y añade que, si en USA se hubiesen empleado exclusivamente MdC de baja osmolaridad el coste conjunto a nivel nacional hubiese sido de $15000 millones en lugar de los sólo $80 millones con los MdC de alta osmolaridad. Autodeclaración aparte, continua existiendo el problema de individualizar los pacientes de riesgo, y por lo tanto, por la parte que nos ocupa, los pacientes con Mieloma y/o BJP en los que se recomienda cautela: emplear los MdC de baja osmolaridad, evitar la deshidratación, etc.. Conclusiones La bibliografía, incluso reciente, coincide en afirmar que en los apacientes con Mieloma los estudios contrastográficos deben efectuarse con una particular cautela en especial si está presente BJP [10, 19, 35, 38, 39]. Las Circulares Ministeriales Las "Circulares Ministeriales" (en Italia) sobre este argumento son a menudo acusadas como causa del exceso de celo de los radiólogos al solicitar la determinación de las BJP para los pacientes que deben someterse a estudios radiográficos con uso de MdC. La primera es la Circular n. 81 del 9 septiembre 1975. Esta circular no nace como una iniciativa autónoma del Consiglio Superiore di Sanità Italiano sino que transcribe una comunicación de la Organización Mundial de la Sanidad (OMS). La Circular tiene carácter “dispositivo” para las Empresas Farmaceuticas para que introduzcan en los folletos de las especialidades afectadas las "Contraindicaciones" y las "Advertencias" indicadas. La sucesiva Circular n. 64 del 28 septembre 1979 rebate el contenido de la precedente y tiene carácter “informativo” para los operadores sanitarios afectados. La última Circular del 1997 no aporta nada nuevo, sobre este argumento, respecto a las precedentes. Conclusiones Las Circulares Ministeriales, al igual que la Bibliografía, incluso reciente, incluyen el Mieloma y la Macroglobulinemia de Waldenström entre las contraindicaciones al uso de medios de contraste organoiodados por vía endovasal. Folletos ilustrativos de las especialidades medicinales Las Empresas productoras de medios de contraste organo-iodados a emplear por via inyectada se adecuaron a la Circular del 1975. Protocolo Precontrastográfico Como ya se ha dicho, las BJP estan presentes en el 60-80% de los pacientes con Mieloma y en el 15-20% de los Mielomas son el único producto segregado por el clon maligno (Mieloma Micromolecular). Además, la orientación que surge de la bibliografía más reciente, es que el riesgo contrastográfico está ligado más a la presencia de BJP (y de CLL) que al propio Mieloma. Por ello, un eventual protocolo precontrastográfico deberá orientarse no tanto a evidenciar la presencia de un Componente Monoclonal (CM) en el suero como señal de Mieloma, sino sobretodo a evidenciar la presencia de BJP en la orina. Pagina: 38 New Scientific Company © La búsqueda de la CM únicamente en el suero, sea cual sea el método empleado, no es exaustiva, ni siquiera como Screening preliminar sobre el que continuar para los positivos con la determinación de las BJP en la orina; es más, el Mieloma Micromolecular se expresa con la BJP en la orina mientras el suero es en muchos casos “normal” tanto en la Electroforesis (EF) como en la determinación cuantitativa incluyendo la relación CLT-κ/CLT-λ (KLR). En otras palabras: a) la electroforesis del suero muy a menudo no es capaz de evidenciar los Mielomas Micromoleculares y por ello, si el objetivo es el de individualizar todos los pacientes con Mieloma, con la EF del suero tendremos un 15-20% de “falsos negativos”; y, por añadidura, son estos los pacientes que presentan un riesgo mayor. b) la presencia de una CM en la EF del suero es un hallazgo frecuente, alrededor del 7% de los pacientes mayores de 50 años, pero en el 97% de los casos se trata de CM benignas [35] es decir de “falsos positivos”. c) la presencia de BJP en la orina se considera uno de los elementos más importantes para diferenciar las CM malignas de las benignas; las BJP estan presentes en el 60-80% de las CM malignas. En cuanto a la sensibilidad del método a emplear para la búsqueda de las BJP en los controles precontrastográficos algunos opinan que puede ser modesta, basándose en la hipótesis de que el riesgo esté ligado a altas concentraciones de BJP. Así pues proponen emplear métodos distintos según el motivo de la solicitud del estudio de las BJP: un método poco sensible en el caso de solicitud para contrastografia y en cambio un método lo más sensible posible en todos los demás casos. Nosotros no hemos encontrado en Bibliografía estudios o indicaciones documentales que relacionen la cantidad de BJP con la entidad del riesgo. Por otra parte es sabido que la nefrotoxicidad no está tanto ligada a la cantidad de BJP (hay sujetos que eliminan una notable cantidad durante años sin presentar alteraciones de la funcionalidad renal) sino a sus características cualitativas estructurales. No parece por ello que pueda ser compartida la opinión de que, en el ámbito de la prevención del riesgo contrastográfico, el estudio de las BJP deba o pueda ser