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UNIVERSIDAD AUSTRAL DE CHILE
FACULTAD DE CIENCIAS
CARACTERIZACIÓN DEL GEN ALS (ACETOLACTATO
SINTASA) Y MUTACIONES QUE CONFIEREN
RESISTENCIA A HERBICIDAS EN QUÍNOA
(Chenopodium quinoa WILLD).
TESIS DE MAGÍSTER
CAMILO ALEXANDER MESTANZA UQUILLAS
VALDIVIA – CHILE
2012
CARACTERIZACIÓN DEL GEN ALS (ACETOLACTATO
SINTASA)
Y
MUTACIONES
QUE
CONFIEREN
RESISTENCIA A HERBICIDAS EN QUÍNOA (Chenopodium
quinoa WILLD).
Tesis presentada a la Facultad de Ciencias de la Universidad Austral de Chile en
cumplimiento parcial de los requisitos para optar al grado de Magíster en
Ciencias mención Genética.
Por:
CAMILO ALEXANDER MESTANZA UQUILLAS
Valdivia - Chile
2012
UNIVERSIDAD AUSTRAL DE CHILE
FACULTAD DE CIENCIAS
INFORME DE APROBACIÓN TESIS DE MAGÍSTER
La Comisión Evaluadora de Tesis comunica al Director de la Escuela de Graduados de la
Facultad de Ciencias que la tesis de Magíster presentada por el candidato
CAMILO ALEXANDER MESTANZA UQUILLAS
ha sido aprobada en el examen de defensa de Tesis rendido el día martes 10 de abril del
2012, como requisito para optar al grado de Magíster en Ciencias mención Genética y, para
que así conste para todos los efectos firman:
Profesor Patrocinante de Tesis:
Prof. Ricardo Riegel Sch. Ing. Agrón, M. Sc., Dr. Rer. Silv. -----------------------------------Facultad de Ciencias Agrarias
Universidad Austral de Chile
Comisión Evaluadora de Tesis:
Prof. Ricardo Fuentes P. Ing. Agrón., M. Sc.
Facultad de Ciencias Agrarias
Universidad Austral de Chile
-------------------------------------
Prof. Christian Figueroa C. Lic. Cs. Biol., Dr.
Facultad de Ciencias
Universidad Austral de Chile
-------------------------------------
Dedico este trabajo a mi amada esposa Diana Verónica, a mis queridos padres José
Camilo y Ligia Pepina, a mis bellas hermanas Jicel y Tamara. Y de manera muy especial a
dos seres que han guiado mi vida, mis abuelos José Gilberto y Mariana de Jesús†.
Agradecimientos
Quiero expresar mi profundo agradecimiento a todas las personas e instituciones que
hicieron posible mi sueño de estudiar en el extranjero y finalmente culminar con este
trabajo de investigación.
A mi profesor guía y Patrocinante, Dr. Ricardo Riegel S. por su gran amistad, apoyo y
constantes consejos. Quedo muy agradecido de toda su entrega y disposición en beneficio
de la culminación exitosa de este trabajo.
A la Universidad Austral de Chile y Universidad Técnica Estatal de Quevedo, por toda la
ayuda y colaboración brindada.
A la Escuela de Graduados de la Fac. de Ciencias y de la Fac. de Ciencias Agrarias, a Doña
Sandra Cifuentes y Doña. Viviana Riquelme por toda la ayuda y colaboración brindada.
Al Instituto de Ciencias Ambientales y Evolutivas. Al Instituto de Producción y Sanidad
Vegetal. Al Laboratorio Silvoagrícola.
A los profesores informantes, Dr. Christian Figueroa C. y M.Sc. Ricardo Fuentes P, por
toda su disposición a recibir mis visitas y consultas.
A M.Sc. Judith Carrasco P. y Dr. Manuel Muñoz D, por toda su ayuda y colaboración
constante durante mi etapa de desarrollo de estudios y ensayos de laboratorio.
A los laboratorios de Fitoquímica, Fitopatología, Ictiopatología y Producción Animal, por
facilitarme las instalaciones para los experimentos de clonación.
A la Bioquímica Ella Matamala, por su colaboración con los ensayos de clonación.
Al Dr. Herman Silva del Laboratorio de Genómica Funcional & Bioinformática de la
Universidad de Chile, por facilitarnos las secuencias de ARNm de Quínoa.
Finalmente agradezco a la SENESCYT de Ecuador, quien me otorgó la Beca de Magister
con la cual pude realizar mis estudios.
ÍNDICE DE CONTENIDOS
Capítulo
Página
1
INTRODUCCIÓN
1
2
MATERIALES Y MÉTODOS
12
2.1
Material vegetal
12
2.2
Selección y diseño de partidores para la amplificación del gen ALS
13
2.3
Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para la amplificación del
gen ALS y secuenciación directa
15
2.4
Clonación y secuenciación
16
2.5
Análisis de secuencias
17
2.6
Validación de las copias de genes ALS y mutaciones
17
3
RESULTADOS
19
3.1
Amplificación mediante PCR del gen ALS en C. quinoa
19
3.2
Aislamiento e identificación del gen ALS en C. quinoa
21
3.3
Variación de la secuencia del gen ALS en C. quinoa
24
3.4
Identificación de mutaciones en el gen ALS en C. quinoa
27
3.5
Validación de copias y mutaciones
28
4
DISCUSIÓN
32
5
CONCLUSIONES
44
5
BIBLIOGRAFÍA
45
ÍNDICE DE TABLAS
Tabla
1
2
3
Página
Mutaciones que confieren diferentes niveles resistencia a herbicidas
de los grupos Sulfonilureas e Imidazolinonas (inhibidores de la
enzima ALS).
7
Partidores empleados para la amplificación de la secuencia del gen
ALS.
14
Resultados de las combinaciones de partidores empleados para la
amplificación de la secuencia del gen ALS.
20
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura
Página
1
Biosíntesis de cadena de los aminoácidos ramificados: valina, leucina
e isoleucina.
2
2
Plantas de la variedad Regalona-Baer y línea mutante O-10-1.
Respuesta fenotípica 15 días después de la aplicación de herbicida
IMI (Onduty, BASF).
12
3
Esquema del anclaje de los partidores empleados para amplificar el
gen ALS en C. quinoa.
14
4
Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) empleada para la
amplificación del gen ALS en C. quinoa.
21
5
Representación esquemática, ubicación y tamaño de los fragmentos
secuenciados con las combinaciones de partidores empleados en la
amplificación del gen ALS en C. quinoa.
22
Relaciones filogenéticas hipotéticas entre las secuencias ALS en
plantas incluyendo la nueva secuencia de C. quinoa, inferida por
máxima parsimonia.
22
7
Imagen parcial de un cromatograma del fragmento A del gen ALS
amplificado en C. quinoa.
23
8
Secuencia de nucleótidos (parte superior) y aminoácidos (parte
inferior) de los genes CQALS1, CQALS2 y CQALS3 del fragmento B.
25
9
Secuencia parcial de nucleótidos y aminoácidos de A= CQALS1 (A)
y B= CQALS3 (B) de C. quinoa.
26
10
Relación filogenética hipotética entre las copias de la secuencias ALS
y una de las copias mutadas de C. quinoa, inferida por máxima
parsimonia
27
6
11
Secuencia parcial de nucleótidos (parte superior) y aminoácidos
(parte inferior) de la ALS en C. quinoa.
28
12
Representación esquemática, ubicación del sitio de corte y tamaño de
los fragmentos ALS en C. quinoa resultantes de la digestión con las
enzimas SexAI (flecha roja), CseI (flecha verde), Mph1103I (flecha
azul) y BspPI (flecha negra) en la variedad Regalona-Baer (superior)
y línea mutante O-10-1 digerida con BspPI (inferior).
29
Detección de las tres copias del gen ALS en C. quinoa variedad
Regalona- Baer empleando endonucleasas. CQALS1 con BspPI (A),
CQALS2 con CseI (B) y Mph1103I (C). CQALS3 doble digestión con
BspPI y Mph1103I (D).
30
14
Análisis del patrón de restricción de ALSmutada en C. quinoa
restringida con la enzima BspPI.
31
15
Relaciones filogenéticas hipotéticas entre las secuencias ALS en
plantas incluyendo las nueva secuencias de C. quinoa, inferida por
máxima parsimonia.
36
13
ÍNDICE DE ABREVIATURAS
ALS
Acetolactato sintasa
AHAS
Acetohidroxiácido sintasa
PCR
Reacción en cadena de la polimerasa (por sus siglas en ingles)
TD
touchdown
IMI
Imidazolinona
SU
Sulfonilurea
CQALS
Genes ALS de Chenopodium quinoa
ACCase
Acetil-CoA carboxilasa
FOPs
Ariloxifenoxipropanoatos
DIMs
Ciclohexanodionas
EPSPS
5-enolpiruvil-shikimato-3-fosfato-sintetasa
CRH
Cultivos resistentes a herbicidas
CTAB
Cetil trimetil bromuro de amonio
ADN
Ácido desoxirribonucleico
MgCl2
Cloruro de magnesio
dNTP
Deoxinucleótido tri-fosfato
TAE
Tris – ácido acético - EDTA
EDTA
Ácido etilendiaminotetraacético
NCBI
National Center for Biotechnology Information
aa
Aminoácidos
nt
Nucleótidos
Taq
Thermus aquaticus
S
Aminoácido Serina (Ser)
G
Aminoácido Glicina (Gly)
T
Treonina (Thr)
P
Prolina (Pro)
g
Nucléotido de Guanina
a
Nucléotido de Adenina
t
Nucléotido de Timina
c
Nucléotido de Citosina
dds
Días después de la siembra
RESUMEN
La quínoa (Chenopodium quinoa Willd) es un pseudocereal subutilizado de gran
valor alimenticio cuyas cualidades nutritivas han sido reconocidas en el mundo entero. De
acuerdo a su origen genético C. quinoa es un alotetraploide (2n = 4x = 36), formado por
hibridación interespecífica de dos genomios de especies diploides y una posterior
duplicación del número de cromosomas.
La principal limitante para masificar el cultivo es el control de malezas. Los
herbicidas no son suficientemente selectivos para ser usados en C. quinoa, debido a que
esta se encuentra filogenéticamente emparentada con malezas de las subfamilias
Chenopodioideae y Amaranthoideae
Actualmente, existen especies vegetales con resistencia a herbicidas vinculados con
el gen acetolactato sintasa (ALS o AHAS). La enzima derivada de este gen cataliza el primer
paso en la síntesis de la cadena de los aminoácidos ramificados y es agronómicamente
importante ya que es el blanco de varios herbicidas de amplio espectro como las
imidazolinonas. Diferentes mutaciones puntuales del gen ALS en siete residuos conservados
de aminoácidos generan distintos niveles de resistencia.
