determinación del efecto producido por diferentes tipos de aceites

DETERMINACIÓN DEL EFECTO PRODUCIDO POR DIFERENTES TIPOS DE
ACEITES VEGETALES Y COMBINACIONES EN LA BIOSÍNTESIS Y
COMPOSICIÓN DEL POLIHIDROXIALCANOATO PRODUCIDO POR
Pseudomonas putida IPT 046 Y Pseudomonas aeruginosa IPT 171
IVÁN ALEJANDRO AVILA LEÓN
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA
FACULTAD DE CIENCIAS
CARRERA DE MICROBIOLOGÍA INDUSTRIAL
São Paulo, SP, Brasil
Enero 2007
DETERMINACIÓN DEL EFECTO PRODUCIDO POR DIFERENTES TIPOS DE
ACEITES VEGETALES Y COMBINACIONES EN LA BIOSÍNTESIS Y
COMPOSICIÓN DEL POLIHIDROXIALCANOATO PRODUCIDO POR
Pseudomonas putida IPT 046 Y Pseudomonas aeruginosa IPT 171
IVÁN ALEJANDRO AVILA LEÓN
TRABAJO DE GRADO
Presentado como requisito parcial para optar al título de
MICROBIOLOGO INDUSTRIAL
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA
FACULTAD DE CIENCIAS
CARRERA DE MICROBIOLOGÍA INDUSTRIAL
São Paulo, SP, Brasil
Enero 2007
NOTA DE ADVERTENCIA
“La Universidad no se hace responsable por los conceptos emitidos por sus
alumnos en sus trabajos de tesis. Solo velará por que no se publique nada
contrario al dogma y a la moral católica y por que las tesis no contengan ataques
personales contra persona alguna, antes bien se vea en ellas el
anhelo de buscar la verdad y la justicia”.
Artículo 23 de la Resolución N° 13 de Julio de 1946
DETERMINACIÓN DEL EFECTO PRODUCIDO POR DIFERENTES TIPOS DE
ACEITES VEGETALES Y COMBINACIONES EN LA BIOSÍNTESIS Y
COMPOSICIÓN DEL POLIHIDROXIALCANOATO PRODUCIDO POR
Pseudomonas putida IPT 046 Y Pseudomonas aeruginosa IPT 171
IVÁN ALEJANDRO AVILA LEÓN
Dr. JOSE GREGORIO CABRERA GOMEZ
Biólogo, Ph.D.
Director
Dra. LUIZIANA FERREIRA DA SILVA
Bióloga, Ph.D
Jurado
SONIA REGINA SILVA QUEIROZ
Ing. Química M.Sc
Jurado
DETERMINACIÓN DEL EFECTO PRODUCIDO POR DIFERENTES TIPOS DE
ACEITES VEGETALES Y COMBINACIONES EN LA BIOSÍNTESIS Y
COMPOSICIÓN DEL POLIHIDROXIALCANOATO PRODUCIDO POR
Pseudomonas putida IPT 046 Y Pseudomonas aeruginosa IPT 171
IVÁN ALEJANDRO AVILA LEÓN
Dra. ANGELA UMAÑA MUÑOZ Ph.D
Decana Académica
Facultad de Ciências
Dr. LUIS DAVID GOMEZ M.Sc
Director de la Carrera
Microbiologia Industrial
A Ana, el ángel guardián que me ha cuidado y amado toda la vida;
A Samuel, por ser el soporte y apoyo a todas mis metas;
A mis 3 padres que siempre me han dado consejos y fuerzas
Y a todos los miembros de mi familia que se han preocupado siempre por mí.
Christian y Rafael, jamás se borrarán sus huellas en mi vida,
sus sueños continúan.
AGRADECIMIENTOS
A mi padre por apoyarme económicamente, por sus consejos, ayuda y ánimo
durante toda mi carrera.
Al Dr. José Gregorio Cabrera Gomez por permitirme trabajar bajo su orientación,
por su apoyo, su paciencia y por compartir su conocimiento a lo largo de la
realización de este trabajo.
A Sonia Queiroz por su apoyo, colaboración y consejos durante este trabajo.
Al Instituto de Pesquisas Tecnológicas del Estado de São Paulo por permitirme
realizar los ensayos en sus instalaciones y a los funcionarios del Centro
Tecnológico de Procesos y Productos por su ayuda.
A mis amigos por su motivación, fuerza y consejos, en especial a Luisa
Velásquez, Mónica Cubillos, Cecilia Romero, Adriana Quintero, Andrés Salcedo
y Killian Nylander.
A mis hermanos, tíos y primos por su apoyo, palabras de aliento, ayuda y
motivación durante toda la carrera y en especial en los momentos más difíciles
de mi vida.
TABLA DE CONTENIDO
RESUMEN
13
1.
INTRODUCCIÓN
14
2.
REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA
16
2.1
POLIHIDROXIALCANOATOS
16
2.1.1
Definición
16
2.1.2
Historia
17
2.1.3
Estructura química
18
2.1.4
Propiedades físicas
19
2.1.5
Aplicaciones
20
2.1.6
Biosíntesis
22
2.1.6.1
β-Ketoacil-CoA tiolasa
22
2.1.6.2
Acetoacetil-CoA reductasa
23
2.1.6.3
P(3HB) Polimerasa
23
2.1.6.4
Formación de gránulos
23
2.1.7
Otras rutas biosintéticas
25
2.1.7.1
Biosíntesis de PHAscl
25
2.1.7.2
Biosíntesis de PHAmcl
26
2.1.7.2.1 Biosíntesis a partir de carbohidratos
26
2.1.7.2.2 Biosíntesis a partir de ácidos grasos
27
2.1.8
Detección y cuantificación de PHA
27
2.2
GÉNERO Pseudomonas
28
2.3
METABOLISMO DE ÁCIDOS GRASOS
30
3.
FORMULACIÓN DEL PROBLEMA Y JUSTIFICACIÓN
35
4.
OBJETIVOS
37
4.1
Objetivo General
37
4.2
Objetivos específicos
37
5.
MATERIALES Y MÉTODOS
38
5.1
Recuperación de los linajes
39
5.2
Producción de PHAmcl a partir de aceites vegetales
39
5.3
Transesterificación BF3 para aceites vegetales
40
5.4
Determinación masa seca celular
41
5.5
Caracterización del polímero
42
5.5.1
Liofilización
42
5.5.2
Cantidad y composición del PHA
42
6.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
44
6.1
Determinación de la composición de los aceites vegetales
44
6.2
Producción y composición de PHA
47
6.3
Influencia del pH
51
6.4
Modulación en la composición del polímero producido
53
6.5
Análisis de flujos metabólicos
58
7.
CONCLUSIONES
63
8.
RECOMENDACIONES
65
9.
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
66
10.
ANEXOS
73
Anexo 1: Medios de cultivo empleados
73
LISTA DE TABLAS
Tabla 1
Monómeros esperados como constituyentes
en la formación de PHA
34
Tabla 2
Composición de los aceites vegetales a utilizar
y las mezclas de estos
40
Tabla 3
Composición de aceites vegetales obtenida
por análisis de cromatografía gaseosa
46
Tabla 4
Producción de PHA por P. putida IPT 046 a
partir de diferentes aceites vegetales y/o
combinaciones de estos
48
Producción de PHA por P. aeruginosa IPT 171
a partir de diferentes aceites vegetales y/o
combinaciones de estos
49
Tabla 6
Variación del pH luego de 72h de cultivo
52
Tabla 7
Producción de 3HDd∆6 por Pseudomonas putida
IPT 046 a partir de ácido linoléico
61
Tabla 8
Producción de 3HDd∆6 por Pseudomonas aeruginosa
IPT 046 a partir de ácido linoléico
62
Tabla 5
LISTA DE FIGURAS
Figura 1.
Gránulos de Polihidroxialcanoato
acumulado en bacterias.
17
Figura 2.
Formula estructural de los polihidroxialcanoatos
19
Figura 3.
Diversos objetos formados por PHB.
21
Figura 4.
Mecanismo propuesto para la formación de
gránulos de PHA.
25
Figura 5.
Vías metabólicas involucradas en la síntesis de PHA.
26
Figura 6.
Vía metabólica de la β-oxidación
30
Figura 7.
Actividades para la determinación de producción
de PHA en linajes IPT 046 e IPT 171 a partir de
aceites vegetales
38
Comparación entre la composición de monómeros
en los PHA sintetizados por P. putida IPT 046 y
P. aeruginosa IPT 171 a partir de un mismo
aceite vegetal
50
Correlación entre la concentración de ácido linoléico
suministrada y la fracción molar de 3HDd∆6 detectado
en el PHA producido por P. putida IPT 046
55
Figura 8.
Figura 9.
Figura 10.
Correlación entre la concentración de ácidos grasos
precursores de monómeros insaturados y la fracción
molar de estos en el PHA producido por P. putida IPT 046. 55
Figura 11.
Correlación entre la concentración de ácidos grasos
precursores de monómeros saturados y la fracción
molar de estos en el PHA producido por P. putida IPT 046. 56
Figura 12.
Correlación entre la concentración de ácido linoléico
suministrada y la fracción molar de 3HDd∆6 detectado
en el PHA producido por P. aeruginosa IPT 171.
56
Correlación entre la concentración de ácidos grasos
precursores de monómeros insaturados y la fracción
molar de estos en el PHA producido por
P. aeruginosa IPT 171
57
Correlación entre la concentración de ácidos grasos
precursores de monómeros saturados y la fracción
molar de estos en el PHA producido por
P. aeruginosa IPT 171
57
Figura 15.
Representación del análisis de flujo metabólico de
los aceites vegetales y su incorporación al PHA.
58
Figura 16.
Relación para determinar la cantidad de monómeros
formados a partir de la síntesis de novo de ácidos
grasos, basada en la cantidad detectada de 3HDd∆5
59
Figura 13.
Figura 14.
RESUMEN
La producción de polihidroxialcanoatos (PHA) en Pseudomonas aeruginosa
IPT171 y P. putida IPT046 fue evaluada utilizando 11 aceites vegetales y 10
combinaciones de estos. Los valores de PHA acumulados por el linaje IPT046
fueron significativamente superiores a aquellos observados para el linaje IPT171
y alcanzó hasta 60% de la masa seca celular. 3-Hidroxioctanoato (3HO) y 3hidroxidecanoato (3HD) representaron un porcentaje mayor que 65% de los
monómeros detectados en el PHA producido por los dos linajes bacterianos,
utilizando cualquiera de los dos aceites. Se observó una tendencia de
incorporación mas eficiente de 3HO en el linaje IPT171 en comparación con el
linaje IPT046. Por otro lado, el sistema de biosíntesis de PHA del linaje IPT046
fue más eficiente en la incorporación de 3-hidroxihexanoato (3HHx) y 3-hidroxi6-dodecenoato (3HDd∆6). La cantidad de monómeros insaturados pudo ser
modulada en función del aceite vegetal suministrado e fueron obtenidos PHA
conteniendo de 0 a 17 mol% de estos monómeros. Menos que 29% del ácido
linoleico suministrado fue efectivamente incorporado como monómero 3HDd∆6.
Por medio del análisis de flujo metabólico, se determinó que en los dos linajes
bacterianos se usaron las dos vías metabólicas para la formación de monómeros
constituyentes del PHA, cuando son cultivados en diversos ácidos grasos; la
síntesis de novo de ácidos grasos se detectó por la cantidad de 3HDd∆5
detectado, y la presencia de la β-oxidación por la existencia de 3HDd∆6.
Estos dos linajes lograron producir monómeros con conformaciones especiales
que pueden hacer factible la modificación química del polímero y su
mejoramiento de las características físicas.
1. INTRODUCCIÓN
Los polihidroxialcanoatos (PHA) son polímeros acumulados por diversas
bacterias en forma de gránulos intracelulares, que alcanzan hasta el 90% de la
masa seca celular (Marchessault, 1996), bajo condiciones desbalanceadas de
crecimiento, como un exceso de fuente de carbono disponible y limitación de por
lo menos un nutriente esencial para la multiplicación celular (Sanchez et. al.,
2003)
Estas moléculas de PHA presentan, una vez extraídas de la célula, propiedades
similares a algunos plásticos comunes, como el polipropileno. El origen
bacteriano del PHA hace de este poliéster un material natural, y por ende,
muchos microorganismos como bacterias y hongos han desarrollado la
capacidad de degradar estas moléculas para usarlas como fuente de carbono;
aparte de esta biodegradabilidad, el PHA es reciclable como los termoplásticos
petroquímicos (Poirier et. al., 2001).
