validacin y estndarizacin de la tcnica de recuento de clulas somticas

ESTANDARIZACIÓN Y VALIDACIÓN DE LA TÉCNICA DE RECUENTO
DE CÉLULAS SOMÁTICAS DEL EQUIPO DCC DeLaval FRENTE A LA
TÉCNICA DE MICROSCOPÍA DIRECTA EN LA ORGANIZACIÓN LA
ALQUERÍA S.A.
NOHORA MILENA GÓMEZ HURTADO
TRABAJO DE GRADO
Presentado como requisito parcial
Para optar al título de
Microbiólogo Industrial
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA
FACULTAD DE CIENCIAS
CARRERA DE MICROBIOLOGÍA INDUSTRIAL
BOGOTÁ D.C.
AÑO 2008
2
NOTA DE ADVERTENCIA
Artículo 23 de la Resolución N° 13 de Julio de 1946
“La Universidad no se hace responsable por los conceptos emitidos por sus alumnos
en sus trabajos de tesis. Solo velará porque no se publique nada contrario al dogma y
a la moral católica y por que las tesis no contengan ataques personales contra persona
alguna, antes bien se vea en ellas el anhelo de buscar la verdad y la justicia”
3
ESTÁNDARIZACIÓN Y VALIDACIÓN DE LA TÉCNICA DE RECUENTO
DE CÉLULAS SOMÁTICAS DEL EQUIPO DCC DeLaval FRENTE A LA
TÉCNICA DE MICROSCOPÍA DIRECTA EN LA ORGANIZACIÓN LA
ALQUERÍA S.A.
NOHORA MILENA GÓMEZ HURTADO
APROBADO
_____________________________
Olga Cristina Gamba, Microbióloga
Director
________________________
David Gómez, Microbiólogo
Jurado
_________________________
Mayerly Gómez, Bacterióloga
Jurado
4
ESTÁNDARIZACIÓN Y VALIDACIÓN DE LA TÉCNICA DE RECUENTO
DE CÉLULAS SOMÁTICAS DEL EQUIPO DCC DeLaval FRENTE A LA
TÉCNICA DE MICROSCOPÍA DIRECTA EN LA ORGANIZACIÓN LA
ALQUERÍA S.A.
NOHORA MILENA GÓMEZ HURTADO
APROBADO
_________________________
________________________
Ingrid Schuler, PhD
Decano Académico
Janeth Arias, M.Sc - M.Ed
Director de Carreras
5
Gracias a Dios por ser mi luz y mi fuerza cada día. A mis padres por brindarme el
amor más grande y puro, por ser mi apoyo y mis más inmensos motivos. A mis
hermanitas por acompañarme y compartir cada uno de los momentos de mi vida. A
toda mi familia por ser mi soporte, por tantos valores que contribuyeron a mi
formación y me hacen ser lo que soy hoy en día. A todas las personas importantes en
mi vida, GRACIAS.
6
AGRADECIMIENTOS
A la organización Alquería S.A., por la financiación total del proyecto, en especial a
las doctoras Olga Cristina Gamba y Mayerly Gómez, por su valiosa colaboración.
A todas las personas que de una u otra forma con su colaboración y amistad
incondicional participaron en la elaboración de este proyecto.
7
TABLA DE CONTENIDOS
1. Introducción…………………………………………………………………….20
2. Marco teórico……………………………………………………..……….…......22
2.1. Organización Alquería………………………………………………..…………22
2.2. Definición de Células Somáticas.………………………………………...……..24
2.2.1. Función de Células Somáticas………………………………………...………25
2.3. Definición de Mastitis…………………………………………………………...25
2.3.1. Patógenos más comunes………………………………………………...…….29
2.3.2. Detección de mastitis……………………………………………….…………30
2.3.2.1. Examen físico de la ubre…………………………………………..………..30
2.3.2.2. Aspecto de la leche………………………………………………..………...31
2.3.2.3. Cultivo bacteriano……………………………………………….…………..31
2.4. Técnicas para la detección de Células Somáticas…………………...…………..31
2.4.1. Prueba de mastitis de California (CMT)……………………...……………….31
2.4.2. Prueba de Wisconsin …………………..…………………..………………….32
2.4.3. Coulter Counter….……………………………………………………………33
2.4.4. Fossomatic…………………………………………………………………….33
2.4.5. Recuento bajo microscopio.…...……………………………...……………….34
2.4.5.1. Aplicaciones del Método de Microscopio Directo………………………….35
2.4.5.1.1. Aplicaciones a la leche cruda por pasteurizar……………...……………...35
2.4.5.1.2. Aplicación a la leche pasteurizada………………………………………..36
2.4.5.1.3. Aplicaciones a la leche en polvo………………………………………….37
2.4.5.2. Fuentes de error en el método de microscopía directa……………………...37
2.4.5.3. Recuentos de grumos bacterianos…………………………….………….….38
2.4.5.4. Clasificación de las muestras………………………………………………..39
2.5. Equipo DCC DeLaval…………………………………………………………...40
2.6. Parámetros estadísticos………………………………..…………………...……41
2.6.1. Validación……………………………………………………………...……...41
2.6.1.1. Planificación………………………………………………………………...41
8
2.6.1.2. Calificación del diseño…………………………………...………………….42
2.6.1.3. Calificación de la instalación…………………………..……………………42
2.6.1.4. Calificación del funcionamiento.…………………….………………..…….42
2.6.1.5. Calificación de desempeño…..……………………………………...………43
2.6.2. Validación Primaria…………………………………………………….……..43
2.6.3. Validación Secundaria..………………………………………………..……...44
2.6.4. Tipos de Validación…………………………………………………….……..45
2.6.4.1. Validación Prospectiva…………….………………………………….…….45
2.6.4.2. Validación Retrospectiva.……………….……………………………..……45
2.6.4.3. Validación Concurrente….……………………………………………….....46
2.6.4.4. Revalidación………………………………………………………………...46
2.6.5. Parámetros analíticos para la validación de una técnica o método…………....47
2.6.5.1. Precisión………………………………………………………………….....47
2.6.5.1.1. Repetibilidad………………………………………………………………47
2.6.5.1.2. Reproducibilidad…………………………………………………….…….47
2.6.5.1.3. Solidez y Robustez…………………………………………….………….48
2.6.5.2. Selectividad………………………………………………………………….48
2.6.5.3. Especificidad……………………………………………………………...…48
2.6.5.4. Linealidad…………………………………………………………...………49
2.6.5.5. Exactitud……………………………………………………………...……..49
2.6.5.6. Estabilidad…………………………………………………………...……...49
2.6.5.7. Límite de detección…………………………………………………………49
2.6.5.8. Límite de cuantificación…………………………………………………….49
3. Justificación y Formulación del problema……………………..………………50
4. Objetivos……………………………………………….…………………………53
4.1. Objetivo General………………………………………………………………...53
4.2. Objetivos Específicos…………………………………………………………...53
5. Metodología……………………………………...…………………...…………..54
9
5.1. Recuento de células somáticas por microscopía directa (Método de
Referencia)……………………………………………………….……………...…...54
5.1.1. Alistamiento de la muestra……………………………………..……………..54
5.1.2. Ejecución de la prueba………………………………………………………...54
5.1.3. Lectura de las células somáticas………………………………………………55
5.1.4. Interpretación de resultados…………………………………………...………56
5.2. Recuento de células somáticas del DCC DeLaval………………………………57
5.2.1. Alistamiento de la muestra……………………………………………………57
5.2.2. Alistamiento del cassette……………………………………………………...57
5.2.3. Operación del equipo…………………………………………………….……58
5.2.4. Validación de la técnica………………………………………………..……...58
5.3. Análisis estadístico………………………………………………………....…...59
6. Resultados y Discusión…………………...……………………………….………63
6.1. Estandarización de las técnicas………………………………………………….63
6.2. Presentación y descripción de datos…………………………………………….63
6.3. Ensayos para la validación de la técnica………………………………………...63
6.3.1. Ensayo de precisión…………………………………………………………...70
6.3.1.1. Ensayo de repetibilidad……………………………………………………...70
6.3.1.1.1. Ensayo de repetibilidad dentro del método de microscopía directa (análisis
de parámetros estadísticos)………………………………………………...………...70
6.3.1.1.2. Ensayo de repetibilidad dentro del método de microscopía directa (prueba
de hipótesis)……………………………………………………………..…………...76
6.3.1.1.3. Ensayo de repetibilidad dentro del método de equipo DCC DeLaval
(análisis de parámetros estadísticos)…………………………………………............79
6.3.1.1.4. Ensayo de repetibilidad dentro del método de equipo DCC DeLaval (prueba
de hipótesis)……………………………………………………………………..…...84
6.3.1.1.5. Ensayo de repetibilidad entre método de microscopia directa y equipo DCC
DeLaval…………………………………………………………………….………...87
6.3.1.2. Ensayo de reproducibilidad……………………………………..…………..90
10
6.3.1.2.1. Ensayo de reproducibilidad dentro del método de microscopía directa
(análisis de parámetros estadísticos)…………………………………………..……..91
6.3.1.2.2. Ensayo de reproducibilidad dentro del método de microscopía directa
(prueba de hipótesis)…………………………………………………..……………..93
6.3.1.2.3. Ensayo de reproducibilidad dentro del método de Equipo DCC DeLaval
(análisis de parámetros estadísticos)………………………………............................96
6.3.1.2.4. Ensayo de reproducibilidad dentro del método de Equipo DCC DeLaval
(prueba de hipótesis)……………………………………………….………………...99
6.3.2. Ensayo de exactitud……………………………………...…………………..102
7. Conclusiones………………………………………………..…………………...105
8. Recomendación…………………………………………………………………106
9. Referencias bibliográficas……………….……………………………………..107
11
LISTA DE TABLAS
Tabla 1. Resultados de lecturas de células somáticas por microscopio (M) y equipo
(E)……………………………………………………………………………………64
Tabla 2. Promedio de lecturas de células somáticas por microscopio y equipo…….67
Tabla 3. Análisis de desviación estándar, varianza, coeficiente de variación y valores
mínimos y máximos de la prueba de repetibilidad con el ensayo de microscopía
directa………………………………………………………………………………...71
Tabla 4. Análisis de desviación estándar, varianza, coeficiente de variación y valores
mínimos y máximos de la prueba de repetibilidad con el ensayo de microscopía
directa………………………………………………………………………………...71
Tabla 5. Análisis de desviación estándar, varianza, coeficiente de variación y valores
mínimos y máximos de la prueba de repetibilidad con el ensayo de microscopía
directa………………………………………………………………………………...72
Tabla 6. Análisis de desviación estándar, varianza, coeficiente de variación y valores
mínimos y máximos de la prueba de repetibilidad con el ensayo de microscopía
directa………………………………………………………………………………...72
Tabla 7. Análisis de desviación estándar, varianza, coeficiente de variación y valores