efectuada con una técnica poco sensible [26,29,32, 35]. Además no parece una opción practicable , no sólo por razones organizativas sino también por motivos éticos, diferenciar el método de estudio de las BJP según el motivo de la solicitud del análisis. Hallazgos accesorios No es en absoluto excepcional que se evidencíe la presencia de BJP en Pacientes para los que tal estudio se ha efectuado en el ámbito del protocolo precontrastográfico y sin que hubiese ninguna sospecha clínica previa. Dado el valor de marcador tumoral de las BJP, la tendencia de estos Pacientes a desarrollar una insuficiencia renal y los buenos resultados que se obtienen con una terapia aplicada a tiempo, la evidenciación de la presencia de BJP en ocasión de una contrastografía no puede más que ser considerado un hecho positivo. El estudio de las BJP en el protocolo precontrastográfico, además de ser un objetivo específico y dado el hecho de encontrar tanto BJP como CLLP absolutamente insospechadas, tiene por ello ciertamente el mérito de haber estimulado una mayor atención en las Cadenas Ligeras Libres. New Scientific Company © Pagina: 39 Página dejada intencionadamente en blanco Pagina: 40 New Scientific Company © Referencias Bibliográficas 1) 2) 3) 4) 5) 6) 7) 8) 9) 10) 11) 12) 13) 14) 15) 16) 17) 18) 19) 20) 21) 22) 23) 24) 25) 26) 27) 28) 29) 30) 31) 32) 33) 34) 35) 36) 37) 38) 39) 40) 41) Tillyer CR, Iqbal J, Raymond J, Gore M, McIlwain TJ. Immunoturbidimetric assay for estimating free light chains of immunoglobulins in urine and serum. J Clin Pathol, 1991, 44, pp. 466 - 471 Bence Jones H. - On a new substance occurring in the urine of a patient with mollities ossium. Proc R Soc Lond, 1847, 5, 673. Bence Jones H. Papers on chemical pathology. Lecture III. 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Radiology 1997 Aug;204(2):333-7 New Scientific Company © Pagina: 41 Página dejada intencionadamente en blanco Pagina: 42 New Scientific Company © Relación Bibliográfica Introducción y Leyenda La bibliografíaa se ha organizado en los Capítulos relacionados a continuación, con una abreviatura a su lado indicativa de su tipo: y Tratados (TR) y Referencias específicas de los kits NSC (RS) y Abstracts (AB), Referencias bibliográficas (RB) a su vez divididas en: · Metodos y Varios · Nefropatías · Contrastografías · Proteinuria y Muestras Tratados (TR) • • Putnam F.W. - The Plasma Proteins - Accademic Press - (Second Edition) Clerici E., Villa M.L. - Immunologia Generale - UTET - (Terza Edizione) Referencias Específicas de los kits NSC (RS) • • • • • • • • • Massaro L. - Metodo para la determinación de cadenas ligeras libres en muestras de orina, conjunto de preparados para la ejecución del método y relativo reactivo. Patente registrada. Abate L, Martelli M, Zannini R. - Proteinuria di Bence Jones: sperimentazione di un nuovo metodo immunoturbidimetrico per la determinazione delle Catene Leggere Libere nelle urine non concentrate. Biochimica Clinica, 12, 1988, pp. 1451 - 1457 e Biochimica Clinica, 16, 1992, pp. 1222 - 1229 Massaro L. Metodo Immunoturbidimetrico - Immunonefelometrico per la Determinazione delle Catene Leggere Libere nelle Urine. Riunione: SIBIOC / PROTEINE - Asti, 17 - 19 ottobre 1989. Disponibile presso: New Scientific Company Migliorati T. Uso della prova di Precipitazione in Provetta per Immunoglobuline Urinarie o loro frammenti presenti in Gammopatie Monoclonali. Biochimica Clinica, 13, 1989, pp. 1237 - 1240 Massaro L. - Lettera a Francesco Aguzzi - Commento all' articolo di Abate L. et Al. Biochimica Clinica, 14, 1990, pp. 70 - 72 Alecci A., Brandini A. Amiloidosi AL o Amiloidosi AH ? Biochimica Clinica, 14, 1990, pp. 471 - 472 Martelli M, Zannini R. 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The assay, on a centrifugal analyser, is simple and rapid. The limit of detection is 5 mg/l of free light chain, with an assay range of 5-120 mg/l, intrabatch precisions from 1.5-6.4%, and interbatch precisions from 6.5-8.9%. The assay was only slightly less sensitive than colloidal gold staining of cellulose acetate electrophoreses for the detection of Bence-Jones protein in urine. For the serial monitoring of response to chemotherapy in patients with myeloma, the assay correlated well with serum paraprotein estimates obtained by densitometric scanning of Ponceau stained cellulose acetate electrophoreses, but not with serum beta-2 microglobulin measurements, even after correction for the effects of creatinine. These assays may prove to be of use for the monitoring of tumour response in the treatment of Bence-Jones myeloma. • Tillyer CR. Department of Chemical Pathology, Royal Marsden Hospital, London, UK. The estimation of free light chains of immunoglobulins in biological fluids. Int J Clin Lab Res, 1992, 22, pp. 152 - 158. Methods for the estimation of the free light chains of immunoglobulins in serum, urine and cerebrospinal fluid are divided into two groups, electrophoretic and immunological, and the analytical performance of each method