Es grande la cantidad de microorganismos productores de PHA; entre los más
estudiados se encuentran Ralstonia eutropha, Methylobacterium y especies del
género Pseudomonas (P. denitrificans, P. putida, P. oleovorans, P. aeruginosa).
Existen también otras especies menos estudiadas, como Agrobacterium,
Actinobacillus, Azotobacter, Rhodobacter y Sphaerotilus. (Madison y Huisman,
1999).
Gran variedad de sustratos para la producción de PHA han sido utilizados; cabe
destacar el uso de alcanos, alcoholes, ácidos grasos, aceites vegetales y
carbohidratos. Los aceites de origen vegetal son una buena opción para la
obtención de PHA, puesto que son una fuente de carbono renovable y
económica y muchos de los ácidos grasos constituyentes de los aceites
vegetales son insaturados, por lo que pueden funcionar como precursores de
monómeros insaturados que son incorporados al polímero, lo que es esencial
para algunas modificaciones químicas (Silva-Queiroz, 2003).
La actual preocupación por la polución ambiental causada por los plásticos
petroquímicos descartados, ha dado mayor ímpetu al estudio de la producción y
degradación de PHA en el ambiente natural (Anderson y Dawes, 1990). Por tal
motivo, es de vital importancia la optimización de la producción de PHA,
observando no solamente la productividad volumétrica y el contenido final de
PHA en la célula (Hazenberg y Witholt, 1997), sino también el sustrato
empleado, para obtener polímeros que presenten características deseadas y
que sean de bajo costo. Dentro de las estrategias empleadas para el aumento
de la productividad, se describen el uso de cepas mas productivas, la
optimización de los medios de cultivo y el uso de fuentes de carbono de menor
costo (Almeida et. al., 2004), una vez que la fuente de carbono puede contribuir
con 40% del costo de producción de este bioproducto (Choi y Lee, 1999).
Analizando este aspecto, los aceites vegetales se colocan como una buena
alternativa de fuente de carbono, puesto que según Kahar et. al., (2004), el
rendimiento máximo teórico de conversión de aceites vegetales a PHA está en el
orden de 1,00 g/g, comparado con el valor de conversión de sacarosa de 0,33
g/g, obtenido en la práctica industrial (Nonato et. al., 2001).
Adicional a ello, el empleo de aceites vegetales y mezclas de estos no sólo
contribuye a una reducción en los costos de producción, sino que permite la
obtención de polímeros con diferentes conformaciones, debido al metabolismo
empleado por los linajes de Pseudomonas en la asimilación de los ácidos grasos
y la posterior biosíntesis del polímero, lo que permitiría mejorar las propiedades
del PHA para su producción a grande escala.
2. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA
2.1 POLIHIDROXIALCANOATOS
2.1.1 Definición
Los Polihidroxialcanoatos (PHAs) son estructuralmente simples macromoléculas
sintetizadas por muchas bacterias Gram-positivas y Gram-negativas. Los PHAs
son acumulados en gránulos (Figura 1) hasta niveles del 80% del peso seco de
la célula y juegan un rol como material de reserva de energía, carbono y
equivalentes reductores; al polimerizar intermediarios solubles a moléculas
insolubles, la célula no sufre alteraciones de su estado osmótico y se evita así la
pérdida de compuestos valiosos, con lo que las reservas de nutrientes
permanecerán disponibles por un relativo bajo costo (Madison y Huisman, 1999).
La formación de estas macromoléculas se da normalmente bajo condiciones de
privación nutricional de elementos como N, P, S, O o Mg, en presencia de un
exceso de fuente de carbono (Castro y Rendón, 2003).
La utilización de dicho polímero también es considerada una estrategia
desarrollada por las bacterias para incrementar su supervivencia en ambientes
cambiantes. Los PHA son utilizados como fuente de carbono y energía en
condiciones de escasez de nutrientes, como fuente de carbono y energía para el
enquistamiento (en Azotobacter) y la esporulación (en Bacillus), para la
degradación de compuestos tóxicos, como fuente de poder reductor (Almeida et.
al., 2004; Anderson y Dawes, 1990) y como protección de la nitrogenasa de las
bacterias fijadoras de nitrógeno, puesto que el PHA actúa como un sustrato
oxidable en ausencia de sustratos exógenos que puedan ser oxidados
(Anderson y Dawes, 1990). Asimismo, los PHA han sido detectados como
constituyentes de la membrana celular citoplasmática, en complejos con calcio e
polifosfato o asociados a proteínas (Gomez y Bueno-Netto, 2001)
B
A
Figura 1: Gránulos de Polihidroxialcanoato acumulado en bacterias. (A). Azotobacter
chroococcum (Lenz y Marchessault, 2005). (B). Pseudomonas fluorescens (Lee et. al.,
2001)
2.1.2 Historia
El
primer
PHA
descubierto
fue
el
poli(3-D-hidroxibutirato)
(PHB),
un
homopolímero que fue detectado en la especie Bacillus megaterium en el año
1927 (Lenz y Marchessault, 2005). Desde entonces, una larga variedad de PHAs
con diferentes longitudes de cadena de carbonos y grupos R se han estudiado,
con por lo menos 150 diversos componentes de PHA y por lo menos cinco
diversos caminos biosintéticos diferentes (Rehm et al., 1998). Esta variabilidad
en la composición depende de la especificidad del sistema de polimerización, de
la naturaleza del sustrato suministrado, así como de las rutas metabólicas que
llevan a la formación de los monómeros (Silva-Queiroz, 2003).
Los procesos comerciales para la producción de PHAs fueron desarrollados
inicialmente por W.R. Grace en los años sesenta y desarrollados mas adelante
por Imperial Chemical Industries, ICI, en el Reino Unido entre los años setenta y
ochenta. Desde los años noventa, Metabolix Inc. y Monsanto han sido las
fuerzas impulsoras tras la explotación comercial de los polímeros de PHA en
Estados Unidos (Castro y Rendón, 2003). Actualmente, existen 4 marcas:
Biopol™
(copolímero
de
hidroxibutirato
e
hidroxivalerato),
Biomer™
(homopolímero de hidroxibutirato), Nodax™ (copolímero de hidroxibutirato e
hidroxihexanoato) y Biocycle™ (homopolímero de hidroxibutirato, copolímero de
hidroxibutirato e hidroxivalerato) (Lemos et. al., 2006). En Latinoamérica, este
biopolímero viene siendo producido por la empresa brasileña PHB Industrial S.A.
desde el año 2000, con capacidad inicial de 50 toneladas/año e ya en fase de
ampliación (Nonato et. al., 2001).
Recientemente, copolímeros de 3HB y 3-hidroxialcanoatos de cadena media
(3HAmcl) han sido objeto de diferentes patentes presentadas por la empresa
Procter & Gamble (Noda & Bond, 2002; Noda & Satkowski, 2003; Noda et al.,
2005; Hassan et al., 2006), los cuales son polímeros de gran interés, puesto que
poseen propiedades intermediarias entre PHAscl y PHAmcl, como alongamiento
superior al 600% (Sudesh et al., 2000)
2.1.3 Estructura química
Estructuralmente, los PHA son polímeros lineales de (R)-3-hidroxiácidos en los
cuales el grupo carboxilo de un monómero forma un enlace tipo éster con el
grupo hidroxilo del monómero siguiente (Figura 2). El radical R puede ser un
átomo de hidrógeno o una cadena de hasta trece átomos de carbono, que puede
contener instauraciones, cadenas cíclicas, grupos aromáticos e inclusive otros
átomos como bromo, flúor o cloro (Almeida et. al., 2004).
Mas de 150 diferentes tipos de ácidos hidroxialcanoicos han sido identificados
como constituyentes de PHA, cuando la bacteria es cultivada bajo condiciones
limitadas de nitrógeno (Steinbüchel y Valentin, 1995).
Thakor et. al., 2005). Esta variación en la composición monomérica depende del
sustrato suministrado durante la acumulación, por lo que para la síntesis e
incorporación de la mayoría de los monómeros es necesario proporcionar un
sustrato estructuralmente relacionado a estos (Silva-Queiroz, 2003).
Figura 2. Formula estructural de los polihidroxialcanoatos. (Romero, C. 2006)
Los PHA pueden ser divididos en dos clases de polímeros: polímeros de cadena
corta o PHAscl (“short chain length”), conteniendo ácidos 3-hidroxibutírico (3HB)
y 3-hidroxivalerico (3HV), y polímeros de cadena media o PHAmcl (“medium
chain length”), que contienen monómeros de C6 (3-hidroxihexanoato) a C14 (3hidroxitetradecanoato) (Hazenberg y Witholt, 1997). Esta diferencia parece
deberse a la PHA sintasa de los microorganismos, que puede ser dividida en
dos tipos distintos, a pesar que las bases moleculares para la especificidad de
sustrato aun es desconocida (Gomez et al., 1996). Los PHAscl son encontrados
en Ralstonia eutropha, Alcaligenes latus, Azotobacteri vinelandii, Azotobacter
chrococcum y Methylobacterium organoplhilum entre otras (Choi y Lee, 1999),
mientras que los PHAmcl son encontrados en Pseudomonas oleovorans,
Pseudomonas aeruginosa y otras Pseudomonas fluorescentes (Silva-Queiroz,
2003).
2.1.4 Propiedades físicas
La masa molecular varia dependiendo del microorganismo productor de PHA,
pero generalmente esta en el orden de 50,000 a 1,000,000 Da. Dentro de la
célula, el polihidroxibutirato P(3HB) existe en un estado liquido y amorfo; sin
embargo, después de la extracción de la célula por solventes orgánicos, el
P(3HB) se convierte en un estado altamente cristalino, lo que le da bastante
dureza, pero a su vez lo hace un material muy quebradizo. Su punto de fusión es
relativamente alto (180oC), pero cerca del punto de degradación térmica (200oC)
(Kim y Lenz, 2001).
Los polímeros de cadena corta son mas duros y quebradizos, mientras que los
de cadena media son mas flexibles y tienen un punto mas bajo de cristalinidad,
por lo que cada polímero tiene diferentes rangos de aplicación (Madison y
Huisman, 1999). Los PHAscl son catalogados como termoplásticos, mientras
que los PHAmcl, por tener menor cristalinidad y puntos de fusión menores son
reconocidos como elastómeros (Poirier et al., 2001). Los PHAmcl tienen un
alongamiento para ruptura mayor que 100%, mientras que los PHAscl poseen un
alongamiento para ruptura menor que 5%; la incorporación de unidades de 3HV
al P3HB permite aumentar la maleabilidad y resistencia, alcanzándose valores
de alongamiento para ruptura cerca de 50% (Sudesh et al., 2000).
2.1.5 Aplicaciones
Además
de
sus
propiedades
termoplásticas,
los
PHA
poseen
otras
características interesantes: su biodegradabilidad y el hecho de que pueden ser
producidos a partir de recursos renovables. Su producción fermentativa utiliza
productos derivados de la agricultura como fuente de carbono. En la naturaleza
los microorganismos son capaces de degradar los PHA, mediante la acción de
PHA depolimerasas y PHA hidrolasas extracelulares, hasta CO2 y agua
(Almeida et al, 2004).
Como se mencionó anteriormente, las diferencias estructurales de los polímeros
producidos permiten diferentes lugares de aplicación. Los PHAmcl, debido a su
baja rigidez, tienen aplicaciones potenciales en películas medicas y dispositivos
especiales (Sánchez et al., 2003), como transportadores de fármacos, suturas
quirúrgicas, implantes médicos temporarios, como soporte para regeneración de
arterias y sutura para venas de pacientes con deficiencias vasculares; entre
otras
aplicaciones
estudiadas,
especialmente
para
polihidroxibutirato-co-
hidroxivalerato (P3(HB-co-3HV), un copolímero de PHAscl, hay tecnicas de
microencapsulación para la liberación controlada de drogas y otros agentes
activos tales como albúmina de suero bovina, hormona folículo estimulante y
tionicotinamida para el control de la enfermedad de Chagas (Silva-Queiroz,
2003).
También se han empleado en aplicaciones de moldeado, en particular en
embalajes de productos de consumo como botellas, recipientes para
cosméticos, bolígrafos, y palos de golf (Madison y Huisman, 1999) (Figura 3).
