Cepas vínicas - digital

Cepas vínicas de Saccharomyces cerevisiae con bajo
rendimiento en etanol
Ramón González , José María Barcenilla y Laura Tabera
Instituto de Fermentaciones Industriales, CSIC
Desde el punto de vista de la microbiología enológica, y asociados al cambio climático, las
variaciones previstas en las condiciones ambientales (temperatura, estrés hídrico, etc.),
en la composición del sustrato, o incluso en la fisiología de la baya y en las técnicas de
cultivo, hacen probable que se modifiquen la ecología, la biodiversidad y el metabolismo
de la microbiota de la viña, la uva, el mosto y el vino. Uno de los aspectos de este
problema que más inquieta a los productores es que, para alcanzar la madurez fenólica
apropiada, el contenido en azúcar de la uva y el grado alcohólico esperado irán
probablemente en aumento, dando lugar a dos situaciones potencialmente negativas, en
función también de otros factores, como el estilo de vinificación.
Por un lado está la posibilidad de fermentaciones incompletas, si se supera el nivel de
tolerancia al etanol de las levaduras predominantes durante el proceso de fermentación
(que en principio serán células de la cepa utilizada como cultivo iniciador), dando lugar a
vinos con exceso de azúcar residual, microbiológicamente inestables y sensorialmente
defectuosos. La situación recíproca, en el caso de que la fermentación sea completa, sería
una producción excesiva de etanol, que además de constituir una limitación para la calidad
sensorial del vino, lo es también para su viabilidad comercial. Como otras muchas
cuestiones en vitivinicultura, el problema del excesivo grado alcohólico del vino puede ser
abordado desde diferentes puntos de vista y recurriendo a diferentes disciplinas
(viticultura, microbiología, tecnología, biotecnología ) de una manera complementaria. En
este artículo vamos a discutir fundamentalmente la posibilidad de reducir la producción de
etanol durante la fermentación alcohólica, recurriendo a la microbiología y la biotecnología
microbianas, en concreto mediante la selección y desarrollo de cepas
deSaccharomyces con bajo rendimiento alcohólico.
La variabilidad natural de Saccharomyces
Existen numerosos determinantes genéticos, ambientales y fisiológicos que afectan a la
producción de etanol por parte de las levaduras durante la fermentación
alcohólica. Saccharomyces cerevisiae parece haberse adaptado a lo largo de su evolución
para optimizar su tasa de crecimiento en ambientes ricos en nutrientes fácilmente
asimilables como azúcares y aminoácidos. Algunas características de esta levadura que
forman parte de su adaptación a este nicho particular son el hecho de que S.
cerevisiae pueda metabolizar la glucosa y la fructosa tanto por vía respirativa como por vía
fermentativa, y de crecer en condiciones aerobias o anaerobias. Todo ello hace que esta
especie presente algunas particularidades metabólicas, como el efecto Pasteur y el efecto
Crabtree y, fundamentalmente, esta última debe ser tenida en cuenta a la hora de estudiar y
tratar de modificar la producción de etanol durante la fermentación.
El efecto Crabtree se ha descrito en S. cerevisiae y un número limitado de otras levaduras y
hace que en presencia de cantidades de glucosa relativamente bajas, aún en presencia de
cantidades suficientes de oxígeno, gran parte del azúcar consumido se destine a la
producción de etanol mediante la vía fermentativa. Una de las explicaciones propuestas para
este fenómeno es que en presencia de glucosa se alcanzan grandes concentraciones de
piruvato intracelular, lo que favorece su degradación por la vía de la piruvato descarboxilasa
(fig.1), un enzima con gran capacidad de carga y alta Km, en lugar del complejo piruvato
deshidrogenasa, que lleva directamente a acetil CoA. Puesto que la capacidad de las
reacciones posteriores que permitirían la transformación del acetaldehído formado por la
piruvato descarboxilasa en acetil-CoA es limitada, esto favorece finalmente la formación de
etanol aún en condiciones aeróbicas.1
Figura 1. Degradación de la glucosa por la vía de la piruvato descarboxilasa
En la utilización preferente de la vía fermentativa en presencia de grandes cantidades de
hexosas parece que también podrían jugar un papel los fenómenos de represión por
catabolito de carbono, aunque en algunos casos los datos experimentales no son del todo
concluyentes. La represión por catabolito de carbono es un fenómeno común a muchos
microorganismos por el cual la transcripción de los genes implicados en la utilización de
fuentes de carbono alternativas está reprimida en presencia de azúcares represores,
fundamentalmente la glucosa y la fructosa, que son metabolizadas con mejor eficiencia.