described. The problems associated with the accurate and precise determination of free light chains by the different methods are discussed and their complementary clinical roles emphasized. It is proposed that an International Reference Preparation for free light chains is established. Publication Types: • Tillyer CR. Department of Chemical Pathology, Royal Marsden Hospital, London, UK. Clinical Applications of immunoglobulin free light chain estimations. Int J Clin Lab Res, 1993, 23, pp. 25 - 29. The relevance of free light chain assays to diagnosis, staging, treatment and prognosis assessment in B-cell disorders (including myeloma, chronic lymphocytic leukaemia, and lymphoma), multiple sclerosis and diabetes is discussed and their actual and potential use is examined. Comment in: Int J Clin Lab Res 1994;24(2):120-1 New Scientific Company © Pagina: 43 • Jenkins MA; O'Leary TD; Guerin MD Department of Chemical Pathology, Heidelberg Repatriation Hospital, Vic., Australia. Identification and quantitation of human urine proteins by capillary electrophoresis. J Chromatogr B Biomed Appl 1994 Dec 2;662(1):108-12 Capillary electrophoresis, as a fully automatable, powerful analytical technique, has the potential for use in clinical laboratories for separation and identification of protein types in normal and abnormal human urine specimens. Abnormal urine specimens containing previously identified proteins, anion-exchange resin treatment and addition of known components were used to identify and determine migration times of the peaks found in the electropherogram of human urine. The correlation coefficients between capillary electrophoresis and the currently used method of high-resolution agarose gel electrophoresis for Bence Jones protein and albumin were found to be 0.95 and 0.93, respectively. • Pallotti G. et al. Valutazione Multicentrica di Metodi e Protocolli per le Catene Leggere Libere e Proteine di Bence Jones in urine - Primi Risultati. Biochimica Clinica, 19, 1995, pp 410 425 Obbiettivo del gruppo di studio è la verifica della possibilità di uniformare la valutazione, l' interpretazione e la comunicazione refertuale delle Proteine di Bence Jones (BJP) e, più in generale, delle Catene Leggere Libere (CLL) in urine. In un precedente lavoro (bib) furono presentati i primi risultati ottenuti dalla valutazione multicentrica multimetodologica di diluizioni scalari di un campione di urina con BJP lambda; in questo vengono presentati i risultati di analoga sperimentazione condotta su due campioni di urina: uno con BJP lambda e l’ altro con BJP kappa. Rileva, almeno nell' ambito dei campioni esaminati e dei metodi utilizzati, quanto segue: l' inaffidabilità del dosaggio delle Proteine Totali in urine. la relativamente bassa sensibilità dell' ElettroForesi colorata con Oro colloidale, almeno per i kit commerciali. la discreta sensibilità dell' ElettroForesi con i kit per "urine non concentrate". la buona sensibilità della ImmunoFissazione sia con gli antisieri anti Catene Leggere Totali sia con gli antisieri specifici anti Catene Leggere Libere. i buoni risultati in termini di sensibilità e di precisione (nella serie, tra serie e tra Laboratori) ottenuti con la nefelometria sia con reagenti per le Catene Leggere Totali sia con reagenti specifici diretti per le Catene Leggere Libere. La valutazione ha consentito di definire quali “campioni di controllo” almeno in termini di “positivo/negativo” la diluizione 1:60 del campione BJP-kappa e 1:100 del campione BJP-lambda. Obbiettivo futuro del gruppo di studio sarà il tentativo di uniformare il “tipo di campione” e i diversi aspetti della “comunicazione refertuale”. • Jenkins MA Division of Laboratory Medicine, Austin and Repatriation Medical Centre, Heidelberg, Victoria, Australia. [email protected] Clinical application of capillary electrophoresis to unconcentrated human urine proteins. Electrophoresis 1997 Sep;18(10):1842-6 Urine protein electrophoresis can be performed by capillary electrophoresis using spun unconcentrated urine diluted with running buffer. The separation which utilises the excellent sensitivity of capillary electrophoresis gives electropherograms similar to those obtained by diluting concentrated urine with buffer. A 72 cm x 50 microns internal diameter (ID) fused silica capillary was used for the analysis which took less than 15 min. Bence Jones protein can be detected from unconcentrated urine over urine protein concentrations ranging from 9.7 g/L to 0.04 g/L. Other clinical patterns, such as glomerular proteinuria, the presence of intact immunoglobulin and Tamm Horsfall protein can also be detected. The benefit of using unconcentrated urine is the time and cost saved by not concentrating the urine. Métodos y Varios - Referencias Bibliográficas (RB) • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • Bence Jones H. Papers on chemical pathology. Lecture III. Lancet, 1847, 2, 88-92 Bence Jones H. - On a new substance occurring in the urine of a patient with mollities ossium. Proc R Soc Lond, 1847, 5, 673. MacIntyre W. - Case of mollities and fragilitas ossium, accompanied with urine strongly charged with animal matter. Med Chir Soc, 1850, 33, pp. 211 - 232. Kyle RA, Maldonado JE, Bayrd ED. Idiopathic Bence Jones proteinuria - A distinct entity ? - Am J Med, 1973, 55, pp 222-226. Sølling K. - Free Light Chains of Immunoglobulins. Scan J Clin Lab Invest - Suppl 1981, 157, pp. 1 - 83. Solomon A. - Bence Jones proteins: malignant or benign ?. 