El objetivo de este trabajo consistió en caracterizar la familia génica que codifica la
enzima ALS en C. quinoa. Además, identificar las mutaciones puntuales asociadas a la
resistencia a herbicidas en genotipos mutados resistentes a imazapic e imazapyr, con el fin
de desarrollar marcadores moleculares ligados a estos genes para asistir en el mejoramiento
genético de C. quinoa.
Para ello se extrajo ADN de la variedad Regalona Baer y de línea mutante artificial
O-10-1. La línea mutante ha sido seleccionada según sus niveles de resistencia a imazapic e
imazapyr (herbicida del grupo de las imidazolinonas). Para la amplificación del gen ALS se
utilizaron partidores descritos para otras especies y también se diseñaron nuevos partidores
analizando regiones conservadas entre especies emparentadas.
Los resultados obtenidos muestran que el genoma de quínoa presenta al menos tres
copias distintas del gen ALS. Las copias del gen ALS, CQALS1 y CQALS2 son genes
expresados. Estas copias no se encuentran interrumpidas por intrones, con un tamaño de
2001 pb las cuales se traducen en 667 aminoácidos incluidos el codón “stop”. La ausencia
de ARNm y cambio del marco de lectura de CQALS3 sugiere que es una copia silenciada.
La línea mutante O-10-1 en comparación con la variedad original mostró tres
polimorfismos que generan cambios aminoacídicos en la proteína, dos de las cuales se
encuentran en los dominios no conservados de la proteína (nt 299 y nt 392). Mientras que la
tercera sustitución en la copia CQALS2 del gen representa la mutación Thr195Ser. Esta
mutación se ubica en el dominio conservado (dominio A) la cual está asociada con la
resistencia a herbicidas del grupo de las imidazolinonas. La variación nucleotídica del gen
ALS en C. quinoa permitió desarrollar un marcador del tipo PCR-RFLP para la detección
de alelos específicos asociados a la resistencia a herbicida.
Este trabajo genera la base para la rápida identificación de nuevas variantes y la
generación de nuevos marcadores moleculares específicos para cada copia y mutación.
Estos genes serán introgresados en nuevas variedades comerciales, permitiendo la
producción de quínoa a gran escala proporcionando un control químico eficiente de
malezas.
Palabras claves: pseudocereal, ALS o AHAS, resistencia a herbicidas, mutación,
PCR-RFLP.
ABSTRACT
Quinoa (Chenopodium quinoa Willd) is an underutilized pseudocereal highly
nutritious whose qualities have been recognized worldwide. According to their genetic
origin C. quinoa is an allotetraploid (2n = 4x = 36), formed by hybridization of two diploid
genomes of species and a subsequent doubling of chromosomes.
The main limitation for widespread cultivation is weed control. Herbicides are not
sufficiently selective for use in C. quinoa, because this is species is phylogenetically close
related with weedy relatives of the subfamilies and Amaranthoideae Chenopodioideae.
Currently, there are plants species with herbicide resistance linked to the
acetolactate synthase (ALS or AHAS) gene. The enzyme derived from this gene catalyzes
the first step in the synthesis of branched chain amino acids and is agronomically important
since it is the target of several broad spectrum herbicides, as the imidazolinones. Different
mutations of the ALS gene in seven conserved amino acid residues generate different levels
of resistance.
The aim of this study was to characterize the gene family encoding the ALS enzyme
in C. quinoa. Also, identify point mutations associated with resistance to herbicide in
mutant genotypes resistant to imazapic and imazapyr, in order to develop molecular
markers linked to those genes to assist in C. quinoa breeding.
To achieve this, DNA was extracted from the variety Regalona Baer and artificial
mutant line O-10-1. The mutant line has been selected according to their levels of
resistance to imazapic and imazapyr. For the ALS gene amplification, primers were used as
described for other species and new primers were designed by analyzing conserved regions
between related species.
The results show that the quinoa genome has at least three different ALS gene
copies. The ALS gene copies, CQALS1 and CQALS2 are expressed genes. These copies are
not interrupted by introns, with a size of 2001 bp which translate into 667 amino acids
including stop codon. The absence of mRNA and change the reading frame of CQALS3
suggests that a copy is silenced.
The mutant line O-10-1 compared with the original variety showed three amino acid
polymorphisms that lead to changes in the protein, two of which are in non-conserved
domains of the protein (nt 299 and nt 392). While the third substitution in the gene copy
CQALS2 represents the mutation Thr195Ser. This mutation is located in the conserved
domain (domain A) which is associated with resistance to herbicides of the imidazolinone
group. The ALS gene nucleotide variation in C. quinoa marker opportunity to develop a
PCR-RFLP type for the detection of specific alleles associated with resistance to herbicide.
This work creates the foundation for the rapid identification of new variants and
generation of new molecular markers specific for each copy and mutation. These genes will
be introgresados in new commercial varieties, allowing the production of quinoa on a large
scale by providing efficient chemical control of weeds.
Keywords: pseudocereal, ALS or AHAS, herbicide resistance, mutation, PCR-RFLP.
1. INTRODUCCIÓN
La caracterización de genes implicados en la resistencia a herbicidas ha sido
ampliamente descrita tanto en plantas cultivadas como en malezas (Powles y Holtum, 1994;
Powles y Shaner, 2001; Powles y Yu, 2010). El justificativo de estudios en este campo
tienen que ver con que las malezas son una limitación importante para la producción de
cultivos y los herbicidas son elementos claves para su control en la mayoría de los sistemas
mundiales de producción de cultivos (Vila-Aiub y col., 2009).
Además la gran mayoría de los herbicidas empleados inhiben enzimas específicas
de la planta (sitio de destino del herbicida) que son esenciales en el metabolismo por lo cual
ha sido muy importante la descripción de los genes que codifican dichas para enzimas
(Powles y Yu, 2010).
Existen varios genes descritos que codifican enzimas que son el sitio de destino de
los herbicidas. Entre ellos tenemos a: i) psbA, un gen plastídico involucrado en la
resistencia a triazina (Foes y col, 1999; Foes y col 1998; Hirschberg y McIntosh, 1983;
Gronwald, 1994; Yaacoby y col., 1986; Lior y col., 2000). ii) Acetil coenzima A
carboxilasa (ACCase), que codifica una enzima clave en la biosíntesis de lípidos,
involucrada
en
la
resistencia
a
herbicidas
ariloxifenoxipropionatos
(FOPs)
y
ciclohexanodonas (DIMs) (Heap y Knight, 1982; Llewellyn y Powles, 2001; Owen y col.,
2007; Broster y Pratley, 2006; Delye y col., 2007; Moss y col., 2007). iii) 5-enolpiruvilshikimato-3-fosfato-sintetasa (EPSPS), enzima del cloroplasto involucrada en la síntesis de
producción de aminoácidos aromáticos, responsable de la resistencia a glifosato (Powles,
2003; Powles, 2008, Lee y Ngim, 2000; Baerson y col., 2002; Ng y col., 2003; Yu y col.,
2007). iv) Acetohidroxiácido sintasa (AHAS) también conocida como acetolactato sintasa
(ALS) que en los últimos años ha concitado un mayor interés (Heap, 2012; Saari y col.,
1994; Tranel y Wright, 2002; Powles y Yu, 2010).
La acetolactato sintasa (ALS o AHAS) es una enzima esencial en plantas, hongos y
bacterias pero no en mamíferos. Cataliza dos reacciones diferentes en la síntesis de la
cadena de los aminoácidos ramificados: valina, leucina e isoleucina. La primera reacción es
la condensación de dos moléculas de piruvato para formar acetolactato (producto
intermedio en la síntesis de la valina y leucina) y la segunda reacción es la condensación de
piruvato y 2-cetobutirato para formar 2-aceto-2-hidroxibutirato (un producto intermedio en
la síntesis de isoleucina) (Figura 1) (Chipman y col., 1998; Singh y col, 1999; Umbarger,
1978; Duggleby y Pang, 2000; McCourt y Duggleby, 2006).
Figura 1 Biosíntesis de cadena de los aminoácidos ramificados: valina, leucina e isoleucina.
Óvalo rojo muestra ubicación de AHAS o ALS en la ruta biosintética.
FUENTE: Duggleby y Pang, (2000).
Se afirma que la enzima ALS en plantas es un conjunto formado por cuatro
subunidades catalíticas y cuatro reguladoras (Lee y Duggleby, 2001, 2002; Duggleby y col.,
2008). Tanto en procariotas y eucariotas, los niveles de los aminoácidos de cadena
ramificada son moduladas por la inhibición por retroalimentación (Miflin, 1971; Miflin y
Cave, 1972; Umbarger, 1969), mientras que en las bacterias, los niveles de ALS están
regulados por la represión de genes (Umbarger, 1969, 1978).
La ALS se encuentra codificada en el núcleo de la célula, pero la localización
subcelular de la proteína en algunas levaduras y hongos está asociada a la mitocondria
(Ryan y Kohlhaw, 1974) mientras que en las plantas superiores se localiza en el cloroplasto
(Jones y col., 1985; Miflin, 1974). Puesto que genes nucleares codifican la ALS, ésta se
debe trasladar a los organelos después de la síntesis gracias al péptido de tránsito.
Numerosos intrones han sido reportados en los genes ALS de algas verdes y hongos
(Sweigard y col., 1997; Funke y col., 1999) y hasta el año 2002 todas las secuencias
publicadas de genes ALS en plantas mostraban genes no interrumpidos, libres de intrones y
compartían una considerable homología (Duggleby y Pang, 2000; Chipman y col., 1998;
Singh, 1999). Sin embargo, Uchino y Watanabe (2002), encontraron intrones en los dos
loci ALS clonados y secuenciados en Lindernia spp, posteriormente Uchino y col., (2007) y
Scarabel y col., (2010) también hallaron intrones en los loci ALS tanto para Schoenoplectus
juncoides y Schoenoplectus mucronatus respectivamente.
En lo referente al número de copias del gen se ha descrito que las levaduras tienen
una sola copia del gen ALS. En cambio, las bacterias tienen múltiples copias (Keeler y col.,
1993). En plantas superiores el número de copias de este gen es variable, principalmente
asociado al nivel de ploidía de las plantas. Así, especies diploides como Arabidopsis
thaliana tiene una sola copia constitutiva (Mazur y col., 1987). Zea mays definido como
alopoliploide críptico, tiene dos isoenzimas ALS muy similares (Fang y col., 1992). Los
alopoliploides como: Nicotiana tabacum tiene dos loci ALS, cuyas copias se expresan
coordinadamente en todos los órganos (Keller, 1993). En tanto, Gossypium hirsutum tiene
seis loci (Grula y col., 1995), Brassica napus, tiene cinco genes ALS, con las diferentes
isoformas, incluyendo al menos un pseudo gen (Wiersma, 1989; Oullet y col., 1992).