mínimos y máximos de la prueba de repetibilidad con el ensayo de microscopía
directa………………………………………………………………………………...73
12
Tabla 8. Análisis de desviación estándar, varianza, coeficiente de variación y valores
mínimos y máximos de la prueba de repetibilidad con el ensayo de microscopía
directa………………………………………………………………………………...73
Tabla 9. Análisis de desviación estándar, varianza, coeficiente de variación y valores
mínimos y máximos de la prueba de repetibilidad con el ensayo de microscopía
directa………………………………………………………………………………...74
Tabla 10. Análisis de desviación estándar, varianza, coeficiente de variación y
valores mínimos y máximos de la prueba de repetibilidad con el ensayo de
microscopía directa…………………………………………………………………..75
Tabla 11. Resultados de pruebas pareadas para las réplicas 1 y 2 del método de
microscopía directa………………………………………...………………………...76
Tabla 12. Resultados de pruebas pareadas para las réplicas 2 y 3 del método de
microscopía directa…………………………………………………………………..76
Tabla 13. Resultados de intervalos de confianza y pruebas T para las réplicas 1 y 2
del método de microscopía directa…………………………………………………..77
Tabla 14. Resultados de intervalos de confianza y pruebas T para las réplicas 2 y 3
del método de microscopía directa…………………………………………………..77
Tabla 15. Análisis de desviación estándar, varianza, coeficiente de variación y
valores mínimos y máximos de la prueba de repetibilidad con el ensayo del Equipo
DCC DeLaval………………………………………………………………………..79
13
Tabla 16. Análisis de desviación estándar, varianza, coeficiente de variación y
valores mínimos y máximos de la prueba de repetibilidad con el ensayo del Equipo
DCC DeLaval………………………………………………………………………..80
Tabla 17. Análisis de desviación estándar, varianza, coeficiente de variación y
valores mínimos y máximos de la prueba de repetibilidad con el ensayo del Equipo
DCC DeLaval………………………………………………………………………..80
Tabla 18. Análisis de desviación estándar, varianza, coeficiente de variación y
valores mínimos y máximos de la prueba de repetibilidad con el ensayo del Equipo
DCC DeLaval………………………………………………………………………..81
Tabla 19. Análisis de desviación estándar, varianza, coeficiente de variación y
valores mínimos y máximos de la prueba de repetibilidad con el ensayo del Equipo
DCC DeLaval………………………………………………………………………..81
Tabla 20. Análisis de desviación estándar, varianza, coeficiente de variación y
valores mínimos y máximos de la prueba de repetibilidad con el ensayo del Equipo
DCC DeLaval………………………………………………………………………..82
Tabla 21. Análisis de desviación estándar, varianza, coeficiente de variación y
valores mínimos y máximos de la prueba de repetibilidad con el ensayo del Equipo
DCC DeLaval………………………………………………………………………..82
Tabla 22. Análisis de desviación estándar, varianza, coeficiente de variación y
valores mínimos y máximos de la prueba de repetibilidad con el ensayo del Equipo
DCC DeLaval………………………………………………………………………..83
Tabla 23. Resultados de pruebas pareadas para las réplicas 1 y 2 del método de
Equipo DCC DeLaval………………………………………………………………..84
14
Tabla 24. Resultados de pruebas pareadas para las réplicas 2 y 3 del método de
Equipo DCC DeLaval………………………………………………………………..85
Tabla 25. Resultados de intervalos de confianza y pruebas T para las réplicas 1 y 2
del método de Equipo DCC DeLaval………………………………………………..85
Tabla 26. Resultados de intervalos de confianza y pruebas T para las réplicas 2 y 3
del método de Equipo DCC DeLaval………………………………………………..85
Tabla 27. Resultados de pruebas pareadas para los métodos de Microscopia Directa y
Equipo DCC DeLaval………………………………………………………………..88
Tabla 28. Resultados de intervalos de confianza y pruebas T para los métodos de
Microscopia Directa y Equipo DCC DeLaval……………………………………….88
Tablas 29. Resultados de reproducibilidad entre analistas en el método de
Microscopía Directa………………………………………………………………….91
Tabla 30. Resultados de reproducibilidad entre analistas en el método de
Microscopía Directa………………………………………………………………….91
Tabla 31. Resultados de reproducibilidad entre analistas en el método de
Microscopía Directa………………………………………………………………….92
Tabla 32. Resultados de pruebas pareadas entre analistas por el método de
microscopía directa…………………………………………………………………..93
Tabla 33. Resultados de intervalos de confianza y pruebas T para los analistas 1 y 2
en el método de microscopía directa………………………………………………....94
15
Tabla 34. Resultados de reproducibilidad entre analistas en el método de Equipo
DCC DeLaval………………………………………………………………………..97
Tabla 35. Resultados de reproducibilidad entre analistas en el método de Equipo
DCC DeLaval………………………………………………………………………..97
Tabla 36. Resultados de reproducibilidad entre analistas en el método de Equipo
DCC DeLaval………………………………………………………………………..98
Tabla 37. Resultados de pruebas pareadas entre analistas por el método de Equipo
DCC DeLaval………………………………………………………………………..99
Tabla 38. Resultados de intervalos de confianza y pruebas T para los analistas 1 y 2
en el método de Equipo DCC DeLaval……………………………………………...99
Tabla 39. Resultados de pruebas pareadas para la medición de exactitud…………103
Tabla 40. Resultados de intervalos de confianza y pruebas T para la medición de
exactitud…………………………………………………………………………….103
16
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Representación gráfica del promedio de lecturas obtenidas de células
somáticas con Microscopio y Equipo DCC DeLaval………………………………..69
Figura 2. Prueba de hipótesis para evaluación de repetibilidad entre réplicas 1 y 2 del
método de microscopia directa………………………………………………………77
Figura 3. Prueba de hipótesis para evaluación de repetibilidad entre réplicas 2 y 3 del
método de microscopia directa………………………………………………………78
Figura 4. Prueba de hipótesis para evaluación de repetibilidad entre réplicas 1 y 2 del
método de Equipo DCC DeLaval……………………………………………………86
Figura 5. Prueba de hipótesis para evaluación de repetibilidad entre réplicas 2 y 3 del
método de Equipo DCC DeLaval……………………………………………………86
Figura 6. Prueba de hipótesis para evaluación de repetibilidad entre Métodos……..88
Figura 7. Análisis de varianzas entre los métodos de Equipo y Microscopio………90
Figura 8. Prueba de hipótesis para evaluación de reproducibilidad entre analistas en
el Método de Microscopia Directa…………………………………………………...94
Figura 9. Análisis de varianzas entre analistas dentro del método de microscopio...96
Figura 10. Prueba de hipótesis para evaluación de reproducibilidad entre analistas en
el Método de Equipo DCC DeLaval………………………………………………..100
Figura 11. Análisis de varianzas entre analistas dentro del método de equipo……102
17
Figura 12. Prueba de hipótesis para evaluación de exactitud……………………104
18
RESUMEN
Las empresas productoras de alimentos tienen el deber de brindar alta calidad a sus
consumidores. Este es el caso de la empresa Alquería S.A., quien se ha destacado
durante muchos años por ofrecer a sus clientes productos de muy buena calidad.
Debido a que los alimentos que esta empresa elabora pueden comprometer la salud de
sus consumidores, es necesario llevar a cabos análisis microbiológicos, pues de esta
manera se puede determinar o no si hay confiabilidad y niveles de calidad propios en
cada producto, para que este pueda salir al comercio.
Esto conlleva a realizar análisis confiables que aseguran la calidad de los resultados
emitidos por el laboratorio de microbiología de la empresa Alquería S.A.
Los programas de control interno de un laboratorio incluyen evaluación continua y/o
monitoreos de los principales materiales y objetos que se utilizan dentro de los
análisis, como equipos, reactivos e instrumentos, además de la validación de
procedimientos técnicos. También se deben incluir manuales de procedimientos y
documentación en general, por tal motivo antes de hacer la validación para este
proyecto, fue necesario estandarizar cada una de las técnicas evaluadas, para sí poder
garantizar un buen desarrollo del procedimiento y que este se realice en forma
correcta cada vez que se ejecute.
Para este proyecto se llevó a cabo la estandarización y validación de la técnica de
recuento de células somáticas del equipo DCC DeLaval frente a la técnica de
microscopía directa en la Organización La Alquería S.A. Por medio de los resultados
obtenidos fue posible validar esta técnica, ya que fueron analizados estadísticamente
y se evidenció un lato grado de concordancia en los coeficientes de variación de los
diferentes ensayos de repetibilidad y reproducibilidad realizados, además de
19
determinar que el método alterno (Equipo DCC DeLaval) es exacto con respecto al
método de referencia (Microscopía Directa).
20
1. INTRODUCCIÓN
Las células somáticas están constituidas por una asociación de leucocitos y células
epiteliales. Los leucocitos se introducen en la leche en respuesta a la inflamación que
puede aparecer debido a una enfermedad o, a veces, a una lesión (Blowey y
Edmondson, 1995). La inflamación es un mecanismo de protección de la glándula
para ayudar a eliminar los microorganismos y sus toxinas y reparar los tejidos
afectados (Ma et al., 2000).
El contenido de células somáticas en la leche nos permite conocer datos claves sobre
la función y el estado de salud de la glándula mamaria lactante y debido a su cercana
relación con la composición de la leche da un criterio muy importante sobre la
calidad de esta (Danków et al. 2003).