Adicional a su potencial como material plástico, los PHA sirven como
precursores quirales para la síntesis de compuestos ópticamente activos; estos
compuestos son usados como portadores biodegradables para dosificación a
largo plazo de insecticidas y herbicidas y son usados como materiales
osteosintéticos en la estimulación del crecimiento de huesos, debido a sus
propiedades piezoeléctricas (Khanna y Srivastava, 2005)
Figura 3: Diversos objetos formados por PHB. Se ha comprobado que la degradación
de estos objetos en suelo es de 3 meses. (Lenz y Marchessault, 2005)
2.1.6 Biosíntesis
Los pasos individuales para la biosíntesis de PHB han sido estudiados en detalle
para algunas bacterias, teniendo en cuenta 3 enzimas de vital importancia en
dicho proceso (Castro y Rendón, 2003):
2.1.6.1 β -Cetoacil-CoA tiolasa: cataliza el primer paso en la formación del
P(3HB). Se dividen en dos grupos dependiendo en la especificidad de sustrato.
El primer grupo consiste en tiolasas con una amplia especificidad por el βketoacil-CoAs en un rango de C4 a C16 (Castro y Rendón, 2003). Esta clase de
enzimas están involucradas principalmente en la degradación de ácidos grasos y
están localizadas en el citoplasma de procariotas y en mitocondrias y
peroxisomas de células vegetales y de mamíferos (Madison y Huisman, 1999)
El segundo tipo de β-Ketoacil-CoA tiolasas esta considerada como biosintética y
tiene un estrecho rango de especificidad por el tamaño de la cadena, de C3 a C5;
estas tiolasas biosintéticas están especializadas para una variedad de roles,
como formación de cuerpos ketónicos y biosíntesis de isoprenoides y esteroides
(Madison y Huisman, 1999).
El mecanismo de acción consiste en dos medias reacciones, de las que resulta
la condensación de dos moléculas de acetil-CoA a acetoacetil-CoA. En la
primera parte de la reacción, el sitio activo con cisteína ataca una molécula de
acetil-CoA para formar el intermediario acetil-S-enzima; en la segunda parte de
la reacción, una segunda cisteína deprotona la otra molécula de acetil-CoA,
resultando una molécula inactiva de acetil-CoA que es capaz de atacar el
complejo acetil-S-enzima y formar de esta manera acetoacetil-CoA. Por lo
anterior, se expone que la enzima contiene dos sitios activos de cisteína, y se
cree que estas tiolasas usan el mismo mecanismo enzimático para condensar
acetil-CoA con acetil-CoA o acil-CoA (Madison y Huisman, 1999).
2.1.6.2 Acetoacetil-CoA reductasa: esta enzima es una (R)-3-hidroxiacil-CoA
deshidrogenasa y cataliza el segundo paso en la biosíntesis del p(3HB),
convirtiendo el acetoacetil-CoA en 3-hidroxibutiril-CoA (Castro y Rendón, 2003).
Esta enzima, junto con la P(3HB) polimerasa, estimulan la reacción de
condensación, puesto que la tiolasa tiene preferencia por la ruptura tiolítica, lo
cual ocurre en dirección opuesta a la biosíntesis de P(3HB); sin embargo, bajo
condiciones de acumulación de P(3HB), la tiolasa actúa contra su dirección
termodinámicamente favorable, cuando la acetoacetil-CoA reductasa reacciona,
la cual necesita de equivalentes reductores en forma de NADPH, por lo cual la
disponibilidad de estos equivalentes es considerada la fuerza directriz de la
formación de P(3HB) (Madison y Huisman, 1999).
2.1.6.3 P(3HB) Polimerasa: es la tercera enzima involucrada en la biosíntesis
de P(3HB). La actividad de polimerización de esta enzima se basa en la
formación de enlaces éster con un residuo de cisteína como sitio activo. Se ha
descubierto que la polimerasa se encuentra en estado hidrofílico e hidrofóbico,
por lo que se supone que la evolución ha seleccionado enzimas que sean
catalíticamente eficientes cuando se presenten problemas relacionados con la
“superficie-zona hidrofóbica-proteína”. La gran variedad de microorganismos
productores de PHA representaría un vasto espectro de condiciones
intracelulares en donde estas enzimas tendrían que haberse adaptado; esto
explicaría el bajo nivel identidad total de secuencias dentro de las diferentes
PHA polimerasas (Madison y Huisman, 1999). Se presume también que el rol de
transferencia de monómeros en la cadena, hecho por la PHA polimerasa, debe
ejercer algún control en el peso molecular del polímero producido, lo cual es una
característica típica de cada microorganismo (Anderson y Dawes, 1990)
2.1.6.4 Formación de gránulos:
Los gránulos tienen un diámetro típico entre 0,2 y 0,5 µm y poseen una
membrana como cobertura de cerca de 2 nm de grosor, compuesto por lípidos y
proteínas, representando el 0,5 y el 2%, respectivamente, del peso del gránulo.
Parece que el número de gránulos por célula es fijado en los estados tempranos
de la acumulación del polímero, y durante la acumulación, la célula pierde su
conformación típicamente cilíndrica para acomodar polímero adicional, hasta el
punto en que la síntesis de PHA disminuye. El cese en la acumulación de
polímero puede deberse a la cantidad acumulada, puesto que al alcanzar su
porcentaje máximo de reserva, la PHA polimerasa permanece activa, lo que
sugiere que constricción física opera e impide que la célula acomode más
polímero dentro de ella, a pesar de la disponibilidad de sustrato y de la
polimerasa activa (Anderson y Dawes, 1990).
La formación de los gránulos puede seguir 4 pasos (Figura 4): 1) la polimerasa
soluble actúa con concentraciones cada vez mayores de 3-hidroxibutiril-CoA en
el citoplasma. Durante la fase lag, oligómeros de hidroxibutiril (HB) son formados
y se mantienen unidos con la enzima. 2) Estos oligómeros de HB forman micelas
que aumentan en tamaño e hidrofobicidad. Consecuentemente, estas partículas
proveen una unión de dos fases, con la polimerasa en la interfase. 3) La enzima
entonces procede rápidamente con la síntesis de P(3HB) dentro del gránulo en
crecimiento, la cual precisa de una superficie disponible. 4) Eventualmente las
micelas coalescen formando grandes gránulos que pueden ser fácilmente
visualizados en el microscopio de contraste de fases (Madison y Huisman, 1999)
Por último, la PhaP es una proteína de unión de PHA que determina el tamaño
de los gránulos. Esta proteína parece que está involucrada en el mantenimiento
de las condiciones óptimas para la síntesis de PHA y la formación de los
gránulos; actúa de manera similar a las oleosinas de las plantas productoras de
aceites y mantiene la integridad de los cuerpos oleosos previniendo su
coalescencia (Madison y Huisman, 1999).
Figura 4. Mecanismo propuesto para la formación de gránulos de PHA. (Madison y
Huisman, 1999)
2.1.7 Otras rutas biosintéticas
Debido a la gran variedad de microorganismos que producen PHA y que viven
en diferentes ambientes y con diferentes fuentes de carbono, la ruta biosintética
que envuelve las enzimas tiolasa, reductasa y polimerasa no es la única
empleada.
2.1.7.1 Biosíntesis de PHAscl (Madison y Huisman, 1999)
La biosíntesis de ese grupo de PHA involucra dos rutas metabólicas diferentes,
dependiendo del sustrato empleado; la primera está mediada por el uso de
monómeros generados durante la oxidación de ácidos grasos, como el enoilCoA, por lo que no implica a las enzimas tiolasa y reductasa. Se produce PHA
principalmente con monómeros de 3-hidroxivalerato (3HV), pero también se
encuentran pequeñas cantidades de 3HB.
La segunda vía envuelve el uso de carbohidratos, por la ruta metilmalonil-CoA.
En esta ruta, se acumula PHA con monómeros de 3HV, con acetil-CoA y
propionil-CoA como precursores: el succinil-CoA es convertido a metilmalonilCoA, el cual es descarboxilado a propionil-CoA; por su parte, el acetil-CoA
proviene de la glicólisis. Este tipo de vía es característica de los Actinomycetes.
2.1.7.2 Biosíntesis de PHAmcl
La biosíntesis de
PHAmcl
posee varias rutas metabólicas, que son
esquematizadas en la figura 5:
Transacilase
Figura 5: Vías metabólicas involucradas en la síntesis de PHAmcl. (Park et al., 2006)
2.1.7.2.1 Biosíntesis a partir de carbohidratos: cuando el microorganismo es
cultivado con carbohidratos como única fuente de carbono, el PHA producido
está compuesto principalmente por monómeros de C10 y C8. Por tal motivo, se
sugiere que estos monómeros son derivados de intermediarios de la biosíntesis
de ácidos grasos a partir de glucosa, lo cual es confirmado por experimentos de
inhibición: cuando la cerulenina (inhibidor de la biosíntesis de ácidos grasos) es
adicionado a cultivos celulares, no se forma PHA a partir de glucosa, aunque sí
hay producción a partir de ácidos grasos. (Madison y Huisman, 1999). Se forman
moléculas de 3-hidroxiacil a partir de la condensación de moléculas de AcetilCoA, via malonil –CoA, para formar el hidroxiácido que será incorporado al
polímero, que es trasferido de la ACP (Acyl Carrier Protein) para la coenzima A
por la transacilasa, para luego realizar la reacción de polimerización catalizada
por la PHA sintasa (Rehm et. al., 1998)
2.1.7.2.2
Biosíntesis a partir de ácidos grasos: la composición de estos
polímeros está directamente relacionada con la estructura de la fuente de
carbono, lo cual sugiere que la ruta biosintética es una rama directa de la
oxidación de ácidos grasos. Cuando la fuente de carbono es de C6 a C12, los
monómeros de PHA tienen la misma longitud que el sustrato disponible, o tienen
dos, cuatro o seis átomos menos. Cuando se administran ácidos grasos de C13C18, la composición del PHA no es relacionada con la longitud del sustrato,
puesto que el monómero más largo insertado tiene 11 o 12 carbonos, aunque es
dependiente para configuraciones como insaturaciones. Cuando se emplean los
ácidos heptadecanoico u octadecanoico, no se observa acumulación de PHA,
puesto que esta fuente de carbono no permite el crecimiento de los
microorganismos, aunque Ballistreri et. al., (2001) lograron obtener acumulación
de PHA a partir de ácido eicosanoico. Como los intermediarios de la oxidación
de ácidos grasos presentan una conformación (S)-3-hidroxiacil-CoA, se necesita
un paso adicional para transformarlos a (R)-3-hidroxiacil-CoA, puesto que la
polimerasa para PHAmcl presenta especificidad para este tipo de monómeros
(Madison y Huisman, 1999); por lo tanto, enzimas como una (R)-específica enoilCoA hidratasa, una hidroxiacil-CoA epimerasa y una 3-cetoacil reductasa han
sido postuladas para unir la β-oxidación con la biosíntesis de PHA (Hoffmann y
Rehm, 2004).
2.1.8 Detección y cuantificación de PHA
Para la determinación de la producción de PHA en las células, las bacterias son
teñidas con colorante Negro Sudan B, indicando la naturaleza lipídica de los
gránulos. Asimismo, pueden teñirse los gránulos con Azul Nilo A, una oxazina
que produce fluorescencia naranja con excitación a 460nm (Khanna y
Srivastava, 2005)
La cuantificación de polímeros del tipo polihidroxialcanoato, se lleva a cabo en la
mayoría de los estudios reportados mediante cromatografía de gases,
empleándose un patrón interno de ácido benzoico, el cual establece los tiempos
de retención mediante los cuales se informa el tipo de estructura y la cantidad de
carbonos que puede tener (Castro y Rendón, 2003). Sin embargo, para usar la
cromatografía de gases es necesario realizar una depolimerización del PHA una
vez extraído de la célula, formando metil-ésteres ó propil-ésteres, dependiendo
si el método empleado es metanólisis (Braunegg et. al, 1978) o propanólisis (Riis
y Mai, 1988), respectivamente.
Se ha empleado el análisis espectroscópico con Resonancia Magnética Nuclear
con
13
C (13C-NMR) para el estudio de la estructura de PHA. Sin embargo, para
PHA con monómeros saturados e insaturados de cadena larga la
13
C-NMR es
mucho mas complicada por la equivalencia de los cambios químicos de los
átomos de carbono y los patrones protónicos del espectro de NMR, lo que
dificulta la determinación estructural (Lee y Choi, 1995)
2.2 GENERO Pseudomonas
Son bacilos rectos o curvados Gram.-negativos que se encuentran en suelos,
aguas dulces y de mar, lodo, vegetación en descomposición y en diferentes
asociaciones con plantas y animales. Su diversidad ecológica refleja sus
requerimientos nutricionales simples y la habilidad por metabolizar un amplio
rango de componentes orgánicos. Son quimiorganotróficos y quimiolitotróficos,
usando CO2 y H2 como fuente de energía. Crecen a pH casi neutro y a
temperaturas en la zona de mesofilia, hasta 43ºC; algunas especies usan más
de cien compuestos diferentes como fuente de carbono y solo unas pocas
especies usan menos de veinte. Utilizan azúcares, ácidos grasos, ácidos
dicarboxílicos y tricarboxílicos, alcoholes, glicoles, compuestos aromáticos
aminoácidos y otros, pero normalmente no pueden descomponer polímeros en
sus componentes monómeros (Moreno y Rios, 1995)
Las Pseudomonas son particularmente ricas en lipasas catalíticamente útiles.
