Facultad de Ciencias Veterinarias - UNCPBA - Eficacia de Duddingtonia flagrans sobre larvas pre-parasíticas de rumiantes en verano Zegbi, Sara; Berisso, Raúl; Saumell, Carlos; Fernández, Silvina Diciembre, 2015 Tandil Eficacia de Duddingtonia flagrans sobre larvas pre-parasíticas de rumiantes en verano Tesina de la Orientación Sanidad de Grandes Animales, presentada como parte de los requisitos para optar al grado de Veterinario del estudiante: Zegbi Sara. Tutor: Med. Vet., Berisso Raúl Director: Med. Vet., PhD, Fernández Silvina Codirector: Med. Vet., PhD, Saumell Carlos Evaluador:Prof., MSc, Iglesias Lucía Agradecimientos Al Área de Farmacología por prestarme los ovinos con los cuales se realizó el ensayo, y a Santiago Leeson por permitirme usar sus terneros como donantes de materia fecal. A Martin Ignacio Bayala, del Instituto de Hidrología de Llanuras por los datos meteorológicos brindados. A cada uno de los que integran el Área de Parasitología y Enfermedades Parasitarias, desde los ayudantes alumnos a los profesores que me ayudaron en el presente proyecto, especialmente a mis directores Silvina y Carlos, les agradezco el apoyo, orientación y experiencia adquirida en esta etapa. A mis familiares y amigos que estuvieron siempre a mi lado acompañándome durante toda la carrera, en particular a Silvia, mi mamá, por su apoyo incondicional brindado. Resumen El presente trabajo es un ensayo experimental que tuvo como objetivo dilucidar el comportamiento predador e interacción del hongo Duddingtonia flagrans con las larvas de nematodos gastrointestinales de rumiantes en el ambiente durante el verano del 2015 sobre parcelas con pasturas consociadas en el sudeste de la provincia de Buenos Aires. Previamente se hizo una breve revisión bibliográfica sobre los nematodos gastrointestinales parásitos que afectan a los rumiantes, su ciclo y su modo de control actual, haciendo hincapié en el control biológico como herramienta alternativa de control basada en el uso de hongos nematófagos, y principalmente en D. flagrans, que fue el agente en estudio. El ensayo experimental se basó en exponer por 30 días deposiciones fecales de ovinos y bovinos con y sin el hongo a condiciones ambientales de verano bajo la sombra y al sol. Durante ese período se procedió a la recuperación y conteo de las larvas infectantes (L3) del pasto en los días 16 y 30 y al día 30 también se recuperaron las deposiciones fecales. Tanto en los grupos tratados como controles se obtuvo un bajo número de L3 y sin diferencia estadística significativa entre los mismos. A su vez durante el ensayo los registros de temperatura dentro y fuera de la materia fecal fueron analizados, atribuyéndoles a las altas temperaturas y desecación el bajo número de L3. Palabras clave: Nematodos gastrointestinales, control biológico, Duddingtonia flagrans, verano. Índice Introducción .......................................................................................1 Objetivo ..............................................................................................1 Revisión bibliográfica .......................................................................1 Parasitosis en el ganado: Nematodos tricostrongilídeos ................................ 1 Ciclo biológico................................................................................................ 2 Control actual y sus consecuencias ............................................................... 4 Alternativas de control ................................................................................... 5 Control biológico ............................................................................................ 6 Hongos nematófagos: Duddingtonia flagrans ................................................ 7 Materiales y métodos ......................................................................10 Diseño experimental .................................................................................... 10 Parcela experimental ................................................................................... 12 Donantes de materia fecal ........................................................................... 12 Material fúngico ........................................................................................... 12 Monitoreo de temperatura ............................................................................ 13 Técnicas de laboratorio ................................................................................ 13 Análisis estadísticos..................................................................................... 14 Resultados .......................................................................................14 Coprocultivos ............................................................................................... 14 Larvas en pasto ........................................................................................... 15 Larvas en materia fecal ................................................................................ 16 Temperaturas ambientales y dentro de la materia fecal ............................... 18 Discusión..........................................................................................20 Conclusiones ...................................................................................25 Bibliografía .......................................................................................25 Apéndice ...........................................................................................33 Introducción La capacidad de los hongos nematófagos de atrapar larvas de nematodos tricostrongilídeos ha sido demostrada tanto en ensayos in vitro como in vivo. La aplicación experimental de hongos nematófagos en sistemas pastoriles redujo significativamente la población de larvas en pasto y las cargas parasitarias en los animales. Uno de los desafíos aún pendientes es evaluar la aplicación de los hongos a campo en sistemas reales de producción, donde algunos aspectos ambientales que podrían influir en el rendimiento de los hongos no han sido estudiados hasta el momento. Los hongos generalmente tienen como aliado para su desarrollo la humedad del suelo y como aspectos que influyen negativamente, la falta de humedad y la acción directa del sol. Ambas condiciones son comunes de observar en los sistemas de pastoreo continuo, donde existen potreros con extensas áreas soleadas y con algunas áreas de sombra para la protección de los animales. Por lo tanto, la aplicación y acción predadora de los hongos nematófagos debe analizarse bajo las condiciones naturales para conocer su verdadero alcance a través de las diferentes condiciones ambientales