Las bacterias ambientales están presentes en el medio ambiente de la vaca, en su piel,
pesebre, charcos de agua, etc. y penetran en la ubre cuando se dan determinadas
condiciones. Una vez que las bacterias atacan las células del interior de la glándula
mamaria la respuesta inmunitaria del organismo es enviar glóbulos blancos de la
sangre para neutralizar a las bacterias invasoras. Estos glóbulos blancos son en
esencia lo que constituye los conteos de células somáticas (CCS). Un alto CCS en la
leche de vacas individuales o en el tanque de enfriado significa que las bacterias han
invadido la glándula de la vaca (García, 2004).
Cada leche contiene células somáticas, las cuales en una glándula sana sólo se
presentan en un número pequeño. En este caso se trata de células de tejido (células
epiteliales) y células inmunes, (neutrófilos polimorfonucleares, granulocitos,
macrófagos, linfocitos). La importancia biológica de las células somáticas es que
participan en la defensa contra infecciones de la ubre. Cuando hay estímulos o
21
enfermedades de la glándula mamaria aumenta en contenido de células somáticas,
con lo cual el número de células inmunes aumenta considerablemente (Danków et al.
2003).
Efectuar conteos celulares somáticos es un procedimiento común, sobre todo en la
industria láctea para medir la calidad de la leche. En el establo se utiliza como
indicador de las infecciones. Cuando el conteo de células somáticas (CCS) resulta
elevado, ya sea de una vaca o del tanque enfriador, indica que hay un problema de
mastitis. El recuento de células somáticas, es el número de células existentes en leche.
Se utiliza como indicador de la infección de la glándula mamaria (Blowey y
Edmondson, 1995).
La mastitis causa pérdidas económicas múltiples, la prevención es la mejor inversión
y no queda dudas que lograr un ambiente higiénico en el interior de la sala de ordeño
y por fuera, donde las vacas caminan, comen y duermen es la forma ideal de
mantener
aceptables
los
recuentos
de
células
somáticas.
Cada rodeo lechero con problemas de mastitis y calidad de leche debería conocer su o
sus causas y así, mayoría tendría solución. Tomar conciencia de esto es importante
porque provoca el desafío de buscar los motivos o las causas. El productor y
Veterinario actuantes deben formar un equipo para encontrar las causas y ofrecer
soluciones de acuerdo al sistema de producción donde interactúan.
Todo esto se hace de gran importancia debido a que la leche es un alimento que
presenta un alto grado de consumo y uno de los propósitos principales de la empresa
Alquería es ofrecer a sus consumidores productos de excelente calidad los cuales se
encuentren en condiciones óptimas para contribuir de esta manera en la nutrición y
salud de la población.
22
2. MARCO TEÓRICO Y REVISIÓN DE LITERATURA
2.1. Organización Alquería S.A.
Alquería es una expresión de origen español que significa “pequeña granja”. Inició
hace 45 años, como un aporte al compromiso con la salud del pueblo colombiano y
ante la responsabilidad de generar un cambio de hábito de consumo hacia la leche
pasteurizada, evitando así las innumerables enfermedades que produce la leche cruda,
sobretodo en la población infantil. Por esto, desde sus inicios, Alquería mantiene el
eslogan: “una botella de leche es una botella de salud”. En 1958, la calidad que
ofrecía el mercado era baja, sin embargo Alquería se distinguía como la marca que
ofrecía altísima calidad en su leche grado A, la especificación de esa época. El
negocio estaba básicamente concebido como el procesamiento, pasteurización y
distribución de leche en botellas de vidrio de 750 cc, a domicilio en hogares de
Bogotá. Para el año siguiente, Alquería sacó sus primeras producciones en envase de
cartón, dándole un vuelco al mercado que seguía con las botellas de vidrio. El cartón
utilizado como envase era de parafina y su recubrimiento se hacía en la planta de
Cajicá. El uso del cartón se constituye en la primera evidencia, del interés permanente
de Alquería por estar a la vanguardia en los envases, con el objetivo de siempre
ofrecerle al consumidor final un valor agregado que se traduzca en envases más
cómodos, más fáciles de manejar, más seguros, más económicos, más ecológicos y
que no ocupen mucho espacio. Posteriormente, Alquería sacó al mercado productos
envasados en bolsa plástica y mejoró el empaque de cartón, no recubierto de parafina
sino de plástico (Organización Alquería, 2008).
Desde 1992, Alquería obtuvo un contrato de sublicencia con Tampico Beverages Inc.,
dueña de la marca de los jugos Tampico en Estados Unidos. En 1995 se inició el
proyecto larga vida que convirtió a Alquería en la planta de ultra pasteurización más
23
moderna y con mayor capacidad del Pacto Andino. El resultado de este proyecto ha
sido un crecimiento considerable en términos de ventas, número de clientes, el
liderazgo en una categoría nueva de mercado y mejores márgenes. En 1998, Alquería
se convirtió en licenciatario directo de Tampico Beverages Inc., para la producción y
distribución del Tampico en Bogotá y la Sabana. En el año 2.001 Alquería recibió la
certificación por parte del sello más importante de calidad en leches del mundo, el
sello Quality Chekd, el cual cada año es renovado gracias a la perseverancia en la
búsqueda de los más altos estándares de calidad en todos sus productos (Organización
Alquería, 2008).
En Octubre de 2003, el INVIMA certificó su línea de “LECHE Y PRODUCTOS
LACTEOS UHT” en el sistema HACCP y en Noviembre de ese mismo año, gracias
al trabajo realizado por cada una de las áreas, se recibe oficialmente la certificación
ISO 9001:2000 por parte del ICONTEC. Alquería, pensado siempre en sus clientes y
consumidores, lleva 45 años destacándose por la calidad e innovación tecnológica de
sus productos y servicios, por lo que hoy es una empresa líder con productos
ganadores como la leche UHT (larga vida) y el jugo Tampico. Las mediciones en el
mercado indican que la marca, la distribución, las características de envase, calidad y
precio son factores por los que clientes y consumidores prefieren con fidelidad los
productos de Alquería (Organización Alquería, 2008).
Alquería juega hoy y desde siempre un papel social muy importante, siendo el
principal empleador de la región, con casi 700 colaboradores a su servicio, más los
empleos indirectos que genera a través de los ganaderos, fleteros, tenderos y
proveedores (Organización Alquería, 2008).
24
2.2. Definición de células somáticas
La leche contiene células que provienen de la descamación del epitelio mamario,
como del sistema inmune de la vaca. En principio se las denomino “Células
Somáticas” por considerarse que provenían del soma o cuerpo, fundamentalmente por
descamación.
Posteriormente se reconoció que los principales tipos celulares en una glándula
mamaria son leucocitos provenientes de la sangre, sin embargo el uso del término
termino “Células Somáticas”, se generalizo para caracterizar a las células presente en
la leche (García, 2004).
Cuando se produce la entrada de bacterias a la glándula mamaria, la multiplicación de
estas da lugar a la formación de sustancias que son reconocidas por los macrófagos
que como repuestas secretan moléculas que atraen a los glóbulos blancos que circulan
en
la
sangre.
Estos
glóbulos
blancos
son
conocidos
como
Neutrófilos
Polimorfonucleares (PMN) (García, 2004).
Los PMN son atraídos a los sitios afectados, por lo que entran rápidamente en la
leche almacenada en los alvéolos e intenta ingerir y eliminar a los organismos
patógenos a la vez que estimulan la reacción inflamatoria. Paralelamente a este
proceso son retenidas células sanguíneas tales
como linfocitos, plaquetas y
eosinófilos, pero la mayoría de las células que aparecen como repuesta a la infección
son PMN (más del 90%) (García, 2004). Cuando la inflamación es muy severa, el
número de PMN es muy alto, observándose grumos de pus (caso clínico) (García,
2004).
Las células somáticas son células corporales. Estas pasan a la leche procedente de la
sangre y del tejido glandular. El contenido de células somáticas en la leche permite
conocer el estado funcional y de salud de la glándula mamaria en periodo lactante;
25
debido a su estrecha relación con la composición de la leche, es un criterio de calidad
muy importante (FEDEGAN, 2008).
De todas las células de la leche de un cuarto infectado, aproximadamente el 99%
serán leucocitos, mientras que el resto serán células secretoras que se originan de los
tejidos de la glándula mamaria. Juntos, esos dos tipos de células constituyen la cuenta
de células somáticas de la leche que comúnmente es expresada en mililitros (Philpot y
Nickerson, 1991).
2.2.1. Función de células somáticas
Las funciones que cumplen las células somáticas son combatir la infección por el
proceso de fagocitosis y la reparación del tejido secretor, que de acuerdo a la
gravedad de las lesiones, es la recuperación de la funcionalidad del mismo (García,
2004). Cada leche contiene células somáticas, las cuales en una glándula sana sólo se
presentan en un número pequeño. En este caso se trata de células de tejido (células
epiteliales) y células inmunes, (neutrófilos polimorfonucleares, granulocitos,
macrófagos, linfocitos). La importancia biológica de las células somáticas es que
participan en la defensa contra infecciones de la ubre. Cuando hay estímulos o
enfermedades de la glándula mamaria aumenta en contenido de células somáticas,
con lo cual el número de células inmunes aumenta considerablemente (Danków et al.
2003).
2.3. Definición de mastitis
La mastitis no es una enfermedad simple, es un complejo de enfermedades que por su
naturaleza misma no tiene soluciones simples. Lo simple de este complejo esta en el
entendimiento de que se da por la interacción de tres elementos:
26
•
Los microorganismos como agentes causales.
•
La vaca como huésped.
•
El ambiente que puede influir, tanto en la vaca como en los microorganismos.
(García, 2004)
Existen más de 100 microorganismos que pueden causar mastitis, que varían en la
ruta de acceso a la vaca y en la naturaleza de la mastitis que causan.
Algunas vacas son más susceptibles que otras para contraer la infección, a diferentes
edades y estados de lactación. Es por esto que las vacas juegan un papel muy activo
en el desarrollo de la mastitis. El ambiente en el que se encuentra el ganado, juega un
papel importante tanto en el número como en el tipo de microorganismos a los que la
vaca es expuesta y en la resistencia que esta pueda tener contra ellos.
Es importante observar que a través de buenas practicas de manejo, el ambiente
puede ser controlado para reducir la exposición de la ubre a los patógenos y para
aumentar la resistencia de esta a las infecciones (García, 2004).