Variaciones en la composición de un medio tan complejo como el mosto, en la adición de
sulfitos o de aditivos van a afectar también la producción de etanol a través de diversos
mecanismos metabólicos. La naturaleza y abundancia de las fuentes de nitrógeno también
pueden tener efecto sobre los productos mayoritarios de la fermentación.
La forma más sencilla de explotar enológicamente la variabilidad natural de S. cerevisiae ha
consistido en la selección de cepas específicas mediante aislamientos a partir de uva o de
mostos en diferentes fases de fermentación. Esta estrategia es utilizada aún de manera
extensiva, y en prácticamente todas las regiones vitivinícolas del mundo se ha procedido o se
está procediendo al aislamiento y caracterización de cepas autóctonas, con el fin de
utilizarlas como levadura seca activa.2 Entre los criterios de selección tradicionales para
cepas vínicas el poder fermentativo ocupaba un papel preponderante hasta hace poco
tiempo. Sin embargo, ante la nueva situación planteada por el cambio climático, sería
deseable la selección de cepas de Saccharomyces con un poder fermentativo más moderado,
al menos en términos de rendimiento en etanol. Por lo tanto una fuente de nuevas cepas
para vinificación, mejor adaptadas a la nueva situación podría seguir siendo la selección de
cepas de origen natural, pero con nuevos criterios de selección, más adecuados a la situación
y los estilos de vinificación actuales.
Sin embargo, muchos consideran que la variabilidad natural de S. cerevisiae para el carácter
«producción de etanol» se considera bastante baja. Además, el uso extendido de levadura
seca activa dificulta la tarea de identificar nuevas epas naturales a partir de microorganismos
aislados en las bodegas. Como elemento positivo está el hecho de que en nuestro país se
conservan diversas colecciones de cepas de levaduras enológicas, fruto de procesos previos
de selección o de estudios de campo, que podrían constituir una fuente de cepas ya
caracterizadas como base para un proceso de selección menos azaroso.
La selección genética clásica
Una alternativa a la selección de cepas de levadura completamente nuevas consiste en la
mejora genética de cepas que ya han sido seleccionadas previamente y que están incluso en
uso, con el fin de, conservando las propiedades iniciales por las que han sido seleccionadas,
alterar el rendimiento en la producción de etanol. Por este motivo diversos grupos de
investigación de todo el mundo recurren a la mejora genética de cepas enológicas, ya
existentes y de eficacia comprobada, para obtener nuevas cepas con propiedades
mejoradas.2-5
En comparación con otros microorganismos de uso industrial, la mejora genética clásica ha
sido poco explotada para la modificación de levaduras vínicas, en parte por las dificultades
derivadas de las características genéticas y la estructura genómica de estas levaduras
(aneuploidías, carencia de marcadores genéticos). Algunos ejemplos de aplicación exitosa en
enología son la mutagénesis al azar y la hibridación sexual, tanto mediante el método
tradicional como mediante la técnica de «rare-mating».2,4,6Se trata de dos técnicas que han
sido utilizadas anteriormente con éxito para la mejora genética de levaduras industriales.7
En comparación con la ingeniería genética o la fusión artificial de protoplastos, estas dos
técnicas presentan la ventaja de ser ampliamente aceptadas en el entorno social y enológico
y de no estar sometidas a restricciones de uso y comercialización como lo están los
organismos genéticamente modificados (OGM).
Para cualquiera de estos métodos no dirigidos, desde la selección de cepas naturales,
pasando por la mutagénesis al azar y la hibridación sexual, la reducción de la producción de
etanol como criterio de selección tiene la desventaja de constituir un fenotipo que no es fácil
de seleccionar. Procedimientos como la mutagénesis o la hibridación dan lugar a un gran
número de células viables, muchas de las cuales no difieren de la cepa original en el carácter
deseado, en este caso producción de etanol, y sólo una proporción muy baja (a veces menos
de una por millón) tendrá mejorado el carácter deseado. Tampoco hay que perder de vista
que la producción de etanol es un carácter cuantitativo que muchos genes y proteínas, de
modo que muchas de las mutaciones potencialmente interesantes tendrán un efecto mínimo
por sí mismas en la producción de etanol, siendo necesaria la acumulación de diversas
mutaciones para obtener efectos apreciables. Lamentablemente, aún esas pocas cepas
mejoradas pueden ser portadoras de otras mutaciones que hagan que la cepa no sea útil
desde el punto de vista enológico.
Tabla 1. Diferentes alternativas para la obtención de cepas de S. cerevisiae con bajo rendimiento alcohólico.