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Biochimica Clinica, 16, 1992, pp. 1237 - 1241 Pagina: 44 New Scientific Company © • • • • • • Gasparro C, Verri A, Rovescala M, Dolce R, Bergami MR, Aguzzi F. Possibilità e limiti di una tecnica quantitativa su BNA per la ricerca della Proteina di Bence Jones nella urine. Biochimica Clinica, 16, 1992, pp. 1233 - 1237 Gasparro C, Bergami MR, Verri A, Rovescala M, Dolce R, Aguzzi F. - Detection of Bence Jones Proteins by automated Immunonephelometric measurement of IgG, kappa and lambda light chains on QM300 (Sanofi Diagnostics Pasteur). Biochimica Clinica, 16, 1992, pp. 1230 - 1233 Levinson SS. - Studies of Bence Jones Proteins by immunonephelometry. Ann-Clin-Lab-Sci. 1992 22(2). p 100-109. Aguzzi F, Merlini GP. - Aspetti Clinici dell' Analisi delle Plasmaproteine. Beckman Analytical - 1993. Aguzzi F, Gasparro C, Bergami MR, Merlini M. - High-sensitivity electrophoretic method for the detection of Bence Jones protein and for the study of proteinuria in unconcentrated urines. Ann Clin Biochem, 1993, 30 (Pt 3), p 287 - 292. Marshall T; Williams KM - Electrophoretic analysis of Bence Jones proteinuria - Electrophoresis 1999 Jun;20(7):1307-24 Nefropatías - Abstracts (AB) • Teppo-A-M. Groop-L. Fourth Department of Medicine, University Central Hospital, Helsinki, Finland. Urinary excretion of plasma proteins in diabetic subjects. Increased excretion of kappa light chains in diabetic patients with and without proliferative retinopathy. Diabetes. 1985 Jun. 34(6). P 589-94. The urinary excretion of beta2-microglobulin, albumin, kappa light chains, transferrin, and IgG as well as their concentration ratios were assessed in 27 nondiabetic patients with proteinuria and in 72 IDDM patients, 41 with proliferative retinopathy (PR) and 31 without retinopathy, matched for age, duration of diabetes, and treatment. The mean excretions of albumin, transferrin, and IgG were similar in patients with nondiabetic proteinuria and in IDDM patients with PR and were significantly higher than in IDDM patients without retinopathy. Despite similar albumin excretion, the amount of excreted kappa light chains was significantly higher in IDDM patients than in patients with nondiabetic proteinuria, resulting in an elevated kappa chain/albumin ratio. Furthermore, diabetic subjects without microalbuminuria showed increased kappa chain/albumin ratio, indicating that increased urinary excretion of kappa chains may be an early sign of diabetic nephropathy. Determination of kappa light chain excretion may have clinical implications in the differentiation between proteinuria of diabetic and nondiabetic origin. The ratio kappa chain/albumin was independent of the excretion of beta2-microglobulin in patients with PR, suggesting that the reduced ability to reabsorb immunoglobulin light chains may occur earlier than that of beta2-microglobulin in the development of tubular dysfunction in insulin-dependent diabetes mellitus. Author-abstract. • Teppo-A-M. Maury-C-P. Fourth Department of Medicine, University Central Hospital, Helsinki, Finland. Urinary protein excretion patterns in reactive (secondary) systemic amyloidosis. RHEUMATOLOGY INTERNATIONAL. 1988. 8(5). P 213-7. The urinary excretion of immunoglobulin light chains kappa and lambda, immunoglobulin G, transferrin, and beta-2-microglobulin was studied in 21 patients with nonimmunoglobulin-related amyloid nephropathy (secondary, type AA) associated with rheumatic disease and in 39 patients with glomerulopathy of nonamyloid origin, as well as in 22 patients with rheumatic disease without signs of nephropathy and in 15 healthy subjects. Patients with amyloidosis were found to have a higher ratio of excreted lambda/kappa light chains than patients with diabetic nephropathy or chronic glomerulonephritis. The increased lambda/kappa ratio was not dependent on the grade of proteinuria and was evident in patients with mild as well as heavy proteinuria. The ratio of lambda/kappa light chains in serum of patients with amyloidosis did not differ from that in healthy controls. The results suggest that amyloid deposition in the kidneys is associated with a selective alternation of the immunoglobulin light chain excretion in the urine. Author-abstract. • Walton-C. Bodansky-H-J. Wales-J-K. Forbes-M-A. Cooper-E-H. University Department of Medicine, General Infirmary, Leeds. Tubular dysfunction and microalbuminuria in insulin dependent diabetes. ARCHIVES OF DISEASE IN CHILDHOOD. 