La mastitis es una reacción inflamatoria de los tejidos secretores y/o conductores de
la leche de la glándula mamaria, como respuesta a una infección bacteriana o a una
lesión traumática. El término deriva del griego “mastos”, ubre e “itis”, inflamación
(García 2004).
La mastitis se define como una inflamación de la glándula mamaria en respuesta a
traumas o a una invasión de la ubre por microorganismos (Ma et al. 2000) que,
generalmente, ganan acceso a la glándula mamaria a través del esfínter del pezón.
Como resultado, se observa una inflamación de la glándula mamaria, acompañada de
cambios físicos, químicos y microbiológicos, que ocasionan un incremento en la
concentración de células somáticas y cambios patológicos en el tejido mamario. La
27
mastitis se caracteriza por hinchazón, fiebre, enrojecimiento, dolor e interrupción de
las funciones normales de la ubre (Harmon, 1994; Kehrli y Shuster, 1994). Como
efecto de la inflamación ocurre inhibición de las fases tempranas de la vasodilatación,
edema, migración celular, proliferación de fibroblastos y deposición de colágeno
(Kehrli y Shuster, 1994). El primer cambio patológico que se observa en las vacas
con mastitis es el aumento en la permeabilidad capilar de los tejidos de la glándula
mamaria, lo cual puede afectar la barrera sangre-leche y permitir el paso de proteínas
del suero de la sangre a la leche (Kehrli y Shuster, 1994). El cloruro de sodio y otros
compuestos aumentan en la leche debido al paso de la sangre hacia ésta, causando
que el pH normal de 6.6 aumente hasta 6.9 (Harmon, 1994). Como mecanismo de
compensación osmótica se reduce la síntesis de lactosa a medida que aumenta la
concentración de cloruro de sodio en la leche (Auldist y Hubble, 1998).
Los neutrófilos se mueven rápidamente desde el torrente sanguíneo hacia los cuartos
afectados, en respuesta a la presencia de cuerpos extraños en los tejidos de la ubre y a
la irritación que acompaña la invasión patogénica, causando así aumentos en la
concentración de células somáticas en la leche (Kehrli y Shuster, 1994). El proceso de
proliferación de los microorganismos contribuye a la destrucción del tejido secretor,
reduciéndose así la concentración en la leche de los componentes sintetizados en la
glándula mamaria tales como la caseína y la lactosa (Harmon, 1994). El tejido
afectado es reemplazado por tejido conectivo, lo cual resulta en una pérdida
permanente de la habilidad productiva del animal (Shuster y Harmon, 1992; Shuster
et al., 1993).
El número de células somáticas que entran a la glándula depende del tipo y cantidad
de patógenos que ganan acceso a la ubre (Peters, 2002). Se utiliza el término RCS
preferentemente al recuento de células blancas, debido a que en el RCS se incluyen
tanto las células epiteliales, producto de la descamación normal de los tejidos internos
de la ubre en adición a las células blancas, cuya función principal es controlar es
combatir infecciones (Peters, 2002). Típicamente, entre 15% y 17% de las células
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presentes en los RCS de cuartos no infectados son epiteliales, 30% son macrófagos,
30% son neutrófilos y 25% son linfocitos. En cuartos infectados, se observa un
cambio en la distribución de los tipos de células, ocasionando que los neutrófilos
pueden alcanzar una proporción de hasta un 90% (Sordillo et al., 1989). Debido a que
la población de leucocitos en la ubre aumenta a medida que se agudiza la infección,
los RSC constituyen un buen indicador del grado de mastitis tanto en cuartos
individuales de la ubre como en muestras compuestas de leche de cuartos de vacas
individuales y en muestras del tanque de almacenamiento (Suriyasathaporn et al.,
2000).
El uso de los RCS para evaluar la salud de la ubre ha mostrado ser una herramienta
útil para la detección y control de la mastitis y para la identificación de los principales
patógenos causantes de ésta (Kehrli y Shuster, 1994). Dependiendo de la severidad de
la infección, la mastitis puede clasificarse como clínica, subclínica o crónica (Peters,
2002). La mastitis clínica se caracteriza por síntomas observables, tanto en la leche
como en la ubre. La mastitis clínica puede diagnosticarse al observar secreciones
lácteas con apariencia anormal, por ejemplo con coágulos o sanguinolentos. El animal
afectado por este tipo de mastitis exhibe fiebre, muestra la ubre hinchada y sensible y,
si la condición persiste, podría transformarse en mastitis crónica.
La mastitis subclínica no es detectable a simple vista. La leche y la ubre aparentan
estar en condiciones normales, aunque la composición de la leche es anormal. La
mastitis subclínica es de larga duración, difícil de detectar y predomina más en el hato
que la forma clínica a la cual generalmente antecede (Philpot y Nickerson, 1991).
Uno de los cambios principales que ocurren durante la mastitis subclínica, y que sirve
para su detección, es el aumento en la concentración de leucocitos en la leche (Peters,
2002). La mastitis crónica es una infección persistente que está la mayor parte del
tiempo en forma subclínica pero ocasionalmente se convierte en la forma clínica
activa (Kehrli y Shuster, 1994).
29
2.3.1. Patógenos más comunes
Se han aislado más de 135 especies de microorganismos de infecciones
intramamarias en el ganado lechero (Smith y Hogan, 1998). Aunque existen
numerosas especies de bacterias, hongos, levaduras, micoplasmas y virus, los géneros
Staphylococcus y Streptococcus continúan siendo responsables de más del 90 % de
las infecciones intramamarias (Bradley, 2002). Se estima que entre el 80 y 90 % de
los casos de mastitis son ocasionados por la invasión de microorganismos patógenos
específicos en los pezones y tejidos de la ubre, causando infecciones intramamarias.
El resto de los casos resultan de traumas, con o sin invasión secundaria de
microorganismos (Bramley y Dodd, 1984).
Los organismos causantes de la mastitis se clasifican como “contagiosos” o
“ambientales” basado en el lugar más frecuente de exposición (Ruegg, 2004). Los
patógenos contagiosos más comunes son Staphylococcus aureus, Streptococcus
agalactiae y Mycoplasma bovis, aunque cepas de Staphylococcus uberis también
pueden ser transmitidas por la leche. La fuente principal de infecciones causadas por
patógenos contagiosos son los cuartos infectados de otras vacas y la transmisión
ocurre generalmente en el ordeño (Peeler et al., 2000).
Las gotas de leche remanentes en las unidades de ordeño, toallas o servilletas
compartidas o las manos de los ordeñadores, son las fuentes más comunes de
exposición a los patógenos contagiosos. La mayoría de las cepas de S. aureus y S.
agalactiae son altamente adaptadas al huésped, producen mastitis subclínica y
ocasionalmente causan episodios agudos de mastitis clínica (Hallberg et al., 1994;
Barkema et al., 1998).
Se ha encontrado que S. aureus fue el patógeno más frecuentemente aislado en casos
de mastitis clínica, y se reportó una asociación significativa entre la frecuencia de
30
casos positivos de S. aureus y S. agalactiae y altos RCS en muestras de leche de
tanque (Peeler et al., 2000).
Entre los patógenos ambientales causantes de la mastitis están las bacterias
coliformes como Escherichia coli y Klebsiella spp. y Streptococcus ambientales
como S. uberis y S. dysgalactiae. Los patógenos ambientales se adquieren
principalmente mediante el contacto con el estiércol, agua, suelo y camada
contaminados. Este tipo de mastitis es normalmente de corta duración y menos del 15
% de los animales afectados desarrollan infecciones crónicas o subclínicas (Ruegg,
2004). Sin embargo, las infecciones causadas por Streptococcus ambientales pueden
resultar en infecciones subclínicas con episodios clínicos periódicos.
Las especies de Staphylococcus coagulasa negativa (SCN) históricamente se han
conocido como patógenos de la ubre menores o secundarios. Estos microorganismos
generalmente causan inflamaciones ligeras con moderados incrementos en los RCS,
pero si la vaca alcanza a tener mastitis clínica, los RCS pueden aumentar hasta
millones (Sears y McCarthy, 2003).
La alta frecuencia de estas bacterias en muestras de leche podría deberse al hecho de
que son patógenos oportunistas y forman parte de la flora bacteriana que reside en la
piel del pezón. Cuando se les provee un ambiente favorable para que colonicen la
parte inferior del pezón o el canal del pezón, estos microorganismos se multiplican,
entran a la glándula y producen mastitis (Sears y McCarthy, 2003).
2.3.2. Detección de mastitis
2.3.2.1. Examen físico de la ubre
Los signos de mastitis aguda incluyen cuartos inflamados, con temperatura elevada y
dolor al tacto. Los cambios en el tamaño y la presencia de tejido cicatrizal pueden ser
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detectados más fácilmente luego del ordeño, cuando la ubre se encuentra vacía
(Quintana, 2006).
2.3.2.2. Aspecto de la leche
La observación de los primeros chorros de leche permite la detección de leche
anormal que debe de ser retirada del consumo. La leche anormal puede mostrar
decoloración (aguado), descamaciones, o coágulos. Se debe tener la precaución, al
remover esta leche de la ubre, de no salpicar esta leche contaminada en las patas,
cola o ubre del animal. Además, el operador no debe de colectar estos primeros
chorros de leche en la palma de su mano debido al riesgo de transferir bacterias de
un cuarto a otro y de una vaca a otra. En los establos donde la leche se ordeña en el
mismo lugar donde se alojan las vacas, la primera leche es volcada en una taza
especial o plato. En los echaderos de ordeño, puede ser volcada directamente al piso
para ser lavada inmediatamente luego de ser evaluada (Quintana, 2006).
2.3.2.3. Cultivo bacteriano
Generalmente, esta prueba se desarrolla en vacas seleccionadas para las que los
conteos de células somáticas de muestras compuestas revelan un problema
persistente serio. Los cultivos de leche de una vaca individual identifican la especie
bacteriana, por lo tanto es la forma más confiable para decidir un tratamiento
óptimo con antibióticos para una vaca en particular (Quintana, 2006).