Método de mejora
Ventajas
Limitaciones
Aislamiento de cepas
Técnicamente sencillo
No aprovecha características previamente
naturales
seleccionadas
Existen colecciones
Variabilidad natural limitada
Hibridación sexual
Sin restricciones legales o comerciales
No hay buenos criterios de selección para baja
producción de etanol
Puede aportar bastante variabilidad
Estabilidad genética
Compatibilidad sexual y capacidad de
esporulación de las cepas
Poca variabilidad de partida para la producción
de etanol
Necesidad de retrocruzamientos
Mutagénesis
Sin restricciones legales o comerciales
No hay buenos criterios de selección para baja
producción de etanol
Técnicamente sencillo
Aporta variabilidad limitada
Trabajo sobre cepas con propiedades
Estabilidad genética
contrastadas
Ingeniería genética
Método muy dirigido
OGM
Trabajo sobre cepas con propiedades
Las consecuencias de la modificación no son
contrastadas
siempre las esperadas (se necesitan varias
modificaciones por cepa)
Relativamente complejo
Fusión de protoplastos Poco limitado por la barrera de especie OGM
Estabilidad de los híbridos
Aporta gran variabilidad
Esta baja frecuencia de aparición de mutantes interesantes, junto con la dificultad para su
selección, es probablemente una de las principales limitaciones de los métodos clásicos de mejora
genética al menos en el caso particular de la baja producción de etanol. Para solventarlo se hace
necesario desarrollar criterios de selección que, teniendo cierto poder predictivo sobre la
producción de etanol de la cepa correspondiente, sean fáciles de seleccionar sin necesidad de un
análisis individualizado, por ejemplo mediante al detección de colonias que crecen en determinados
medios o dan lugar a la aparición de un color característico. Algunos de los criterios posibles son
una mayor producción de biomasa o de productos secundarios de la fermentación, como el glicerol.
La mayor producción de biomasa puede estar asociada con una pared celular más gruesa, y por
tanto con una mayor tolerancia a determinados inhibidores del crecimiento como rojo congo,
calcofluor, o cafeína. También podría encontrarse una mayor producción de biomasa asociada a la
acumulación de más carbohidratos de reserva, como glucógeno, que se puede poner de manifiesto
mediante tinciones específicas. En cualquier caso, se trata de caracteres de tipo gradual y con una
relación indirecta con el que realmente interesa.
Además, los mutantes, o las cepas obtenidas de los cruzamientos pueden ser genéticamente
inestables por diversos motivos, dando lugar a la pérdida del carácter seleccionado o de otras
propiedades enológicas interesantes, por lo que la estabilidad es uno de los rasgos más importantes
que hay que verificar en las cepas obtenidas. Otra limitación de los métodos de selección, cuando se
trata de manipular una gran cantidad de cepas independientes, es que es difícil reproducir a
pequeña escala las condiciones de fermentación industrial, esto puede llevar por ejemplo, a
seleccionar una cepa con menor producción de etanol, como consecuencia de un efecto Crabtree
menos acusado, pero que en condiciones de limitación de oxígeno tendría un comportamiento
similar al de la cepa que se trataba de mejorar.
Por último, como se ilustra más adelante en el caso de cepas mejoradas por ingeniería genética, hay
que considerar el destino de los azúcares del mosto en las fermentaciones con estas cepas y sus
consecuencias para la calidad del vino, ya que pueden no consumirse totalmente, transformarse en
biomasa, carbohidratos de reserva, glicerol, o productos no deseados de la fermentación. En el caso
de la hibridación sexual hay que considerar además las limitaciones derivadas de la poca
variabilidad natural aparente que ya se ha comentado en cuanto a la producción de etanol por S.
cerevisiae, lo que limita la elección de cepas parentales para el cruzamiento. Además, al combinar
genomas muy diferentes (como ocurre en el caso de la fusión de protoplastos), es difícil predecir las
consecuencias de la combinación y puede ser necesario llevar a cabo varios retrocruzamientos para
recuperar las características enológicas de alguna de las cepas de partida.
La ingeniería genética
La ingeniería genética constituye la alternativa más obvia a la mejora genética clásica para
mejorar cepas de levadura vínica industrial. De hecho, en la actualidad se comercializa en
los Estados Unidos una cepa recombinante capaz de catalizar la descarboxilación del ácido
málico. En lo que concierne a la producción de etanol, se han desarrollado diversos
proyectos de ingeniería metabólica con el fin de alterar las proporciones de los diversos
metabolitos que se obtienen durante la fermentación de los azúcares del
mosto,2,4 incluyendo una disminución de la producción de etanol.8-10 Uno de los objetivos a
los que se han consagrado más esfuerzos es aumentar la producción de glicerol a costa de
la de etanol mediante la superexpresión del gen GPD1(glicerol-3-fosfato deshidrogenasa),
sin embargo las restricciones que impone el equilibrio redox de la célula han hecho que
necesarias diversas modificaciones genéticas adicionales con el fin de compensar el
aumento concomitante de la acidez volátil y otros productos secundarios de la
fermentación, además de alteraciones en las condiciones de fermentación.11,12 Además, esta
estrategia presenta el inconveniente de que las levaduras obtenidas serían consideradas
OGM por la legislación europea, lo que acarrearía una importante serie de limitaciones a su
uso y comercialización, sin menospreciar el efecto de que sería necesario un etiquetado
específico, además de que la OIV no ha aceptado todavía la utilización enológica de los
OGM.