durante los ciclos productivos, donde la humedad, intensidad del sol, sombra de los lugares de protección, etc., podrían influir directamente en la eficacia del hongo para reducir la población larvaria en las pasturas. Esta tesina apunta a contribuir a ese conocimiento mediante un estudio bajo condiciones naturales de verano en el centro-sudeste de la Pcia. de Buenos Aires. Objetivo Dilucidar el comportamiento predador e interacción del hongo Duddingtonia flagrans con las larvas de nematodos gastrointestinales de rumiantes en el ambiente en verano. Revisión bibliográfica Parasitosis en el ganado: Nematodos tricostrongilídeos Los nematodos gastrointestinales (NGI) de rumiantes son una de las mayores limitantes de los sistemas productivos pastoriles en nuestro país. Estos 1 parásitos pertenecen al phylum Nemathelminto, clase Nematoda, orden Strongylida, superfamilia Trichostrongyloidea, familias Trichostrongylidae y Molineidae, subfamilias Haemonchinae, Ostertagiinae, Cooperiinae, Trichostrongylidae y Nematodirinae (Soulsby, 1987). En cuanto a los géneros y especies, los principales en bovinos son: Haemonchus placei, Ostertagia ostertagi y Trichostrongylus axei en el abomaso, T. colubriformis, Cooperia oncophora y Nematodirus helvetianus en intestino delgado y Oesophagostomum radiatum en intestino grueso. En los ovinos las principales especies en el abomaso son H. contortus, Teladorsagia circumcincta y T. axei, en el intestino delgado Cooperia spp., N. battus, N. filicollis, T. colubriformis, y T. vitrinus, y en el intestino grueso O. venulosum, Chabertia ovina y Trichuris ovis (Steffan et al., 2012). En el tubo digestivo tanto de bovinos como ovinos puede haber 7-8 géneros, sin embargo, los de mayor incidencia y patogenicidad son solo 2 o 3. De este modo cabe destacar que en la recría de razas carniceras bovinas en regiones templadas/frías (predominando Aberdeen angus, Hereford y sus cruzas), Ostertagia es el género de mayor patogenicidad y junto a Cooperia, de elevada prevalencia, constituyen los principales géneros que provocan pérdidas productivas, mientras que en sistemas de cría toma importancia T. axei así como lo hace H. placei en rodeos lecheros. En ovinos los géneros de mayor importancia son H. contortus, que debido a la anemia que genera puede producir muertes asintomáticas hacia fines de primavera y otoño, y T. colubriformis, causante de diarreas a fines de otoño-invierno (Fiel et al., 2013). Ciclo biológico El ciclo de los NGI es de tipo directo y consta de una fase parasitaria y una fase de vida libre. La fase parasitaria se inicia cuando el tercer estadío larvario (L3) es ingerido por el animal junto con el pasto. Las L3 pierden su envoltura externa en rumen o abomaso, dependiendo si se localizarán en abomaso o intestino, respectivamente; en estos lugares comienza la fase histotropa hasta su desarrollo preadulto (L5). Luego, en la luz del órgano alcanzan la adultez, se diferencian en machos y hembras, se produce la cópula y las hembras ponen huevos que alrededor de las 3 semanas comenzarán a hallarse en la materia fecal de los animales. En el momento que los huevos caen al suelo con las 2 heces comienza la fase de vida libre, en la cual los huevos evolucionarán dependiendo de la temperatura, humedad y oxigenación y originarán el primer estadío larvario (L1) que luego muda a larva 2 (L2). Ambos estadíos se alimentan y tienen poca motilidad, a diferencia de las L3 infectantes que tienen gran movilidad y no pueden alimentarse al mantener la cutícula de las L2 más su envoltura externa. Finalmente las L3, si existe suficiente humedad, son arrastradas fuera de la materia fecal y en la pastura tienen la capacidad de migrar activamente de acuerdo a la humedad e intensidad lumínica esperando ser ingeridas por el hospedador y así reiniciar su ciclo (Giudici et al., 2013; Soulsby, 1987). Los efectos de la parasitosis por NGI son consecuencia directa de la acción de los parásitos, e indirecta por la respuesta del organismo, y varían según la especie animal, la categoría del rodeo/majada y los géneros parasitarios actuantes. Es de amplio conocimiento que en bovinos, ya sea una explotación para producción de carne así como tambera, la categoría de mayor riesgo parasitario es la recría (desde los 6 a los 20 meses de edad), mientras que los ovinos son susceptibles a las parasitosis durante toda su vida, presentando mayor riesgo los corderos, borregos diente de leche y ovejas durante el parto y lactancia (Fiel et al., 2013; Giudici et al., 2013). En general los NGI producen pérdida del apetito y por lo tanto reducción de la ingesta de alimentos, pérdidas de sangre y/o proteínas plasmáticas en el tracto gastrointestinal, alteraciones en el metabolismo proteico, reducción en los niveles minerales, depresión en la actividad de algunas enzimas intestinales y diarrea; todo esto contribuye a afectar la salud productiva de los animales produciendo mermas significativas en la ganancia de peso durante el crecimiento, disminuyendo la calidad y rendimiento de la res, así como también falta de desarrollo corporal para el servicio de vaquillonas y disminución de la producción de leche, mientras que en ovinos a su vez disminuye el crecimiento y calidad de lana (Steffan et al., 2012; Soulsby, 1987). 3 Periodo de Prepatencia: 3 semanas, salvo (en bovinos) en primavera que dura 4 meses (hipobiosis). Fase parasitaria: L4-L5-Adultos Fase de vida libre Ciclo de vida de los nematodos gastrointestinales. Adaptado de Steffan et al., 2012. Control actual y sus consecuencias Como medida de control de los NGI para contrarrestar los efectos mencionados con anterioridad, en Argentina se adopta casi exclusivamente el uso de antihelmínticos (ATH) químicos (Caracostantólogo et al., 2013). Sin embargo su uso desmedido e indiscriminado ha hecho que en la actualidad la aparición de resistencia a los mismos sea cada día mayor, surgiendo además la posibilidad de que aumenten los niveles de sus residuos tanto en carne como en leche, así como también la contaminación del medio ambiente (Nari y Hansen, 1999). Haciendo hincapié en la resistencia a las drogas utilizadas hoy en día, cabe mencionar que el impacto que genera en la producción es cada vez mayor, produciéndose en su mayoría pérdidas subclínicas que favorecen la diseminación de los genes resistentes, así como también pérdidas clínicas cuando los géneros involucrados son Haemonchus y Ostertagia (Anziani y Fiel, 2015). Fiel et al. (2011a) demostraron que la resistencia a la ivermectina 4 puede llegar a disminuir hasta el 50% la ganancia diaria de peso en bovinos durante un período de 90 días de pastoreo. En cuanto a la situación actual en Argentina, en ovinos ya se han