Múltiples genes ALS parecen no ser esenciales para el crecimiento normal de las
plantas superiores ya que muchas de ellas poseen uno solo. La presencia de varias copias
ALS en plantas poliploides refleja el origen genético de la especie en consideración (Keeler
y col., 1993; Lee y col., 1988; Rutledge y col., 1991; Grula y col., 1995; Oullet y col.,
1992). El mantenimiento de más de un gen funcional de ALS parece depender de una
expresión variable en diferentes órganos o durante diferentes etapas de desarrollo de la
planta (Oullet y col., 1992).
Se ha descrito que la duplicación génica juega un papel importante en la evolución
de las funciones de las proteínas. Sin embargo, todavía hay mucho debate acerca de los
mecanismos evolutivos que son responsables del destino de los genes duplicados (Storz,
2009).
Adams y Wendel, (2005) manifiestan que los genes duplicados se convierten en: i)
Una isoforma silenciada siempre y cuando no cumplan alguna función esencial. Las copias
generalmente acumulan mutaciones degenerativas debido a una relajación de la selección
purificadora (Storz, 2009); ii) Conservan su función original, con un mayor nivel de
regulación de la expresión; iii) Son subfuncionalizados particionando la función ancestral;
iv) Adquieren una nueva función (neofuncionalización), sobre la cual actúa principalmente
la selección positiva dado que hay una mejora en la adaptación de las funciones de las
proteínas, tanto ancestral y como derivada (Storz, 2009).
El interés de estudio sobre la enzima ALS se debe a que es el blanco de varias clases
de herbicidas, incluyendo: imidazolinonas (Shaner y col., 1984), sulfonilureas (Ray, 1984),
triazolopirimidina (Gerwick y col, 1990), piridinil benzoatos (Takahashi y col., 1991) y
sulfonylamino-carbonyl-triazolinona
(Vencill,
2002).
Ellos
actúan
induciendo
la
precipitación o inhibiendo la acción enzimática de la ALS (Subramanian y col., 1990;
Jander y col., 2003). Así, provocan la acumulación de niveles tóxicos de 2-cetobutirato y la
disminución de la síntesis de proteínas que afecta el crecimiento celular y desemboca en la
muerte de la planta (Shaner, 1984, 1991; Singh y col., 1988). La popularidad de los
herbicidas inhibidores de la ALS radica en su empleo a bajas dosis (Saari y col., 1994), su
baja toxicidad para los mamíferos, amplia selectividad hacia los cultivos, control efectivo y
prolongado de un amplio espectro de malezas (Mazur y Falco, 1989).
La notoriedad lograda por los herbicidas inhibidores de la ALS y por lo tanto del uso
repetido de los mismos, ha favorecido la resistencia en poblaciones de muchas especies.
Actualmente están descritas 201 especies (116 dicotiledóneas y 85 monocotiledóneas) con
resistencia a los inhibidores de la ALS (Heap, 2012).
La evolución de ésta resistencia a herbicidas puede basarse en mecanismos de
desintoxicación (Kemp, 1990; Christopher, 1991, 1992; Saari y col., 1994; Veldhuis, 2000;
Preston, 1996; Hidayat y Preston, 2001; Fischer y col., 2000; Nandula y Messersmith,
2000), pero el mayor componente de la resistencia a inhibidores de la ALS está generado
por modificaciones en el sitio de destino del herbicida. En la mayoría de los casos, los
cultivos resistentes tienen una alteración en la enzima ALS que ya no es sensible a los
herbicidas (resistencia de sitio blanco) (Tranel y Wright, 2002), alteraciones que
curiosamente no afectan la función normal de la enzima (Kogan y Pérez, 2004).
En biotipos resistentes a herbicidas inhibidores de la ALS se han encontrado
cambios puntuales principalmente sustituciones que alteran la secuencia de nucleótidos del
ADN. Estas mutaciones provocan una reducción o inhiben la capacidad de unión de los
herbicidas con la enzima.
Un total de 22 mutaciones en el gen ALS dotan de resistencia en doce residuos
aminoacídicos (Tranel y Wright, 2002). Como se muestra en la tabla 1, éstos generan
distintos niveles de resistencia para distintos grupos de herbicidas (Kogan y Perez, 2004;
Powles y Yu, 2010). Las principales posiciones aminoacídicas que conducen a
sustituciones implicadas en la resistencia a herbicidas son: G121, A122, Ml24, P197, A205,
K256, M350, H351, D375, D376, R377, M570, W574, S653 y G654 (Laplante y col.,
2009; Massa y col., 2011; Boutsalis y col., 1999; Tranel y Wright, 2002; Ashigh y col.,
2009; Warwick y col., 2008; Whaley y col., 2007; Oh y col., 2001; Duggleby y col., 2003;
Le y col., 2003, 2005; Kolkman y col., 2004; Preston y col., 2006; Tranel y Trucco, 2009).
Las mutaciones descritas han sido identificadas dentro de cinco regiones altamente
conservadas del gen ALS que se extienden desde 12 a 57 pb (Devine y Eberlein, 1997).
Estas regiones son: C, A y D dentro del dominio α (residuos 86-280); B en el dominio γ
(residuos 463-639), E en la región C-terminal (residuos 646 – 668) (Guttieri y col, 1992;
Guttieri y col., 1995; McCourt y col., 2006), y un dominio β (residuos 281 – 451),
denominado región intermedia.
En ésta región intermedia han sido descritos menor nivel de mutaciones que
generan resistencia, debido a que es un sitio donde los herbicidas no realizan su unión
(Duggleby y Pang, 2000). Además, Yu y col., (2011) al analizar plantas de Raphanus
raphanistrum homocigotas para la mutación D376, encontraron que dicha mutación estuvo
asociada con una reducción notable del crecimiento por una alteración en la función propia
de la enzima. Esta situación genera una reducción en el fitness de la planta y probablemente
sea eliminada por selección purificadora.
Li, (1997), Pal y col., (2006) y Gillespie, (1991) manifiestan que la diversidad de
mutaciones en las distintas regiones del gen pueden ser determinada por dos factores: la
tasa de mutación y la intensidad de la selección que ocurre en las regiones conservadas y no
conservadas del gen. Ésta situación ha sido descrita por Yang y col., (2009) para el caso de
los genes de la biosíntesis de ácido giberélico en la tribu Oryzeae, cuya tasa de sustitución
entre las distintas regiones ofrece una gran variación.
La significante heterogeneidad de las regiones variables y conservadas de los genes
permite la comparación de las mismas, ya que pueden verse afectadas por procesos
evolutivos independientes. El hallazgo de microsatélites en la región del péptido de tránsito
del gen ALS también ofrece información sobre el mecanismo que puede haber contribuido a
su ampliación y diversificación (Kolkman y col., 2004).
Tabla 1 Mutaciones que confieren diferentes niveles resistencia a herbicidas de los grupos
Sulfonilureas e Imidazolinonas (inhibidores de la enzima ALS).
Dominio
Aminoácido
y posicióna
(C) VFAYPGGNANSMEIHQALTRS
Ala122
(A) AITGQVPRRMIGT
Pro197
(D) AFQETP
Ala205
Asp376
(B) QWED
Trp574
Ser653
(E) IPSGG
Gly-654
a
Sustitución
Thr
Tyr
His
Thr
Arg
Leu
Gln
Ser
Ala
Ile
Met
Lys
Trp
Val
Asp
Glu
Leu
Arg
Asp
Thr
Asn
Ile
Glu
Asp
Nivel de Resistencia
Sulfonilureas
Imidazolinonas
(SU)b
(IMI)b
S
R
MR
R
R
S/MR
R
S/MR
R
S
R
R/MR/S
R
S
R
S
R
S
R
MR
R
?
R
?
R
?
MR/S
R/MR
R
?
R/MR
R
R
R
R
R
MR
R
S/MR
R
S/MR
R
MR
R
?
R
S
R
Numeración basada en la secuencia del gen ALS de A. thaliana.
S: susceptible; R: resistente; MR: moderadamente resistente; ?: no determinado.
Adaptado de: Kogan y Pérez., (2004); Powles y Yu., (2010).
b
Las pruebas y estudios realizados sugieren que la resistencia a herbicidas
inhibidores ALS es monogénica en especies diploides (Tuesca, 2009; Singh y Shaner,
1995). Los alelos resistentes (R) son dominantes sobre los susceptibles (S) (Penner y
Wright, 2007). Sin embargo, el grado de dominancia varía entre las especies de plantas o
alelos (Foes y col., 1999; Hart y col., 1992; Sebastián y col., 1989; Wright y Penner 1998,
Tranel y Wright, 2002), mostrando un efecto aditivo de la combinación de alelos en una
línea resistente (Falconer y Mackay 1996; Rutledge y col, 1991).
Además está bien documentado que la respuesta varía en función del grupo de
herbicida, ingrediente activo y la dosis aplicada (Sala y col., 2008). El efecto de la dosis
génica sobre el nivel de resistencia a herbicidas en poliploides ha generado una
investigación mayor (Liu y Adams, 2007) ya que, estudios de plantas poliploides muestran
que los niveles de expresión génica varían dado que las copias de genes duplicados por
poliploidía pueden tener diferentes tasas y patrones de expresión (Adams, 2007).
El efecto que tienen los distintos niveles de expresión en relación a la resistencia a
herbicidas en los alopoliploides genera una ventaja dentro del proceso del mejoramiento
genético, ya que el número de alelos ALS-mutantes que puede contener una planta se puede
manejar mediante introgresiones, facilitando el mayor o menor empleo de dosis de
herbicidas en cuanto al nivel de toxicidad o resistencia que muestren.
En resumen, especies cultivadas con resistencia a herbicidas agregan valor a la
agricultura y ofrecen un beneficio económico a los productores, los costos de los programas
de control de malezas han disminuido tanto en los sistemas convencionales como en los
cultivos con cultivos resistentes a herbicidas (CRH) en razón de la reducción del precio de
los herbicidas. Además permiten la sustitución de algunos herbicidas actualmente en uso
por otros menos perjudiciales para el ambiente (Olofsdotter y col., 2000).
La quínoa (Chenopodium quinoa Willd) es un pseudocereal de gran valor
alimenticio cuyas cualidades nutritivas están bien documentados y han sido reconocidas en
el mundo entero (Fleming y Galwey, 1999). Está descrita como el alimento más completo
para la nutrición humana basada en sus proteínas de alta calidad con un balance ideal de sus
aminoácidos esenciales.
El alto valor nutricional del grano de quínoa se debe principalmente a que el
embrión ocupa una mayor proporción de la semilla (25-30%) en relación a los cereales
(Koziol, 1992). Así, su contenido de proteína puede alcanzar un 22%. Se puede considerar
como una de las especies “sub-utilizadas” de mayor potencial en el mundo lo que ha
generado un gran interés en los últimos años en los investigadores por mejorar este cultivo
(Ruales y Nair, 1992; Ruales y col., 2002; Mujica y Jacobsen, 2006).
