5.anexo 1 - U

Universidad de Chile
Facultad de Ciencias Físicas y Matemáticas
Departamento de Ingeniería Civil Química y Biotecnología
BT3401-1 Biología y Biotecnología
Producción de etanol en
una fermentación batch
Integrantes : Constanza Garcés
Joaquín Morales
Luis Rodríguez
Profesores
: Juan Asenjo, Ana María
Ronco, Oriana Salazar
Profesora
Auxiliar
: Daniela Vaismann
Ayudantes
: Lisset Manzano
Fecha
: 14 de Mayo del 2012
RESUMEN
En el presente trabajo se analizó el crecimiento y cinética de formación de etanol por
la levadura Saccharomyces ovarum en una fermentación anaeróbica a una temperatura de
25°C y pH 7,0 en un cultivo tipo batch en un fermentador Biostat B-2. Utilizando un modelo
matemático y una regresión polinómica, se obtuvieron diversos parámetros de fermentación.
Se encontró que la velocidad de crecimiento específica máxima
era 0,690 [h]-1
correspondiente a t=0, mientras que la concentraciones máximas de biomasa y etanol eran
8,23 [gr/l] en t = 37,02 [h] 88,13 [gr/l] en t = 43,27 [h] respectivamente. La velocidad de
producción de etanol máxima era 2.78 [gr/lh] en t= 14,27 [h]. Por otra parte, se estudió el
rendimiento de etanol en glucosa y el de biomasa en glucosa, y se observó que el primero
aumente en el tiempo, mientras que el segundo disminuye.
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ÍNDICE
INTRODUCCIÓN ------------------------------------------------------------------------------ PÁGINA 4
1.1. OBJETIVOS GENERALES--------------------------------------------- PÁGINA 5
1.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS ------------------------------------------- PÁGINA 5
MATERIALES Y MÉTODOS -------------------------------------------------------------------- PÁGINA 6
2.1 ORGANISMOS Y MEDIO DE CULTIVO ---------------------------- PÁGINA 6
2.2 PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL -------------------------------- PÁGINA 6
2.3 MÉTODOS ANALÍTICOS --------------------------------------------- PÁGINA 6
RESULTADOS ------------------------------------------------------------------------------------ PÁGINA 8
DISCUSIÓN --------------------------------------------------------------------------------------
PÁGINA 10
CONCLUSIONES --------------------------------------------------------------------------------
PÁGINA 11
BIBLIOGRAFÍA ----------------------------------------------------------------------------------- PÁGINA 12
ANEXO 1 -----------------------------------------------------------------------------------------
PÁGINA 13
3
1. INTRODUCCIÓN
La mayoría de los organismos vivos obtienen la energía necesaria para sustentar la vida
desde la oxidación por oxigeno molecular de sustancias orgánicas, en el proceso de respiración
celular. Bajo condiciones anaeróbicas, muchos organismos, incluyendo levaduras, obtienen
energía mediante el proceso de fermentación; láctica o alcohólica.
Las levaduras son cuerpos unicelulares (2 a 4 μm) presentes de forma natural en algunos
productos como las frutas, cereales y verduras. Se denominan organismos anaeróbicos
facultativos, es decir que pueden desarrollar sus funciones biológicas sin oxígeno
En la fermentación alcohólica, característica de muchas especies de levaduras, ente ellas la
Saccharomyces uvarum, la reacción comienza con una molécula de azúcar de seis carbonos
(glucosa) y termina con dos moléculas de alcohol de dos carbonos (etanol), dos moléculas de
CO2 y dos moléculas de ATP que consumen los propios microorganismos en su metabolismo:
Levadura
C6H12O6 + 2 Pi + 2 ADP
2 CH3-CH2OH + 2 CO2 + 2 ATP + 25.5 kcal
La secuencia de transformaciones para degradar la molécula de glucosa hasta dos
moléculas de alcohol es un proceso complejo.
Cuando se siembran microorganismos en un medio de cultivo apropiado, los mismos
comienzan a dividirse activamente (crecimiento exponencial) empleando los nutrientes que le
aporta el medio de cultivo para aumentar su número. Este proceso continúa hasta que algún
nutriente del medio de cultivo se agota (sustrato limitante) y el crecimiento se detiene.
También puede detenerse el crecimiento por acumulación de alguna substancia inhibidora
formada por los mismos microorganismos.[1]
Para evaluar esta transformación se utiliza el rendimiento de etanol en glucosa(𝑌[𝐸] ) y
[𝐺]
el de biomasa en glucosa(𝑌[𝐵] ).