detectado casos de resistencia simultánea a dos o a varios antihelmínticos (Anziani y Fiel, 2015); en cuanto a bovinos la resistencia también se incrementó aunque los casos de resistencia múltiple no son tan numerosos y los imidazotiazoles (levamisol) permanecen aún efectivos (Anziani y Fiel, 2015). Más recientemente, pero no menos relevante, surge la importancia que los residuos de los ATH en alimentos están teniendo. Desde el punto de vista económico, en el 2012 disminuyó la exportación de carnes termoprocesadas a los EE.UU. por encontrarse residuos de IVM en embarques de Argentina con ese destino; lo mismo había ocurrido en el 2011 en Brasil, donde en el 2014 se prohibió la fabricación, el fraccionamiento, la importación y la comercialización de antiparasitarios de larga duración que contengan lactonas macrocíclicas (Anziani y Fiel, 2015). Otro inconveniente que se presenta es que una vez que dichas drogas son eliminadas con la materia fecal, se produce la contaminación del medio ambiente y los niveles de ATH que quedan activos generan desórdenes sobre la biodiversidad (ecotoxicidad) de los organismos que utilizan las heces como medio de alimentación y desarrollo (Iglesias et al., 2006, 2011, Nari et al., 2013;). Sumado a todo esto, se encuentra el creciente aumento de las producciones orgánicas en nuestro país, con una superficie estimada en el 2013 de 3 millones de ha destinadas a la producción ganadera orgánica (SENASA, 2014), demandando, el muy limitado o nulo uso de ATH sintéticos. Alternativas de control Los inconvenientes que presenta el uso de ATH sintéticos generaron la búsqueda de alternativas sustentables para el control de los NGI del ganado. Dentro de las alternativas se encuentran las que buscan estimular la inmunidad del animal, como son la resistencia genética natural del animal, el desarrollo de vacunas, así como también el desarrollo inmunitario a partir de la nutrición que se le brinda al animal. Otro tipo de alternativas que surgieron son las que actúan directamente sobre los NGI ya sea en su fase parasitaria como de vida libre. Dentro de este grupo se mencionan los vegetales con propiedades antihelmínticas, los nutracéuticos y el control biológico (Saumell et al., 2005; 5 Hoste y Torres-Acosta, 2011; Nari, 2011). Hoy en día no se plantea un solo método de control sino que se busca un control integrado de los parásitos con el fin de aumentar la producción animal, racionalizar la necesidad del uso de ATH sintéticos, reducir los riesgos debido a los residuos en productos animales y disminuir la contaminación y ecotoxicidad por pesticidas; todo esto se logra combinando estrategias de tratamientos y prácticas de manejo que requerirán mayor trabajo y monitoreo (Nari et al., 2013). Control biológico El control biológico es una de las alternativas más prometedoras; el mismo se define como “un método ecológico diseñado por el hombre para reducir una población parasitaria a densidades subclínicas aceptables o para mantener estas poblaciones en un nivel no perjudicial utilizando antagonistas vivos” (Grønvold et al., 1996a). El objetivo del mismo no es eliminar la totalidad de los parásitos sino disminuir su población para así disminuir sus efectos contraproducentes (Sagüés et al., 2011a) al mismo modo que una baja carga parasitaria estimule la inmunidad del hospedador. Artrópodos coprófagos, bacterias y hongos nematófagos han sido estudiados en mayor o menor medida como agentes de control biológico. Los hongos nematófagos tienen como ventajas que se pueden combinar con otras estrategias de control, no generan resistencia, se pueden utilizar en producciones orgánicas, disminuyen el uso de ATH químicos y, por ende, la producción de residuos y no se han demostrado efectos adversos ni toxicidad ambiental; dentro de sus desventajas se encuentran con las limitantes de que hoy en día no hay productos disponibles en nuestro país, hay escaso control de las variables ambientales, se necesita mayor conocimiento epidemiológico y presentan variabilidad en los recursos financieros para desarrollar esta tecnología a nivel industrial (Etchepare et al., 2004). Los hongos nematófagos se clasifican en 4 grupos de acuerdo a la manera de actuar sobre sus presas, 1) predadores, que poseen órganos de captura como hifas adhesivas, bulbos adhesivos, anillos constrictores y no constrictores, o redes bidimensionales y tridimensionales, los cuales utilizan para atrapar los nematodos de los que se alimentan; 2) endoparásitos, que son parásitos obligados, por lo que deben ser previamente ingeridos por los nematodos para desarrollarse dentro de los 6 mismos y producirles su muerte; 3) ovicidas, que son hongos facultativos saprófitos del suelo y oportunistas que parasitan huevos de NGI y quistes de nematodos fito-parásitos; y 4) hongos que producen toxinas (Fernández y Saumell, 2012). Hongos nematófagos: Duddingtonia flagrans Sobre hongos nematófagos se basa el presente trabajo, y específicamente uno en particular que es Duddingtonia flagrans. La elección del mismo se debió a la alta eficacia (valores de eficacia entre 60 y 90% aplicado a campo) y actividad predadora que presenta tanto in vitro como in vivo sobre las fases de vida libre de diversos géneros de nematodos (incluido Nematodirus spp. y Dictyocaulus viviparus) de distintos hospedadores. A su vez, está comprobado que tiene la capacidad de atravesar el tracto gastrointestinal en forma de clamidosporas (forma de resistencia con una gruesa pared que tolera condiciones extremas), sin que esto modifique su capacidad predadora y siendo inocuas para el animal. Se suma a esto que las clamidosporas son producidas en gran cantidad lo que facilita la obtención del material fúngico para los estudios que se precisen realizar, (Larsen et al., 1992; Fernández et al., 1997; Grønvold et al., 1999; Larsen, 1999; Saumell, 2002; Fernández y Saumell, 2012;). Duddingtonia flagrans es administrado de forma oral al animal y eliminado como clamidosporas por materia fecal, donde desarrolla las formas vegetativas (hifas y conidios). Pertenece al grupo de hongos predadores por desarrollar redes tridimensionales adhesivas como órganos de captura, la red posee una capa mucilaginosa a la que quedan adheridos los nematodos debido al estímulo de los mismos. Este estímulo dependería en parte de los géneros parasitarios, por este motivo los géneros que poseen larvas más móviles como Cooperia, Ostertagia y Haemonchus, estimularían una mayor producción de redes tridimensionales, caso contrario a lo que sucede con las larvas de movimientos más lentos, como es el caso de Oesophagostomum (Nansen et al., 1988). Sin embargo, esto no se cumple con las distintas formas larvarias ya que a pesar de las L1 y L2 poseer escaso movimiento son más susceptibles a la acción del hongo que las L3 que, al conservar la vaina de la L2, son más resistentes a la mortalidad que el hongo pueda originarle (Nansen et al., 1986). 