La quínoa tuvo un papel predominante como base de la alimentación en la historia
de culturas prehispánicas antiguas, ésta especie fue cultivada extensamente por las
civilizaciones Incas, Aymaras, Araucanas y Mapuches desde el norte de Colombia hasta el
sur de Chile (Gandarillas, 1979). Posteriormente los españoles desplazaron éste cultivo por
cereales introducidos como trigo y cebada (Aguerrea, 1998).
La quínoa es un miembro de la familia Amarantaceae (antes Chenopodiaceae, actual
subfamilia Chenopodioideae), que contiene especies de plantas económicamente
importantes, tales como la espinaca (Spinacia oleracea L.) y remolacha azucarera (Beta
vulgaris L.). Este pseudocereal cuenta con numerosas especies silvestres emparentadas con
el número de cromosomas de 2n = 18, 36 y 54, indicativo de su diversidad y nivel de
poliploidía (Mujica y Jacobsen, 2006).
De acuerdo a su origen genético C. quinoa es un alotetraploide (2n = 4x = 36),
formado por hibridación interespecífica de dos genomios de especies diploides y una
posterior duplicación del número de cromosomas (Simmonds, 1971; Gandarillas, 1986).
Sin embargo, la mayoría de los marcadores genéticos (tanto morfológicos como
moleculares) muestran herencia disómica. Mientras que algunos rasgos cualitativos
expresan una herencia tetrasómica mínima (Risi y Galwey, 1984; Maughan y col., 2004;
Ward, 2000, 2001; Bonifacio, 1990; Simmonds, 1971; Gandarillas, 1968).
La alotetraploidía de la quínoa ha sido confirmada por Sederberg (1998) y Maughan
y col., (2006) mediante la caracterización por medio de hibridación in situ de loci
ribosomales 5S y 45S en 23 especies del género Chenopodium. Sin embargo, no se ha
logrado confirmar cuáles serían los parentales diploides, llegando a la conclusión que el
grupo de posibles especies ancestros para la C. quínoa incluye a: C. fremontii, C. incanum,
C. neomexicanum y C. watsonii.
Al igual que muchos cultivos secundarios, la quínoa presenta varias peculiaridades
que impiden masificar su siembra, producción y consumo. Entre estos problemas se
encuentran la presencia de factores anti-alimentarios como saponinas y ácido fítico.
Las saponinas son glicoalcaloides que se encuentran en la cubierta del grano de
quínoa constituyendo aproximadamente un 4%. Este problema puede ser eliminado
mediante vigorosos lavados en agua fría o a través de pulidos con abrasivos (Johnson,
1993) y con la selección de genotipos con bajo contenido de saponinas que en la actualidad
existen.
El control de malezas es otro de los factores que es una limitante para masificar el
cultivo de la quínoa. Aguerrea (1998) concluye que los rendimientos de quínoa se ven
seriamente disminuidos cuando compite con malezas, logrando tan solo el 9% de
rendimiento en comparación con un testigo sin malezas. En la actualidad, no existe un
herbicida que actúe de manera adecuada sobre el cultivo de la quínoa, ya que aquellos que
presentan un buen control de malezas causan fitotoxicidad.
Por ejemplo, Aguerrea (1998) al emplear Alacloro como agente controlador de
malezas obtuvo el mayor rendimiento en quínoa, resultado que equivale al 50% de la
producción en relación a un testigo con control manual. Los herbicidas no son
suficientemente selectivos para ser usados en C. quinoa, debido que esta importante especie
cultivada se encuentra filogenéticamente emparentada con malezas de las subfamilias
Chenopodioideae y Amaranthoideae (Coile y Artaud, 1997).
En este trabajo de investigación, se hipotetiza la existencia de una asociación entre
secuencias modificadas de sitios conservados del gen ALS y la insensibilidad de la planta a
los herbicidas del grupo de las imidazolinonas. Se predice que el mecanismo de resistencia
en mutantes artificiales de C. quinoa se basa en la existencia de al menos una mutación en
los sitios blanco de unión del herbicida de alguna de las copias alélicas del gen ALS.
Teniendo en consideración el potencial nutritivo y económico de C. quinoa, su
condición alotetraploide y la necesidad de contar con un eficiente control de malezas, el
objetivo de este trabajo fue caracterizar la familia génica que codifica la enzima ALS en
plantas susceptibles y resistentes a herbicidas pertenecientes al grupo de las imidazolinonas
(imazapic e imazapyr). Además, identificar las mutaciones puntuales asociadas a la
resistencia a herbicidas en genotipos mutados, con el fin de desarrollar marcadores
moleculares ligados a estos genes para asistir en el mejoramiento genético de C. quinoa.
2. MATERIALES Y MÉTODOS
2.1. MATERIAL VEGETAL
Se emplearon plantas de quínoa de la variedad Regalona-Baer y una línea mutante
(0-10-1) procedentes de un trabajo realizado por Tropa (2010) quien indujo mutaciones con
EMS en semillas de quínoa de la variedad Regalona Baer. Ésta línea mostró mayores
niveles de resistencia a Onduty (Figura 2) un herbicida post-emergente del grupo de las
imidazolinonas (i.a. 525 g kg-1 imazapic + 175 g kg-1 imazapyr) con una dosis equivalente
de 114 g ha-1. Las plantas mostraron una respuesta fenotípica variada desde: Sin o poco
síntoma (40%), planta con curvatura (20%), planta con curvatura y clorosis (20%), planta
con curvatura, clorosis y marchita (10%) y planta muerta (10%).
Figura 2 Plantas de la variedad Regalona-Baer y línea
mutante O-10-1. Respuesta fenotípica 15 días después
de la aplicación de herbicida IMI (Onduty, BASF).
El crecimiento de las plantas se realizó en forma aislada. Las semillas fueron
sembradas el mes de julio del 2011 en macetas de 300 ml con una mezcla de suelo/arena y
cultivadas en el invernadero de la Universidad Austral de Chile. Las condiciones de
temperatura de crecimiento fueron 20/12 °C día/noche (± 4 C), con un régimen de luz
14/10 h de día/noche y 900 µmol m-2 s-1 de intensidad de la luz.
Los tejidos foliares fueron cosechados a partir de plantas individuales cuando estas
presentaban cuatro hojas verdaderas (aprox. 15 después de la siembra). A partir de ellas se
realizo la extracción de ADN mediante un protocolo basado en el reactivo CTAB
modificado por Arismendi y col., (2010). El ADN aislado se cuantificó midiendo la
absorbancia a 260 nm, y se diluyó con agua destilada a una concentración aproximada de
20 ng µl-1, almacenándose a -20 °C para futuros análisis.
2.2. SELECCIÓN Y DISEÑO DE PARTIDORES PARA LA AMPLIFICACIÓN DEL
GEN ALS
Varios partidores fueron seleccionados y diseñados para amplificar el gen ALS
(Tabla 2, Figura 3). En primer lugar, la selección se realizó utilizando información de
publicaciones existentes de especies filogenéticamente relacionadas como Amaranthus spp,
Bassia spp y Salsola spp.
Para el diseño de nuevos partidores se realizó una alineación de las secuencias ALS
de Amaranthus hypochondriacus (Número de accesión GenBank: EU024568.1),
Amaranthus
tuberculatus
(EF157821.1),
Amaranthus
retroflexus
(AF363369.1),
Amaranthus powellii (AF363370.1), Bassia scoparia (EU517499.1) y Salsola tragus
(GU271215.1) en el programa ClustalW, posteriormente se identificó las regiones
conservadas de la secuencia y finalmente con la ayuda del programa en línea Primer3
(Rozen y Skaletsky, 2000) se efectuó el diseño.
Tabla 2 Partidores empleados para la amplificación de la secuencia del gen ALS.
PARTIDOR
SECUENCIA DE NUCLEÓTIDOS (5´-3´)
GÉNERO
FUENTE
F10
CCTAAACCTAAACCTCCTTC
Amaranthus
Corbett y Tardif (2008).
F1
TTTTGTTTCCCGATTTAGCCC
Amaranthus
Corbett y Tardif (2008).
F3
ATTCCTCCGCAATACGCCATT
Amaranthus
Corbett y Tardif (2008).
R4
AATCAAAACAGGTCCAGGTC
Amaranthus
Corbett y Tardif (2008).
R1
CCTACAAAAAGCTTCTCCTCTATAAG
Amaranthus
Corbett y Tardif (2008).
R10
TTATTCAACCCCTGTAATGC
Amaranthus
Warwick y col., (2010).
RUTH-F-1C
CKGGCCGTGTKGGTGTTTG
Salsola
Warwick y col., (2010).
RUTH-R-3B
AACTTGTTCTTCCATCACCTTCG
Salsola
Warwick y col., (2010).
E-FR
GAAATCTTTCAACAATATAGGAAGATC
Bassia
Foes y col., (1999).
B1-F
ATGGCGTCTACTTGTGCAAATCC
Bassia
Foes y col., (1999).
CHALSF1
GCGTCTACTTGTKCAAAYC
Chenopodium
Diseñados en este estudio.
CHALSF4
GACCTGGACCTGTTTTGATT
Chenopodium
Diseñados en este estudio.
CHALS R1
CAAAGTAACAAGCAACATRAMAAC
Chenopodium
Diseñados en este estudio.
Figura 3 Esquema ilustrativo del anclaje de los partidores empleados para amplificar el gen
ALS en C. quinoa. Detalle de la secuencia de los partidores en la Tabla 2.
2.3. REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR) PARA LA
AMPLIFICACIÓN DEL GEN ALS Y SECUENCIACIÓN DIRECTA
Se emplearon múltiples combinaciones de partidores para amplificar y secuenciar el
gen ALS (Tabla 3). Las reacciones de amplificación contenían 2 µl de ADN total (20 ng µl1
), 2 µl de cada partidor (10 ρM), 4 µl de MgCl2 (25 mM), 2 µl de cada dNTP (2.5 mM), 2
unidades de ADN polimerasa Taq Platinum y 5 µl de Buffer 10X suministrado con la
enzima, en un volumen final de 50 ml.
El protocolo de amplificación consistió de una incubación de 3 min a 94 °C, 34
ciclos de 35 seg a 94 °C, 45 seg a X °C, y 1.45 min a 72 °C, y una extensión final de 7 min
a 72 C, donde X es la temperatura de hibridación para cada par de partidores utilizados
(Tabla 3). Los productos de amplificación se analizaron por electroforesis en geles de
agarosa al 1,2% en tampón TAE 1X con bromuro de etidio durante 30 minutos a 100
voltios. Las bandas de ADN fueron visualizadas bajo luz ultravioleta, comparadas con un
marcador de peso molecular conocido y finalmente fotografiadas (Araujo, 1999).