Enzimas de este tipo en las especies P. fluorescens y P. aeruginosa presentan
hidrólisis de éster enantioselectiva, lo cual las hace altamente procuradas en las
reacciones de biotransformación y reacciones de esterificación; adicional a ello,
preparados de estas enzimas no requieren de cofactores para su uso. Las
biotransformaciones también están siendo favorecidas por el uso de cepas
recombinantes, en las que este género bacteriano también presenta grandes
ventajas: los genes de Pseudomonas son frecuentemente más eficientes en su
transcripción y trasducción en las especies originales que en hospederos
heterólogos. Además, pseudomonadas, mucho más que otros microorganismos
Gram-positivos y Gram-negativos, se acomodan mejor para su uso en sistemas
acuosos/solventes por su inherente resistencia a solventes; esta tolerancia a
compuestos tóxicos puede servir para almacenar enzimas a partir de DNA
recombinante que sean eficaces en convertir sustratos insolubles en agua, tales
como los ácidos grasos (Montie, 1998)
Los primeros reportes de la formación de PHAmcl por especies de
Pseudomonas fueron de la especie P. oleovorans, describiendo la producción
del polímero conteniendo 3-hidroxioctanoato por la asimilación de ácidos grasos
de cadena media y cadena larga; esta capacidad también es expresada para el
crecimiento en alcanos (Kessler y Palleroni, 2000). Sin embargo, la síntesis de
PHAmcl es ahora considerada pertinente no sólo para P. oleovorans, sino
también común para todas las Pseudomonas fluorescentes (Ballistreri et. al.,
2001)
Una característica fascinante de muchas especies de Pseudomonas como
organismos productores de PHA es su capacidad de sintetizar estos polímeros
con varios grupos funcionales como halógenos, alquilos ramificados, fenilos,
fenoxilos, olefinas y ésteres, cuando son cultivados en sustratos conteniendo las
estructuras químicas correspondientes. Los PHA que contienen grupos
funcionales son de gran interés, puesto que estos grupos pueden mejorar las
propiedades físicas de los PHAmcl. Además, algunos grupos funcionales
pueden ser modificados por reacciones químicas para obtener más grupos
útiles, que pueden extender la potencial aplicación de los PHA como polímeros
biodegradables y biomateriales funcionales para aplicaciones biomédicas (Kim
et al., 2000)
2.3 METABOLISMO DE ACIDOS GRASOS
Muchas bacterias pueden crecer en ácidos grasos de cadena larga, que son
oxidados a acetil-CoA por una vía llamada β-oxidación (Figura 6).
Ácidos grasos
fabD
Acetil-CoA
acil-CoA
sintetasa
Acil-CoA
β-cetotiolasa
3-Cetoacil-CoA
Acil-CoA
deshidrogenasa
Via de la
β-oxidación
3-hidrxiacil-CoA
desidrogenasa
Enoil-CoA
Enoil-CoA
hidratasa
(S)-3-Hidroxiacil-CoA
Figura 6: Vía metabólica de la β-oxidación para la formación de Acetil-CoA a partir de
ácidos grasos. (Adaptado de Stryer, 1998)
Esta vía consiste en una serie cíclica de cuatro reacciones, al final de las cuales
el acil-CoA es cortado en moléculas con 2 carbonos, liberados bajo la forma de
Acetil-CoA (White, 2000). El acetil-CoA producido a partir de la oxidación de
ácidos grasos de cadena media y larga, y del catabolismo de ácidos grasos de
cadena corta, puede servir como sustrato para la biosíntesis de novo de ácidos
grasos y fosfolípidos, o puede ser metabolizado por la vía del ciclo de Krebs,
para servir como fuente de carbono y energía (Black y DiRusso, 1994)
Los ácidos grasos de cadena larga entran a la célula por un sistema de
transporte auxiliado por proteínas. La proteína FadL se localiza en la membrana
externa, donde actúa como un receptor de ácidos grasos y auxilia su paso a
través de la membrana externa. La acil-CoA sintetasa es responsable por la
activación de acido graso y su paso por la membrana interna; esta molécula
activada (acil-CoA) es oxidada por las enzimas acil-CoA deshidrogenasas,
sintetizadas a partir de los genes fadF y fadG. Estas enzimas presentan
especificidades diferentes, puesto que la codificada por el primer gen posee
especificidad por acil-CoA de cadena media o larga, mientras que la codificada
por el gen fadG presenta especificidad para acil-CoA de cadena corta. El
resultado de la oxidación es un enoil-CoA (acil-CoA insaturado en la posición 2)
(Silva-Queiroz, 2003).
Los siguientes pasos en la β-oxidación de ácidos grasos están asociados a un
complejo multienzimático codificado por los genes fadA y fadB. En este complejo
se encuentran las enzimas enoil-CoA hidratasa, 3-hidroxiacil-CoA hidrogenasa y
3-β-cetoacil-tiolasa. Esta última enzima está codificada exclusivamente por el
gen fadA, mientras que las otras 2 son codificadas por el gen fadB (SilvaQueiroz, 2003).
La
hidratación
del
enoil-CoA
por
la
enzima
enoil-CoA
estereospecífica. Cuando se hidrata el doble enlace trans-
hidratasa
2
es
solamente se
forma el L-isómero del 3-hidroxiacil-CoA. La enzima hidrata también un doble
enlace cis-
2
, pero el producto es entonces el D-isómero. Esta hidratación es el
preludio de la segunda reacción de oxidación, que convierte el grupo hidroxilo
del carbono 3 en un grupo ceto y genera NADH, mediada por la enzima 3hidroxiacil-CoA hidrogenasa, que es específica para el L-isómero del sustrato
hidroxiacilo (Stryer, 1998).
Las reacciones precedentes han oxidado el grupo metileno en el carbono 3
hasta un grupo ceto. La etapa final es la escisión del 3-cetoacil-CoA por el grupo
tiol de una segunda molécula de CoA, que produce acetil-CoA y un acil-CoA
acortado en dos átomos de carbono. Esta escisión tiolítica es catalizada por la 3β-cetoacil-tiolasa. A diferencia de las acil-CoA deshidrogenasas, la β-cetoaciltiolasa tiene una especificidad muy amplia con respecto a la longitud del grupo
acilo (Stryer, 1998).
Los ácidos grasos insaturados, presentes en la mayoría de aceites vegetales,
requieren de dos nuevas enzimas, una isomerasa y una reductasa, para su total
degradación. Esta degradación sigue los pasos normales de la β-oxidación, pero
al llegar a la instauración se requiere de las enzimas adicionales, puesto que la
enzima encargada de la primera oxidación, la acil-CoA deshidrogenasa, no
puede tomar como sustrato un cis-
3
-enoil-CoA, por lo cual la isomerasa
convierte este doble enlace en un doble enlace trans-
2
, logrando así que la
oxidación del ácido graso continúe normalmente. Por otra parte, cuando el ácido
graso posee instauraciones en carbonos pares, luego de la acción de la acil-CoA
deshidrogenasa se produce el 2,4-dienoil-intermediario, que no es un sustrato
adecuado para la siguiente enzima de la vía de la β-oxidación. El obstáculo se
salva por la acción de la 2,4-dienoil-CoA reductasa, una enzima que usa NADPH
para reducir el 2,4-dienoil-intermediario en cis-
3
-enoil-CoA; la isomerasa lo
convierte entonces en forma trans, un intermediario habitual de la β-oxidación
(Stryer, 1998; Schulz y Kunau, 1987). De esta manera, los dobles enlaces
situados en posiciones impares son manipulados por la isomerasa, y los
situados en posiciones pares, por la reductasa y la isomerasa (Stryer, 1998).
Finalmente, cabe resaltar que el uso de lípidos como fuente de carbono
involucra ruptura de triglicéridos por acción de lipasas bacterianas, formando
glicerol y los ácidos grasos correspondientes. El glicerol es fosforilado y oxidado
a dihidroxiacetona fosfato, el cual es un intermediario de la glicólisis, para
convertirse posteriormente a ácido pirúvico y finalmente a Acetil-CoA, que puede
tener 3 destinos: el ciclo de Krebs, la biosíntesis de PHA y la biosíntesis de
ácidos grasos (Romero, 2006).
La síntesis de PHA ocurre luego de la incorporación tanto de intermediarios en el
metabolismo de los ácidos grasos precursores como de sus derivados
(Steinbüchel y Hein, 2001). Por tal motivo, luego de la β-oxidación de los ácidos
grasos administrados como sustrato, se espera observar una incorporación de
monómeros en el PHA relacionados a la fuente de carbono adicionada, con las
correspondientes estructuras químicas (Kim, et. al., 2000); estos monómeros
pueden observarse en la Tabla 1 (Gomez, 2006)
Tabla 1: Monómeros esperados como constituyentes en la formación de PHA,
generados por la b-oxidación de ácidos grasos
Monómeros esperados
Ácido
graso
C6
C8
C10
C12
C8
Octanóico
3HHx
3HO
C10
Decanóico
3HHx
3HO
3HD
C12
Dodecanóico
3HHx
3HO
3HD
3HDd
C14
Mirístico
3HHx
3HO
3HD
3HDd
C16
Palmítico
3HHx
3HO
3HD
3HDd
C16:1
9-hexadecenóico
3HHx
3HO
3HD
3HDd∆
∆5
C18
Esteárico
3HHx
3HO
3HD
3HDd
C18:1
Oleico
3HHx
3HO
3HD
3HDd
C18:2
Linoleico
3HHx
3HO
3HD
3HDd∆
∆6
C18:3
Linolénico
3HHx
3HO
3HDd∆
∆6,9
3HD∆
∆7
Alfa-oleosteárico
3HHx
3HO
C18:3
3HD∆
∆5
3HDd∆
∆5,7
3,6dHDd
C18:1
Ricinolêico
3HHx
3HO
3HD/4HD
C20
Eicosanóico
3HHx
3HO
3HD
3HDd
3HHx: 3-hidroxihexanoato. 3HO: 3-hidroxioctanoato. 3HD: 3-hidroxidecanoato. 3HDd: 3hodroxidodecanoato.
3HDd∆5:
3-hidroxi-5-dodecenoato.
3HDd∆6:
3-hidroxi-6dodecenoato. 3HD∆7: 3-hidroxi-7-decenoato. 3HDd∆6,9: 3-hidroxi-6,9-dien-dodecanoato.
3HD∆5: 3-hidroxi-5 decenoato. 3HDd∆5,7: 3-hidroxi-5,7-dien-dodecanoato. 4HD: 4hidroxidecanoato. 3,6dHDd: 3,6-dihidroxidodecanoato
3. FORMULACION DEL PROBLEMA Y JUSTIFICACION
Debido al aumento de la población mundial, se ha generado una creciente
demanda de productos derivados del petróleo, lo cual contrasta bruscamente
con el agotamiento de este recurso no renovable y su consecuente aumento del
precio en el mercado internacional, actualmente encima de US$ 50/barril
(www.mem.gob.ve/preciopetroleo). Ante esta perspectiva, las investigaciones
que involucren el descubrimiento y mejoras en la producción de productos que
logren reemplazar a los derivados de este combustible fósil, han tomado un
nuevo impulso, y los polihidroxialcanoatos aparecen como una alternativa
altamente prometedora.
Por otra parte, la gran cantidad de residuos generados por la actividad humana,
ha suscitado una preocupación extendida por el manejo y disposición de los
desechos, de los cuales los plásticos están entre los que tienen más impacto
ambiental por su lenta degradación y en muchos casos su difícil disposición.
Aunque el reciclaje alivie en parte la problemática actual, se requieren de
acciones más eficaces para lograr obtener soluciones con mejores resultados,
puesto que el reciclaje presenta un costo elevado y desprecia el material
polimérico. Por otro lado, la incineración libera, durante su proceso, gases
tóxicos que son nocivos al medio ambiente (Costa, 1995). Por este motivo, el
reemplazo de los plásticos no degradables por biopolímeros totalmente
degradables obtenidos a partir de fuentes de carbono renovables sería una
solución mucho más completa para los diferentes aspectos de este problema.