La fusión de protoplastos es otro método de mejora genética sobre el que existen varios
ejemplos de uso exitoso para mejorar las propiedades de cepas industriales
de Saccharomyces ,6y que podría llegar a ser interesante en este contexto, sin embargo la
actual legislación europea también considera los organismos así obtenidos como OGM, por
lo que comparten las limitaciones de las cepas mejoradas por ingeniería genética.
En conclusión, y a pesar de todas las limitaciones de la mejora genética clásica comentadas
anteriormente, la mutagénesis y la hibridación sexual son en este momento dos de las estrategias
más prometedoras para la obtención de cepas enológicas de levadura con producción reducida de
etanol.
Bibliografía
1.
Pronk, J.T.; Steensma, H.Y. y van Dijken, J.P.: «Pyruvate metabolism inSaccharomyces
cerevisiae », Yeast 1996; 12 (16): 1607-1633.
2.
Pretorius, I.S.: «Tailoring wine yeast for the new millennium: novel approaches to the
ancient art of winemaking», Yeast 2000; 16 (8): 675-729.
3.
Querol, A. y Ramon, D.: «The application of molecular techniques in wine
microbiology», Trends in Food Science & Technology 1996, 7 (3): 73-78.
4.
Bisson, L.F.: «Biotechnology of wine yeast», Food Biotechnology 2004, 18(1): 63-96.
5.
Cebollero, E.; González-Ramos, D.; Tabera, L. y González, R.: «Transgenic wine yeast
technology comes of age: is it time for transgenic wine?», Biotechnology Letters2007; 29
(2): 191-200.
6.
Spencer, J.F.T; Spencer, D.M.; Whittingtonvaughan, P. y Miller, R.: «Use of mitochondrial
mutants in the isolation of hybrids involving industrial yeast strains .4. Characterization of
an intergeneric hybrid, Saccharomyces-diastaticus x Hansenula-capsulata , obtained by
protoplast fusion», Current Genetics 1983, 7 (2): 159-164.
7.
González, R.; Martínez-Rodríguez, A.J. y Carrascosa, A.V.: «Yeast autolytic mutants
potentially useful for sparkling wine production», International Journal of Food
Microbiology 2003; 84 (1): 21-26.
8.
Remize, F.; Roustan, J.L.; Sablayrolles, J.M.; Barre, P. y Dequin, S.: «Glycerol
overproduction by engineered Saccharomyces cerevisiae wine yeast strains leads to
substantial changes in by-product formation and to a stimulation of fermentation rate in
stationary phase», Applied and Environmental Microbiology 1999; 65 (1): 143-149.
9.
Michnick, S.; Roustan, J.L.; Remize, F.; Barre, P. y Dequin, S.: «Modulation of glycerol and
ethanol yields during alcoholic fermentation in Saccharomyces cerevisiaestrains
overexpressed or disrupted for GPD1 encoding glycerol 3-phosphate
dehydrogenase», Yeast 1997; 13 (9): 783-793.
10. Eglinton, J.M.; Heinrich, A.J.; Pollnitz, A.P.; Langridge, P.; Henschke, P.A. y Lopes, M.D.:
«Decreasing acetic acid accumulation by a glycerol overproducing strain
ofSaccharomyces cerevisiae by deleting the ALD6 aldehyde dehydrogenase
gene»,Yeast 2002; 19 (4): 295-301.
11. Cambon, B.; Monteil, V.; Remize, F.; Camarasa, C. y Dequin, S.: «Effects of GPD1
overexpression in Saccharomyces cerevisiae commercial wine yeast strains lacking ALD6
genes», Applied and Environmental Microbiology 2006; 72 (7): 4688-4694.
12. Heux, S.; Sablayrolles, J.M.; Cachon, R. y Dequin, S.: «Engineering a Saccharomyces
cerevisiae wine yeast that exhibits reduced ethanol production during fermentation under
controlled microoxygenation conditions», Applied and Environmental Microbiology2006; 72
(9): 5822-5828.