2.4. Técnicas para la detección de Células Somáticas
2.4.1. Prueba de mastitis de California (CMT)
En esta prueba se utiliza el reactivo púrpura de bromocresol para estimar los RCS. La
magnitud de la reacción entre el detergente y el ADN del núcleo de las células es un
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estimador del número de células somáticas presentes en la muestra de leche. A
concentraciones de 150,000 a 200,000 células/ml, un precipitado comienza a
formarse. Un gel más viscoso se presenta en muestras con concentraciones mayores
de células somáticas. La cantidad de gel formado se evalúa visualmente sobre el
fondo blanco de una paleta o recipiente que viene al efecto y se clasifica en una
escala que abarca trazas y resultados positivos del 1 al 3. La calificación es subjetiva,
ya que depende del criterio de quien la realiza (Houghtby et al., 1992).
Fuente: Ávila et al, 2005
2.4.2. Prueba de Wisconsin
Utiliza el mismo principio y reactivo químico que la CMT, pero diluido al 50 % con
agua destilada. En esta prueba, la viscosidad del gel formado se mide y expresa en
términos del volumen del gel que se forma y que permanece en un tubo de ensayo
luego de 15 segundos de escurrido a través de un orificio de 1.15 mm. de diámetro.
Esta prueba semicuantitativa se considera más objetiva que la de CMT (Houghtby et
al., 1992).
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Fuente: Ávila et al, 2005
2.4.3. Coulter Counter
En el caso del “Coulter Counter” un volumen de leche conocido se hace pasar por un
orificio pequeño (100 micras) y cada célula que pasa genera un impulso eléctrico, que
es contabilizado y anotado automáticamente por el instrumento (Kitchen, 1981).
Fuente: Ávila et al, 2005
2.4.4. Fossomatic
Es un instrumento que cuenta las células somáticas por el método fluoro-óptico
electrónico, utilizando como compuesto fluoro-óptico al bromuro de etilo (Mochrine
y Monroe, 1978). Con este instrumento completamente automático, se pueden
procesar hasta 180 muestras de leche por hora y la correlación simple con el método
directo al microscopio es de .99 (Mochrine y Monroe, 1978).
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Fuente: Ávila et al, 2005
2.4.5. Recuento bajo microscopio
La observación y recuento directo bajo el microscopio ha sido el método tradicional
para estimar los RCS. Este método permite realizar el RCS y, a la misma vez, una
evaluación morfológica de las células y de las especies de bacterias presentes,
permitiendo que el analista pueda ofrecer información más precisa sobre la calidad
del producto. Esta prueba constituye también el estándar por el cual el resto de las
pruebas diagnósticos son calibradas. Aunque el método directo al microscopio es
considerado el procedimiento estándar, el mismo resulta tedioso y lento, lo cual limita
el número de muestras que se pueden realizar por unidad de tiempo. La precisión de
este método depende del tamaño de la muestra, espesor de la película de leche sobre
el portaobjetos utilizado y el número de campos sometidos a conteo (Houghtby et al.,
1992).
Fuente: Ávila et al, 2005
35
El método de microscopio directo consiste en examinar con un microscopio
compuesto, frotis coloreados de una cantidad determinada de leche o crema desecada
en portaobjetos. La coloración permite el reconocimiento de bacterias (y células) en
los frotis. El uso de este método permite:
1. Examen rápido de frotis para clasificar las muestras por grados o categorías
apropiados.
2. La notificación de los recuentos de bacterias individuales o de grupos de bacterias
(considerando cada bacteria aislada y cada grupo de bacterias no separada, como un
grumo), el reconocimiento de la forma y la distribución de células y bacterias
características que están generalmente asociadas con ciertas condiciones indeseables.
En casos que la leche es de inferior calidad, estos resultados deberían indicar la causa
o causas más probables de la diferencia (Asociación Americana de la Salud Pública,
1963)
2.4.5.1. Aplicaciones del Método de Microscopio Directo
2.4.5.1.1. Aplicaciones a la leche cruda por pasteurizar
El método microscópico ofrece una técnica rápida para determinar el grado de
contaminación bacteriana de la leche o la crema. Las muestras individuales se pueden
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examinar en 10 – 15 minutos. La distribución de las células bacterianas en los frotis
sugiere con frecuencia cual puede ser la causa probable de un recuento elevado,
mientras que el número excesivo de leucocitos señala condiciones anormales en la
ubre, frecuentemente mastitis (Robert, 1992).
La exactitud de los recuentos hechos por el método microscópico es mayor en la
leches con gran cantidad de bacterias, disminuyendo a medida que baja el nivel de
contaminación (Asociación Americana de la Salud Pública, 1963).
2.4.5.1.2. Aplicación a la leche pasteurizada
El método microscópico se puede usar también para determinar el grado de
contaminación bacteriana en la leche y crema pasteurizadas. Pese a que algunas
células bacterianas no se colorean, a la dispersión habitual de las bacterias y a los
efectos del tiempo y de la temperatura de almacenamiento después de la
pasteurización, los laboratoristas experimentados pueden reconocer con frecuencia
indicios sugestivos de:
1. Leche cruda con alto contenido bacteriano,
2. Número excesivo de leucocitos,
3. Prácticas deficientes en la planta lechera, tales como el uso
indebidamente
prolongado de filtros o pasteurizadotes,
4. Crecimiento bacteriano después de la pasteurización (Asociación Americana
de la Salud Pública, 1963).
Otros factores no tan evidentes en el cuadro microscópico son los siguientes:
1. Temperatura inadecuada o mantenimiento deficiente de la misma durante la
pasteurización,
37
2. Supervivencia y
crecimiento de las especies termodúricas después de la
elaboración, recontaminación después de la pasteurización, desarrollo de
especies psicrofílicas.
En los productos pasteurizados pueden predominar las bacterias mesofílicas o
psicrofílicas, según la temperatura y el tiempo de almacenamiento (Robert, 1992).
2.4.5.1.3. Aplicaciones a la leche en polvo
La leche en polvo, contiene por lo general, pocas bacterias vivas. El examen
microscópico de frotis preparados con muestras reconstituidas puede proporcionar
valiosa información sobre la historia del producto. Se han adoptado normas para el
recuento microscópico directo de grumos como una ayuda para controlar la calidad
(Robert, 1992).
2.4.5.2. Fuentes de error en el método de microscopía directa
Tal como sucede con otros métodos para la determinación del contenido bacteriano
de la leche, los resultados obtenidos por el método microscópico no son más que
aproximaciones. El recuento microscópico directo debe ser efectuado siempre por
laboratoristas adiestrados y experimentados, de lo contrario se puede obtener
resultados falsos. Aún con la técnica más rigurosa la repetición de un ensayo puede
dar resultados considerablemente diferentes. Entre los factores que causan las
variaciones se encuentran los siguientes:
1. La inexactitud al medir cantidades de 0,01 ml.
2. La preparación y coloración deficientes de los portaobjetos.
3. La imposibilidad de colorear ciertas bacterias.
4. La cantidad diminuta de leche que se examina al hacer el recuento.
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5. La distribución irregular de bacterias en los frotis.
6. El no contar un número suficiente de campos microscópicos.
7. Los errores en la observación y en el cálculo.
8. La iluminación inadecuada o excesiva del microscopio.
9. La fatiga o cansancio del laboratorista que efectuó el recuento.
Aún cuando se ponga sumo cuidados, la clasificación por el método microscópico
directo es a veces mucho más tolerante que el Recuento Estándar en Placa. El error
experimental puede reducirse aumentando el número de campos contados, pero en
muestras con pocas bacterias este procedimiento aumenta mucho el trabajo (Robert,
1992).
2.4.5.3. Recuentos de grumos bacterianos
El término “recuento bacteriano” se aplica a menudo tanto a la clasificación o
adjudicación de grados como a los recuentos numéricos de grumos (o de bacterias
individuales) obtenidos por este método. Aún cuando los recuentos numéricos se
hagan con cuidado, los resultados no son más que “recuentos bacterianos
aproximados”, a diferencia de “la adjudicación de grados o la clasificación”
(Asociación Americana de la Salud Pública, 1963).
El hacer los recuentos numéricos de grumos de bacterias (o de bacterias individuales)
requiere más esmero que el “clasificar” las muestras. En vista que el porcentaje de
error en los recuentos notificados es inversamente proporcional a la raíz cuadrada del
número de bacterias observadas, la precisión relativa de los recuentos depende del
número de grumos (o de organismos individuales) por campo visual y del número de
campos contados. Debido a la distribución desigual de los grumos de bacterias y de
bacterias individuales, sobre todo en muestras con pocas bacterias, las estimaciones
aproximadas deben ser notificadas sólo después de un cuidadoso examen de no
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menos del número mínimo de campos especificados. Si se desea mayor exactitud se
pueden examinar campos adicionales. A menos que se especifique lo contrario, los
recuentos microscópicos se refieren solamente a recuentos de grumos (Robert, 1992).
2.4.5.4. Clasificación de las muestras
Los laboratoristas hábiles pueden usar este método de manera rutinaria para el cálculo
rápido de la densidad de grumos bacterianos, de modo que se puedan adjudicar sin
demora determinados grados a las muestras, evitándose así la necesidad de calcular,
por métodos más cuidadosos, el número de grumos bacterianos (o de células
individuales). A fin de reducir el número de decisiones en casos dudosos, es
conveniente reconocer no más de dos o tres grupos mayores, de acuerdo con las
diferencias perceptibles de calidad. Puesto que se puede reconocer fácilmente tanto la
ausencia como la presencia de bacterias, la técnica de clasificación por grados puede
aplicarse por igual a las muestras de alta calidad (contenido bacteriano bajo) y a las
de baja calidad (Breed, 1991). Cuando hay un gran número de bacterias y ellas están
distribuidas uniformemente en los frotis, el examen de un campo visual microscópico
indica a menudo el carácter general de la muestra (Breed, 1991).
Cuando se encuentran pocas bacterias o cuando están distribuidas irregularmente, se
deben realizar exámenes de muchos campos microscópicos para asegurar la
clasificación correcta. Los frotis preparados con leche de lata calidad sanitaria
contienen con frecuencia tan pocas bacterias que no puede encontrarse ninguna
después de buscar en 100 campos o más, mientras que en los frotis de leche de baja
calidad se hallan numerosas bacterias en cada campo examinado (Robert, 1992).