[𝐺]
Diversos parámetros afectan el rendimiento, como son la clase de microorganismo
utilizado, la concentración de glucosa, concentración de etanol, temperatura, pH y la
concentración de nutrientes.
En el presente trabajo, se estudia el crecimiento y cinética de formación de producto
en una fermentación anaerobia llevada a cabo por Saccharomyces uvarum a una temperatura
de 25°C y pH 7.0 en un cultivo batch, proceso discontinuo por lotes.
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1.1 OBJETIVOS GENERALES
Examinar el crecimiento y la cinética de la formación de producto (etanol) en una
fermentación anaerobia con levaduras a 25° por 48 horas.
1.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Determinar los siguientes parámetros de fermentación:
(1)
(2)
(3)
(4)
(5)
(6)
Velocidad de crecimiento específica máxima.
Concentración máxima de biomasa.
Concentración máxima de etanol.
Velocidad de producción de etanol máxima.
Rendimiento de etanol en glucosa.
Rendimiento de biomasa en glucosa.
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2.MATERIALES Y MÉTODOS
2.1 ORGANISMOS Y MEDIO DE CULTIVO
Se utilizó Saccharomyces uvarum ATCC 26602, un tipo de levadura altamente
floculante [2].
El crecimiento se llevó a cabo en un fermentador Biostat B-2 de Braun Biotechnology,
donde todas las aplicaciones necesarias para controlar la fermentación, como bombas de
dosificación, agitador de 6 hojas, módulos de medida y control de variables, están combinados
en una unidad básica que puede funcionar casi de forma automática.
Las condiciones fijadas para llevar a cabo la fermentación fueron; mantener un pH
igual a 7.0 y una temperatura de 25°C en ausencia de aire (sin oxígeno), es decir, en un medio
anaeróbico.
La composición del medio de cultivo por 1 litro fue: 250 gr glucosa, 10 gr extracto de
levadura Oxoid, 6.4 gr de urea, 1.2 gr de KH2PO4, 0.18 gr de Na2HPO4, 10 ml de una solución
A y 10 ml de una solución B. La solución A contenía las siguientes trazas de metales: 5.6 gr de
CaO, 2.0 gr de ZnO, 27.0 gr de FeCl3*6H2O, 5.0 gr MnCl2*4H2O, 0.85 gr CuCl2*2H2O, 1.2 gr
CoCl2*6H2O, 0.3 gr de H3BO3 y 65 ml de HCl concentrado 5:1 con agua destilada. La solución
B contenía 50.5 gr de MgO, 225 ml de HCl concentrado a razón 5:1 con agua [3].
2.2 PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL
Colonias simples de levadura fueron tomadas de tubos de cultivo y se transfirieron a
un matriz Erlenmeyer esterilizado [que contenía 100 ml con 10% glucosa.] Después de 24
horas agitando la mezcla a 25°C, se transfirió al fermentador que contenía 900 ml del medio de
cultivo [3]. Nitrógeno gaseoso (N2) se introdujo al fermentador por 3 horas antes y después de
la inoculación para mantener la anaerobiosis. El cultivo se mantuvo agitado suavemente para
mantener un cultivo homogéneo durante todo el proceso. El pH se mantuvo controlado a un
valor de 7.0 con la adición automática (por parte del fermentador) de NaOH 4M. Para
mantener la temperatura a 25°C y reducir la evaporación de etanol se recirculó agua por la
doble camisa del fermentador.
2.3 MÉTODOS ANALÍTICOS
Se tomaron muestras de 10 ml del fermentador a intervalos de tiempo durante 48
horas para determinar el peso seco de la biomasa. La cantidad de glucosa fue estimada usando
el método del ácido dinitrosalicílico [4]. Para la estimación del etanol, se siguió el
procedimiento desarrollado por Sawyer y Dixon.