7 Nematodo atrapado en la red tridimensional (Grønvold et al., 1993) La formación de la red tridimensional comienza por una rama lateral que crece fuera de la hifa (Grønvold et al., 1996b). Formación de una clamidospora a partir de una hifa (a-c); (d) clamidospora madura con las protuberancias en su superficie (Grønvold et al., 1996b). Microscopia electrónica de una clamidospora madura de D. flagrans (Grønvold et al., 1996b). 8 Duddingtonia flagrans coloniza la materia fecal de los rumiantes como esporas y una vez que germina actúa sobre la fase no parasitaria de los NGI y debido a que más del 95% de la población total de parásitos se encuentra en el ambiente (Herd, 1985), actuaría sobre el punto de mayor importancia para el control, disminuyendo el número de L3 en la materia fecal y por consiguiente la infectividad de las pasturas (Wright et al., 2003; Ketzis, 2006). Por lo tanto, el substrato de desarrollo y acción nematófaga del hongo es la materia fecal y es ahí donde ocurre la interacción hongo-parásito, siendo el hongo afectado por factores abióticos (clima y suelo) y bióticos (coprofauna, fungistasis y pasturas), como así también por las características físicas de la materia fecal, las que van a depender tanto de la especie animal como de la dieta que reciban los mismos (Saumell et al., 2008). En este sentido, Grønvold et al. (1999) evaluaron la influencia de estos factores y demostraron que a temperatura constante de 20ºC y 30ºC y siendo estimulado por L3 de C. oncophora, D. flagrans formó redes tridimensionales eficazmente, y que la máxima cantidad de esas redes la alcanzó al día uno post-estimulación. En cuanto al volumen de oxígeno, el hongo no creció en anaerobiosis; sin embargo, en una atmósfera microaerófila (6% vol O2) creció en forma similar a lo propio en una atmósfera normal (21% vol O2). Otro factor que estos autores estudiaron fue el pH, siendo entre 7 y 8 el óptimo para la producción de redes tridimensionales. A su vez, incubaron al hongo tanto en materia fecal seca como húmeda durante 15 días y midieron el crecimiento del micelio, el cual fue mayor en la materia fecal húmeda (15-20 mm) que en la seca (7-10 mm); por último observaron que D. flagrans produjo más redes tridimensionales cuando mayor fue el número de L3 con las que se incubó. En cuanto a las características de las heces, D. flagrans tiene la capacidad de desarrollar tanto en materia fecal bovina como ovina, lo que demuestra su gran versatilidad en la naturaleza (Fernández y Saumell, 2012). Según su capacidad de crecimiento en el ambiente, D. flagrans se clasifica dentro del grupo de los hongos nematófagos no formadores espontáneos de trampas, que tiene como característica la capacidad saprófita, por lo que poseen mayor resistencia en el ambiente (Saumell et al., 2008). Ante esta particularidad cabe destacar que el uso masivo de este hongo no afecta las tasas de degradación de la materia fecal, ni modifica el número de los 9 microartrópodos, la macrofauna ni las lombrices de tierra, así como también está corroborado que no tienen un efecto relevante sobre los nematodos del suelo (Fernández y Saumell, 2012; Saumell et al., 2015). Todo esto indicaría que el uso del hongo como agente de control biológico no genera impacto ambiental en los aspectos evaluados. Se han estudiado varias formas de vehiculizar las esporas del hongo de manera práctica para su administración oral al ganado, entre las cuales se encuentran los granos de cereales, bloques minerales, bloques energéticos, pellets de alginato, bolos de liberación controlada (Sagüés, 2011a). Se utilizan las clamidosporas debido a que se ha comprobado su capacidad de sobrevivir a los procesos industriales de manufactura de pellets para alimentación animal (Arias et al., 2015), siendo en la actualidad los pellets nutricionales elaborados en México los únicos disponibles en el mercado que, además de contener clamidosporas de D. flagrans, son fuente de energía y proteína (Mendoza de Gives y Valero Coss, 2009). En lo que a la Argentina respecta, no se encuentra disponible en el mercado, sin embargo se han utilizado experimentalmente bloques energéticos con clamidosporas de D. flagrans en ovinos infectados naturalmente con NGI, obteniéndose reducciones del 100% para H. contortus y T. circumcinta, 89.9% contra T. colubriformis, 87.5% contra C. oncophora y 90% contra T. axei (Sagüés et al., 2011b) Materiales y métodos Diseño experimental El ensayo fue llevado a cabo del 2 al 30 de marzo del 2015 en una parcela experimental ubicada en el predio de la Facultad de Ciencias Veterinarias de la UNCPBA en Tandil. Previamente se recolectó materia fecal de ovinos y bovinos infectados con NGI. De ovinos en total se juntaron 9 kg de materia fecal que fue ligeramente desmenuzada manualmente y mezclada, y con la que se realizaron tres conteos de huevos de nematodos (hpg) para asegurar la homogeneidad de la misma. La materia fecal se dividió en 2 partes iguales, una de las cuales fue adicionada con clamidosporas de D. flagrans. Posteriormente, cada parte fue dividida en 22 porciones de 200 g cada una. De bovinos se 10 colectaron 25 kg de materia fecal que fue homogeneizada manualmente y se procedió igual que con la de ovinos: se realizaron tres hpg para asegurar su homogeneidad; una vez corroborado esto, se dividió en dos y a una mitad se le agregó clamidosporas de D. flagrans, luego se armaron 22 porciones individuales de 500 g de materia fecal cada una para los grupos tratados y con la mitad que quedó sin tratar se hicieron 22 porciones individuales con la misma cantidad para los grupos controles. Luego que se prepararon las porciones individuales, las mismas fueron llevadas a la parcela de pastura consociada y se depositaron de la siguiente manera: la mitad de las porciones tratadas y controles se depositaron en un sector que se encontraba expuesto al sol, mientras que la otra mitad se depositaron en un sector cubierto con una media sombra (bloqueaban 80-90% la irradiación solar) para que estuvieran bajo sombra continua. De manera que tanto en el sector al sol como en el sector a la sombra se depositaron 44 muestras, las cuales consistieron en 10 controles y 10 tratadas de ovinos, y 10 controles y 10 tratadas de bovinos, y las restantes 4 se establecieron como deposiciones artificiales centinelas, uno por cada grupo. Estas deposiciones centinelas permitieron detectar, mediante muestreos semanales, la aparición de L3 en la materia fecal, y así determinar