1988 Mar. 63(3). P 244-9. The nature of microproteinuria in the early years of insulin-dependent diabetes was investigated in a cross sectional study of 80 children with insulin-dependent diabetes and 40 normal children. Urinary excretion of three low molecular weight proteins: alpha-1-microglobulin, beta-2microglobulin and kappa light chains was used as an index of proximal renal tubular function. The first urine samples of the morning were collected and excretion of proteins measured was expressed as ratio of protein to creatinine. There was a strong correlation between excretion of alpha-1-microglobulin and kappa light chains and their excretion was significantly higher in diabetic children indicating decreased proximal tubular reabsorbtion. The excretion of beta-2-microglobulin was found to be an unsatisfactory index of proximal tubular function. Urinary albumin excretion was not significantly raised in diabetic children and did not correlate with urinary alpha-1-microglobulin or kappa light chain excretion. Glycaemic control might influence proximal tubular function as both urinary glucose concentration and glycosylated haemoglobin showed correlations with urinary alpha-1-microglobulin excretion and with urinary kappa light chain excretion. Author-abstract. • Hopper-J-E. Sequeira-W. Martellotto-J. Papagiannes-E. Perna-L. Skosey-J-L. Section of Hematology, University of Illinois College of Medicine, Chicago 60680. Clinical relapse in systemic lupus erythematosus: correlation with antecedent elevation of urinary free light-chain immunoglobulin. JOURNAL OF CLINICAL IMMUNOLOGY. 1989 Jul. 9(4). P 338-50. This paper reports preliminary evidence suggesting that measurements of free light-chain Ig (FLIg) in urine may represent quantitative markers of in vivo polyclonal B-cell activation. Thus, longitudinal levels of urinary FLIg in patients with systemic lupus erythematosus (SLE) may be used to track or monitor the in vivo immunopathologic B-cell activity of SLE and be helpful in predicting a disease relapse. Our findings showed that dramatic rises in urinary FLIg occurred during asymptomatic intervals that preceded by 4-8 weeks the first symptomatic signs of acute SLE relapse. These results suggest that a sizable lead time may exist between the occurrence of immunopathologic B-cell stimulation and the resultant symptoms and tissue damage of immune complex-induced acute inflammation. In these studies the measurement of urinary FLIg was accomplished by an indirect method using ng-sensitive radioimmunoassays (RIAs) that measured isotypic IgG, IgA, IgM, total kappa-Ig, and total lambda-Ig. As a control for the assessment of renal tubular function and the excretion of low molecular weight proteins in SLE patients, longitudinal measurements of beta-2-microglobulin (B2M) and lysozyme were made using a novel solid-phase 3H-biotin RIA technique. Authorabstract. New Scientific Company © Pagina: 45 • Groop-L. Makipernaa-A. Stenman-S. DeFronzo-R-A. Teppo-A-M. Fourth Department of Medicine, University Central Hospital, Helsinki, Finland. Urinary excretion of kappa light chains in patients with diabetes mellitus. KIDNEY INTERNATIONAL. 1990 Apr. 37(4). P 1120-5. The urinary excretion of kappa light chains, beta 2-microglobulin and albumin was examined in patients with newly diagnosed and long-standing insulin-dependent (IDDM) and non-insulin-dependent (NIDDM) diabetes mellitus, and compared to age-matched control subjects. Patients with IDDM diagnosed within two months, presented with normal albumin excretion, whereas the concentrations of beta 2-microglobulin and kappa light chain in urine were higher than in control subjects. The initiation of insulin therapy reduced, but did not completely normalize, the elevated rate of kappa light chain excretion. Patients with IDDM of long duration showed increased urine excretion of kappa light chains and albumin. In keeping with the findings in IDDM, patients with newly diagnosed NIDDM (within one year) showed increased urinary excretion of kappa light chains compared with control subjects. There was, however, no further increase in light chain excretion with longer duration of NIDDM. To study the effect of short-term hyperglycemia on urinary protein excretion, 12 normal subjects participated in a three-step hyperglycemic clamp study, during which their plasma glucose concentration was raised by +50, +125 and +300 mg/dl. The urine excretion of albumin and beta 2microglobulin rose progressively with each hyperglycemic clamp step, whereas that of kappa light chain excretion was unaffected by hyperglycemia. We conclude that increased urinary excretion of kappa light chain is a consistent finding in all types of diabetes mellitus, and can be observed even when the albumin excretion is normal. Since the serum concentration of kappa light chain is normal in diabetes, the increased urinary excretion of kappa light chains must be of renal origin.