Problemas de enzimología

Problemas de Enzimología
Hoja 1
1."
• Vol = 0,1 ml
• Pm (NR) = 500.000 Da
• Vmax = 20 mol/5ml
• [E] = 0,5 mg/ml (de ella sola al estar en homogeneidad)
• Vfinal de reacción = 1 ml
a)
Para definir la actividad de la reacción, en este caso para una enzima purificada a homogeneidad, se parte
siempre de un dato de velocidad, Vmax. Este parámetro es la condición en la que normalmente se define la
cantidad de enzima que hay en una preparación, midiendo la velocidad en condiciones de saturación por
sustrato. Por esto se sobrentiende que el dato que nos da el problema de velocidad es el de Vmax.
Por lo tanto, para definir la actividad (Act) en U/ml, partimos de la equivalencia de los apuntes:
Lo que nos piden con la actividad es la cantidad de enzima que hay en la preparación de NR. Lo que nosotros
hacemos es ensayar en un volumen total de reacción de 1 ml un volumen de enzima de 0,1 ml, con lo que 1/10
del volumen será enzima. Lo que nos piden es la cantidad de enzima en 1ml, que es la misma que hay en los
0,1 de preparación de enzima homogénea.
Para calcular el dato comenzamos con la Vmax expresada en min"1:
Esta velocidad, es la que presentan 0,1 ml de la muestra de enzima. Como nos piden las Unidades por mililitro
de la reacción, no hay más que realizar una regla de tres:
b)
En este caso nos piden la actividad específica (Ae), que se trata de la actividad referida a la cantidad total de
proteína. La forma habitual de expresar la Ae es en U/mg de proteína. Como ya sabemos la actividad, y nos
dan la concentración de proteína. En este caso, al encontrarse la enzima purificada a homogeneidad, los mg de
proteína que nos dan están referidos únicamente a la NR. Ya que la Ae nos define un valor de concentración
de enzima, y toda la proteína es ella misma, el dato de Ae que nos da, es el máximo alcanzable.
El valor máximo que obtenemos es:
1
c)
Los Katales son una medida de actividad, definida por los moles transformados por segundo. Po lo tanto, no
se trata más que de transformar las unidades:
d)
En este apartado se nos pide la actividad molecular de la enzima, o lo que es lo mismo, Kcat. Como ya vimos
en teoría, la constante catalítica sale de la expresión de Vmax, siendo la constante de proporcionalidad que
multiplica a [E]T para darnos Vmax. Ya que tenemos el dato de Ae máxima, podemos calcular directamente
Kcat, sin más que multiplicar por el peso molecular.
Esto se debe al hecho de estar purificada a homogeneidad, de modo, que la Ae que hemos hallado es
velocidad de transformación por mg de proteína, y como toda la proteína es enzima queda en moles al
multiplicarlo por el peso molecular. Hay que tener en cuenta que este dato solo es aplicable en el caso de tener
un dato de Ae de la enzima pura. Esto se demuestra fácilmente, mediante las unidades.
Esto puede ser útil en muchas ocasiones, pero siempre hay que tener en cuenta que necesitamos un dato de
Vmax obtenido de la enzima purificada. Una vez sabido esto, calculamos Kcat.
2
e)
Si nos confirman que la enzima presenta dos centros activos, sabríamos que la Kcat hallada es Kcat
molecular, al haber utilizado en la expresión del apartado anterior el peso del oligómero. De modo que, como
vimos en teoría, lo único que hay que hacer para calcular Kcat C.A. es dividir por el nº de C.A.. En este caso
Kcat C.A.= 666,6 s"1/2 = 333,3 s"1.
f)
El tiempo del ciclo catalítico (tcc) no es más que la inversa de Kcat. Ya que tenemos una Kcat C.A. es
preferible utilizar este valor, al garantizarnos un tiempo de catálisis por C.A. tcc = 1/333,3 s"1 = 3·10"3 s = 3
milisegundos.