el momento oportuno de comenzar a muestrear la pastura. Todas las masas fecales fueron colocadas sobre rejillas plásticas de 1 cm de apertura y de un tamaño de 10 x 10 cm y de 15 x 15 cm para ovinos y bovinos, respectivamente. Estas rejillas facilitaron la recuperación de las deposiciones fecales a la vez que permitieron la interacción natural entre suelo y materia fecal de la micro y macrofauna. Las deposiciones se colocaron a 1,5 m de distancia entre una y otra. Las muestras extraídas de las deposiciones centinelas pesaron 12-21g (ovinos) y 25-37g (bovinos). Con estas muestras se realizó la recuperación de larvas mediante la técnica de Baermann. Con los resultados de los muestreos de las deposiciones centinelas a la semana 1 se decidió comenzar con el primer muestreo de pasto a la semana siguiente (día 16 post-deposición), mientras que el segundo muestreo y las deposiciones fecales se recolectaron dos semanas después (30 días postdeposición). Las deposiciones fecales recolectadas fueron sometidas a la 11 técnica de Baermann para recolectar las L3 remanentes. Las larvas extraídas tanto del pasto como de la materia fecal fueron conservadas a 5ºC para su posterior conteo e identificación. Con parte de la materia fecal tratada y control se realizaron 40 coprocultivos, 10 de cada grupo (ovino control y tratado, bovino control y tratado) para establecer los géneros presentes en la infección parasitaria y corroborar la actividad predadora del hongo bajo condiciones de laboratorio. Parcela experimental La parcela seleccionada se encontraba libre de animales en pastoreo, sin embargo, previo a la deposición de las masas fecales artificiales, se recolectó pasto de la parcela para corroborar la ausencia de L3 de NGI de rumiantes que pudieran influir en los resultados finales. El suelo de la parcela es caracterizado como argiudol típico, cubierto por una pastura compuesta por trébol blanco (Trifolium repens), trébol rojo (T. pratense), raigrás (Rye grass) y pasto ovillo (Dactylis glomerata) (Iglesias et al., 2004). Donantes de materia fecal En el caso de ovinos se utilizaron machos Corriedale de 8 meses de edad, experimentalmente infectados con H. contortus y mantenidos en la Chacra de la Facultad de Ciencias Veterinarias de Tandil. Las muestras de materia fecal de ovinos se extrajeron colocándole a los mismos arneses de colecta y recolectándola a intervalos de 24 Hs. En cuanto a bovinos, se utilizaron terneros Holando Argentino naturalmente infectados con NGI y que no recibieron tratamientos químicos, pertenecientes a un tambo comercial cercano a la unidad experimental. La materia fecal se recolectó como pool fresco a primera hora de la mañana después de encerrar a los animales en corral con piso de cemento para permitir la defecación. Se realizó conteo de hpg de la materia fecal y luego se conservó a 5ºC en una cámara hasta su utilización. Material fúngico Se utilizaron clamidosporas de una cepa local de D. flagrans mantenida en el laboratorio de Parasitología y Enfermedades Parasitarias (Saumell et al., 2015), las cuales previamente habían sido sembradas en una placa de agar agua con 12 el agregado de Panagrellus sp. para estimular el desarrollo del hongo y así poder corroborar su capacidad de crecimiento y desarrollo (formar hifas, redes tridimensionales y micelios) y su utilidad para el ensayo. La cepa que se usó fue sembrada el 2-07-2014 y cosechada 28 días después. La cantidad de material fúngico que se utilizó fue de 11.000 clamidosporas/g de materia fecal; la decisión de usar dicha cantidad surgió de ensayos previos realizados en el mismo laboratorio (Fernández, S., comunicación personal). Monitoreo de temperatura La temperatura dentro de las deposiciones fecales fueron monitoreadas mediante la introducción en las mismas de sensores electrónicos (Datalogger Hygrochron iButton®), uno para cada uno de los 8 grupos. Cada sensor se colocó en una deposición seleccionada al azar. Las temperaturas ambientales se obtuvieron de la Estación Meteorológica del Campus Universitario de la UNCPBA, perteneciente al Instituto de Hidrología de Llanuras “Dr. Eduardo J. Usunoff” y las mismas fueron medidas a 2 m de altura con respecto al suelo. Técnicas de laboratorio Los conteos de huevos por gramo (hpg) se realizaron mediante la técnica Mc Master modificada (Fiel et al., 2011). Los coprocultivos se realizaron mediante una técnica estándar (Fiel y cols, 2011) y luego de un período de incubación de 14 días a 22-24 ºC, las L3 fueron recuperadas mediante la técnica estándar de migración larval de Baermann. Las L3 se mantuvieron refrigeradas a 4ºC hasta su posterior conteo e identificación (Niec, 1968) bajo el microscopio óptico. Los lavados de pastos se realizaron mediante técnica estándar (Ministry of Agriculture, Fisheries and Food, 1986) con la modificación que después del lavado se sacó el pasto, se escurrió y se colocó en bolsas de red para su secado, y una vez que este alcanzó un peso constante en el tiempo, ese peso fue el que se expresó en materia seca. En cuanto a las L3 recuperadas, las mismas se conservaron a 5ºC para su posterior lectura e identificación. La 13 infectividad del pasto se expresó como número de larvas por kg de pasto seco (PS) usando la fórmula: L3/ kg PS= (Nº de L3 contadas/ peso del PS en g) x 1.000 Con las deposiciones fecales recolectadas de la parcela se realizó un macrobaermann (Grønvold, 1984) durante 48 hs, luego con el líquido recuperado se realizó otro Baermann (Fiel et al., 2011). Previo a realizar la recuperación de larvas, fue necesario sumergir la materia fecal bovina en agua por 3-4 h para lograr un correcto desmenuzado de la misma y recuperando el agua utilizada para este fin junto con la materia fecal. Análisis estadísticos Los análisis estadísticos fueron realizados usando el software GraphPad Prism (GraphPad Software, Inc), versión 5.04. En todos los casos se realizó el Test no paramétrico Kruskal-Wallis y el post-test Dunn siendo para todos el intervalo de confianza de 95%. Resultados Coprocultivos Bajo condiciones de laboratorio controladas los coprocultivos de ovinos mostraron buen desarrollo larval. Partiendo de que la materia fecal de ovinos presentaba un Hpg promedio de 3007 huevos, y de acuerdo a lo recuperado en los controles, hubo un 64,2% de desarrollo larval, mientras que en bovinos ese porcentaje fue de 24% de acuerdo a los 237 Hpg promedio. En cuanto a los géneros que se presentaron en ovinos, sabiendo que estaban experimentalmente infectados, predominó Haemonchus siendo 99,7 y 99,5 % en control y tratado, respectivamente, las larvas restantes fueron de Oesophagostomum. Los géneros en bovinos fueron más variados presentando los controles 42,5% de Ostertagia, 16,7% Trichostrongylus, 17,5% Haemonchus, 22,3% Cooperia y 1% Oesophagostomum y para los tratados 29,6% de Ostertagia, 23,1 % Trichostrongylus, 17,5% Haemonchus, 28,8% Cooperia y 1% Oesophagostomum. Con respecto a la eficacia del hongo (Gráfico 1), la misma resultó de 31,6 % en la materia fecal de ovinos y de 44% 14 en la de bovinos, en ambos casos no se halló diferencia significativa entre el grupo control y tratado (P>0,05). 