(ABSTRACT TRUNCATED AT 250 WORDS). Author-abstract. • Groop-L. Stenman-S. Groop-P-H. Makipernaa-A. Teppo-A-M. Fourth Department of Medicine, Helsinki University Hospital, Finland. The effect of exercise on urinary excretion of different size proteins in patients with insulin-dependent diabetes mellitus. SCANDINAVIAN JOURNAL OF CLINICAL AND LABORATORY INVESTIGATION. 1990 Sep. 50(5). P 525-32. To examine whether exercise-induced proteinuria in diabetes is dependent upon the size of the excreted protein, we measured urinary excretion of beta 2-microglobulin, kappa light chains, albumin and IgG before and after 20 min of moderate ergometer exercise in 34 patients with insulin dependent diabetes mellitus (IDDM) and in eight healthy control subjects. Seventeen patients with newly diagnosed IDDM and 17 patients (seven of which had elevated albumin excretion rate) with longstanding IDDM were studied. Exercise did not significantly influence protein excretion in control and newly diagnosed IDDM subjects. In contrast, exercise enhanced excretion of beta 2-microglobulin (p less than 0.050.01), kappa light chains (p less than 0.001), albumin (p less than 0.005-0.001) and IgG (p less than 0.01-0.001) in patients with long-standing IDDM independently of whether the patient had proteinuria in the resting state or not. In conclusion, proteinuria induced by moderate exercise is not observed in the early stages of IDDM, and is independent of the size of the excreted protein. Therefore, moderate exercise does not appear to influence the size selectivity of the glomerular capillary wall in patients with longstanding IDDM. Author-abstract. • Knudsen LM; Hippe E; Hjorth M; Holmberg E; Westin J Renal function in newly diagnosed multiple myeloma--a demographic study of 1353 patients. The Nordic Myeloma Study Group. Department of Internal Medicine, Herlev Hospital Copenhagen, Denmark. Eur J Haematol 1994 Oct;53(4):207-12 This study describes the occurrence of renal failure among 1353 newly diagnosed cases of multiple myeloma. Renal function was evaluated by serum creatinine concentration in 1353 cases, 31% of whom had renal failure at the time of diagnosis. In 1206 cases an estimation of creatinine clearance was made. When renal failure was defined by using creatinine clearance estimation, 49% had renal failure at the time of diagnosis. Renal failure was present in 24% of patients with an M component of IgG-, 31% of IgA- and 100% of IgD-type. 52% of patients with light chain disease had renal failure. The frequency of renal failure was similar in lambda- and kappa-light chain disease. Patients with a high excretion of Bence Jones protein in the urine (> 10 g/24 h) had renal failure significantly more often than patients with lower excretion. Renal failure was related to advanced disease; 41% of patients with stage III (Durie-Salmon) disease had renal failure. Renal failure was found in 45% of patients with hypercalcaemia. When estimated creatinine clearance was used as a predictor of renal function, the same trends were found as mentioned above. In addition, the proportion of patients with renal failure was found to increase with advancing age. Nefropatías - Referencias Bibliográficas (RB) • • • • • • • • • • • • • • • Reddy-J. Bailey-R-R. - Paraproteinaemia and renal papillary necrosis in three women: coincidence or not ? N-Z-Med-J. 1981 Apr 8. 93(681). P 230-1. Hill-G-S. Morel-Maroger-L. Mery-J-P. Brouet-J-C. Mignon-F. - Renal lesions in multiple Myeloma: their relationship to associated protein abnormalities. Am-J-Kidney-Dis. 1983 Jan. 2(4). P 423-38. McLeod-B-C. Viernes-A-L. Sassetti-R.J. - Serum-free light chain analysis by crossed immunoelectrophoresis: correlation with plasmapheresis in light chain disease nephropathy. Am-J-Hematol. 1983 Aug. 15(1). p 75-88. Akahonai-Y. Abe-T. Hirata-H. Ban-N. Nomura-T. Ohshima-T. Suga-M. Yachi-A. [A case of IgD (lambda) myeloma with acute renal failure due to Bence Jones protein nephropathy successfully treated by plasma exchange]. Rinsho-Ketsueki. 1984 Feb. 25(2). P 176-81. Fang LST. (Principal discussant). Light-chain nephropathy. 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This could be due to an adverse effect of Bence Jones proteins on the renal tubules or their tendency to precipitate in tubular lumina during periods of reduced tubular flow. 4) The prognosis of patients with multiple myeloma who develop acute renal failure is poor; only 5 of our 14 patients survived the early period of acutely impaired renal function, and 4 of these subsequently died within 2 months. Preventive measures particularly the prompt correction of hypercalcemia and volume depletion, are the most important aspects of patient management. Author-abstract. • Davies-P. Roberts-M-B. Roylance-J. Acute reactions to urographic contrast media. BRITISH MEDICAL JOURNAL. 1975 May 24. 