Para modelar la variación de las concentraciones de biomasa, glucosa y producto en el
tiempo a partir de una tabla de datos discretos se realizó una regresión polinómica de segundo
grado para el caso glucosa y de tercer grado para biomasa y etanol usando una planilla en el
6
programa Office Excel. Luego, utilizando estas curvas se calcularon los parámetros de
fermentación pedidos en el intervalo 0-50 horas, usando las siguientes ecuaciones:
1 𝑑[𝐵]
∙
[𝐵] 𝑑𝑡
(1) Velocidad de crecimiento específica:
𝜇𝑚á𝑥 =
(2) Concentración máxima de biomasa:
𝑑[𝐸]
([E] = [𝐸]𝑚á𝑥 ) = 0
𝑑𝑡
(3) Concentración máxima de etanol:
𝑑[𝐵]
([B] = [𝐵]𝑚á𝑥 ) = 0
𝑑𝑡
(4) Velocidad de producción de etanol máxima:
𝑑 2 [𝐸] d[E] d[E]
(
=
)=0
𝑑𝑡 2
dt
dt 𝑚á𝑥
(5) Rendimiento de etanol en glucosa:
𝑌[𝐸] = −
𝑑[𝐸](𝑡)
𝑑[𝐸] 𝑑[𝐺]
=−
/
𝑑[𝐺](𝑡)
𝑑𝑡
𝑑𝑡
(6) Rendimiento de biomasa en glucosa:
𝑌[𝐵] = −
𝑑[𝐵](𝑡)
𝑑[𝐵] 𝑑[𝐺]
=−
/
𝑑[𝐺](𝑡)
𝑑𝑡
𝑑𝑡
[𝐺]
[𝐺]
7
3.RESULTADOS
Las regresiones polinómicas arrojaron las siguientes curvas (gráfico 1):
Biomasa
[B] = 0,00008t3 - 0,0119t2 + 0,5522t + 0,0718
(tercer grado):
Glucosa
[G] = 0,0875t2 - 9,403t + 259,08
(segundo grado):
Etanol
[E] = -0,0011t3 + 0,0471t2 + 2,103t - 1,9341
(tercer grado):
R² = 0,9731
R² = 0,9876
R² = 0,994
Gráfico 1: Ajuste de datos discretos obtenidos mediante curvas polinómicas.
De (1) se obtuvo máx = 0,690 [h]-1 en t = 0
De (2) se obtuvo que la concentración máxima de biomasa [B]máx = 8,23 [gr/l] en t = 37,02 [h].
De (3) se obtuvo que la concentración máxima de etanol [E]máx = 88,13 [gr/l] en t = 43,27 [h].
De (4) se obtuvo que la velocidad de producción de etanol máxima d[E]/dt máx = 2,78 [gr/lh] en t=
14,27 [h].
De (5) se obtuvo que el rendimiento de etanol en glucosa se comporta de la siguiente manera en el
tiempo:
8
𝑌[𝐸] (𝑡) =
[𝐺]
0,0033𝑡 2 + 0,0942𝑡 − 2,103
0,175𝑡 − 9,403
De (6) se obtuvo que el rendimiento de biomasa en glucosa se comporta de la
siguiente manera:
𝑌[𝐵] (𝑡) =
[𝐺]
−0,00024𝑡 2 + 0,0238𝑡 − 0,5522
0,175𝑡 − 9,403
Los valores obtenidos para los últimos dos parámetros los podemos apreciar en los
gráficos 1 y 2:
Gráfico 2: Rendimiento de biomasa en glucosa vs tiempo.
Gráfico 3: Rendimiento de etanol en glucosa vs tiempo.
Se adjuntan en la planilla anexa (anexo 1) los valores obtenidos en las funciones de regresión y los
distintos parámetros y su variación en el tiempo.
9
4.DISCUSIÓN
Acerca de las valores obtenidos para la fermentación Batch a 25ºC se puede observar que
hay un coeficiente de regresión R2 cercano a 1. Esto muestra que el modelo matemático
utilizado tiene determinada exactitud. Los polinomios permiten diferenciar sin mayor
dificultad y los cálculos matemáticos se limitaron a encontrar raíces cuadráticas y cúbicas.
Los datos hacen sentido: una población de levaduras en crecimiento a medida que
consume glucosa, la utiliza y libera al fermentador su producto metabólico (el etanol). Por otro
lado, a medida que el alimento se va agotando y aumenta la concentración del alcohol el
ambiente alcanza poco a poco su capacidad de carga al estancarse el crecimiento de
Saccaromyces uvarum e incluso disminuir por dos factores: la falta del azúcar y la toxicidad del
etanol.
Existe una aproximada correlación entre [E] y [B] en el intervalo, tal como lo señala la
ecuación diferencial vista en clases:
𝑑[𝐸]
𝑑𝑡
=𝛼
𝑑[𝐵]
𝑑𝑡
. Es por eso que se puede afirmar que el
etanol es un producto asociado al crecimiento.