25000 L3/10 g MF 20000 15000 10000 31.6% 5000 44% B T B C O T O C 0 Gráfico 1: promedio de L3 recuperadas por 10g de materia fecal de ovino control (OC), ovino tratado con D. flagrans (OT), bovino control (BC) y bovino tratado con D. flagrans (BT). Se muestran los porcentajes de eficacia de D. flagrans. Larvas en pasto En la recuperación de larvas del pasto (Gráfico 2) no se detectaron diferencias estadísticas significativas entre tratados y controles debido al bajo número de L3 que en general fue recuperado. La única diferencia con significancia estadística fue la que se encontró entre OCS 30 y OCSb 30 (P<0,01). En el apéndice se adjunta el total de L3/kg de PS para los controles y para los tratados, a su vez se adjunta un cuadro con los pesos promedio de PS de cada grupo. 15 40 35 30 L3/kg PS 25 20 15 10 5 16 O TS b 16 B C S 16 B TS 16 B C Sb 16 B TS b 16 O C S 30 O TS 30 O C Sb 30 O TS b 30 B C S 30 B TS 30 B C Sb 30 B TS b 30 Sb 16 O C O TS O C S 16 0 Gráfico 2: Promedios y sus respectivos desvíos estándar de L3 por kg de pasto seco que fueron recuperadas a mitad (día 16) y al final (día 30) del ensayo. O: ovinos, B: bovinos, C: controles, T: tratados, S: sol, Sb: sombra. Larvas en materia fecal En cuanto a la recuperación de las L3 de la materia fecal, no se encontró diferencia significativa entre los grupos controles y tratados; pero hubo diferencias significativas entre muestras depositadas al sol y a la sombra en el caso de la materia fecal de bovinos, es decir, entre el BCS y BCSb (P<0,001) y entre BTS y BTSb (P<0,05). El Gráfico 3 muestra el promedio del total de larvas recuperadas en el total de materia fecal de cada grupo. Al ser tan bajo el número de L3, expresarlas en L3/ g de materia fecal no permitió apreciar si hubo diferencia alguna, por lo que el mismo se encuentra adjunto en el apéndice (Apéndice: Gráfico 2). 16 3000 2500 2000 1500 1000 500 200 180 L3 160 140 120 100 80 60 40 20 TS b B Sb C B B TS S C B O TS b O C Sb O TS O C S 0 Gráfico 3: promedio del total de L3 que se recuperaron de cada grupo al finalizar el ensayo. O: ovinos, B: bovinos, C: controles, T: tratados, S: sol, Sb: sombra. En cuanto al peso de la materia fecal recuperada, en el cuadro siguiente se detalla el promedio de pesos por grupo y entre paréntesis el desvió estándar de los mismos. Tabla 1: peso (g) de la masa fecal recuperada al finalizar el ensayo Día 30 Grupos Ovino Bovino CS 81,52 (11,8) 81,37 (2,2) TS 56,63(16,3) 82,86(2,9) CSb 73,62 (11,3) 98,13 (12,1) TSb 37,51 (15,5) 91,2 (6,5) El peso de la materia fecal, sobre todo en el caso de bovinos que se usaron 500g, refleja el grado de deshidratación que sufrió durante los 30 días en la 17 pastura. La materia fecal de bovino recuperada en promedio de todos los grupos fue de 88,4g lo que representa el 17,7% de lo que había en un principio. Con las deposiciones de ovinos, en cambio, fue menos brusco debido a que de por sí ya es más seca, sin embargo, al poseer menor contenido acuoso se seca menos pero más rápido. Por otra parte, la comparación de pesos de las deposiciones fecales recuperadas refleja que la inclusión masiva de clamidosporas no modificó las características físicas de la materia fecal. Temperaturas ambientales y dentro de la materia fecal Las condiciones ambientales entre el 1 y el 30 de marzo fueron típicas de un verano caluroso y seco, esto se debió a las temperaturas registradas y a que no hubo registro de precipitaciones durante esos 30 días. Las temperaturas registradas tuvieron un rango de 5,6-33ºC con un promedio de 20ºC. Se tomaron como límites de temperaturas de supervivencia larval las que tienen H. contortus y Ostertagia en laboratorio, debido a que fueron éstos los géneros predominantes en los coprocultivos de ovinos y bovinos respectivamente. La temperatura ambiental fue registrada cada 15 minutos, mientras que la temperatura dentro de la materia fecal fue registrada mediante sensores cada 30 minutos. Temperaturas en materia fecal de ovinos: La temperatura registrada dentro de la materia fecal de ovinos por los sensores fue mayor en las deposiciones al sol que a la sombra, superando en el OTS los 37ºC un total 75 h y en el caso de OCS 38 h, mientras que a la sombra no alcanzó esa temperatura, sin embargo, en un total 34 h se encontró por encima de los 30ºC el OCSb y 19 h en el OTSb. 18 50 45 Temperatura (ºC) 40 37 35 30 25 20 15 10 5 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 Marzo 2015 (días) 22 24 26 28 OTS - T max OTSh - T max OCS - T max OCSh - T max OTS - T min OTSh - T min OCS - T min OCSh - T min T ambiente max T ambiente min 30 Gráfico 4: Temperaturas máximas (T max) y mínimas (T min) registradas por los sensores dentro de las deposiciones de cada grupo, y temperatura ambiental máxima y mínima durante el periodo experimental. La línea horizontal a 37ºC marca el límite de supervivencia para H. contortus en condiciones de laboratorio (Mahmood, 1974). Temperaturas en materia fecal de bovinos: Se registraron temperaturas por encima de los 35ºC en la materia fecal de bovinos en un total de 63 y 91 h para los grupos BCS y BTS respectivamente, no siendo esta temperatura superada en la sombra, donde se registraron temperaturas superiores a los 30ºC por 34 y 26 h para los grupos BCSb y BTSb respectivamente (Gráfico 5). 