02(5968). P 434-7. A prospective study of 3509 consecutive patients examined by excretion urography has been conducted to assess the incidence and significance of the untoward effects of urographic contrast media. Four compounds were used in doses containing 160 to 500 mg iodine/kg body weight. Toxic effects, arm pain, and allegic reactions were assessed separately, while the remainder were classified according to the influence of each reaction on the investigation and the need for treatment. From the results and a review of the literature we conclude that when there is a clear clinical indication for excretion urography a dose of contrast medium containing up to 600 mg iodine/kg body weight should be injected rapidly. Prophylactic antihistamine treatment and pretesting should be abandoned. Special care is needed for small infants and the lederly and for patients with renal or hepatic failure, myeloma, heart disease, or a history of previous major reaction. Full resuscitation facilities must always be available. Author-abstract. • Min-K. Cain-G-D. Gyorkey-P. Gyorkey-F. (Department of Pathology, Department of Medicine, Veterans Administration Hospital, Houston.) Myeloma-like lesions of the kidney. Occurrence in a case of acinic cell adenocarcinoma of the pancreas. ARCHIVES OF INTERNAL MEDICINE. 1976 Nov. 136(11). P 1299-302. A 54-year-old man with acinic cell adenocarcinoma of the pancreas died of oliguric renal failure associated with myeloma-like renal lesions. Electron microscopical study of the tumor cells disclosed rich rough-surfaced endoplasmic reticulum and membrane-bound secretory granules, which indicated active protein synthesis and suggested that abnormal proteins produced by the tumor cells were the underlying cause of the renal lesions. Rapid deterioration of renal function ensued after intravenous pyelography, as is usual in the syndrome of myeloma-like lesions of the kidneys. This case presents further evidence for the occurrence of "myeloma kidney" in association with tumors other than plasma cell myeloma. Author-abstract. • Shulman-G. (Department of Chemical Pathology, School of Pathology, University of the Witwatersrand, Johannesburg.) Bence Jones myelomatosis and intravenous pyelography. SOUTH AFRICAN MEDICAL JOURNAL. 1977 Apr 23. 51(17). P 574-6. The consequences of intravenous pyelography are described in 3 patients with unsuspected myelomatosis. One patient died, and 1 surviving patient showed unusual solubility of Bence Jones protein to acid pH in vitro. The urine of a third patient was negative for Bence Jones protein. Simple chemical screening of urine, to detect Bence Jones protein, is essential before patients undergo urography. Author-abstract. • Cosio-F-G. Pence-T-V. Shapiro-F-L. Kjellstrand-C-M. (Department of Medicine, University of Minnesota Hospital, Minneapolis.) Severe renal failure in multiple myeloma. CLINICAL NEPHROLOGY. 1981 Apr. 15(4). P 206-10. Twenty-four patients with multiple myeloma and renal failure severe enough to require dialysis were retrospectively analyzed. Most patients initially presented with renal failure and multiple myeloma was subsequently diagnosed. Intravenous pyelography precipitated irreversible renal failure in 2 patients. Absence of light chain disease and treatment with peritoneal dialysis were associated with increased recovery of renal fraction. The one year survival rate of myeloma patients on chronic dialysis was similar to the general myeloma population but was much worse than a group of age matched non-myeloma chronic dialysis patients. Survival rate was diminished in patients with elevated serum calcium levels. Author-abstract. New Scientific Company © Pagina: 47 • Gassmann-W. Haferlach-T. Schmitz-N. Kayser-W. Loffler-H. (Ii. Medizinische Klinik, Universitat Kiel.) [Problems of intravenous urography in patients with plasmocytoma]. Zur Problematik der intravenosen Urographie bei Patienten mit Plasmozytom. SCHWEIZERISCHE MEDIZINISCHE WOCHENSCHRIFT. JOURNAL SUISSE DE MEDECINE. 1983 Feb 26. 113(8). P 301-4. Numerous reports refer to the development of acute renal failure following intravenous urography in patients with multiple myeloma, while other authors consider the risk to be acceptable if abdominal compression and dehydration are avoided and alkalization of urine is carried out. The outcome of 34 intravenous urographies with Conray 70, Conray FL, and Conray 36 has been evaluated in 26 patients with multiple myeloma. No case of acute renal failure was observed. Two patients experienced a mild increase (greater than 0.3 mg/dl) in serum creatinine levels. Mean value of serum creatinine was 1.28 mg/dl prior to and 1.18 mg/dl after urography. In three of four patients with preexisting azotemia serum creatinine levels fell after urography, while in the fourth a mild increase from 2.0 mg/dl to 2.5 mg/dl five days after the examination was observed. Data from the literature in addition to own data are presented. From all the data taken together we conclude that intravenous urography may carry a moderately increased risk of acute renal failure in patients with multiple myeloma. It may be performed if the indication is well established. Author-abstract. • Taraba-I. Hering-A. Dialysis treatment in multiple myeloma. INTERNATIONAL UROLOGY AND NEPHROLOGY 1985. 