Los parámetros de fermentación muestran que existe una explosión reproductiva en la
población al comienzo pues el ambiente es rico en nutrientes y no es tóxico. Es por eso que es
completamente factible que la máx = 0,690 [h]-1 se obtenga en t = 0. Por su lado, los
rendimientos permiten intuir las siguientes relaciones; la eficiencia metabólica de una colonia
disminuye a medida que va aumentando la biomasa; se va liberando cada vez más etanol al
metabolizar la misma cantidad de glucosa. También se puede inferir por la tendencia del
rendimiento de biomasa en glucosa que las levaduras utilizan a esta última principalmente en
reproducirse, pues una vez que se alcanza la capacidad de carga la colonia disminuye su
consumo considerablemente. Puede atribuirse a que inteligentemente optimiza su
mantenimiento ante la escasez para sobrevivir.
10
5.CONCLUSIONES
Los parámetros de fermentación obtenidos son los siguientes:





máx = 0,690 [h]-1 en t = 0
La concentración máxima de biomasa [B]máx = 8,23 [gr/l] en t = 37,02 [h].
La concentración máxima de etanol [E]máx = 88,13 [gr/l] en t = 43,27 [h].
La velocidad de producción de etanol máxima d[E]/dt máx = 2,78 [gr/lh] en t= 14,27 [h].
El rendimiento de etanol en glucosa se comporta de la siguiente manera en el tiempo:
𝑌[𝐸] (𝑡) =
[𝐺]

0,0033𝑡 2 + 0,0942𝑡 − 2,103
0,175𝑡 − 9,403
El rendimiento de biomasa en glucosa se comporta de la siguiente manera:
𝑌[𝐵] (𝑡) =
[𝐺]
−0,00024𝑡 2 − 0,0238𝑡 + 0,5522
0,175𝑡 − 9,403
El etanol es un producto asociado al crecimiento de Saccaromyces uvarum.
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5.BIBLIOGRAFÍA
[1]
MARÍA DE LOURDES ESCAMILLA HURTADO, FRIDA MALPICA SÁNCHEZ, ALBERTO REYES
DORANTES Y JOSÉ RAMÓN VERDE CALVO. DEPTO. BIOTECNOLOGÍA. DIV. CIENCIAS
BIOLÓGICAS Y DE LA SALUD. UNIDAD IZTAPALAPA. UNIVERSIDAD AUTÓNOMA
METROPOLITANA. [en línea]
<http://docencia.izt.uam.mx/mleh/alimentos_fermentados/otros_sitios/Contenido.htm>
[ULTIMA VISITA 15/05/2012]
[2] ROSE, D., 1976, PROC. BIOCHEM, 11, (2), 10-12.
[3] JAE HEUNG LEE, D. WILLIAMSON AND P.L. ROGERS, 1980, BIOTECHNOLOGY LETTERS, 2,
83-88.
[4] SAWADA, H AND ROGERS, P.L., 1977, J. FERM. TECHNOL, 55, 297-310.
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5.ANEXO 1
Tabla 1: Datos entregados por las curvas ajustadas a los valores discretos.
Datos de curvas ajustadas para una fermentación a 25ºC
B = 8E-05t3 0,0119t2 +
0,5522t +
0,0718
[G] = 0,0875t2 9,403t + 259,08
[E] = -0,0011t3
+ 0,0471t2 +
2,103t - 1,9341
=1/[B]·0,0002
4t20,0238t+0,5522
VPE=-0,0033t20,0942t+2,103
Ye/g=
VPE/(0,175t9,403)
Yb/g=(0,00024t20,0238t+0,5522
)/(0,175t-9,403)
Tiempo
[h]
0
Biomasa
[g/L]
0,8
Glucosa
[g/L]
259,08
Etanol
[g/L]
-2

g/hL]
0,690
VPE
[g/h]
2,103
Ye/g
Yb/g
0,224
0,059
3
1,6
232
5
0,297
2,415
0,272
0,054
6
3,0
206
12
0,141
2,787
0,334
0,050
9
4,1
182
20
0,086
3,218
0,411
0,046
12
5,1
159
28
0,059
3,709
0,508
0,041
15
5,9
138
36
0,042
4,259
0,628
0,037
20
7,0
106
50
0,025
5,307
0,899
0,029
24
7,6
84
60
0,016
6,265
1,204
0,023
28
8,0
64
69
0,009
7,328
1,627
0,016
34
8,2
41
80
0,002
9,121
2,641
0,006
37
8,3
31
83
0,000
10,106
3,452
0,000
44
8,1
15
86
-0,004
12,637
7,420
-0,018
48
8,0
9
83
-0,005
14,228
14,185
-0,037
13