40
Aunque el control de la calidad sanitaria por medio de la clasificación se basa
fundamentalmente en el contenido bacteriano de las muestras de leche y de crema, el
uso solamente de términos de clasificación para indicar lo grados relativos de calidad
impide, al parecer, que los organismos de control cuenten con la información que a
través de los años se ha considerado como específica y esencial para corregir
condiciones antihigiénicas Al no poder hacer las comparaciones de costumbre con los
cálculos sobre los productos de otros vendedores o productores, algunos oficiales
encargados del control se sienten privados de información aparentemente útil cuando
no encuentran cálculos tan específicos como el “Recuento Estándar en Placa por ml”,
“Recuento Microscópico Directo (de grumos) por ml” o el “Recuento Microscópico
Individual por ml” (Robert, 1992).
Debido a que todos los intentos de enumerar bacterias dan esencialmente
estimaciones aproximadas, el uso de términos de clasificación para indicar si los
productos son o no “aceptables” evitará con frecuencia discusiones innecesarias sobre
diferencias insignificantes. (Robert, 1992).
2.5. Equipo DCC DeLaval
El DCC DeLaval es un contador de células óptico portátil, que funciona con baterías
y proporciona una medición en menos de un minuto. El conteo de células somáticas
en la leche es una medida utilizada para la determinación del estado de salud de la
ubre, además se utiliza comúnmente como un indicador del Standard sanitario en la
producción de leche (Manual de instrucciones, Contador de células DeLaval DCC,
2003).
Este equipo cuenta con un cassette el cual se utiliza para la recogida de la muestra de
leche previa al proceso de contaje de las células con el DCC. Este cassette contiene
pequeñas cantidades de reactivos que cuando se mezclan con la leche, reaccionan con
el núcleo de las células somáticas. La muestra de leche en el cassette se expone a la
acción de la luz en el DCC, dando lugar a la producción de señales fluorescentes.
41
Estas señales se registran en forma de imagen y dicha imagen se utiliza para
determinar el número de células somáticas en la leche (Manual de instrucciones,
Contador de células DeLaval DCC, 2003).
2.6. Parámetros estadísticos
2.6.1. Validación
Es demostrar con un alto grado de confianza, por medio de evidencia documentada
que un proceso específico producirá de forma consistente y permanente productos
que poseerán las características de calidad predefinidas (WHO Technical Report
Series, No. 823, 1992). Es el proceso por el cual se establecen mediante estudios de
laboratorio que las características de desempeño del método analítico cumplen los
requerimientos para la aplicación analítica propuesta, es decir, para detectar o
cuantificar grupos microbianos específicos como es el caso, siendo su principal
objetivo confirmar y documentar la confiabilidad de los resultados obtenidos (USP
XXVI, 2003).
Para validar un proceso se deben realizar sistemáticamente los procedimientos de
puesta a punto del mismo, mediante el seguimiento de las siguientes fases:
2.6.1.1. Planificación
Se busca establecer programas temporales y listas de verificación, protocolos de la
validación con criterios de aceptación/rechazo, necesidades de recursos, análisis de
riesgos, etc. (Padilla, 2007).
42
2.6.1.2. Calificación del diseño
El primer elemento de la validación es la validación de nuevas instalaciones, sistemas
o equipos. Se deberá demostrar y documentar la adecuación del diseño a las normas
de correcta fabricación (Padilla, 2007).
2.6.1.3. Calificación de la instalación
Busca establecer por evidencia objetiva que todos los aspectos claves del equipo de
proceso y la instalación de sistemas auxiliares cumplan con las especificaciones
aprobadas del fabricante y las recomendaciones del abastecedor del equipo para el
correcto funcionamiento, y las exigencias de mantenimiento de este. Además de esto
también se incluyen requisitos de calibración y verificación de los materiales de
construcción (Padilla, 2007).
2.6.1.4. Calificación del funcionamiento
Esta calificación deberá realizarse tras la calificación de la instalación, y busca
establecer por medio de evidencia objetiva los límites de control de proceso y los
niveles de acción que resultan en un producto que cumpla con todos los
requerimientos predeterminados.
Debe incluir:
a. Ensayos que hayan desarrollado especialistas con conocimiento sobre procesos,
sistemas y equipos.
b. Ensayos que incluyan una situación o un conjunto de ellas que abarquen los límites
máximos y mínimos de trabajo, condiciones denominadas como frecuencia “caso más
desfavorable”.
43
La finalización de forma satisfactoria de la calificación del funcionamiento permitirá
terminar los procedimientos de calibración, fabricación y limpieza, la formación del
operario y las exigencias de mantenimiento preventivo. Así, permitirá la aprobación
formal de las instalaciones, sistemas y equipos (Padilla, 2007).
2.6.1.5. Calificación de desempeño
La calificación de desempeño deberá efectuarse una vez realizadas satisfactoriamente
la calificación de la instalación y de funcionamiento. Esta proveerá evidencia
documentada, bajo condiciones anticipadas, que se produce de manera consistente un
producto que cumpla con las especificaciones y el criterio de diseño (Padilla, 2007).
La calificación de la ejecución del proceso incluirá, entre otras cosas, lo siguiente:
a. Ensayos, empleando materiales de producción (o componentes sustitutivos
calificados y/o simulaciones de productos), que se hayan desarrollado a partir del
conocimiento especializado sobre los procesos y las instalaciones, sistemas o equipos.
b. Ensayos que incluyan una situación o un conjunto de ellas que abarquen los límites
máximos y mínimos de funcionamiento (Padilla, 2007).
2.6.2. Validación primaria
La validación primaria es un proceso exploratorio que tiene como metas establecer
los límites operacionales y las características de desempeño de un método nuevo,
modificado o caracterizado en forma inadecuada. Debe dar origen a especificaciones
numéricas y descriptivas para el desempeño e incluir una descripción detallada y
precisa del objeto de interés.
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Característicamente, la validación procede mediante el uso de esquemas de ensayo
especialmente diseñados.
Los laboratorios que desarrollan un método “en casa” o una variante de una norma
existente deben realizar los pasos de la validación primaria (Padilla, 2007).
2.6.3. Validación secundaria
La validación secundaria tiene lugar cuando un laboratorio procede a implementar un
método desarrollado en otra parte. Esta validación se centra en la reunión de
evidencia acerca de que el laboratorio está en capacidad de cumplir las
especificaciones establecidas en la validación primaria. Suele llamarse verificación; y
es la confirmación, mediante el aporte de pruebas objetivas, de que se han cumplido
los requisitos establecidos (ISO 9000, 2000).
Normalmente, la validación secundaria emplea formas seleccionadas y simplificadas
de los mismos procedimientos empleados en la validación primaria, aunque
posiblemente extendidas por un tiempo mayor. Las muestras naturales constituyen el
material de ensayo óptimo y el trabajo sólo requiere tratar el procedimiento dentro de
los límites operacionales establecidos por la validación primaria (Padilla, 2007).
Para un laboratorio de análisis es importante validar sus técnicas para así optimizar
sus procesos, al mejorar el uso de equipos y de personal de laboratorio y eliminar los
tiempos muertos, lo cual genera confiabilidad en los resultados, lo que a su vez
implica reducción en los gastos (PDA Suggested Revision, 2000). Así mismo sirve
para dar cumplimiento a las normas legales pertinentes o a normas internacionales de
calidad, contribuyendo a la credibilidad del laboratorio y a obtener altos niveles de
calidad que generen confianza dentro de sus clientes.
45
2.6.4 Tipos de validación
2.6.4 1. Validación prospectiva
Este tipo de validación se basa en información obtenida antes de implantar el proceso
de validación. Se debe realizar un análisis de riesgos para determinar si podrían
conducir a situaciones críticas; se investigan posibles causas y se determina la
probabilidad de que suceda. Luego de efectúan los ensayos y se hace una valoración
general; si los resultados son aceptables al final, el proceso es satisfactorio. Los
procesos no satisfactorios se tienen que modificar y mejorar hasta que una nueva
validación demuestre su carácter satisfactorio (Padilla, 2007).
2.6.4.2. Validación retrospectiva
Este tipo de validación involucra la revisión y análisis de la información histórica del
proceso para proveer de la evidencia documentada necesaria que el proceso está
haciendo lo que debe hacer. Los pasos involucrados en este tipo de validación
requieren la preparación de un protocolo específico, el reporte de los resultados de los
datos analizados que conlleven a unas conclusiones y recomendaciones (PDA
Suggested Revision, 2000), (WHO, 1997).
Este tipo de validación sólo es aceptable para procesos bien establecidos y sería
inapropiado si recientemente se hubieran realizado cambios en la composición del
producto, en los procedimientos de operación o en los equipos (PDA Suggested
Revision, 2000), por lo tanto, nunca se debe aplicar a nuevos procesos o productos.
Esta validación puede ser útil en el establecimiento de las prioridades en un programa
de validación (WHO, 1997).
Dentro de la validación retrospectiva es necesario tener en cuenta el control de la
materia
prima,
controles
ambientales,
controles
microbiológicos,
procedimientos, especificaciones y métodos analíticos (Padilla, 2007).
equipos,
46
2.6.4.3 Validación concurrente
Este tipo de validación sirve para demostrar y establecer evidencia documentada que
un proceso hace lo que debe hacer basado en información generada durante una
implementación real del proceso. La validación concurrente es muy utilizada cuando
se ha variado alguna etapa del proceso. Ésta da una información muy valiosa para
modificar y corregir el proceso. Podría considerarse como una evaluación continua
del proceso, mientras se controla al máximo para procurar que el producto o resultado
final sea correcto (Padilla, 2007).
Se debe tener en cuenta el monitoreo en proceso de las variables críticas que
demuestre que el proceso está bajo control y el registro de datos sobre la marcha del
proceso en estado productivo. Sin embargo, cada aproximación tiene sus
características y limitaciones y por lo tanto, antes de desarrollar una validación deberá
evaluarse que tipo de validación puede dar la mayor información sobre la seguridad y
la estabilidad del proceso (Padilla, 2007).
2.6.4 .4 Revalidación
Se aplica cuando se presenta el cambio de uno de los componentes críticos de la
formulación, cambio o reemplazo de una pieza crítica en un sistema o equipo o
cambio en instalaciones. La revalidación periódica se presenta cuando los procesos
experimentan cambios graduales (Padilla, 2007).
Es la repetición de un procedimiento de validación o un procedimiento del mismo.