Sin embargo, el precio de los bioplásticos sigue siendo demasiado alto como
para que puedan desplazar a los plásticos tradicionales, sumado al hecho que
algunos pueden no cumplir con las expectativas de aplicación por sus
propiedades mecánicas. Debido a esto, es necesario diseñar estrategias para
obtener polihidroxialcanoatos a un costo similar y que logren satisfacer las
exigencias de los procesos a los que serían sometidos para su uso.
El uso de sustratos como los aceites vegetales, muestra una perspectiva positiva
para solucionar los costos de producción y las exigencias en las propiedades de
los polímeros, puesto que estos sustratos permiten reducir los costos de
elaboración del polímero, por ser Latinoamérica una fuente de gran abundancia
vegetal. Según Akiyama et al. (2003), los aceites vegetales podrían representar
factores de producción de PHA mayores, cuando son comparados con los
factores de producción usando glucosa o sacarosa como fuente de carbono,
puesto que los aceites contienen mayor cantidad de carbono que los azúcares,
reduciendo así los costos de producción y consumo de energía.
Asimismo, la composición de los diferentes aceites vegetales permite añadirle
monómeros con diferentes conformaciones, como instauraciones y radicales
acilos con mayor cantidad de carbonos, lo que daría a los biopolímeros las
propiedades deseadas y mejoradas, junto con una posible potencialización en la
acumulación del polihidroxialcanoato en las bacterias, ayudando de esta manera
en la optimización de la producción de los bioplásicos a escalas mayores.
4. OBJETIVOS
4.1 OBJETIVO GENERAL.
Determinar el efecto producido por el suministro de diversos aceites vegetales y
mezclas de estos, en la biosíntesis y composición del biopolímero producido por
dos linajes bacterianos del género Pseudomonas, (P. putida IPT 046 y P.
aeruginosa IPT 171) conocidas por su producción de este polímero.
4.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
•
Evaluar cuantitativamente la formación de PHA por Pseudomonas putida
IPT-046 y Pseudomonas aeruginosa IPT-171 mediante cromatografía
gaseosa con aceites vegetales como única fuente de carbono.
•
Determinar los diferentes monómeros generados a partir de los aceites
vegetales utilizados como sustrato (tungue, mamona, girasol, coco, linaza,
palma, arroz, canola, maíz, soya y algodón) mediante cromatografía
gaseosa.
•
Establecer las rutas metabólicas implicadas en la degradación de los ácidos
grasos y su acumulación o no dentro del PHA, mediante un análisis de flujo
metabólico.
•
Crear una matriz para determinar la interferencia de los diversos ácidos
grasos componentes de los aceites vegetales en la formación de PHA.
5. MATERIALES Y METODOS
El estudio fue realizado en los laboratorios del Centro Tecnológico de Procesos
y Productos del Instituto de Pesquisas Tecnológicas del Estado de São Paulo,
Brasil (IPT). La metodología empleada para el presente estudio se ve
esquematizada en la figura 7.
Linajes IPT 046 e IPT 171 en glicerol
Recuperación de linajes en Agar
nutriente
Siembra en caldo nutriente
Siembra en medio mineral con los diferentes
aceites vegetales y/o mezclas
Medición pH
Centrifugación
Suspensión células en solución salina con tween 0,1m/v
Centrifugación
Filtración
Secado
Determinación
masa seca
Cromatografía gaseosa
Suspensión células en
agua destilada
Liofilización
Propanólisis
Figura 7: Actividades para la determinación de producción de PHA en linajes IPT
046 e IPT 171 a partir de aceites vegetales
5.1. RECUPERACIÓN DE LOS LINAJES
Se tomaron muestras conservadas en glicerol de cada linaje del banco de cepas
de los laboratorios del IPT, que fueron aisladas de suelos de plantaciones de
caña de azúcar (Gómez et. al., 1996).
Los linajes fueron reactivados por estriamiento en placas de Agar Nutriente
(Anexo 1) y cultivados por 72h a 30oC. Colonias aisladas de cada cultivo se
utilizaron para inocular 125mL de Caldo Nutriente, e incubadas por 24h (30oC,
150rpm). Una vez incubadas, se tomaron muestras para analizar la axenidad del
cultivo por medio de una coloración de Gram.
5.2. PRODUCCIÓN DE PHAmcl A PARTIR DE ACEITES VEGETALES
Los aceites vegetales utilizados se observan en la Tabla 2. También se pueden
observar las diferentes mezclas de los aceites vegetales que fueron
empleadas en el estudio, las cuales fueron deducidas teniendo en cuenta la
cantidad de los respectivos ácidos grasos en cada aceite citados por literatura
(Silva-Queiroz,
2003;
Vieira
et
al.,
2005),
para
obtener
diferentes
concentraciones y poder de esta manera correlacionar la formación de los
monómeros de PHA, con la cantidad de sustrato relacionado (ácido graso) que
es adicionado al cultivo (Gómez, J.G.C., 2006).
Se inocularon 20mL del cultivo anterior a 200mL de Medio Mineral (Anexo 1) con
1g/L de (NH4)2SO4, para que el nitrógeno sea el nutriente limitante, teniendo
como única fuente de carbono los diferentes aceites vegetales y sus mezclas
(concentración 1%v/v), y se incubaron por 72h a 30oC y 150 rpm; pasado el
tiempo de incubación, se hizo la respectiva medición de pH en potenciómetro
(Mettler modelo Delta 350), utilizando patrones de pH 4,7 y 9 (Silva-Queiroz,
2003).
Tabla 2: Composición de los aceites vegetales a utilizar y las mezclas de estos, de
acuerdo con los datos de literatura (Silva-Queiroz, 2006)
ACEITE VEGETAL
O MEZCLA
Tungue
Mamona
Girasol
Linaza
Palma
Arroz
Canola
Maíz
Soya
Algodón
Coco
Mamona (20%), Palma (80%)
Arroz (50%), Maíz (50%)
Palma (15%), Canola (85%)
Palma (50%), Soya (50%)
Girasol (80%), Soya (20%)
Linaza (25%), Algodón (75%)*
Linaza (40%), Algodón (60%)*
Linaza (50%), Algodón (50%)*
Linaza (70%), Algodón (30%)*
Linaza (80%), Algodón (20%)*
C12
C14
0,1
50,9
18,4
48,2
1,0
16,6
PORCENTAJE DE ACIDOS GRASOS (%m/m)
A
C16 C18 C18:1 C18:1
C18:2 C18:3
4,0
1,0
8,0
4,0
3,0
1,2
1,0
3,3
89,2
3,6
0,2
7,0
3,3
14,3
75,4
5,5
3,5
19,1
15,3
56,5
8,7
1,9
14,6
1,2
17,5 1,3
39,9
39,1
0,3
5,4
1,6
56,3
25
11,5 2,2
26,6
58,7
10,5 3,2
22,3
54,5
8,3
25,0 2,8
17,1
52,7
8,0
3,8
5,0
2,5
35,4 3,8
33,5
8,3
14,5 1,8
33,3
48,9
5,9
1,6
50
21,4
9,8
2,7
19,2
33,2
5,0
8,4
3,3
17,5
67,04
3,3
14,5
22,6
28,3
39,6
45,3
C18:3
80
A
C12: ácido láurico. C14: ácido mirístico. C16: ácido palmítico. C18: ácido esteárico.
C18:1: ácido oléico. C18:1A: ácido ricinoléico. C18:2: ácido linoleico. C18:3: ácido
linolénico. C18:3A: ácido α-eleosteárico. *Las mezclas de aceite de linaza y de algodón
son para tener diferentes concentraciones de ácido linolénico
5.3.
TRANSESTERIFICACIÓN BF3 (Trifluoruro de boro) PARA ACEITES
VEGETALES
Para comprobar la composición de los aceites empleados en este estudio, se
realizó el método descrito por Williams (1984), una preparación de ésteres
metílicos para análisis de ácidos grasos por cromatografía en fase gaseosa.
Se pesaron 0,3g de cada uno de los aceites empleados en beaker de 50mL, a
los cuales se les adicionó 6mL de solución de NaOH al 20% en metanol y fue
agitado y calentado cada beaker en baño de maria por 5 minutos. Se agregaron
8mL de BF3-metanol al 20% y esta mezcla se hizo hervir por 3 minutos, luego
de enfriar a temperatura ambiente, se adicionaron 5mL de éter de petróleo y
3mL de solucón saturada de NaCl, descartando el precipitado formado y
recuperando el sobrenadante, al cual le fue agregado sulfato de sodio para
retirar agua residual. Finalmente, la fracción etérea resultante fue analizada por
cromatografía gaseosa, en un cromatógrafo gaseoso Hewlett Packard HP 6890
Series equipado con una columna HP-20M, con 1mL/min de nitrógeno como
fase móvil (Silva-Queiroz, 2006).
5.4.
DETERMINACION MASA SECA CELULAR
Se tomaron 10mL de cada cultivo y se centrifugaron 10min (10000rpm, 10oC).
Se resuspendió el pellet en solución salina con Tween 0,1%m/v y nuevamente se
centrifugó por 10min (10000rpm, 10oC); se suspendió en agua destilada y se
filtró en membranas de poro 0,45µm (Millipore). La membrana junto con las
células se secó por 4h a 100oC; luego de ser retiradas del horno, este conjunto
permaneció 20min en desecador y, después de este período, se determinó la
masa seca celular (MS) por la siguiente ecuación:
MS =
MMC − MM + UM
x1000
VOL
Ecuación 1: Determinación de masa seca.
En donde:
MMC: Masa de la membrana y células después del secado (g)
MM: Masa de la membrana (g)
UM: Humedad media del lote de membrana (g)
VOL: Volumen de suspensión centrifugada (mL)
5.5.
CARACTERIZACIÓN DEL POLÍMERO
5.5.1. Liofilización
Se tomaron 10mL de cada cultivo y se centrifugaron 10min (10000rpm, 10oC).
Se resuspendió el pellet en solución salina con Tween 0,1%m/v y nuevamente se
centrifugó por 10min (10000rpm, 10oC); se suspendió en 2mL de agua destilada
y fue congelado a -20oCpara su posterior liofilización, que fue realizada en un
equipo Labconco modelo 5-75050/75150 con cámara de control de temperatura
durante 24h (Silva-Queiroz, 2003).
5.5.2. Cantidad y composición del PHA
Para determinar la cantidad y la composición del PHA, se realizó el método de
propanólisis descrito por Riis y Mai (1988), en donde se tomaron 20mg de
células liofilizadas, se les adicionaron 2mL de solución de ácido clorhídrico (HCl)
0,1N en propanol (1:4v/v), 2mL de 1,1-dicloroetano (solvente que extrae el
polímero) y 200µL de solución de 40g/L de ácido benzoico en propanol, como
patrón interno. Los tubos fueron cerrados, agitados y sometidos por 3 horas a
100oC en baño de María, agitándolos después de los primeros 30 minutos. Se
enfriaron a temperatura ambiente y se adicionaron 4mL de agua Milli-Q,
agitando vigorosamente por 30seg. La fase acuosa (superior) se descartó y la
fase orgánica (inferior) que contiene los propil-ésteres fue analizada con un
cromatógrafo gaseoso Hewlett Packard HP 6890 Series equipado con una
columna HP-5 (Gomez et al., 1996), con ácido benzóico como patrón interno y
polímeros producidos por P. oleovorans fueron utilizados como patrones
externos (Silva-Queiroz, 2003). Para el análisis de monómeros conteniendo
insaturaciones, especialmente en la región de 12 carbonos, se admitió el mismo
factor de respuesta del componente saturado con 12 carbonos, es decir, el
3HDd.
6.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
6.1 Determinación de la composición de los aceites vegetales
Para confirmar la composición de los ácidos grasos contenidos en los aceites,
estos fueron analizados por cromatografía gaseosa. Los resultados son
presentados en la Tabla 3.
Comparando las tablas 2 y 3, se puede observar que la composición de ácidos
grasos obtenida para los aceites de algodón, arroz, coco, girasol, maíz, soya y
palma, a pesar de no ser exactamente iguales a los datos de literatura,
presentaron grande semejanza.
Para el aceite de canola, se observó una grande diferencia entre los datos de la
literatura y los resultados del análisis. Se esperaba encontrar un alto contenido
de acido oleico (aproximadamente 50%) y un contenido de acido linoleico de
25%; sin embargo, la composición de ácidos grasos fue mucho mas semejante a
aquella encontrada en el aceite de soya o maíz, es decir, cerca de 25% de ácido
oleico y 50% de acido linoleico.