En esta segunda parte del ejercicio se nos dan unos datos de purificación, a través de los cuales debemos
hallar el grado de purificación alcanzado. En esta tabla se nos dan los valores de Volumen, Actividad y
Cantidad de proteína, suficientes para calcular el resto de la siguiente forma:
• Actividad Total: Se define como las Unidades totales del extracto crudo. Para calcularla se multiplica la
actividad por el volumen (U/ml · ml totales = unidades totales). Ejemplo: 1,72 U/ml · 14,080 ml = 24,217 U
totales
• Actividad específica: Actividad del extracto crudo. Como ya hemos mencionado muchas veces, no implica
más que dividir la actividad entre la cantidad de proteína (U/ml ÷ mg/ml = U/mg). Ejemplo: 1,72 U/ml ÷
31,4 mg/ml = 0,0547 U/mg
• Rendimiento: Se trata de comparar el paso con el extracto crudo. El parámetro a comparar es la actividad
total, de modo que efectuamos un cálculo de tanto por ciento haciendo que la actividad total del extracto
crudo sea el 100%. Ejemplo:
• Grado de purificación: a diferencia del anterior, esta comparación se realiza con la actividad específica y
no se da en tanto por ciento, sino en veces, resultado de dividir Aedel paso entre Aecrudo. Ejemplo: Ae
(paso II)/Ae (crudo) = 0,3615 U·mg"1/0,0547 U·mg"1= 6,6 veces
El resultado de calcular esto para todos los pasos se presenta en la siguiente tabla.
I
Nº
II
Paso de
purificación
1 Volumen (ml)
2 Actividad (U/ml)
III
Extracto
crudo
14080
1,72
1600
11,10
163
52,58
IV
V
(NH4)2SO4
Filtración Cromatografía
Calentamiento
(30"45
en gel de DEAE
a 62 ºC
%)
agarosa
celulosa
188
94
29,60
41,37
3
3 Proteína (mg/ml)
Actividad
4
1·2
total
Rendimiento
UT Vs
5
(%)
UTcrudo
Actividad
6 específica2÷3
(U/mg)
Grado
de
Ae Vs
7
purificación
Aecrudo
(veces)
31,40
30,70
7,31
1,43
1,58
24217
17760
8570
5564
3888
100
73,3
35,3
22,9
16,05
0,0547
0,3615
7,19
20,7
26,2
"
6,6
131,5
378
478
Si recordamos, la Ae máxima calculada en el extracto puro, era de 80 U/mg, mientras que la calculada para el
V paso de esta purificación es de 26,2 U/mg. Esto no nos indica necesariamente que en este paso la enzima no
esté pura, sino que pudiera ser que la enzima se halla degenerado. Esto habría que confirmarlo con otras
pruebas como un gel de electroforesis.
2."
• Pm = 29,6 Kda
• 0.9 gr en 10 ml. Purificada.
a)
Nos piden si se ajusta a una cinética M&M. Para averiguarlo, lo que hacemos es primero visualizar la gráfica
V Vs [S], que se presenta en la siguiente página.
Velocidad [S]/V
[penicilina]
0,1
0,3
0,5
1
3
5
0,11
0,25
0,34
0,45
0,58
0,61
0,91
1,2
1,47
2,22
5,17
8,19
Evidentemente, a simple vista parece asemejarse bastante a una hipérbola cuadrangular, con una Vmax que
debe rondar 0,6 nmol · min"1. Para asegurarse, lo que se hace es representrar la linearización de los datos, y si
estos se ajustan a una recta, es que efectivamente estamos ante una cinética M&M.
4
Los datos a representar se encuentran en la tabla anterior, ya que utilizaremos la linearización H"W.
El Excel no nos representa el corte en el eje X, pero nos da la ecuación de la recta, con la que podemos
calcular todos los parámetros:
• Km: Cuando [S]/Vel = 0.
. Km = 0,5 nM; Km = 0,5 · 10"9 M . Si nos fijamos, este dato encaja con lo que se obtendría en la gráfica
anterior.
• Vmax: Dato que se puede averiguar por el corte en el eje Y, además de por la pendiente. Lo haremos por
los dos métodos.
• Pendiente: Ya nos la dan en la ecuación de la recta: tg = 1,4858. Su inversa será Vmax. Vmax =
0,673 nmol · min"1.
• Ordenada en el origen: Se trata del valor de y cuando x = 0.
Con estos dos datos, hacemos la media para obtener que Vmax = 0,6735 · 10"9 mol · min"1.