Los fragmentos amplificados y de interés fueron purificados y enviados a Macrogen
Inc., Corea para su secuenciación. Las secuencias fueron analizadas y editadas usando los
programas computaciones Chromas y Bioedit. La confirmación de la identidad de las
secuencias obtenidas y consensuadas se realizó a través del algoritmo nucleotideBlast y
BlastX del portal NCBI. El péptido de tránsito de la ALS se identificó utilizando el software
en línea ChloroP (Emanuelsson y col., 1999, 2000).
Debido que la variedad Regalona-Baer fue obtenida mediante múltiples procesos de
autofecundación y selección, no era esperable encontrar heterocigosidad para la posición de
un solo nucleótido en la secuencia del cromatograma, por lo cual se asumió que la
presencia de polimorfismos de nucleótidos basadas en la aparición de dos picos se trataba
de la presencia de copias distintas y polimorfismos entre ellos, razón por la cual se procedió
a la clonación de las amplificaciones.
2.4. CLONACIÓN Y SECUENCIACIÓN
Los productos de amplificación F1 – R4 (500 pb aprox.), que contiene los dominios
C, A y D; y F4 – RUTH-R-3B (1250 pb aprox.), que contiene los dominios B y E, se
procedieron a clonar en un vector utilizando el kit pGEMT Easy Vector (Promega). Células
competentes de Escherichia coli fueron transformadas con los plasmidios que contenían el
inserto de interés de acuerdo a las especificaciones del kit.
Al menos diez colonias positivas de cada transformación fueron seleccionadas (para
construir la secuencia de consenso ALS) y amplificadas directamente con partidores sp6 y
T7 y posteriormente enviadas a secuenciación por ambos extremos a Macrogen Inc., Corea.
Las secuencias fueron analizadas y editadas usando los programas computaciones
Chromas y Bioedit, confirmando la identidad de las secuencias obtenidas a través del
algoritmo nucleotideBlast y BlastX del portal NCBI.
2.5. ANÁLISIS DE SECUENCIAS
La herramienta de traducción en línea ExPASy se utilizó para determinar las
secuencias de aminoácidos (aa), y a través del programa en línea ClustalW se realizó la
comparación de cambios nucleotídicos y aminoacídicos en las secuencias de ADN y
proteína respectivamente.
Las secuencias de Regalona Baer se analizaron en primer lugar para corroborar las
variantes isoenzimáticas ALS y posteriormente se compararon con las secuencias de la línea
mutante para determinar si un cambio de nucleótido había ocurrido en los sitios descritos
por Kogan y Perez (2004) y Tranel y Trucco (2009), o a su vez si ocurrieron nuevos
cambios.
En base a las nuevas secuencias de C. quinoa y aquellas descritas para otras plantas
se construyeron árboles filogenéticos para inferir las relaciones hipotéticas. Se utilizó el
método de Máxima Parsimonia usando el programa MEGA. El árbol fue obtenido usando
el algoritmo Close-Neighbor-Interchange (CNI). Todas las posiciones que contenían gaps y
datos faltantes fueron excluidas del análisis. Para testear la robustez de la hipótesis de
relaciones filogenéticas se aplicó un análisis de Bootstrap con mil réplicas.
2.6. VALIDACIÓN DE LAS COPIAS DE GENES ALS Y MUTACIONES
Como en la gran mayoría de los casos las variantes de ALS y la resistencia a
inhibidores de ALS se deben a varios polimorfismos en una misma posición nucleotídica
(SNPs, por sus siglas en ingles) en el gen ALS, y para lo cual muchas técnicas que
identifican dichas sustituciones de nucleótidos se han desarrollado (Guttieriy col., 1992;
Tan y Medd, 2002).
Para ratificar la presencia de las copias en la variedad Regalona-Baer y validar la
existencia de mutaciones puntuales que confieren resistencia a herbicidas en la línea
mutante (0-10-1). En este trabajo fragmentos amplificados por PCR fueron digeridos con
enzimas de restricción [SexAI (CsiI) (5'A↓CCWGGT3'), CseI (HgaI) (5'GACGC (N5)↓3'),
Mph1103I (NsiI) (5'ATGCA↓T3'), BspPI (AlwI) (5'GGATC(N)4↓3')] con las condiciones
apropiadas suministradas por el fabricante (Fermentas).
El patrón de restricción para cada enzima/alelo (in silico) fue predicho utilizando
NEBCutter (New England Biolabs, Inc., MA). Los productos de restricción se analizaron
por electroforesis en geles de agarosa al 2% en tampón TAE 1X con bromuro de etidio
durante 60 minutos a 25 voltios. Las bandas fueron visualizadas bajo luz ultravioleta,
comparadas con un marcador de peso molecular conocido y finalmente fotografiadas.
3. RESULTADOS
3.1. AMPLIFICACION MEDIANTE PCR DEL GEN ALS EN C. quinoa
Aunque muchos partidores se seleccionaron y diseñaron para amplificar el
fragmento completo del gen ALS, varios fragmentos obtenidos presentaron una mala
calidad debido principalmente a la inespecificidad de los partidores. Además hubo
combinaciones que no amplificaron (Tabla 3, Figura 4).
Este problema puede deberse al uso de partidores derivados de estudios con otras
especies. Que, al ser similares a la secuencia blanco pueden no amplificar o producir
amplificaciones no específicas.
El uso de partidores degenerados redujo ampliamente la especificidad de la
amplificación por PCR. Aunque, se describen como muy convenientes si se desean
amplificar el mismo gen en distintas especies (Linhart y Shamir, 2004; Ausubel y col.,
1996). Además éste problema tampoco pudo resolverse al usar PCR touchdown (TD) (Don
y col., 1991) (Tabla 3, TD). La figura 4 muestra las bandas de PCR obtenidas a partir de
reacciones optimizadas y no optimizadas.
Las mejores amplificaciones se obtuvieron en los fragmentos B y D. Varias
reacciones que inicialmente mostraron más de una banda amplificada o bandas putativas
ALS amplificadas débilmente, no correspondieron a las secuencia de la ALS debido a una
unión no específica de los partidores.
Tabla 3 Resultados de las combinaciones de partidores empleados para la amplificación de
la secuencia del gen ALS. Detalle de los partidores en la Tabla 2 y anclaje de los mismos en
la Figura 3.
Combinación
Tm (°C) empleada
Amplificación
F10 – R4
50 - 55 - 60 - TD
Inespecífico
F10 – R10
50 - 55 - 60
Negativo
F1 – R4 (Fragmento B)
50 - 55 - 60
Positivo a 58 °C
F1 – R10
50 - 55 - 60
Negativo
F3 – R1
50 - 55 - 60
Negativo
F10 – R1
45 - 48 - 50
Negativo
F1 – R1
45 - 48 - 50
Negativo
45 - 48 - 50 - TD
Inespecífico
CHALSF1 – R4 (Fragmento A)
50 - 55 - 60
Positivo con inespecificidad a 57 °C
F3 – CHALSR1
50 - 55 - 60
Inespecífico
CHALSF1 – CHALSR1
50 - 55 - 60
Negativo
CHALSF4 – R1
50 - 55 - 60
Inespecífico
50 - 55 - 60 - TD
Inespecífico
57 - 61 - 65
Inespecífico
57 - 61 - 65 - TD
Inespecífico
B1-F – E-FR
57 - 61 - 65
Negativo
CHALSF1 – RUTH-R-3B
53 - 57 - 61
Negativo
CHALSF1 – E-FR
53 - 57 - 61
Negativo
F1 – RUTH-R-3B (Fragmento E)
55 - 58 - 61
Positivo a 58 °C
F1 – E-FR
55 - 58 - 61
Negativo
CHALSF4 – RUTH-R-3B (Fragmento D)
55 - 57 - 60
Positivo a 57 °C
CHALSF4 – E-FR
55 - 57 - 60
Negativo
RUTH-F-1C – CHALSR1
57 - 61 - 65
Negativo
RUTH-F-1C – RUTH-R-3B (Fragmento C)
57 - 61 - 65
Positivo a 60 °C
RUTH-F-1C – E-FR
57 - 61 - 65
Negativo
F1 – CHALSR1
CHALSF4 – CHALSR1
B1-F – CHALSR1
B1-F – R4
(TD = PCR touchdown).
En algunos casos la inespecificidad fue solucionada con el empleo de Taq
Polimerasa Hot Start (Figura 4, fragmentos A y D). Un paso de optimización es necesario
para asegurar una amplificación de la banda ALS, y así reducir al mínimo los errores
evitando la aparición de bandas no específicas o ADN falsos.
Figura 4 Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) empleada para la amplificación del
gen ALS en C. quinoa. Flechas señalan tamaño esperado. Detalle de los partidores en la
Tabla 2 y de los fragmentos en la Figura 5.
Con los resultados obtenidos se seleccionaron cinco combinaciones de partidores:
A, B, C, D y E (Tabla 3, Figura 5) para la secuenciación directa ya que con ellos se logró
amplificar la región que abarca el péptido de tránsito y los dominios ALS C, A, D, B y E, en
donde se encuentran descritas las mutaciones que confieren resistencia.
3.2. AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN DEL GEN ALS EN C. quinoa
Los fragmentos de PCR seleccionados para la secuenciación directa abarcaron un
total de 1992 pb (Figura 5). Las secuencias editadas y analizadas mostraron un 87% de
identidad con Bassia scoparia (GenBank: EU517498.1) y un 86% con Salsola tragus
(GU271186.1), todos miembros de la subfamilia Chenopodiaceae y un 84% con
Amaranthus powellii (AF363370.1), Amaranthus retroflexus (AF363369.1) y Amaranthus
tuberculatus (EF157819.1), miembros de la subfamilia Amaranthoideae.
Figura 5 Representación esquemática, ubicación y tamaño de los fragmentos secuenciados
con las combinaciones de partidores empleados en la amplificación del gen ALS en C.
quinoa. Áreas encuadradas indican dominios conservados. Detalle de los partidores en la
Tabla 2 y de los fragmentos en la Tabla 3.
Las relaciones filogenéticas inferidas entre varias secuencias de gen ALS existentes
en las bases de datos agruparon a la secuencia ALS de C. quinoa dentro de la familia
Amaranthaceae y más específicamente dentro de la subfamilia Chenopodiaceae (Figura 6).
Figura 6 Relaciones filogenéticas hipotéticas entre las secuencias ALS en plantas
incluyendo la nueva secuencia de C. quinoa, inferida por máxima parsimonia. El óvalo
muestra los miembros de la subfamilia Chenopodiaceae. Los números en los nodos
representan valores bootstrap (1.000 réplicas).
Con los datos obtenidos mediante la secuenciación directa el tamaño de la secuencia
fue de 1992 pb sin haber logrado amplificar la región del codón inicial y del codón “stop”.