En el aceite de linaza también se observó una diferencia significativa en la
composición. Se esperaba cerca de 50-60% de acido linolénico, sin embargo, el
análisis por cromatografía gaseosa reveló apenas cerca de 7%. Entretanto, el
acido linoleico que debería corresponder a cerda del 15% fue detectado en
concentraciones elevadas (cerca de 60%). Esta variación pudo ser causada por
una alteración del aceite con otro aceite vegetal, o bien por el envejecimiento y
la degradación oxidativa propia que sufre este aceite, provocando un aumento
en el acido linoleico a partir de la oxidación del acido linolenico (Schönemann et.
al., 2006)
Para los aceites de mamona y tungue se esperaba encontrar dos componentes
en cantidades elevadas que no estarían presentes en los demás aceites. En el
caso del aceite de mamona, el pico más expresivo del análisis cromatográfico
presentaba el mismo tiempo de retención el ácido linoleico. Así, fue interpretado
que este pico correspondería al ácido ricinoléico, lo que impidió determinar la
cantidad de ácido linoleico presente en la muestra. Adicional a ello, la cantidad
de ácido ricinoléico detectada fue bastante menor que aquella esperada en la
literatura, siendo detectado el ácido oleico en cantidades mucho mayores que
las esperadas.
En el caso de aceite de tungue, el pico más expresivo del análisis
cromatográfico presentaba el mismo tiempo de retención del ácido linolénico. De
esta manera, fue interpretado que este pico correspondería al ácido αeleosteárico, lo que impidió determinar la cantidad de ácido linolénico presente
en la muestra. Otro punto a tener en cuenta es que la cantidad de acido αeleosteárico detectada fue bastante menor que la esperada con base en la
literatura (aprox. 80%) (Schönemann et. al., 2006), siendo detectados los ácidos
oleico y linoléico en cantidades mucho mayores que las esperadas. Estos
resultados frustraron en parte la propuesta inicial que consistía en evaluar el
PHA producido a partir de aceites vegetales con composición de ácidos grasos
diferenciados.
Aceites
octanóico decanóico
Algodón
0,00
0,00
Arroz
0,00
0,00
Canola
0,22
0,26
Coco
2,21
2,63
Girasol
0,00
0,00
Linaza
0,00
0,00
Mamona
0,00
0,00
Maíz
0,13
0,15
Palma
0,02
0,02
Soya
0,00
0,00
Tungue
0,00
0,00
Láurico
0,00
0,00
4,05
43,15
0,00
0,00
0,00
2,37
0,25
0,00
0,00
Composición de ácidos grasos de los aceites vegetales (% m/m)
Mirístico Palmítico Esteárico Oleico Ricinoleico Linoleico Linolênico α-eleosteárico
0,27
14,64
3,78
21,77
0,00
55,08
4,46
0,00
0,00
16,79
3,96
36,99
0,00
39,77
2,49
0,00
1,55
11,60
3,97
20,65
0,00
51,32
6,38
0,00
16,32
9,68
3,71
18,94
0,00
3,33
0,04
0,00
0,08
8,95
4,16
20,70
0,00
62,42
3,70
0,00
0,00
11,29
3,26
21,29
0,00
57,30
6,86
0,00
0,00
10,66
6,55
27,74
49,71
?
5,35
0,00
0,91
11,38
3,93
24,83
0,00
50,84
5,45
0,00
0,82
41,42
4,99
42,35
0,00
9,89
0,24
0,00
0,00
11,16
3,73
24,46
0,00
54,87
5,78
0,00
0,00
8,63
6,52
22,75
0,00
19,41
?
42,69
Tabla 3: Composición de aceites vegetales obtenida por análisis de cromatografía gaseosa
6.2 Producción y composición de PHA
Los resultados obtenidos de la producción de polihidroxialcanoato son
presentados en las tablas 4 y 5, para P. putida IPT 046 y P. aeruginosa IPT171
respectivamente. Fue observado una acumulación mucho más expresiva por el
linaje IPT 046 que por el linaje IPT 171. Mientras que P. putida IPT 046 alcanzó
hasta 62% de PHA acumulado, los valores obtenidos con P. aeruginosa IPT 171
fueron inferiores a 20%.
Con el objetivo de analizar las diferencias en la eficiencia de incorporación de
monómeros por los linajes bacterianos, fue correlacionado el valor obtenido de
cada monómero a partir de un mismo aceite vegetal o mezcla (Figura 8). Se
observó una tendencia de incorporación más eficiente de 3HO y 3HDd en el
linaje IPT 171 en comparación con la IPT 406 (Figura 8B y 8D). Por otro lado, el
sistema de biosíntesis de PHA de éste último linaje fue más eficiente en la
incorporación de 3HHx, 3HD y 3HDd∆6 (Figura 8A, 8D y 8F). Estos resultados
son confirmados por el experimento realizado por Silva-Queiroz (2003), en
donde el linaje IPT 171 acumuló hasta 35% de 3HO, mientras que en el linaje
IPT 046 el PHA contenía mayor cantidad de 3HD (hasta 50%), confirmado
también por los ensayos realizados por Ballisteri et al. (2001). Para el
monómeros 3HD∆5 no se observó diferencia en la eficiencia de incorporación de
estos monómeros por el sistema de biosíntesis de los dos linajes evaluados
(Figura 8). En la figura 8-G, se observa una mayor eficiencia en la incorporación
de monómeros insaturados por el sistema de biosíntesis de PHA de P. putida
IPT 046, comparada con P. aeruginosa IPT 171.
Al analizar la cantidad de 3HO y 3HD producido por estos dos linajes, ambos
monómeros predominantes en el PHA producido por estas bacterias, se puede
corroborar la observación que ha sido analizada en bastantes ocasiones, en la
que sustratos no relacionados con PHAmcl, como glucosa, gluconato y glicerol,
producen PHA con 3HO como principal constituyente (Solaiman et al., 2006).
Los precursores para la biosíntesis de ácidos grasos vienen del Acetil-CoA
generado de varios sustratos como carbohidratos. El Acetil-CoA es convertido a
alonil-CoA, que es usado para alargar la cadena de carbonos del ácido graso en
dos átomos (Sanchez et al, 2003); esta vía biosintética produce moléculas
alifáticas de (R)-3-hidroxiacil-ACP que son convertidas a R-3-hidroxiacil-CoA por
una transacilasa codificada por el gen phaG, que actúa como sustrato para la
PHA polimerasa (Tobin y O’connor, 2005).
En el PHA producido a partir de aceite de tungue por el linaje IPT 046, fue
observado un pico próximo a la región con monómeros insaturados de 12
carbonos, no detectado en los PHA producidos en los otros aceites. Una vez que
el aceite de tungue presentaría el ácido α-eleosteárico, este pico fue
considerado
correspondiente
al
propil
éster
3-hidroxi-5,7-dodecenoato
(3HDd∆5,7), que sería generado por la β-oxidación de este ácido graso. Este
componente no fue detectado en el PHA producido por el linaje IPT 171.
Xr
PHA
3HB 3HHx 3HO 3HD 3HDd 3HDd∆5,7 3HDd∆5 3HDd∆6 (%MSC) (g/L)
0,9
5,0 22,6 45,3 9,1
0,0
3,1
14,0
48,63 1,49
0,8
5,6 23,7 48,8 8,1
0,0
3,6
9,4
43,20 3,07
0,9
5,1 23,7 49,1 10,7
0,0
2,8
7,8
40,40 2,37
0,4
4,8 24,8 44,8 15,6
0,0
2,8
6,8
19,81 3,21
0,6
5,6 26,8 49,1 16,0
0,0
1,5
0,4
56,70 2,16
1,3
6,5 25,8 47,4 6,2
0,0
2,8
9,9
36,20 3,35
1,0
5,6 24,0 47,3 6,9
0,0
3,4
11,7
26,06 2,92
1,1
6,8 27,5 45,7 6,4
0,0
3,2
9,3
44,08 2,46
1,0
6,4 25,8 47,0 6,8
0,0
3,3
9,6
42,67 3,32
0,9
6,4 25,8 46,1 7,2
0,0
3,5
10,1
45,84 2,69
0,9
6,1 24,9 46,4 7,1
0,0
3,9
10,7
46,89 2,75
1,0
6,5 26,4 46,9 6,2
0,0
3,3
9,7
45,32 2,76
0,9
6,3 25,9 46,8 6,2
0,0
3,5
10,5
41,59 2,96
1,3
6,9 31,4 53,9 3,0
0,0
1,6
N.D
41,54 1,79
1,3
6,2 25,0 45,7 8,3
0,0
3,4
10,1
41,91 2,62
0,6
4,9 24,2 49,8 9,3
0,0
3,5
7,7
62,19 2,00
1,3
8,6 28,9 46,2 7,9
0,0
2,5
4,6
25,45 3,73
0,7
5,8 26,2 50,2 12,6
0,0
2,1
2,4
49,12 2,61
0,7
5,8 25,7 51,0 13,1
0,0
1,8
1,9
52,34 2,52
1,0
6,2 25,0 46,0 7,2
0,0
3,5
11,0
42,88 1,73
0,2
4,2 22,5 48,1 8,1
5,5
8,4
2,9
17,57 2,70
Composición PHA (mol%)
MSC – Masa Seca Celular; 3HB – 3-hidroxibutirato; 3HHx – 3-hidroxihexanoato; 3HO – 3-hidroxioctanoato;
3HD – 3-hidroxidecanoato; 3HDd – 3-hidroxidodecanoato; 3HDd∆5,7 – 3-hidroxi-5,7-dodecenoato;
3HDd∆5 – 3-hidroxi-5-dodecenoato; 3HDd∆6 – 3-hidroxi-6-dodecenoato. PHA – polihidroxialcanoato;
Xr – biomasa residual.
ACEITES
Algodón
Arroz50/Maiz50
Arroz
Canola
Coco
Girasol80/Soya20
Girasol
Linaza25/Algodón75
Linaza40/Algodón60
Linaza50/Algodón50
Linaza70/Algodón30
Linaza80Algodón20
Linaza
Mamona
Maiz
Palma15/Canola85
Palma50/Soya50
Palma80/Mamona20
Palma
Soya
Tungue
MSC
(g/L)
2,90
5,40
3,97
4,00
4,98
5,25
3,95
4,39
5,78
4,96
5,18
5,05
5,06
3,06
4,51
5,28
5,00
5,12
5,29
3,02
3,27
Tabla 4: Producción de PHA por P. putida IPT 046 a partir de diferentes aceites vegetales y/o combinaciones de estos
MSC
(g/L)
2,58
2,69
2,49
4,61
2,40
2,61
2,69
2,66
2,43
2,58
2,72
2,72
2,67
2,19
2,03
2,30
3,28
4,07
2,73
4,97
2,96
Composición PHA (mol%)
3HB 3HHx 3HO 3HD 3HDd 3HDd∆5,7 3HDd∆5
0,00
2,33
0,88 3,60 33,27 45,64 9,86
0,83 3,28 30,51 48,96 9,46
0,00
3,16
0,76 3,49 28,14 50,65 11,32
0,00
2,69
0,00 4,24 34,36 44,57 9,68
0,00
2,47
1,05 4,87 44,07 35,02 14,99
0,00
0,00
0,88 3,75 30,69 46,73 9,06
0,00
3,28
0,94 3,72 35,11 43,57 9,95
0,00
1,47
1,01 4,46 40,47 35,84 9,83
0,00
1,91
1,11 4,90 38,65 35,72 9,72
0,00
3,18
2,28 4,31 38,55 37,51 10,30
0,00
1,55
0,00 4,87 34,95 41,67 9,22
0,00
3,31
0,00 5,06 35,35 42,93 10,55
0,00
1,35
1,12 4,38 38,92 37,53 9,19
0,00
2,87
0,00 4,87 29,07 38,32 18,56
0,00
3,59
0,00 3,88 33,39 49,17 9,39
0,00
2,82
0,76 3,63 35,12 41,24 11,90
0,00
3,11
0,77 3,73 33,64 46,67 10,99
0,00
2,10
0,64 3,24 31,30 50,01 12,62
0,00
1,62
0,00 4,12 37,14 41,89 13,88
0,00
1,42
0,00 3,70 30,12 50,85 9,23
0,00
2,52
1,09 5,30 29,38 42,43 6,05
0,00
9,80
3HDd∆6
4,42
3,80
2,96
4,69
0,00
5,59
5,25
6,49
6,71
5,51
5,98
4,76
5,99
5,60
1,35
4,23
2,08
0,56
1,56
3,58
5,95
%PHA
(%MSC)
11,51
14,15
16,62
6,80
18,45
13,79
11,78
13,94
13,03
11,05
10,95
8,38
12,53
6,22
10,76
11,04
15,25
15,93
17,29
6,05
6,47
Xr
(g/L)
2,29
2,31
2,08
4,30
1,96
2,25
2,38
2,29
2,12
2,30
2,43
2,50
2,34
2,06
1,81
2,05
2,78
3,42
2,26
4,67
2,77
MSC – Masa Seca Celular; 3HB – 3-hidroxibutirato; 3HHx – 3-hidroxihexanoato; 3HO – 3-hidroxioctanoato;
3HD – 3-hidroxidecanoato; 3HDd – 3-hidroxidodecanoato; 3HDd∆5,7 – 3-hidroxi-5,7-dodecenoato;
3HDd∆5 – 3-hidroxi-5-dodecenoato; 3HDd∆6 – 3-hidroxi-6-dodecenoato. PHA – polihidroxialcanoato;
Xr – biomasa residual.