Esto no significa que el programa original deba ser repetido, pues la revalidación se
efectúa para asegurar que los cambios intencionales o no intencionales en los
procesos no afecten las características del proceso ni la calidad del producto (WHO,
1997).
47
2.6.5 Parámetros analíticos para la validación de una técnica o método
Son las propiedades, características o capacidades del método que indican su grado de
calidad en cuanto a exactitud, exactitud relativa, desviación, desviación positiva,
desviación
negativa,
efecto
matricial,
repetibilidad,
precisión
intermedia,
reproducibilidad, especificidad, límite de detección, límite de cuantificación,
linealidad, rango, sensibilidad, fortaleza y solidez y robustez, entre otras
características (Padilla, 2007).
2.6.5.1 Precisión
Se relaciona con la dispersión de la medida alrededor de un valor medio o central,
que puede ser expresada en términos de varianza, desviación estándar o coeficiente de
variación. La precisión puede ser considerada a tres niveles: repetibilidad,
reproducibilidad y solidez y robustez (Padilla, 2007).
2.6.5.1.1. Repetibilidad
Medida de la precisión del método cuando se realizan mediciones sucesivas por el
mismo analista el mismo día, mismos reactivos, mismo instrumento y condiciones de
medición (precisión dentro del ensayo). Po mediciones sucesivas se entiende aquellas
mediciones repetidas dentro de un corto periodo de tiempo (WHO Technical Report
Series, No. 823, 1992).
2.6.5.1.2. Reproducibilidad
Grado de concordancia entre los resultados de mediciones del mismo analito
realizadas en diferentes condiciones de medición. Una declaración válida de
reproducibilidad requiere que se especifiquen los cambios en las condiciones del
análisis o calibración. Estos cambios pueden incluir: el principio en que se basa la
medición, el método, analista/observador e instrumento, material y patrones de
48
referencia, ubicación, condiciones de uso y tiempo. La reproducibilidad puede ser
expresada cuantitativamente en términos de los parámetros de dispersión de los
resultados (desviación estándar, varianza, coeficiente de variación) (Padilla, 2007).
La reproducibilidad intra-laboratorio es uno de los principales objetivos de los
programas internos de aseguramiento de la calidad. Garantiza que un laboratorio es
capaz de producir resultados constantes a lo largo del tiempo (Padilla, 2007).
2.6.5.1.3. Solidez y Robustez
Busca demostrar la veracidad de un análisis con respecto a variaciones deliberadas en
parámetros del método. Examina el efecto que las condiciones operacionales y del
medio ambiente tienen sobre los resultados del análisis (diferentes temperaturas y
porcentaje de humedad, analistas con diferente experiencia, instrumentos y reactivos
de diferentes marcas). Se determina analizando muestras provenientes de un lote
homogéneo por diferentes analistas y que el procedimiento analítico no se vea
afectado por estas variaciones deliberadas (Padilla, 2007).
2.6.5.2. Selectividad
Se define un método selectivo como aquel que produce resultados exactos para todos
los analitos de interés (WHO Technical Report Series, No. 823, 1992).
2.6.5.3. Especificidad
Es la capacidad del método para diferenciar precisa y específicamente el compuesto
de interés, en presencia de los demás componentes, que se espera estén presentes en
la matriz de la muestra (WHO Technical Report Series, No. 823, 1992). La
especificidad se puede estudiar agregando a la muestra algunas sustancias que se
sospecha que reaccionan de la misma manera que el componente estudiado y
comparar estadísticamente los resultados analíticos con y sin agregado (Padilla,
2007).
49
2.6.5.4. Linealidad
Tiene que ver con la proporcionalidad entre la concentración del analito y su
respuesta, es decir, si la técnica o método produce resultados directa o indirectamente
proporcionales a la concentración o cantidad del analito, dentro de un intervalo
determinado (WHO Technical Report Series, No. 823, 1992).
2.6.5.5. Exactitud
Es el grado de concordancia entre el valor aceptado como un valor verdadero
convencional, o un valor de referencia, y el valor encontrado (Padilla, 2007). Se
conoce también como error sistemático o sesgo.
2.6.5.6. Estabilidad
La estabilidad se considera adecuada si la desviación estándar relativa calculada en
los resultados obtenidos en diferentes intervalos de tiempo, no excede el 20% del
valor correspondiente de la precisión del sistema (WHO Technical Report Series, No.
823, 1992).
2.6.5.7. Límite de detección
Concentración mínima del analito que puede detectarse en una muestra, pero no es
necesariamente cuantificada, bajo condiciones analíticas específicas (Padilla, 2007).
2.6.5.8. Límite de detección
Concentración mínima del analito que puede detectarse en una muestra aceptable en
una muestra bajo condiciones analíticas específicas (Padilla, 2007).
50
3. JUSTIFICACIÓN Y FORMULACIÓN DEL PROBLEMA
La leche es un producto alimenticio secretado por la ubre de las hembras, que en su
estado natural es líquido, de color blanco cremoso, olor y sabor característicos
normales. Es un producto rico en nutrientes y por lo tanto muy delicado y fácil de que
se contamine si no se maneja adecuadamente.
La leche debe ser de excelente calidad, ya sea para el consumo directo de la leche
líquida como para la fabricación de derivados lácteos; esto significa que, además de
un buen contenido de nutrientes, debe tener unas características especiales que
aseguren al consumidor un producto fresco, alimenticio y saludable. Para obtener una
leche de buena calidad se deben cumplir una serie de normas y procedimientos. Se
debe empezar por producirla en buenas condiciones, conservarla adecuadamente en la
finca mientras es recogida y transportada a la planta recibidora o transformadora. De
allí en adelante, se debe transportar y conservar refrigerada, para que llegue a los
distribuidores y consumidores finales en muy buenas condiciones.
Para producir una leche de buena calidad, se deben tener en cuenta los cuatro
principios básicos de toda explotación pecuaria eficiente, o sea: animales de buena
calidad, alimentación adecuada, buen manejo y estricta sanidad. Los dos primeros
influyen directamente en la calidad nutricional o composición; los otros dos en la
calidad higiénica.
La sanidad en el hato es determinante para obtener una leche de buenas características
higiénicas. Esta debe ser más preventiva que curativa. Se debe comenzar por tener
una vaca saludable y bien nutrida, a la que se le haya aplicado todo el plan de
vacunación y vermifugación propio de la zona. Las vacas deben permanecer limpias y
es deseable que tengan cepillada la piel.
51
Las enfermedades que más afectan la calidad de la leche son la mastitis, las fiebres de
varios orígenes, la brucelosis, las inflamaciones, abscesos Y heridas de los pezones.
La mastitis es una enfermedad que es relativamente fácil de prevenir, pues si se hace
un buen manejo e higiene de la ubre y se realiza el chequeo rutinario con la "paleta':
se puede detectar las mastitis subclínicas y realizar un tratamiento oportuno. El
conteo de células somáticas (CCS) es un indicador a nivel de la ubre de cada vaca del
status de salud. Las células somáticas están compuestas principalmente por
leucocitos, cuando existe algún proceso inflamatorio en la ubre, aproximadamente el
99 % de todas las células presentes en la leche del cuarto infectado son leucocitos,
mientras que el 1 % restante son células secretadas en la leche, provenientes del tejido
mamario. El conteo directo o indirecto de las células somáticas es la herramienta más
común que se utiliza para el diagnóstico temprano de la mastitis subclínica.
Como bien es sabido, la Alquería se caracteriza por ofrecer al consumidor productos
lácteos y alimentos de excelente calidad en condiciones óptimas, contribuyendo así a
la nutrición y salud de la población. Para esto desarrollan, dentro de las más altas
normas de calidad y eficiencia, actividades tales como recolección, procesamiento y
transformación de la leche, así como una distribución adecuada de productos finales,
complementada con la educación al minorista y al consumidor sobre el manejo y uso
de los mismos.
Básicamente en términos de Calidad, para producción primaria esta técnica
de
recuento de células somáticas, es un excelente indicador de estado de sanidad Animal
(Mastitis). La resolución 0012 del ICA en pago por calidad y el fuerte de la
organización Alquería que es la producción UHT (Ultra alta temperatura), requiere
buena relación de estabilidad de proteína previo al tratamiento térmico y casualmente
una de los factores que garantiza parte de la estabilidad proteica, es la repulsión de
cargas en la molécula de caseína, que está relacionada con la cantidad de aniones en
la misma. Indirectamente hay afección de la estabilidad proteica, por la presencia de
52
células somáticas o presentación de mastitis, en donde un recuento de células
somáticas, con exceso de cationes de Sodio, puede estar cargando positivamente la
molécula de caseína y afectando la repulsión de cargas, de modo que se vuelve más
susceptible al tratamiento térmico.
Por esta razón se hace necesario validar la técnica de recuento de células somáticas
con el equipo DCC DeLaval pues aunque en la empresa Alquería se cuenta con la
técnica de microscopia directa, es recomendable tener un método alterno para poder
realizar el recuento y así emitir resultados confiables donde se garantice la buena
calidad de la leche y todos lo productos lácteos que allí se fabriquen.
53
4. OBJETIVOS
4.1. Objetivo General
Estandarizar y validar la técnica de recuento de células somáticas por medio del
equipo DCC DeLaval frente a la técnica de microscopia directa para ser usada e
implementada en la empresa Alquería S.A.
4.2. Objetivos Específicos
• Analizar los resultados obtenidos mediante el equipo DCC DeLaval frente a
los resultados obtenidos con la técnica de microscopía directa.
• Realizar un estudio estadístico comparativo de los métodos de recuento de
células somáticas utilizados en la empresa Alquería S.A. (método alterno y
método de referencia) y de esta manera establecer la concordancia que existe
entre ellos.
• Determinar si los resultados obtenidos con el método alterno (Equipo DCC
DeLaval) son equivalentes a los suministrados por el método de referencia
(Microscopía Directa)
54
5. MATERIALES Y MÉTODOS
Como el método a validar era un método nuevo, según el protocolo de validación de
la norma ISO 17025 fue conveniente elaborar los procedimientos de cada uno de los
ensayos (el alterno y el de referencia).
5.1. Recuento de células somáticas por microscopía directa (método de
referencia)
5.1.1. Alistamiento de la muestra
•
Tomar de 20 a 30 mililitros de la muestra, la temperatura de esta debe estar
entre 0 y 5 ºC.