• Kcat: Definimos esta constante como la constante de proporcional para [E]T de la ecuación de la velocidad
máxima. Por esto, podemos definirla como
. Podemos definir Kcat porque tenemos nuestra proteína purificada y podemos hallar la concentración total,
de otra forma sería imposible. Pero, ya definimos otra forma de calcular Kcat, a través de la actividad
específica. El cálculo de Ae lo efectuamos dividiendo el valor de Vmax (mol · min"1) por los mg de
proteína. Esta actividad ya es la actividad de la enzima pura, por haberla hallado con el dato de Vmax del
extracto puro.
5
3."
Respuesta
Explicación
Porque aunque la expresión de Km incluye las concentraciones (como Ks aparente),
a) Verdadero se trata de una razón, con lo que si aumenta [E] libre, disminuye [ES] y viceversa,
manteniendo a Km constante.. Km sólo depende de las constantes cinéticas de los pasos de
unión, disociación y transformación de sustrato, que serán función de la energía libre que se
libere. Vmax si depende de la cantidad de enzima.
Esto se comprueba matemáticamente llegando a la misma expresión de dos formas diferentes.
Decíamos que la constante de especificidad es la razón ente Km y Kcat, y que se trata la
constante de la unión entre la enzima y el sustrato. Ahora, tratamos de llegar a la misma
expresión partiendo de la ecuación de Km y de la velocidad genérica (independiente de [E]).
Sustituyendo [ES] en la ecuación de velocidad obtenemos la misma ecuación, ahora con la
certeza de su independencia de [E].
b) Falso
Hablamos de condiciones saturantes, con lo que implica, pero lo demostramos calculando al
porcentaje de Vmax que llegamos con una [S] de 100 Km.
c) Verdadero
d) Falso
Si V/Vmax = 0,99 esta relación es igual a Kcat·[ES]/Kcat · [E]T (recordemos las ecuaciones).
Esto nos dice que [ES]/[E]T = 0,99, con lo que la enzima libre tiende a 0.
Ya que definimos Kcat como la relación de las constantes implicadas en transformación. En
el caso de una reacción monosustrato Kcat sería k2 , sin incluir k1 y k"1, que formarían parte
de Km y Ks.
4."
Nos piden la especificidad, y el parámetro que nos da ese dato es la constante de especificidad Kcat/Km. Para
determinar Kcat en cada caso, de divide la Vmax entre la concentración total de enzima, (0,03 M). No es
necesario cambiar las unidades ya que las dos están en M y se irán en la operación. Los resultados se muestran
en la tabla:
6
Nº Gly
1
2
3
4
Vmax (M · s"1)
0,093
2,154
0,135
0,063
Km (mM)
0,4
0,4
0,4
0,7
Kcat (s"1)
3,1
7,8
4,5
2,1
Kcat/Km (s"1/mM)
7,75
179,5
11,25
2
En principio no importan las unidades de Kesp ya que, de momento, nos sirve para compararlas. Según eta
tabla, la especificidad iría (de mayor a menor) con el siguiente orden: 2 > 3 > 1 > 4.
b)
En esta pregunta hay que utilizar el dato de Kcat máximo que se muestra en los apuntes, este es de 108 M"1·
s"1 (máximo valor de k1 obtenido experimentalmente), mientras el obtenido en este experimento es de 1,755
·10"5 M"1· s"1, evidentemente no es ele máximo.
Esto se corresponde con lo dicho en teoría, que las proteasas eran, tal vez las enzimas menos eficientes.
5."
E + S ES E + P
No se trata más que de retomar los apuntes:
• Consideramos la transformación más simple, con un complejo ES y la posterior formación de producto más
lenta.
• La concentración inicial de enzima, debe ser al menos dos órdenes de magnitud menor que la concentración
de sustrato. La enzima debe estar a concentración catalítica.
• Consideramos la velocidad inicial hasta que se halla consumido un 5%. Hasta entonces [S]o se considera
constante. Con estas premisas, k"2 es totalmente despreciable. Esto, como ya hemos dicho, se debe al
escaso producto formado a tiempos cercanos a 0.
• Ya que la etapa lenta es la que implica a k"2, es la que determina la velocidad de reacción.
• Se basa principalmente en considerar k2 al menos dos órdenes de magnitud menor que k"1. Esto implica
que despreciamos la formación de producto a partir del complejo enzima sustrato, frente a la formación y
disociación de dicho complejo.