ACEITES
Algodón
Arroz50/Maiz50
Arroz
Canola
Coco
Girasol80/Soya20
Girasol
Linaza25/Algodón75
Linaza40/Algodón60
Linaza50/Algodón50
Linaza70/Algodón30
Linaza70/Algodón30
Linaza80Algodón20
Linaza
Mamona
Palma15/Canola85
Palma50/Soya50
Palma80/Mamona20
Palma
Soya
Tungue
Tabla 5: Producción de PHA por P. aeruginosa IPT 171 a partir de diferentes aceites vegetales y/o combinaciones de estos
3HHx (mol%)
10
9
8
7
6
5
4
3
2
1
0
0,0
3HO (mol%)
B
IPT046
IPT046
A
50
45
40
35
30
25
20
15
10
5
0
1,0
2,0
3,0
4,0
5,0
6,0
7,0
8,0
9,0
0
10,0
5
10
15
20
3HD (mol%)
C
25
30
35
40
45
50
IPT171
IPT171
3HDd (mol%)
D
20,0
60,0
15,0
40,0
IPT046
IPT046
50,0
30,0
10,0
20,0
5,0
10,0
0,0
0,0
10,0
20,0
30,0
40,0
50,0
0,0
0,0
60,0
IPT171
F
15,0
20,0
3HDd∆
∆6 (mol%)
10
9
10
8
7
6
8
9
7
IPT046
IPT046
10,0
IPT171
3HDd∆
∆5 (mol%)
E
5,0
5
4
3
2
6
5
4
3
2
1
1
0
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
0
0,0
10
1,0
2,0
3,0
4,0
5,0
6,0
7,0
8,0
9,0
10,0
IPT171
IPT171
G
3HAInsaturados (mol%)
20,0
IPT046
15,0
10,0
5,0
0,0
0,0
5,0
10,0
15,0
20,0
IPT171
Figura 8: Comparación entre la composición de monómeros en los PHA sintetizados por
P. putida IPT 046 y P. aeruginosa IPT 171 a partir de un mismo aceite vegetal
El monómero 3-hidroxi-5-dodecenoato (3HDd∆5) es producido por la síntesis de
novo de ácidos grasos (Huijberts et al., 1992), siendo normalmente detectado en
los PHA producidos a partir de carbohidratos (Sanchez et. al., 2003), y también
de otras fuentes de carbono que son metabolizadas a acetil-CoA, como
gluconato, acetato y etanol (Rehm et. al., 2001). Para todas las muestras de
aceite fue observada la presencia del monómero 3HDd∆5, probablemente
proveniente de la síntesis de novo de ácidos grasos a partir del Acetil-CoA
derivado de la β-oxidación de los ácidos presentes en los aceites, o de la
oxidación del glicerol proveniente de los triglicéridos. En el PHA producido a
partir de carbohidratos por P. putida IPT 046, fue detectado cerca de 4-5mol%
de este monómero (Sanchez et al., 2003). Utilizando aceite de tungue, se
observó un valor significativamente mayor de 3HDd∆5 tanto para el linaje IPT
046 como para el IPT 171, en comparación con los demás aceites; Este valor
observado es mucho mayor del reportado a partir de carbohidratos como
sustrato, lo que sugeriría la presencia de un ácido graso en el aceite de tungue
que sería precursor de este monómero, una vez que la fracción molar obtenida
no podría ser explicada considerando su síntesis solamente a partir del AcetilCoA resultante de la β-oxidación y de la oxidación del glicerol. Tsuzuki y
colaboradores (2003) verificaron la presencia del ácido 9,11-octadecenóico en el
hígado y lípidos plasmáticos de ratones alimentados con ácido α-eleosteárico; si
esa conversión también ocurriera en bacterias, la metabolización subsiguiente
del ácido 9,11-octadecenóico por el ciclo de la β-oxidación llevaría a la formación
del monómero 3HDd∆5.
6.3 Influencia del pH
De acuerdo a lo propuesto anteriormente por Gomez et. al., (1997), el pH ideal
que favorece tanto el crecimiento como la acumulación por bacterias
productoras de PHA está en el orden de 7, por lo cual el pH inicial de todos los
medios de cultivo para la acumulación de PHA fue ajustado a este valor.
Después de 72h de cultivo, se midió la variación de pH. Los resultados están
presentados en la Tabla 6
Tabla 6: Variación del pH luego de 72h de cultivo
LINAJE
ACEITE Y/O
MEZCLA
IPT171 IPT046
Soya
4,896
6,512
Canola
4,097
6,527
Arroz
4,606
6,532
Palma
4,779
6,543
Linaza
6,142
6,476
Girasol
5,021
6,668
Mamona
4,979
6,446
Algodón
4,892
6,503
6,442
Palma80/Mamona20 4,738
Arroz50/Maiz50
4,643
7,267
Palma15/Canola85
4,980
6,606
Palma50/Soya50
4,940
6,219
Girasol80/Soya20
4,644
7,288
Linaza25/Algodón75 5,304
6,563
Linaza40/Algodón60 5,288
6,392
6,326
Linaza50/Algodón50 5,154
Linaza70/Algodón30 5,146
6,387
Linaza80Algodón20 5,138
5,360
Tungue
6,638
6,493
Coco
5,960
6,572
Maiz
4,715
6,503
Se observa que todos los cultivos de P. aeruginosa IPT171 presentaron un
descenso mayor en el pH comparados con los cultivos de P. putida IPT046. Esto
pudo repercutir en la formación de PHA, lo que se puede inferir por las bajas
concentraciones de polímero acumulado por el linaje IPT 171, puesto que en el
ensayo realizado por Silva-Queiroz (2003), se acumuló hasta 23% de PHA con
este linaje, cuando el pH bajó hasta 5,7, mientras que en este ensayo la media
de pH es de 5,083. El descenso del pH puede ser atribuido al consumo de los
iones de amonio, bien como al metabolismo de los ácidos grasos libres
provenientes de la ruptura de los triglicéridos por acción de las lipasas
bacterianas (Romero, 2006).
A pesar de poder tener un elevado consumo de las fuentes te carbono y
nitrógeno, probablemente los valores de PHA y biomasa totales alcanzados
podrían haber sido mayores si el pH y otros factores que son difíciles de
controlar en frascos agitados hubiesen sido mantenidos en niveles más
adecuados, como acontece en biorreactores.
Con respecto al linaje IPT 046, el pH también tuvo un ligero descenso en
comparación con el ensayo anterior realizado por Silva-Queiroz (2003), aunque
se observó una mayor acumulación de polímero en el presente ensayo.
Probablemente las PHA sintasas en este linaje actúan bajo un pH mas ácido, lo
que favoreció la producción del polímero en mayores cantidades.
6.4 Modulación en la composición del polímero producido
Con el objetivo de verificar la posibilidad de modular la composición del PHA
producido a partir de diferentes aceites o combinaciones de estos, fue
correlacionada la cantidad de ácidos dada y la composición del PHA obtenido
para los dos linajes (Figuras 9 a 14)
Se obtuvo una correlación linear entre la concentración de ácido linoléico suplida
y la fracción molar de 3HDd∆6, tanto para P. putida IPT046 como para P.
aeruginosa IPT171 (Figuras 9 y 12), siendo que en media, el linaje IPT 046 se
mostró mas eficiente (el doble de eficiencia) en la incorporación de 3HDd∆6 a
partir de las mismas cantidades de ácido linoléico adicionadas, con base en los
coeficientes angulares de ajuste de las rectas.
Experimentos anteriores de acúmulo de PHA por P. putida IPT 046 realizados
por Silva-Queiroz (2003), revelaron que la fracción molar de 3HDd∆6 en el PHA
acumulado varió con la cantidad de ácido linoléico adicionada como fuente de
carbono, hasta alcanzar un valor constante de 15mol%, alcanzado con la
administración de 2,5g/L de ácido, no aumentando la cantidad del monómero al
incrementar los gramos de acido (hasta 5g/L). En el presente ensayo,
considerando la composición de ácidos grasos presentes en los aceites
vegetales, fueron realizados experimentos en los cuales se adicionó hasta 5g/L
de ácido linoléico; se observó una variación aproximadamente linear de la
fracción molar de este monómero con relación a la cantidad de acido adicionada,
alcanzando hasta 14mol% de 3HDd∆6. una vez que, el acido linoleico debe ser
inicialmente liberado del triglicérido para luego ser utilizado por la célula, se tiene
un sistema dinámico de liberación de ácidos grasos y consumo de estos, que
son factores que determinan la concentración de este acido en el medio de
cultivo. Así, a pesar de haberse administrado hasta 5g/L en forma de triglicéridos
en el aceite vegetal, la concentración de ácido linoléico disponible para la célula
a lo largo del cultivo podo haber sido muy inferior a ese valor.
También fue obtenida una correlación linear al analizar la presencia de
monómeros insaturados y los ácidos precursores de estos monómeros
incorporados en los aceites (Figuras 10 y 13). Por tanto, la cantidad de
monómeros insaturados pudo ser modulada en función del aceite vegetal
suministrado, obteniendo PHA con valores de 0 a 17mol% de estos monómeros.
Asimismo, se analizó la correlación entre la cantidad de ácidos grasos
precursores de monómeros saturados suministrados e la fracción molar de
monómeros observados (Figuras 11 y 14). Inicialmente, se observa un aumento
prácticamente linear en la cantidad de monómeros saturados a medida que se
adicionan más ácidos grasos precursores. Sin embargo, hay una tendencia a la
estabilización en el valor de 97-98mol%. Este resultado era esperado, una vez
que la formación de 3HDd∆5 por la biosíntesis de ácidos grasos esta siempre
contribuyendo para la composición del PHA sintetizado.
Todos los datos presentados refuerzan la posibilidad de modular el PHA
sintetizado a partir de aceites vegetales o ácidos grasos. Como fue escrito
anteriormente, la posibilidad de modular estos polímeros aumenta su
aplicabilidad, una vez que las propiedades físicas son diferenciadas por su
composición.
16
14
y = 0,0007x + 0,1765
R2 = 0,8531
3HDd 6 (mol%)
12
10
8
6
4
2
0
0
5000
10000
15000
20000
ácido linoleico (µmol/L)
Figura 9: Correlación entre la concentración de ácido linoléico suministrada y la fracción
molar de 3HDd∆6 detectado en el PHA producido por P. putida IPT 046.
18
Monômeros Insaturados (mol%)
16
y = 0,0007x + 1,422
R2 = 0,8715
14
12
10
8
6
4
2
0
0
5000
10000
15000
20000
25000
Ac. Graxos Insaturados (µmol/L)
Figura 10: Correlación entre la concentración de ácidos grasos precursores de
monómeros insaturados y la fracción molar de estos en el PHA producido por P. putida
IPT 046.
Monomeros saturados (mol%)
100
95
90
y = 12,078Ln(x) - 27,792
R2 = 0,854
85
80
10000
15000
20000
25000
30000
35000
40000
Ac. graxos saturados (µmol/L)
Figura 11: Correlación entre la concentración de ácidos grasos precursores de
monómeros saturados y la fracción molar de estos en el PHA producido por P. putida
IPT 046.
16
14
y = 0,0003x + 0,808
R2 = 0,5821
3HDd
∆6 (mol%)
12
10
8
6
4
2
0
0
5000
10000
15000
20000
Ac. Linoleico (µmol/L)
Figura 12: Correlación entre la concentración de ácido linoléico suministrada y la
fracción molar de 3HDd∆6 detectado en el PHA producido por P. aeruginosa IPT 171.
18
Monômeros Insaturados (mol%)
16
y = 0,0004x + 1,3767
14
R20,5695 =
12
10
8
6
4
2
0
0
5000
10000
15000
20000
25000
Acidos Graxos Insaturados (µmol/L)
Figura 13: Correlación entre la concentración de ácidos grasos precursores de
monómeros insaturados y la fracción molar de estos en el PHA producido por P.
aeruginosa IPT 171.