17(4). P 373-7. The histories of three patients suffering from acute renal failure and multiple myeloma are reviewed. In two patients oliguric acute renal failure appeared following intravenous urography. Although renal failure was treated by dialysis, all the three patients died of pulmonary infection. It is concluded that prevention of renal failure is still more promising than its treatment. Author-abstract. • Fontanarosa-P-B. (Northeast Ohio Universities College of Medicine, Akron.) Radiologic contrast-induced renal failure. EMERGENCY MEDICINE CLINICS OF NORTH AMERICA 1988 Aug. 6(3). P 601-16. RCIRF is a complex syndrome resulting in acute renal dysfunction following exposure to radiologic contrast media. It accounts for 10 per cent of all cases of acute renal failure. The pathogenesis appears multifactorial but most probably involves contrast-mediated renal ischemia and direct tubular toxicity. Significant risk factors include preexisting renal insufficiency, diabetes mellitus, advanced age, volume depletion, and presence of multiple myeloma. The diagnosis should be suspected with acute renal dysfunction temporally related to radiologic contrast administration. The prognosis for recovery is good in most cases. Key preventive measures include identification of high-risk patients, ensuring adequate hydration prior to contrast agent administration, avoiding excessive and repeated contrast exposure, and instituting prophylactic therapy in selected cases. Author-abstract. 93 Refs. • McCarthy CS, Becker JA. Multiple Myeloma and Contrast Media. Department of Radiology, State University of New York, Health Science Center at Brooklyn 11203. Radiology, 1992, 183, pp. 519 - 521. Contrast media administered intravenously are still thought by many to be a major cause of acute renal failure (ARF) in myeloma patients. Recently, several authors found that the predominant risk factors of ARF in myeloma patients are hypercalcemia, dehydration, infection, and Bence Jones proteinuria rather than contrast media. In a review of seven retrospective studies of myeloma patients receiving contrast media, 476 patients were noted to have undergone 568 contrast media studies, with an ARF prevalence of 0.6%-1.25%. One large series showed the incidence of ARF after administration of contrast media to be 0.15% in the general population. Although the administration of contrast media to myeloma patients is not totally risk free, it may be performed if the clinical need arises and the patient is well hydrated. • Thatte L, Vaamonde CA Drug-induced nephrotoxicity: the crucial role of risk factors. University of Miami School of Medicine, Florida, USA. Postgrad Med 1996 Dec;100(6):83-4, 87-8, 91 passim Although the exact incidence of drug-induced nephrotoxicity is not known, it is important for clinicians to be aware of the risks in certain patients and to know which drugs are the most commonly implicated. The latter include radiocontrast agents, aminoglycosides, nonsteroidal antiinflammatory drugs, and angiotensin-converting enzyme inhibitors. Other medications also have nephrotoxic potential when they are prescribed in specific patient populations. Renal injury may be transient and mild in many cases, but recognition of the patient at high risk and application of preventive measures are essential to avoid a severe and protracted course • Rudnick MR, Berns JS, Cohen RM, Goldfarb S Contrast media-associated nephrotoxicity. Section of Nephrology and Hypertension, Graduate Hospital and the University of Pennsylvania School of Medicine, Philadelphia 19146, USA. Semin Nephrol 1997 Jan;17(1):15-26 Contrast media-associated nephrotoxicity (CM-AN) continues to be a common cause of hospital-acquired acute renal failure. This review of CMAN discusses the pathogenesis, clinical features, incidence, risk factors with an emphasis on pre-existing renal insufficiency and diabetes mellitus, volume of contrast media, low osmolar versus high osmolar contrast media, and prophylaxis. Although the literature contains an abundance of information concerning CM-AN, areas of uncertainty remain in respect to clinical significance, risk with modem day radiological techniques and contrast media, optimal prophylactic regimens, and criteria for creatinine screening before contrast media administration. Contrastografías - Referencias Bibliográficas (RB) • • • • • • • Bartels ED, Brun GC, Gammeltoft A, Gjorub PA. Acute anuria following intravenous pyelography in patients myelomatosis. Acta Med Scand, 1954, 150, p 297-302. Leucutta T. Multiple Myeloma and intravenous pyelography (editorial). Am J Roent Rad Ther Nucl Med, 1961, 85, p 187-189. Lasser-E-C. Lang-J-H. Contrast-protein interactions. Invest Radiol; VOL 5, ISS 6, 1970, P446-57. Grainger-R-G. Renal toxicity of radiological contrast media. Br Med Bull; VOL 28, ISS 3, 1972, P191-5 (REF: 39). Chavaz-A. Mignon-F. Kanfer-A. Richet-G. [Treatment of kidney failure in multiple myeloma by chronic hemodialysis. 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