La secuencia conseguida fue corroborada con la base de datos del Laboratorio de
Genómica Funcional y Bioinformática de la Universidad de Chile quienes últimamente han
secuenciado el transcriptoma de C. quinoa. Dicha secuencia posee un tamaño de 2001 pb
en comparación con los 1992 pb de nuestro trabajo, las diferencias se encuentran en las tres
bases iniciales (A – T – G) y en las cinco finales (A – T – T – R – A) que incluyen al codón
“stop”.
Por lo tanto, el tamaño total de la secuencia codificante del gen ALS en C. quinoa
corresponde a 2001 pb similar a Bassia scoparia (GenBank: EU517498.1) y difiere de
Amaranthus powellii (AF363370.1), Amaranthus retroflexus (AF363369.1) y Amaranthus
tuberculatus (EF157819.1) quienes poseen 2010 pb.
Además, el análisis de la secuencia completa del gen ALS en C. quinoa mostró que
es un gen no interrumpido por intrones con un total de 667 aa incluyendo el codón “stop”.
La región estimada del péptido de tránsito tiene un tamaño de 50 aa.
El análisis de los cromatogramas obtenidos en este trabajo reveló la presencia de
dobles picos en una misma posición del cromatograma (Figura 7), señalando la presencia
de polimorfismos y sugiriendo la presencia de más de una copia del gen ALS, reflejando la
estructura poliploide de esta especie
Figura 7 Imagen parcial de un cromatograma del fragmento A del gen ALS amplificado en
C. quinoa. Las flechas señalan dobles picos.
3.3. VARIACIÓN DE LA SECUENCIA DEL GEN ALS EN C. quinoa
Los diez fragmentos B de la variedad Regalona – Baer que fueron seleccionados
para la secuenciación posterior a la clonación mostraron la presencia de seis copias
distintas.
Luego considerando el criterio parsimonioso de que una misma diferencia debía
estar al menos en dos copias con el fin de evitar seleccionar cambios generados por errores
de la Taq durante la PCR (Kobayashi y col., 1999) se obtuvieron tres copias distintas
denominadas en este trabajo como CQALS1, CQALS2 y CQALS3.
El análisis entre CQALS1 y CQALS2 reveló la presencia de 20 nucleótidos (nt)
polimórficos de los cuales 19 resultan en cambios sinónimos (estas mutaciones no dieron
lugar a cambios de aminoácidos en el gen) debido a la redundancia del código genético, y
solo existió una sustitución no sinónima (nt 143, g - a) que genera un cambio aminoacídico
en la proteína (S – G) (Figura 8).
CQALS1 y CQALS3 mostraron 13 sitios polimórficos todos resultantes en cambios
sinónimos. CQALS2 y CQALS3 expresaron 7 polimorfismos del cual solo 1 (nt 143) resulta
no sinónimo para la misma posición y con similar cambio como el encontrado entre
CQALS1 y CQALS2 (Figura 8).
Figura 8 Secuencia de nucleótidos (parte superior) y aminoácidos (parte inferior) de los
genes CQALS1, CQALS2 y CQALS3 del fragmento B. Los sitios polimórficos están
coloreados y las fechas señalan la ubicación del único cambio no sinónimo encontrado.
Los diez fragmentos D de la variedad Regalona – Baer expusieron la presencia de
seis copias distintas y empleando el mismo criterio de B se obtuvieron finalmente dos
copias CQALSA y CQALSB. Estas secuencias presentaron 4 polimorfismos incluyendo una
deleción en la posición 940, generando un cambio en el marco de lectura dado que cinco
codones más adelante se forma un codón “stop” (Figura 9).
Figura 9 Secuencia parcial de nucleótidos y aminoácidos de A= CQALS1 (A) y B=
CQALS3 (B) de C. quinoa. La deleción, cambio de aminoácido (N – I) y condón “stop”
están coloreados amarillo y rojo respectivamente.
El análisis de la secuencia CQALS3 obtenida del fragmento B muestra que hasta el
nucleótido 151 se obtiene un 100% de homología con CQALS1, y que desde 152 hasta 358
muestra 100% con CQALS2, y de ahí en adelante hasta culminar con las secuencia del
fragmento D mantiene una alta homología con CQALS1 (Figura 8 y 9).
Por lo tanto con estos resultados se puede establecer que las copias amplificadas
como fragmento D corresponden a CQALS1 (A) y CQALS3 (B).
3.4. IDENTIFICACIÓN DE MUTACIONES EN EL GEN ALS EN C. quinoa
La secuencia de nucleótidos ALS del fragmento B y D en la línea mutante O – 10 –
1 que incluyen las regiones de los dominios C, A, D, B y E fueron analizados para
identificar posibles mutaciones puntuales asociadas con la resistencia.
CQALS3 no pudo ser comparado con alguna de las secuencias obtenidas de las
líneas mutantes ya que solo se obtuvieron secuencias similares a CQALS1 y CQALS2. Uno
de los fragmentos clonados y secuenciados de la línea mutante (B10-15) mostró la mayor
homología con CQALS2 de la variedad Regalona-Baer (Figura 10).
Figura 10 Relación filogenética hipotética entre las copias de la secuencias ALS y una de
las copias mutadas de C. quinoa, inferida por máxima parsimonia. Los números en los
nodos representan valores bootstrap (1.000 réplicas).
La comparación entre CQALS2 y B10-15 mostró solo una sustitución nucleotídica
de t – a en la posición 350 lo que genera un cambio no sinónimo de aminoácido T por S
(Figura 11). Por lo tanto esta sustitución ubicada en el dominio conservado (A) puede ser la
base molecular de la resistencia a los herbicidas IMI en la línea mutante de C. quinoa.
Otro de los fragmentos secuenciados en la línea mutante al ser comparado con
CQALS1 mostró dos polimorfismos en los sitios nt 299 y nt 392, mismos que generan
sustituciones aminoacídicas S-T y S-P respectivamente. Estos cambios no están ubicados
en los dominios descritos que generan resistencia a herbicidas por lo tanto podrían no estar
asociados con la resistencia.
Los fragmentos D en las líneas mutantes no presentaron diferencias nucleotídicas
con respecto a las de la variedad original.
Figura 11 Secuencia parcial de nucleótidos (parte superior) y aminoácidos (parte inferior)
de la ALS en C. quinoa. La sustitución nucleotídica (t-a), cambio de aminoácido (S-T) están
coloreados, dominio A remarcado.
3.5. VALIDACIÓN DE COPIAS Y MUTACIONES
Mediante el empleo de enzimas de restricción se logró establecer la presencia de
cada una de las copias y de la mutación que genera la resistencia a herbicidas. Gracias a la
ayuda del programa NEBCutter se pudo establecer los perfiles esperados de cada una de las
copias con las distintas enzimas de restricción (Figura 12).
De manera general en cada una de las digestiones, la aparición de bandas de otro
tamaño corresponde a que las enzimas reconocían otros sitios en las demás copias, así
como también la banda del tamaño similar al control corresponden a la(s) copia(s) que no
son reconocidas por la enzima y que por lo tanto deben mantener el tamaño original.
Figura 12 Representación esquemática, ubicación del sitio de corte y tamaño de los
fragmentos ALS en C. quinoa resultantes de la digestión con las enzimas SexAI (flecha
roja), CseI (flecha verde), Mph1103I (flecha azul) y BspPI (flecha negra) en la variedad
Regalona-Baer (superior) y línea mutante O-10-1 digerida con BspPI (inferior). Áreas
oscuras encuadradas indican dominios conservados.
La digestión con la enzima SexAI fue usada para corroborar la variante CQALS1.
Esta copia contenía un solo sitio de restricción generando dos fragmentos (250 y 249 pb).
Solo un fragmento fue visible por electroforesis en geles de agarosa debido a la falta de
resolución de la técnica (Figura 13 A) que no permite distinguir la diferencia de 1 base.
Las enzimas CseI y Mph1103I fueron usadas para discriminar la variante CQALS2.
Los fragmentos generados fueron de 357 y 142 (Figura 13 B), 358 y 141 pb (Figura 13 C)
respectivamente para cada una de las enzimas.
Las enzimas BspPI y Mph1103I se usaron para poder visualizar la variante
CQALS3. Luego de realizar la doble digestión se pudo observar correctamente esta
variante, mostrando un perfil de bandeo de 112, 246 y 141 pb (Figura 13 D).
Figura 13 Detección de las tres copias del gen ALS en C. quinoa variedad Regalona- Baer
empleando endonucleasas. CQALS1 con BspPI (A), CQALS2 con CseI (B) y Mph1103I
(C). CQALS3 doble digestión con BspPI y Mph1103I (D). CBR (control) fragmento de
PCR de B sin digerir. M, marcador de peso de 100 y 1000 pb. BR fragmento PCR de B
sometido a digestión.
En el fragmento B de la línea mutante O-10-1 solo se empleó la enzima BspPI dado
que era la única endonucleasa que permitía identificar la mutación existente en B10-15
ALS-mutada que correspondía a la copia CQALS2, un solo sitio de reconocimiento para esta
enzima mostró la presencia de dos bandas, una de 144 y otra de 355 pb después de la
digestión (Figura 14).
Figura 14 Análisis del patrón de restricción de ALSmutada en C. quinoa
restringida con la enzima BspPI. CB10, fragmento B de PCR de la línea
mutada, M, marcador de peso 100 pb, B10 fragmento sometido a
restricción.
4. DISCUSIÓN
En este trabajo, la caracterización de la familia del gen ALS fue investigada en C.
quinoa, una especie alotetraploide muy extendida y con un gran potencial económico y
nutricional. A la fecha se han caracterizado genes ALS en muchas especies vegetales
principalmente en malezas y otras plantas cuya constitución genética es diploide. Por el
contrario, son pocas las especies cultivadas y a su vez poliploides que se han estudiado con
mayor profundidad. Como en toda investigación, fue necesario desarrollar y adatar
metodologías para los estudios genéticos del gen ALS en C. quinoa.
El tamaño total de la secuencia codificante del gen ALS en C. quinoa (2001 pb)
mostró un tamaño similar a Bassia scoparia (Warwick y col., 2008) y difiere de las
especies de Amaranthus (Diebold y col., 2003; McNaughton y col., 2005; Patzoldt y
Tranel, 2007) las cuales poseen 2010 pb. Estas diferencias principalmente están dadas por
polimorfismo de inserciones y deleciones (“indels”) que se ubican en las zonas N-terminal
y C-terminal de la proteína. Dichas regiones están involucradas en el tráfico intracelular
más que en la actividad catalítica de la enzima, y por lo tanto pueden tolerar una mayor
variación ya que no forman parte del sitio activo de la proteína (Duggleby y Pang, 2000).