Se trata de las 4 premisas genéricas más la específica para el estado preestacionario.
b)
Sabemos la ecuación genérica de velocidad, independiente del nº de etapas, que es la que nos muestra el
problema, salvo que nos sustituye Kcat por k2. Entonces se trata de hacer que la constante catalítica sea k2.
Para ver las posibilidades acudimos a la relación de constantes que nos dan Kcat. Para el supuesto k2 << k3.
Con esta condición, la suma del denominador es prácticamente k3, que se elimina con el numerador,
quedando como resultado que Kcat = k2. Esto es el resultado de la limitación del proceso, k2 es tan pequeña
que nos está condicionando toda la transformación. Esto nos sirve para diferenciar las etapas lentas, ya que
siempre que veamos una Kcat que tiende a una sola etapa, sabremos que esa es una etapa lenta que nos limita
7
el proceso, ya que la constante es mucho menor que las demás.
c)
Se ha insistido en numerosas ocasiones en los apuntes, que Km es Ks sólo en el caso sencillo de la
aproximación al equilibrio. Para demostrarlo cogemos la relación de constantes para Km y le aplicamos la 5º
premisa k2 << k"1 (al menos dos órdenes de magnitud).
Como se ve, al hacerse despreciable k2, queda sola la constante k"1, que dividida por k1 es la constante de
disociación.
En un ejemplo numérico como este, lo que se pretende es que sepamos manejar las diferentes unidades de las
constantes, bien sean de 1er o 2º orden. En primer lugar:
• k2 y k"1, al menos con dos órdenes de magnitud de diferencia a favor de k"1. k"1 = 104 s"1; k2 = 102 s"1;
ambas son de primer orden.
• La constante k1 es de segundo orden, de modo que debe presentar unas unidades M"1 · s"1. Su valor
numérico debe hacer que Km sea Ks, por ejemplo 107 M"1 · s"1.
• El valor de Km debe estar en M y elevado a una potencia negativa, nunca puede ser 1M. Esto se debe a que
la formación del complejo ES en condiciones estándar es favorable (Go < 0), lo que hace que su constante
de disociación Ks deba ser menor que 0.
Con esto,
, con lo que Km " Ks.
6."
[S] (nM)
2500
3300
5000
10000
16700
Vel (nmol·min−1)
Xan
HpXan
23,8
15,5
30
19,8
39,2
28,2
56,6
46,5
65,2
64,5
[s]/vel (nM/nmol·s"1)
Xan
HpXan
105
161,3
110
166,7
127,5
177,3
176,6
215,05
256,13
258,9
Tenemos las ecuaciones, de modo que hallamos Km y Vmax para cada una.
• Xantina:
• Km= 7007,8 nM = 70·10"5 M.
• Vmax = 654934,54 nmol · min"1 = 654,9 mol · min"1.
• Hipoxantina:
• Km = 20843,5 nM = 2,08·10"5 M.
8
• Vmax = 3020797 nmol · min"1 = 3.021 mol · min"1.
b)
• Xantina:
• Hipoxantina:
c)
• Xantina:
• Hipoxantina:
Según estas constantes de especificidad, la xantina oxidasa prefiere 27 veces más a la Xantina que a la
Hipoxantina.
En respuesta a la segunda parte de la pregunta, hay que decir que
Hemos dicho unas 10 n veces que las enzimas no afectan a la constante de equilibrio, de modo, que qué
importa Kesp, lo único que se notará es que en una mezcla de ambos sustratos, primero llegará al equilibrio el
de la xantina y después la hipoxantina.
d)
En principio el alopurinol no es un inhibidor competitivo, ya que es transformable por la enzima a aloxantina,
pero tampoco es suicida ya que la unión con la enzima no es lo suficientemente estable (aunque 300 min no
están mal). No sabemos si el complejo E"AloXan es covalente, con lo que tampoco podemos basarnos en esas
pruebas. Por lo tanto se concluye que el alopurinol no es suicida ni competitivo. Sí sería competitivo el
producto de la reacción, la aloxantina, ya que entra en el C.A. y prácticamente lo bloquea (si es que el paso es
igual de lento en una dirección y en la otra).
Podríamos pensar que se trata de un inhibidor reversible parcial, pero estos se caracterizan por unirse al
complejo ES, no a la enzima libre.
1
1
9
k1
k2
k"1
10