19 50 45 Temperatura (ºC) 40 35 30 25 20 15 10 5 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 Marzo 2015 (días) 22 24 26 28 30 BTS - T max BTSh - T max BCS - T max BCSh - T max BTS - T min BTSh - T min BCS - T min BCSh - T min T ambiente max T ambiente min Gráfico 5: Temperaturas máximas (T max) y mínimas (T min) registradas por los sensores dentro las deposiciones de cada grupo, y temperatura ambiental máxima y mínima. La línea horizontal a 35ºC marca el límite de supervivencia para Ostertagia en condiciones de laboratorio (Pandey, 1992). Discusión Los resultados obtenidos evidenciaron que el ambiente tuvo un fuerte efecto sobre la supervivencia larval pero no así sobre su desarrollo. Los huevos fueron capaces de eclosionar y las fases pre-infectivas lograron desarrollar según lo evidenciado por las deposiciones centinelas (Tabla 2 del Apéndice), que mostraron que a los 9 días post-deposición ya había un alto desarrollo de L3. La fase de vida libre de los NGI es controlada por los factores climáticos, siendo la temperatura y humedad los que mayor influencia tienen sobre la epidemiología de los mismos (O'Connor et al., 2006). La temperatura óptima de 20 las L3 de H. contortus es de 30ºC con límite máximo de 37ºC siendo 27 días la supervivencia de las L3 a esa temperatura (Mahmood, 1974). El bajo número de L3 recuperadas se debió a las altas temperaturas alcanzadas en el mes de marzo del 2015 tanto en el ambiente como dentro de la materia fecal. Las temperaturas altas aceleran el metabolismo y la movilidad de las L3 que consumen su reserva energética y por ende disminuye el tiempo de sobrevida de las mismas en el medio (Rossanigo, 1999). A su vez la falta de precipitaciones durante este periodo hizo que a las altas temperaturas se le agregue una desecación extrema de la materia fecal, sabiendo que cuanto más rápida sea la desecación sobrevivirán menos larvas y por menos tiempo (Fiel et al., 2013). Al respecto, Rossanigo (1999) demostró que entre 25 y 30ºC la sobrevida promedio de las L3 no fue mayor a 30 días en un verano donde el 27% de los días la temperatura superó los 30ºC. A modo de comparación, en el presente ensayo se registraron temperaturas mayores a 30ºC en el 36,7% de los días. También Williams y Mayhew (1967) notaron que desde fines de primavera a fines de verano se produjo la reducción más abrupta en el número de larvas y coincidió con el tiempo más corto de supervivencia larval. Por su parte, Bessier y Dunsmore (1993), comprobaron que durante un verano seco y caluroso, cuando las pasturas estaban completamente secas, las L3 no desarrollaban, generándose así una efectiva barrera para H. contortus. Los mismos autores realizaron otro ensayo donde a la materia fecal la colocaron en una parcela con pasturas perennes verdes y así demostraron que a mayor cantidad de material vegetal verde, más se incrementó el periodo de supervivencia de las L3 en verano, esto se debe a la humedad que aporta la vegetación. El presente ensayo concuerda con el primer caso descripto por estos autores, ya que el pasto había sido cortado previamente al ensayo y, gracias a las altas temperaturas y a la ausencia de lluvias, no creció en absoluto como para ser una fuente extra de humedad para las deposiciones fecales; esto se refleja en el bajo peso de las deposiciones fecales al final del ensayo debido a la alta pérdida de humedad experimentada. El nivel de material vegetal verde influye en la humedad de la deposición fecal, tanto directamente como determinante del contenido acuoso de la materia fecal eliminada por el animal, como indirectamente por el efecto de microclima dado por especies vegetales en la pastura evitando o retardando la desecación 21 (O'Connor et al., 2006). El efecto sombra tuvo mejor respuesta en cuanto al número de larvas obtenidas, sin embargo este número fue tan bajo que no se puede afirmar que la sombra evita la muerte de las larvas; lo que sí se constató fue que bajo estas condiciones los grupos tratados no mostraron diferencias en los números de L3 ni en la sombra ni expuesto al sol en comparación con los controles. Lo mencionado en el párrafo anterior justifica el bajo número de larvas recuperadas pero no esclarece lo que pudo haber pasado con D. flagrans. La eficacia del hongo no pudo establecerse porque las larvas no sobrevivieron, y al haber tan bajo número de larvas tanto en deposiciones controles como tratadas, ese efecto no se le puede atribuir al hongo sino más bien a un efecto ambiental. No hay resultados certeros de lo que ocurrió con las clamidosporas de D. flagrans ya que en este sentido no se analizó la materia fecal post ensayo en busca de las mismas. Sin embargo, muchos estudios previos pueden llegar a dilucidar y predecir lo ocurrido. En este sentido, es sabido que D. flagrans es capaz de producir trampas entre 10 y 30ºC sin embargo la destrucción de las redes es mayor a 30ºC que a 20ºC, esto se explica porque a 30ºC hay una fuerte actividad microbiológica, lo que resulta en una lisis de las hifas y redes (Grønvold et al., 1999). La actividad predadora de D. flagrans se ve afectada in vitro por encima de los 35ºC, mientras que estudios realizados en el ambiente a temperaturas fluctuantes entre 13 y 51ºC expuestos al sol demostraron una eficacia del 77,4% mientras que a la sombra, al ser menor el rango de temperatura, la eficacia fue del 100% (Sagüés et al., 2009). En un estudio realizado in vitro simulando 4 regímenes de temperaturas en la época típica de partos de ovejas en Australia (6-19ºC, 9-25ºC, 14-34ºC y 14-39ºC) para simular la variación diurna normal de temperatura, se obtuvo una eficacia promedio contra larvas de H. contortus de 96.4% indicando que las temperaturas no son una barrera para el uso de D. flagrans como control biológico bajo esas condiciones (Kahn et al., 2007). Otro estudio, evaluó el crecimiento radial y la actividad predadora in vitro bajo tres regímenes diferentes de temperaturas constantes y fluctuantes (Fernández et al., 1999). Este estudio mostró la mayor tasa de crecimiento fúngico a temperatura constante de 20ºC. Al incubarse coprocultivos con C. oncophora durante 14 22 días bajo los mismos regímenes de temperaturas, se obtuvo una eficacia de 63-98% a 20ºC constantes en comparación con 0-25% de eficacia obtenida a la misma temperatura pero fluctuante con picos de 35ºC. Con esos datos se concluyó que 35ºC, incluso por pocas horas al día, era una temperatura demasiado alta y que, además, afectó también negativamente el número de larvas desarrolladas según se vio reflejado en los controles. Los autores estimaron, por lo tanto, que no fueron los cambios de temperatura en sí lo que afectó al desarrollo larval y del hongo sino que la temperatura se elevó por encima de los límites superiores de supervivencia tanto para D. flagrans como para las L3. Al respecto, Peloille (1991) registró un límite superior para el crecimiento de D. flagrans de 35ºC, no encontrando desarrollo a los 37ºC. Es de destacar la capacidad de D. flagrans de crecer en sustratos pobres o con poca humedad y su intensa capacidad saprófita, sin embargo su desarrollo es mayor en condiciones de periodos lluviosos, lo que coincide con el mayor desarrollo de las formas de vida libre de los NGI de rumiantes (Saumell et al., 2008). Las condiciones ambientales toman importancia en determinar la velocidad de inducción de la actividad predadora del hongo y en consecuencia la eficacia de este método (Paraud et al., 2006). Con todo lo anteriormente mencionado, es de esperar que D. flagrans no haya tenido la capacidad de crecimiento y de actividad predadora que se esperaría. A esto hay que agregarle que las altas temperaturas habrían sido también responsables de los bajos números de larvas, los que no habrían sido suficientes como para estimular el desarrollo y crecimiento del hongo. Sumado a la temperatura y humedad como último, pero no menos relevante para tener en cuenta, es la observación cualitativa de la ausencia de macrofauna en las deposiciones recuperadas, por lo que se podría pensar en que esa materia fecal no se encontraba en condiciones óptimas en un principio de oxigenación y luego de humedad para el desarrollo de la misma, factores que adquiere importancia tanto para las larvas como para el hongo. El diseño experimental descripto en esta tesina fue realizado en la primavera del 2014, durante 28 días, con temperaturas promedio dentro de las deposiciones fecales al sol de 17,1ºC y 16,7ºC para ovino y bovino respectivamente y a la sombra de 14,17ºC para ovino y 15ºC para bovino. 