Consecuentemente las zonas N-terminal y C-terminal de la proteína pueden
acumular mayor número de mutaciones en estas regiones del gen que no son degenerativas
ni benéficas. Estos cambios le confieren una característica propia a cada gen las cuales son
mantenidas y, evolucionan de una manera neutral, se mantienen por selección purificadora,
o están en proceso de ser transformada con nuevas funciones beneficiosas (Lynch y col.,
2001).
Los 667 aa, incluido el codón “stop”, que fueron traducidos en C. quinoa generaron
una región del péptido de tránsito estimado de 50 aa. Esta región posee un tamaño similar
al estimado para una especie cercana Amaranthus tuberculatus (Patzoldt y Tranel, 2007) a
diferencia de lo estimado por Rutledge y col., (1991) quienes han propuesto que en tres
copias ALS de Brassica napus el tamaño del péptido de tránsito se ubica entre los 70, 61 y
67 aa, mientras que, en Arabidopsis thaliana está descrita de 97 aa (Sathasivan y col.,
1990).
El tamaño variable y aun no consensuado del péptido de tránsito muestra que esta
región tiene una naturaleza única lo que permite que sea utilizado como una sonda
específica y única de cada variante ALS (Bruce, 2001). Por ejemplo, ha sido útil para
distinguir cada una de las copias de este gen en Brassica napus de la de otros miembros de
la familia Brassica (Wiersma y col., 1989), siendo incluso usada como marcador SSR para
facilitar la selección asistida por marcadores (MAS, por su siglas en ingles) basada en
haplotipos ALS1 en el cultivo de girasol (Kolkman y col., 2004). A pesar del número
creciente de secuencias de plantas disponibles, el mecanismo común subyacente a la
función de las secuencias de direccionamiento aún no ha sido descifrado (Bruce, 2001).
A diferencia de otras investigaciones y dada la particular naturaleza del péptido de
tránsito. En este estudio, es la primera vez que se describen copias del gen ALS para una
misma especie que muestran un tamaño similar para el péptido de tránsito (50 aa) y la
proteína madura (617 aa). En discordancia con las copias activas en Schoenoplectus
juncoides (Uchino y col., 2007) donde el péptido de tránsito corresponde a 80 y 77 aa, y la
proteína madura 565 y 567 aa entre ALS1 y ALS2 respectivamente.
El gen ALS en C. quinoa es un gen no interrumpido por intrones similar a muchas
monocotiledóneas y dicotiledóneas (Reith y Munholland, 1993; Tranel y Wright, 2002;
Vinod y col., 2010; Intanon y col., 2011; Warwick y col., 2010; Delye y col., 2011;
Laplante y col., 2009) aunque estos segmentos se han descrito que se encuentran con
frecuencia entre las regiones que codifican para las unidades estructurales en las proteínas
(Dugaiczyk y col., 1978; Wozney y col., 1981; Cochet y col., 1979).
Casos excepcionales son Lindernia spp (Uchino y Watanabe, 2002), Schoenoplectus
juncoides (Uchino y col., 2007) y Schoenoplectus mucronatus (Scarabel y col., 2010) que
poseen intrones y que por lo tanto presentan el “splicing”. Cabe señalar que numerosos
intrones han sido reportados en los genes ALS de algas verdes y hongos (Sweigard y col.,
1997; Funke y col., 1999).
Numerosos intrones en la secuencia ALS de algas y algunas especies de plantas
superiores sugieren que estos segmentos no codificantes se insertaron después de la
divergencia de las algas en la línea evolutiva que conduce a las plantas superiores. Por lo
tanto si consideramos la “Teoría Endosimbiótica” (Margulis, 1971) los genes ALS deberían
ser de origen bacterial (Funke y col., 1999).
Además la ausencia de estos segmentos no codificantes refuerza el modelo de
“introns-late” que predice que todos los intrones en los genes fueron insertados en genes
previamente continuos que representan las formas ancestrales y que son similares a los
genes actuales procariotas, es decir no tienen intrones en sus formas procariotas, pero si en
sus homólogos eucariotas (Rogers, 1990; Cavalier-Smith 1991; Palmer y Logsdon, 1991;
Patthy, 1991). Esto ha generado especulaciones sobre el papel de los intrones y el estudio
de su historia mediante el análisis de antiguos genes conservados cuya proteína se conserva
entre procariotas y eucariotas (De Souza y col., 1998).
En lo referente a la presencia de intrones en Lindernia spp, Schoenoplectus
juncoides y Schoenoplectus mucronatus (Uchino y Watanabe, 2002; Uchino y col., 2007;
Scarabel y col., 2010), las secuencias presentan sitios de consenso de empalme de intrones
(GT...AG), lo cual es consistente con la conocida regla GT-AG de intrones (Breathnach y
col., 1978; Mount, 1982) e incluso estas secuencias se encuentran en la misma posición
codificante de las copias del gen ALS.
La acumulación de datos de secuencias genéticas (intrones y exones) de ALS puede
suministrar información útil sobre las relaciones filogenéticas entre las especies de plantas
y las distintas fuerzas evolutivas que actúan sobre ellas.
En lo referente a la constitución genética de las especies, la condición tetraploide de
un genoma dificulta la capacidad de las técnicas moleculares para identificar con precisión
los heterocigotos verdaderos (heterocigotos para alelos diferentes en el mismo lugar) vs
individuos con la heterocigosidad fija (homocigotos para alelos diferentes en lugares
diferentes) (Warwick y col., 2010).
Concordante con la condición poliploide de C. quinoa, la presencia de dobles picos
en una misma posición de los cromatogramas no hacen más que confirmar la naturaleza
tetraploide de su genoma (Maughan y col., 2006; Palomino y col., 2008) y por lo tanto la
presencia de más de una variante del gen ALS, conclusión a la que llegaron otros
investigadores al caracterizar genes ALS en especies poliploides (Warwick y col., 2010;
Tan y Medd, 2002).
Las tres copias distintas descritas en este trabajo CQALS1, CQALS2 y CQALS3,
fueron comparadas con las secuencias de ARNm facilitadas por el Laboratorio de
Genómica Funcional y Bioinformática de la Universidad de Chile (secuencias #2238 y
#2237) logrando resaltar que CQALS1, CQALS2 y CQALS3 poseen un 99, 97 y 95% de
identidad respectivamente con respecto a la secuencia #2238; mientras que un 95, 99 y 98%
con respecto a la secuencia #2237. Estos resultados avalarían el criterio que CQALS1
corresponde a la secuencia #2238 y CQALS2 a #2237 (Figura 15).
La comparación de las secuencias nucleotídicas de las copias halladas muestran que
la mayoría de los polimorfismos encontrados en el fragmento B, solo generaron una
sustitución no sinónima (S – G). Este fenómeno, en donde la mayor parte de los cambios de
nucleótidos en un gen son neutrales ha sido explicado por los genetistas como “La teoría
neutral de la evolución molecular” (Kimura, 1983) o “La evolución no-Darwiniana (King y
Jukes, 1969) debido principalmente a la redundancia del código genético para la tercera
posición del codón.
Figura 15 Relaciones filogenéticas hipotéticas entre las secuencias ALS en plantas
incluyendo las nueva secuencias de C. quinoa, inferida por máxima parsimonia. Los
números en los nodos representan valores bootstrap (1.000 réplicas).
Luego de los análisis descritos anteriormente, se estableció que las únicas copias
amplificadas como fragmento D corresponden a CQALS1 y CQALS3, sin haberse
encontrado este fragmento para la copia CQALS2. La imposibilidad metodológica para
amplificar la región CQALS2 fue aclarado al comparar el partidor empleado RUTH-R-3B
(5´aacttgttcttccatcaccttcg3´) con las secuencias de #2238 (CQALS1) y #2237 (CQALS2).Se
observó un polimorfismo en el extremo 3´ (g – a) el cual generó que esa copia
correspondiente a CQALS2 o #2237 no haya sido amplificada, debido a la inespecificidad
del partidor en el extremo 3´.
Sobre esta limitante, Prado y col., (2004) manifiestan que se debe tener mucha
precaución al emplear partidores degenerados para amplificar secuencias no conocidas ya
que las bandas de ADN amplificadas con él, muchas veces deben ser clonados en
plásmidos para ser secuenciados. Presentando un problema serio de no lograr obtener la
información exacta si hay heterocigotos o polimorfismos en plantas que se utilizan como
fuente de ADN.
La existencia de una tercera variante del gel ALS en C. quinoa no era esperable ya
que las especies diploides de la familia Amaranthaceae presentan solo una copia del gen
ALS (Wright y Penner, 1998; Warwick y col., 2008; Diebold, 2003; McNaughton y col.,
2005; Ferguson, 2001; McNaughton y col., 2005; Sibony y col., 2001; Scarabel, 2007;
Maertens y col., 2004;Trucco y col., 2006; Sibony y Rubin, 2003; Patzoldt y Tranel, 2007).
A diferencia de Salsosa tragus (Warwick y col., 2010) única tetraploide descrita en esta
familia mostró la presencia de dos variantes.
Con los antecedentes descritos anteriormente y considerando que Regalona-Baer es
una variedad comercial, la explicación a la existencia de una tercera variante del gen ALS
puede ser realizada de distintos procederes:
Primero, fundamentando la tetraploidía de C. quinoa y que por lo tanto puede
poseer hasta cuatro variantes alélicas de un mismo gen (Segarra-Moragues y col., 2003)
dado que cada genomio contribuye hasta con dos variantes alélicas (Comai, 2005). En este
caso la tercera copia hallada podría tratarse de una variante alélica de uno de los genes
duplicados y que por lo tanto uno de los genomios podría encontrarse en estado
heterocigoto.
Sin embargo, considerando que las plantas empleadas en este estudio corresponde a
una variedad comercial obtenida durante un proceso de mejoramiento genético y sucesivas
autofecundaciones controladas, es esperable que presenten homocigosis en todos los loci.
Segundo, de acuerdo a los análisis de la secuencia de CQALS3, un segmento es
homólogo a CQALS1 y otro a CQALS2. No es una variante que llegue a expresarse, debido
que la secuencia presenta una deleción en la posición nt 1652, lo que genera un cambio en
el marco de lectura formando un codón “stop” cinco codones más adelante. Se podría
aseverar que CQALS1 y CQALS2 son los genes que provendrían de cada uno de los
parentales diploides. Mientras que, CQALS3 sería un pseudo gen generado por duplicación
génica posterior a la hibridación y poliploidización de C. quinoa.
Esta duplicación génica podría haber ocurrido luego de un apareamiento de
cromosomas homeólogos genéticamente equivalentes (cromosomas que pertenecen a los
genomios distintos que conforman el genoma poliploide). Este proceso es una situación
recurrente en organismos poliploides a los cuales se los ha definido como alopoliploides
crípticos (Fang y col., 1992). Debido que son individuos estructuralmente heterocigóticos
no identificables al no mostrar configuraciones anormales en el apareamiento meiótico,
sobre todo si las especies parentales son muy próximas (Lacadena, 1996) lo que implica
variación genética críptica sensu (Phillips, 1996).