100
Monômeros saturados (mol%))
y = 7,2522Ln(x) + 23,138
R 20,5841 =
95
90
85
80
0
5000
10000
15000
20000
25000
30000
35000
40000
Acidos Graxos saturados (µmol/L)
Figura 14: Correlación entre la concentración de ácidos grasos precursores de
monómeros saturados y la fracción molar de estos en el PHA producido por P.
aeruginosa IPT 171.
6.5 Análisis de Flujos Metabólicos
Para comprender mejor el metabolismo de los ácidos grasos administrados al
cultivo y su posterior incorporación en la síntesis de PHA, se esquematizó el flujo
metabólico en la Figura 15.
Figura 15: Representación del análisis de flujo metabólico de los aceites vegetales y su
incorporación al PHA. 1: µmoles de ácidos grasos suministrados. 2: Intermediarios
exclusivos de la β-oxidación de ácidos grasos. 3: µmoles de Acil-CoA teóricos
resultantes de la β-oxidación. 4: Intermediarios formados de condensación de AcetilCoA provenientes de la β-oxidación. 5: µmoles Acetil-CoA no utilizado para la formación
de monómeros; 6: µmoles de Acetil-CoA usado para la biosíntesis de novo de ácidos
grasos. 7: µmoles de Acetil-CoA utilizado para respiración y formación de biomasa. 8:
µmoles de Acetil-CoA convertidos a CO2 por el Ciclo de Krebs. 9: µmoles de Acetil-CoA
resultantes de la oxidación del glicerol.
El análisis de flujos metabólicos fue realizado para cada uno de los cultivos
realizados con los dos linajes bacterianos e con los diferentes aceites vegetales
suministrados.
Las concentraciones de los ácidos grasos adicionados fueron estimadas con
base en la composición de los ácidos grasos de los aceites vegetales, que fue
obtenida mediante el análisis realizado por cromatografía gaseosa de metilésteres. El análisis por cromatografía gaseosa determino la cantidad de cada
uno de los monómeros formados. Monómeros obtenidos exclusivamente a partir
de la β-oxidación de ácidos grasos (3HDd∆6 y 3HDd∆5,7) o de la biosíntesis de
ácidos grasos (3HDd∆5) fueron fácilmente detectados. Para los monómeros que
pueden ser producidos tanto a partir de la β-oxidación como por la biosíntesis de
ácidos grasos (3HHX, 3HO, 3HD y 3HDd), con el objetivo de cuantificar la
contribución de cada una de esas vías metabólicas en la formación de esos
monómeros, fue utilizado el siguiente criterio: se admitió que las cantidades de
3HHX, 3HO, 3HD, 3HDd y 3HDd∆5 producidos por la síntesis de novo guardan
la proporción 3:20:70:3:4; o sea, guardan la misma proporción obtenida cuando
únicamente la biosíntesis de ácidos grasos contribuye con los monómeros para
la biosíntesis de PHA, como por ejemplo son suministrados carbohidratos como
fuente de carbono (Sanchez et al., 2003). Así, los monómeros derivados de la boxidación de ácidos grasos fueron estimados considerando la diferencia entre
aquellos que habrían sido provenientes de la biosíntesis de ácidos grasos e el
total de monómeros detectados por cromatografía gaseosa.
Ese criterio utilizado se mostró inadecuado, pues, en la mayoría de los casos, la
cantidad de monómeros que serían obtenidos por la biosíntesis de ácidos grasos
(con base en la cantidad de 3HDd∆5 detectado) fue superior al total de
monómeros detectados por la cromatografía gaseosa. En otras palabras, la
síntesis de monómeros a partir de la biosíntesis de ácidos grasos no ocurre de la
misma forma en la síntesis de PHA a partir de aceites vegetales que cuando una
fuente de carbono que utiliza exclusivamente esa vía metabólica es
suministrada; de esta forma, no fue posible establecer la contribución de cada
una de las vías metabólicas (β-oxidación y síntesis de novo de ácidos grasos)
para la biosíntesis de PHA.
En las tablas 7 y 8 se puede observar la incorporación de 3HDd∆6 por los dos
linajes estudiados. Con estas tablas se puede inferir que la ruta de la β-oxidación
contribuyó en la formación de monómeros, puesto que, este monómero es
obtenido exclusivamente a través de esta vía metabólica (Tabla 1). El porcentaje
de conversión de este ácido a 3HDd∆6 alcanzó un máximo de %YP/S de 28%.
Esto indica que la mayor cantidad de ácido linoléico fue metabolizado
eficientemente por la β-oxidación, no permitiendo de esta manera su
incorporación como 3HDd∆6; el porcentaje de conversión del ácido linoléico a
este monómero fue mucho menor por el linaje IPT171 (Tabla 8), lo que pudo ser
causado por el descenso del pH en el medio de cultivo, lo cual debió haber
impedido la metabolización eficiente de ese substrato por ese linaje bacteriano
Tabla 7: Producción de 3HDd∆6 por Pseudomonas putida IPT 046 a partir de ácido
linoléico
Aceite Vegetal y/o
Mezcla
Algodón
Arroz50/Maiz50
Arroz
Canola
Coco
Girasol80/Soya20
Girasol
Linaza25/Algodón75
Linaza40/Algodón60
Linaza50/Algodón50
Linaza70/Algodón30
Linaza80Algodón20
Linaza
Mamona
Palma15/Canola85
Palma50/Soya50
Palma80/Mamona20
Palma
Soya
Tungue
Maiz
Ac. Linoleico
(µ
µmol/L)
15917,02
13102,04
11506,88
14819,46
940,97
17631,77
18069,14
14758,72
14063,73
13600,41
12673,76
12210,44
11283,79
0,00
13024,69
9368,32
2283,46
2854,33
15882,30
5618,28
14697,19
3HDd∆
∆6
(µ
µmol/L)
1183,35
1331,04
755,16
324,31
144,86
2629,76
727,34
2536,04
3315,79
3208,49
3594,93
3109,19
1344,98
152,90
1526,00
835,44
374,49
315,04
868,48
100,73
1166,71
%YP/S: Porcentaje del Rendimiento producto-sustrato
%YP/S
7,43
10,16
6,56
2,19
15,40
14,91
4,03
17,18
23,58
23,59
28,37
25,46
11,92
0,00
11,72
8,92
16,40
11,04
5,47
1,79
7,94
Tabla 8: Producción de 3HDd∆6 por Pseudomonas aeruginosa IPT 171 a partir de ácido
linoléico
Aceite Vegetal y/o
Mezcla
Algodón
Arroz50/Maiz50
Arroz
Canola
Coco
Girasol80/Soya20
Girasol
Linaza25/Algodón75
Linaza40/Algodón60
Linaza50/Algodón50
Linaza70/Algodón30
Linaza80Algodón20
Linaza
Mamona
Palma15/Canola85
Palma50/Soya50
Palma80/Mamona20
Palma
Soya
Tungue
Ac. Linoleico
(µ
µmol/L)
15917,02
13102,04
11506,88
14819,46
940,97
17631,77
18069,14
14758,72
14063,73
13600,41
12673,76
12210,44
11283,79
N.D
13024,69
9368,32
2283,46
2854,33
15882,30
5618,28
3HDd∆
∆6
(µ
µmol/L)
80,81
88,58
74,72
90,45
0,00
121,69
102,83
150,24
132,39
98,57
109,75
124,87
44,90
18,26
66,20
64,25
22,15
45,60
65,77
69,68
%YP/S: Porcentaje del Rendimiento producto-sustrato
%YP/S
0,51
0,68
0,65
0,61
0,00
0,69
0,57
1,02
0,94
0,72
0,87
1,02
0,40
N.D
0,51
0,69
0,97
1,60
0,41
1,24
7.
•
CONCLUSIONES
Aceites vegetales con diferentes composiciones de ácidos grasos fueron
suministrados tanto para P. aeruginosa IPT171 como para P. putida IPT046.
Se verificó que la composición del PHA depende tanto de la especie
bacteriana como de los ácidos grasos proporcionados.
•
Se corroboró que el linaje P. putida IPT 046 es mas eficiente en la
acumulación de PHA, alcanzando un 62% del monómero en la biomasa
generada, comparado con el linaje P. aeruginosa IPT 171, que alcanzó hasta
un 20%; se determinó también que el pH es un factor importante en la
actividad enzimática de los linajes estudiados y por ende en la formación del
PHA, puesto que el linaje IPT 171 acidificó en mayor cantidad el medio y
produjo menos PHA, comparado con el linaje IPT 046
•
En la síntesis de 3HDd∆6, se observó una correlación linear entre la cantidad
de ácido linoleico abastecida y la fracción molar acumulada de este
monómero. Sin embargo, menos que 28% de este acido fue efectivamente
incorporado en forma de este monómero, indicando un bajo potencial en la
incorporación de 3HDd∆6 por el sistema de biosíntesis de PHA de las dos
bacterias evaluadas.
•
Se determinó que en los dos linajes bacterianos se usaron las dos vías
metabólicas para la formación de monómeros constituyentes del PHA,
cuando son cultivados en diversos ácidos grasos; la síntesis de novo de
ácidos grasos se detectó por la cantidad de 3HDd∆5 detectado, y la
presencia de la β-oxidación por la existencia de 3HDd∆6.
•
A pesar de las divergencias entre las concentraciones de ácidos grasos
detectadas y las esperadas de acuerdo con la literatura, la matriz fue
parcialmente usada, como una extrapolación de los posibles resultados
obtenidos; esto pudo observarse al analizar la cantidad de ácido linoléico que
fue incorporada al polímero en forma de 3HDd∆6, y en la cantidad de ácido αeleosteárico convertido a 3HDd∆5,7, aunque determinados ácidos grasos no
produjeron los monómero o no fueron detectados, como en el caso del aceite
de mamona.
•
El modelo usado para detectar la presencia de monómeros provenientes de
la biosíntesis de ácidos grasos no se adapta a las exigencias del ensayo
anterior, puesto que se detectaron menores cantidades de monómeros
producidos que los calculados.
•
Se lograron producir monómeros con conformaciones especiales que pueden
hacer factible la modificación química del polímero y su mejoramiento de las
características
físicas,
puesto
que
los
linajes
empleados
tomaron
intermediarios de la β-oxidación para su incorporación, como cadenas con
dobles enlaces carbono-carbono; sin embargo, se notó una deficiencia en la
incorporación de monómeros a partir del ácido ricinoléico presente en el
aceite de mamona, probablemente a que fue metabolizado por otras vías que
impidieron su incorporación a partir de la β-oxidación.
8.
•
RECOMENDACIONES
Se recomienda realizar una caracterización del PHA producido a partir de
aceites vegetales que representen extremos diferentes, bien como puntos
centrales, en su composición de ácidos grasos, para visualizar la formación
de PHA con constitución monomérica diferente y más evidente.
•
Se recomienda realizar un análisis de resonancia magnética junto con la
cromatografía gaseosa, para lograr determinar con mayor exactitud los
picos correspondientes a los monómeros con instauraciones.
•
Se recomienda evaluar el modelo utilizado para la determinación de
monómeros conformacionales provenientes de la biosíntesis de ácidos
grasos, puesto que el usado presentaba valores teóricos mayores de estos
monómeros que los detectados por cromatografía gaseosa.
•
Se recomienda analizar la cantidad de aceite vegetal no consumido
después del tiempo de fermentación, según el método descrito por Kahar et
al. (2004), para evaluar la cantidad de aceite asimilada por el
microorganismo.
9.
REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS
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alternativa
ecológica.
Revista
QuímicaViva,
3,3.
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450-472
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IMPALLOMENI,
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10. ANEXOS
ANEXO 1. MEDIOS DE CULTIVO EMPLEADOS
1. Agar Nutriente
Componente
Extrato de carne
Peptona bacteriológica
Ágar bacteriológico
Concentración (g/L)
3
5
20
2. Medio mineral (Ramsay et. al., 1990)
Componente
(NH4)2SO4
Na2HPO4
KH2PO4
Concentración (g/L)
1
3,5
1,5
MgSO4.7H2O
0,2
CaCl2.2H2O
0,01
Citrato férrico amoniacal
0,06
Solución elementos trazos
1mL/L
3. Solución de elementos trazos
Componente
H3BO3
CoCl2..6H4O
ZnSO4.7H2O
MnCl2.4H2O
Concentración (g/L)
0,3
0,2
0,1
0,03
NaMoO4.2H2O
0,03
NiCl2.6H2O
0,02
CuSO4.5H2O
0,01