23 Dicho ensayo mostró reducciones en la recuperación de L3 ovinas en pasto de 92,8% (P<0,0001) en el sol y 77,9% (P=0,14) en la sombra, mientras para bovinos esta reducción fue de 88,6% (P=0,00011) expuesto al sol y de 72,2% (P=0,0265) bajo la sombra (Fernández et al., 2015). Otro ensayo con similares características realizado en esta zona a fines de primavera-principios de verano del 2012, con temperaturas medias ambientales entre 15 y 20ºC y picos de casi 33ºC (similar al presente ensayo) y precipitaciones acumuladas de 65 mm en 15 días, dieron un total de reducción a la sombra de 92,3% (P<0,0001) y al sol de 58,7% (P<0,01) (Bilotto, 2013). Este último estudio da una idea de lo que se supone sucedió con la materia fecal bajo sombra en el presente ensayo. Si bien no se alcanzaron las temperaturas límites de supervivencia larval (como sucedió con las deposiciones expuestas al sol), hubo una alta mortandad de L3 debido a la ausencia de humedad por la falta de precipitaciones, que hizo que la desecación fuera un factor determinante en dicha mortandad. Con respecto a la baja eficacia del hongo que se obtuvo en los coprocultivos bajo condiciones controladas de laboratorio, esta pudo deberse a una falla en el almacenamiento de las clamidosporas de D. flagrans utilizadas en el presente ensayo. Esto puede ser posible porque se corroboró su eficacia previamente al ensayo sólo cualitativa pero no cuantitativamente, es decir, sólo se comprobó que las clamidosporas podían desarrollar su capacidad predadora al adicionar nematodos del suelo pero sin cuantificar los niveles de predación. La atribución a las malas condiciones de almacenamiento se debe a que desde fines de julio a la fecha de su utilización las mismas fueron mantenidas en forma líquida bajo refrigeración, lo que las pudo haber afectado, sabiendo que la exclusión del agua frena el metabolismo fúngico, la depleción de nutrientes, la acumulación de metabolitos tóxicos y la desnaturalización de proteínas. Se puede suponer entonces que la eliminación del agua hubiese asegurado la estabilidad, viabilidad y actividad post-almacenamiento (Burges y Jones, 1998 citados por Etchepare et al., 2004). Esto se constata porque previamente, en la primavera del 2014, se utilizó el mismo lote de clamidosporas, que tenía menos tiempo de almacenamiento y la eficacia fue mayor, lográndose para ovinos una eficacia del 78,3% (P<0.05) mientras que para bovinos fue de 67,7%(P<0.05) (Fernández et al., 2015). 24 Conclusiones Bajo las condiciones experimentadas durante el presente ensayo, de altas temperaturas y sequedad extrema durante los 30 días, no se puede concluir si D. flagrans puede o no aplicarse en verano. Sin embargo, sí se puede asegurar que de llegar a presentarse finales de veranos con similares condiciones, el uso de este método como control biológico no sería necesario porque el ambiente por si sólo ya estaría disminuyendo las formas de vida libre de los NGI parásitos de rumiantes en la pastura. Cabe recordar que el control biológico con D. flagrans no puede usarse aislado para controlar los NGI, necesita complementarse y ser incorporado dentro de un sistema de control integrado de parásitos. En este sentido, el efecto ambiental debe ser tenido en cuenta como parte de ese manejo integrado, destacando la necesidad de más estudios a campo que determinen la relación entre las variables climáticas en el ambiente y la temperatura y humedad dentro de la materia fecal, y de esta forma tener las herramientas para tomar decisiones precisas y específicas adaptadas a cada sistema productivo en cada estación en particular. En cuanto a la forma de almacenamiento del hongo, en ensayos futuros donde se utilicen clamidosporas de D. flagrans, se deberá tener la cautela de conservarlas con la menor cantidad de líquido posible y, de no ser posible, usar las clamidosporas que hayan estado almacenadas por menos tiempo. Debiendo, de ser necesario, un mes previo a un ensayo, sembrar más clamidosporas y así asegurarse de que no estén influidas por ningún efecto de almacenamiento, así como también pruebas que garanticen la viabilidad y actividad fúngica. Bibliografía Anziani, O. S.; Fiel, C. A. (2015). Resistencia a los antihelmínticos en nematodos que parasitan a los rumiantes en la Argentina. Revista de Investigaciones Agropecuarias. 41, 34-46. Arias, M. S.; Cortiñas, F. J.; Riádigos, S.; Cazapal-Monteiro, C.; Arroyo, F.; Hernández, J. A.; Suárez, J.; Ramírez, M.; Francisco, I.; López-Arellano, M. E.; 25 Sánchez-Andrade, R.; Mendoza de Gives, P.; Paz-Silva, A. (2015). 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Es la sumatoria de L3 en pasto de todos los grupos controles ovinos (OC) y bovinos (BC) y todos los grupos tratados ovinos (OT) y bovinos (OT). 33 Peso del PS Tabla 1: Promedios de los pesos de PS(g) y entre paréntesis el desvió estándar a los 16 y 30 días pos deposición (o del inicio de ensayo). Día 16 30 Grupos Ovino Bovino CS 116,8 (9,31) 87,87 (20,7) TS 116,91 (32,04) 129,54 (26,3) CSb 119,65 (23,99) 117,59 (30,3) TSb 142,51 (20,8) 125,06 (15,07) CS 74,52 (18,7) 79,9 (10,3) TS 121,56 (28,7) 114,38(35) CSb 79,59 (41) 94,19 (23,3) TSb 109,64 (22,5) 148,24 (58,1) L3/g de materia fecal 32 28 24 16 12 8 4 b TS B B C Sb TS B S C B O TS b Sb O C O TS S 0 O C L3 / g MF 20 34 Gráfico 2: promedio de L3 por g de materia fecal (MF) recuperadas de los distintos grupos. O: ovinos, B: bovinos, C: controles, T: tratados, S: sol, Sb: sombra. Centinelas Tabla 2: L3/g de materia fecal obtenidas en las distintas fracciones que se fueron extrayendo semanalmente de una de las muestras de cada grupo utilizadas como centinelas. Grupos 9 de Marzo 16 de Marzo 30 de Marzo BCS 6,1 0,9 0,1 BTS 5,5 9,5 0,7 BCSb 3,8 34,0 7,8 BTSb 6,9 24,6 3,1 OCS 185,8 0,0 1,2 OTS 214,2 0,7 3,3 OCSb 86,0 2,5 OTSb 547,2 47,1 0,0 35