El posterior “crossing-over” ocurrido entre cromosomas homeólogos apunta a lo
manifestado por Creighton y McClintock (1931) que cuando ocurre el cruzamiento
citológico (“crossing-over”), es acompañado por un intercambio genético, lo cual habría
ocurrido en C. quinoa.
Además, cabe manifestar que los genes duplicados tienen distintos destinos (Adams
y Wendel, 2005):
i) Mayoritariamente se convierten en una isoforma silenciada siempre y cuando no
cumplan alguna función esencial, ya que si forman parte de la transcripción o
señales de la traducción estos son mantenidos (Blanc y Wolfe, 2004).
ii) Pueden ser retenidos conservando su función original donde la dosis de producto
génico es evolucionariamente limitada y transcripcionalmente regulada.
iii) Son subfuncionalizados es decir, particionan la función ancestral agregada.
iv) O su vez adquieren una nueva función (neofuncionalización) experimentando la
diversificación en la función o regulación de la proteína (Lynch y Conery, 2000;
Lynch y Force, 2000; Lynch y col., 2001).
La tercera variante del gen ALS hallada en C. quinoa sería una copia silenciada, o a
su vez podría tratarse de una nueva variante que se logra expresar en algún tejido
específico. Debido que en la mayoría de los casos la manifestación de los genes en
eucariotes presenta un patrón de expresión específico en tiempo y espacio durante el
desarrollo de los diferentes organismos. Esto se debería corroborar con estudios de
expresión génica.
La presencia de múltiples copias ALS activas, silenciadas, subfuncionalizadas y
neofuncionalizadas está muy bien documentado en las bases de datos sobre todo para
especies alotetraploides. Así, Bidens subalternans, presenta tres isoformas activas (Lamego
y col., 2009), Schoenoplectus juncoides dos copias activas (Uchino y col., 2007),
Schoenoplectus mucronatus con tres copias, una de ellas inactiva que no posee los intrones
como las otras dos (Scarabel y col., 2010).
Por su parte Monochoria vaginalis presenta cuatro variantes de las cuales ALS4 es
inactiva ya que presenta una inserción en el sitio 929 generando un cambio de lectura y la
aparición de un codón “stop” en las posiciones 1003 – 1005 (Ohsako y Tominaga, 2007),
Helianthus annuus con tres loci activos (Kolkman y col., 2004) los cuales han sido
asignados a grupos de ligamiento distintos: 2 (AHAS3), 6 (AHAS2) y 9 (AHAS1) (Tang y
col., 2002; Yu y col., 2003). Gossypium hirsutum tiene seis genes (Grula y col., 1995) de
los cuales tres provienen de cada parental diploide: ALS1, ALS2 y ALS3 del subgenoma A,
ALS4, ALS5 y ALS6 del subgenoma D.
Finalmente una de las mayores y más variadas familias génicas ALS descritas se
presentan en Brassica napus con cinco copias (Rutledge y col., 1991): ALS1 y ALS5 del
genoma C, ALS2, ALS3 y ALS4 del genoma A. Siendo ALS1 y ALS3 constitutivos ALS4 y
ALS5 inactivos, y ALS2 con nueva función detectado exclusivamente en órganos
reproductivos femeninos (óvulo) y que no se acumula en células somáticas (Ouellet y col.,
1992).
Interesantemente, cabe recalcar que la presencia de varias copias del gen ALS
probablemente no sea necesaria para el crecimiento y desarrollo de las especies, ya que
simplemente puede reflejar el origen genético (Keeler y col., 1993). Funciones de múltiples
genes ALS aún no son bien conocidas (Lamego y col., 2009).
El análisis de los sitios de restricción demostró la presencia de las tres copias,
gracias a los polimorfismos detectados y la diferencia de longitud de fragmentos digeridos.
Esta técnica empleada está basada en la secuencia de ADN, lo que permite explorar los
polimorfismos de nucleótidos único entre las secuencias (Sevin, y col., 1998; Sommer y
col., 1989; Newton y col., 1989; Délye y col., 2002).
Por otro lado, el análisis y elucidación de la base molecular del nivel de resistencia a
los inhibidores de ALS (IMI) en la línea mutante O – 10 – 1 de C. quinoa, muestra que la
mutación Thr195Ser hallada en la copia del gen CQALS2 (fragmento B10-15) se ubica en
uno de los dominios conservados de la proteína (dominio A). Sitio en el cual se han
descrito que el cambio de un aminoácido genera insensibilidad de las plantas a los
herbicidas inhibidores de la ALS (Guttieri y col, 1992; Devine y col., 1997; Tranel y
Wright, 2002) por lo tanto reduce la eficacia del herbicida (Lamego y col., 2009).
Es la primera vez que se describe este tipo de sustitución (T – S) en este dominio ya
que normalmente en todas las publicaciones existentes el residuo más reportado como
variable y generador de resistencia es P197 (equivale a P189 en la secuencia de C. quinoa),
(Park y Mallory-Smith, 2004; Uchino y col., 2007; Tranel y Wright, 2002; Whaley y col.,
2007; Scarabel y col., 2010; Ohsako y Tominaga, 2007; Tranel y col., 2012).
Además, cabe mencionar que en los ensayos de invernadero realizados por Tropa
(2010), al aplicar imazapic e imazapyr ingredientes que conforman un solo producto
comercial (Onduty), las plantas mutantes mostraron variación fenotípica como respuesta a
la aplicación del herbicida. Esta sintomatología de
resistencia/toxicidad varió
continuamente desde poca clorosis hasta curvatura, clorosis y muerte de las plantas.
Variación fenotípica de esta índole también fue observada por Délye y col., (2011) en
plantas de Papaver rhoeas al aplicar imazamox (IMI) y tribenuron-methyl (SU).
La marcada variación fenotípica de las plantas, puede ser explicada porque la línea
mutante 0-10-1 de C. quinoa solo posee una variante ALS mutada pudiendo ser un efecto de
dominancia parcial o semi-dominancia (Currie y col., 1995; Siehl y col., 1996; Wright y
Penner, 1998). Plantas con el mismo genotipo en la ALS no siempre muestran el mismo
fenotipo. Por ejemplo, las plantas que contienen alelo ALS-Ser197 pueden ser resistentes,
moderadamente resistentes o sensibles a florasulam (SU). Plantas que contienen un alelo
ALS -His197 pueden ser resistentes, moderadamente resistentes o sensibles a imazamox
(IMI) (Délye y col., 2011).
Otra explicación de la amplia respuesta a la aplicación de herbicidas, está basada en
el tipo de herbicida empleado como agente selectivo. La respuesta más común en los
biotipos resistentes que poseen alterado el dominio A es la resistencia principalmente a las
sulfonilureas (SU) y triazolopirimidinas (Guttieri y col, 1992) mas no a imidazolinonas
(IMI). Esto fue observado por Guttieri y col., (1995) en Bassia scoparia donde las plantas
mostraron alta resistencia SU y de moderadamente a baja resistencia a IMI, mientras que
plantas de Helianthus annus mostraron una respuesta variable en función del tipo de
herbicida y dosis aplicada (Sala y col., 2008).
Finalmente, con la ayuda de la enzima de restricción BspPI (5'GGATC(N)4↓3') se
demostró la presencia de la mutación Thr195Ser en la copia del gen CQALS2 que generaría
la resistencia a herbicidas IMI. Esta técnica ha sido muy empleada en la mayoría de los
trabajos en los que se han tenido que validar mutaciones puntuales que dotan de resistencia
(McNaughton, 2001; Kolkman y col., 2004; Grula y col., 1995; Uchino y Watanabe, 2002).
La diversidad existente en el gen ALS en quínoa permitió desarrollar marcadores
moleculares PCR-RFLP. Estos permiten la rápida confirmación e identificación de la base
molecular de la resistencia, transformándose en una herramienta muy útil en los programas
de mejoramiento genético asistido por marcadores. Además, conocer la ubicación de las
mutaciones, es un proceso es clave para la correcta gestión de la resistencia (Corbett y
Tardif, 2008).
Una posible desventaja de la técnica es que las mutaciones espontáneas o inducidas
pueden aparecer y cambiar un sitio de reconocimiento para una enzima de restricción o
alterar un sitio de unión del partidor. Esto podría conducir a un falso diagnóstico de las
variantes, resistentes o susceptibles (Corbett y Tardif, 2008). Sin embargo, la probabilidad
de ocurrencia de mutaciones silentes espontáneas en dentro de los dominios conservados de
este gen en estas especies es pequeña (Corbett y Tardif, 2008).
En definitiva los experimentos realizados pueden elucidar completamente la
existencia de al menos dos copias teóricamente funcionales del gen ALS en C. quinoa. El
gen ALS descrito, comparte varias características en común con otros genes ALS
previamente caracterizados en otras especies. Estas similitudes incluyen una región
conservada de codificación, una región encargada del transporte intracelular, la existencia
de secuencias asociadas con la resistencia a los herbicidas y la inexistencia de intrones.
En trabajos futuros se verificará la expresión del gen ALS en los distintos órganos y
también la identificación de las especies progenitoras de las cuales derivan ambas copias en
C. quinoa. Este trabajo genera la base para la rápida identificación de nuevas variantes y la
generación de nuevos marcadores moleculares específicos para cada copia y mutación.
Estos genes serán introgresados en nuevas variedades comerciales, permitiendo la
producción de quínoa a gran escala proporcionando un control químico eficiente de
malezas.
4. CONCLUSIONES
De acuerdo a los resultados obtenidos y en respuesta a los objetivos e hipótesis
planteadas, se desprenden las siguientes conclusiones:
-
El genoma de Chenopodium quinoa presenta al menos tres copias distintas del
gen ALS.
-
Las copias del gen ALS, CQALS1 y CQALS2 son genes expresados. La ausencia
de ARNm y cambio del marco de lectura de CQALS3 sugiere que es una copia
silenciada.
-
El gen ALS en C. quinoa no se encuentra interrumpido por intrones, con un
tamaño de 2001 pb las cuales se traducen en 667 aminoácidos incluidos el codón
“stop”.
-
La línea mutante O-10-1 en comparación con la variedad original mostró tres
polimorfismos que generan sustituciones aminoacídicas, dos de las cuales
encuentran en los dominios no conservados de la proteína (nt 299 y nt 392).
-
La línea mutante 0-10-1 presenta la mutación Thr195Ser en la copia CQALS2 del
gen, misma que se ubica en el dominio conservado de la proteína (dominio A) la
cual está asociada con la resistencia a herbicidas del grupo de las
imidazolinonas.
-
La variación nucleotídica del gen ALS en C. quinoa permitió desarrollar un
marcador del tipo PCR-RFLP para la detección de alelos específicos asociados a
la resistencia a herbicida.
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