•
Depositarlos en un recipiente que se encuentre limpio y libre de impurezas.
•
Mezclar la muestra girando e invirtiendo el recipiente 25 veces.
5.1.2. Ejecución de la prueba
•
Tomar la lámina plantilla la cual tiene cinco pozos dibujados con medidas
específicas para el microscopio utilizado en el laboratorio de microbiología de
la Alquería. Estas medidas específicas se obtienen a partir de un factor
microscópico, el cual se determina para cada microscopio.
•
Apoyar sobre la plantilla el portaobjetos.
55
•
Tomar 10uL de cada muestra y depositarlos en cada uno de los pozos.
•
Esparcir la muestra suavemente en forma circular hasta llenar todo el pozo.
Tener en cuenta el orden de las muestras para marcarlas en la lámina de
vidrio.
•
Retirar cuidadosamente la lámina plantilla y dejar secar la lámina de vidrio a
temperatura ambiente. No moverla.
•
Cuando las muestras se encuentren totalmente secas agregar Xilol a cada pozo
(para fijar la muestra) dejar secar a temperatura ambiente.
•
Sin lavar previamente, agregar azul de metileno al 1% sobre toda la lamina,
durante 3 minutos exactamente (usar cronometro).
•
Lavar cuidadosamente con agua evitando que esta toque directamente la
muestra, pues esta se puede perder en la lavada.
•
Dejar secar a temperatura ambiente para posteriormente realizar la lectura.
5.1.3. Lectura de las células somáticas
En esta lectura se busca contabilizar el total de leucocitos presentes en la leche,
indicadores de una posible infección del animal.
56
•
Colocar la lámina en el microscopio y ubicar el lente 40x, de esta forma se
ubica la zona ideal para leer (es aquella donde la coloración se observa más
clara o donde el paso de luz se dificulta menos)
•
Luego pasar al lente de 100x y leer la lámina hasta completar un total de 20
campos. No ignorar ningún campo y leerlos todos así no contengan células
somáticas.
•
Mover la platina del microscopio haciendo el siguiente recorrido para evitar
leer el mismo campo varias veces:
5.1.4. Interpretación de resultados
C.SOMÁTICAS =
RECUENTO
* 320000
20
El factor de 320000 fue calculado exclusivamente para el microscopio que se usa en
la Organización Alquería S.A.
57
5.2. Recuento de células somáticas del DCC DeLaval (método alterno)
5.2.1. Alistamiento de la muestra
•
Tomar de 20 a 30 mililitros de la muestra, la temperatura de esta debe estar
entre 0 y 5 ºC.
•
Depositarlos en un recipiente que se encuentre limpio y libre de impurezas.
•
Mezclar la muestra girando e invirtiendo el recipiente 25 veces.
5.2.2. Alistamiento del cassette
•
Sacar de refrigerador el cassette que se va a usar.
•
Ubicar la entrada del cassette en la muestra de leche a analizar.
•
Presionar el pistón del cassette.
•
Verificar que la muestra se cargue hasta la mitad del recorrido 3. (A partir de
este punto la leche entrará en contacto con los reactivos).
•
Colocar el cassette en el DCC y comenzar la medición en los dos minutos
siguientes.
•
Ubicar el cassette en el contador con la entrada de este a la izquierda.
58
•
Cerrar la tapa del DCC.
5.2.3. Operación del equipo
•
Realizar la medición pulsando la tecla “RUN”
•
Anotar el valor del contaje que aparece en la pantalla.
•
Presionar al botón “ESC” para borrar los resultados obtenidos de las
anteriores mediciones.
•
Sacar el cassette del equipo, el cual deberá ser desechado
•
Cerrar la tapa de inserción de la muestra una vez finalizada la medición.
5.2.4. Validación de la técnica
Se tomaron muestras de leche que llegaban diariamente a la empresa la Alquería,
provenientes de los hatos que la suministran para la realización de sus productos.
Según la Norma Técnica Colombiana 5014 (norma utilizada en la empresa Alquería
para la validación de métodos alternos), el número de muestras que se debían analizar
para la validación de un método alterno era de 60, pero en este caso se analizaron 87
muestras. Este número de muestras fue propuesto por la empresa, debido a la
complejidad e importancia de la técnica para producción de alimentos estables y con
alta calidad.
59
5.3. Análisis estadístico
El diseño experimental de este proyecto se basó en dos pasos. El primer paso fue una
presentación y descripción de los datos, esto se hizo por medio de tablas y gráficos.
El segundo paso fue el análisis y discusión de los resultados, este análisis se hizo por
medio de pruebas estadísticas de tipo cuantitativo. Estas pruebas fueron: precisión y
exactitud.
•
En Precisión, se evaluaron dos aspectos:
1. Repetibilidad: La medida de repetibilidad se determinó analizando la proximidad
de concordancia entre los resultados obtenidos con el mismo método, con idéntico
material de ensayo y bajo las mismas condiciones (aparatos, operarios, laboratorio).
La lectura de cada muestra se hizo tres veces por cada método, de esta manera se
determinó un análisis de varianza, desviación estándar y coeficiente de variación.
También se hizo una prueba de hipótesis con un nivel de confianza del 99%, usando
una prueba pareada:
Estas hipótesis ayudaron a determinar la equivalencia de repetibilidad para los dos
métodos.
60
Además siguiendo la Norma Técnica Colombiana 5014 se evaluó y comparó la
repetibilidad de los dos métodos (alterno y referencia) por medio de una distribución
F, analizando sus varianzas.
Adicionalmente se hizo uso del coeficiente de variación, esto para ver que tan
alejados estaban los datos de la tendencia central. Este análisis se realizó para los dos
métodos, mediante la siguiente fórmula:
Esto examinó la concordancia de los datos, si la dispersión era significativa, es decir
si el índice de coeficiente de variación (CV) era elevado, significaba que los datos
estaban muy alejados de su tendencia central, por lo cual la concordancia entre ellos
sería baja.
2. Reproducibilidad: La medida de reproducibilidad se determinó analizando la
proximidad de concordancia entre los resultados de las pruebas con idéntico material
de ensayo, uso de los mismos métodos y además obtenidos por diferentes operadores.
La lectura de cada muestra por cada uno de los métodos se hizo por dos analistas
diferentes, al mismo tiempo y con los mismos equipos. La lectura de resultados por
cada uno de los métodos no pudo ser determinada por equipos distintos, ya que sólo
se cuenta con un equipo para cada método.
También se hizo una prueba de hipótesis con un nivel de confianza del 99%, usando
una prueba pareada:
61
Estas hipótesis ayudaron a determinar la reproducibilidad entre analistas para los dos
métodos.
Además siguiendo la Norma Técnica Colombiana 5014 se evaluó y comparó la
reproducibilidad en los dos métodos (alterno y referencia)
por medio de una
distribución F. De esta manera se pudo probar si había equivalencia entre analistas
para los dos métodos, además de comparar las varianzas de reproducibilidad de
ambos métodos con el fin de comprobar la concordancia entre el método alterno y el
método de referencia.
Adicionalmente se hizo uso del coeficiente de variación, esto para ver que tan
alejados estaban los datos de la tendencia central. Este análisis se realizó para los dos
métodos, mediante la siguiente fórmula:
Esto examinó la concordancia de los datos, si la dispersión era significativa, es decir
si el índice de coeficiente de variación (CV) era elevado, significaba que los datos
estaban muy alejados de su tendencia central, por lo cual la concordancia entre ellos
sería baja.
3. Exactitud: La exactitud para esta validación se puntualizó como los valores
aceptados de referencia dentro de una definición de veracidad, la cual se obtuvo
solamente con los resultados logrados con el método de referencia y muestras
idénticas. Así las desviaciones que se obtuvieron con el método alterno correspondían
a la exactitud para la validación de este método. Para esto se plantearon dos hipótesis,
una alterna (Ha) y una nula (Ho):
62
Estas hipótesis se analizaron mediante una tabla de t Student, luego de este análisis se
pudo determinar si el método alterno carecía de exactitud o no, en relación con el
método de referencia.
63
6. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
6.1. Estandarización de las técnicas
Se analizaron 87 muestras de leche provenientes de los diferentes hatos que surten a
la empresa Alquería S.A. Como primera medida se hizo necesario estandarizar cada
una de las técnicas usadas para el recuento de células somáticas, tanto la del recuento
por microscopía directa, como la lectura por medio del equipo DCC DeLaval.
Esta estandarización permitió establecer los parámetros de operación para cada una
de las técnicas, además de dejar un procedimiento en la empresa para que los
operarios encargados de analizar las muestras siguiera los pasos señalados en cada
uno de los protocolos (recuento por microscopía directa y por el equipo DCC
DeLaval) y así poder obtener resultados verídicos y confiables.
Luego de esta estandarización, las 87 muestras analizadas para esta validación fueron
tratadas según el procedimiento creado para cada una de las técnicas, y así, tener la
seguridad que todas las muestras hayan sido montadas de la misma forma y bajo las
mismas condiciones.
6.2. Presentación y descripción de datos
A continuación se encuentra una tabla donde se muestran los resultados obtenidos de
las lecturas de células somáticas de las 87 muestras analizadas mediante las dos
técnicas: recuento por microscopia directa (método de referencia), y recuento por
medio del equipo DCC DeLaval (Método alterno). Estos resultados fueron obtenidos
por un solo analista y las muestras se trataron bajo las mismas condiciones de
operación, en un mismo laboratorio, con los mismos equipos y en diferentes días.
Cabe resaltar que cada una de las muestras fue montada al mismo tiempo para las dos
64
técnicas (Microscopio y Equipo), ya que la acidez de la leche cambia con gran
rapidez, lo cual afecta directamente el resultado en el conteo de células somáticas,
debido a que el contenido de estas células aumenta cuando aumenta la acidez de la
leche (Salvador et al 2006).
Tabla 1. Resultados de lecturas de células somáticas por microscopio (M) y equipo (E)
Muestra
DÍA
1
DÍA
2
DÍA
3
MICROSCOPIO (células/mL)
EQUIPO (células/mL)
REPLICA REPLICA REPLICA REPLICA REPLICA REPLICA
1M
2M
3M
1E
2E
3E
1
304000
308000
305000
363000
363000
361000
2
416000
412000
414000
487000
488000
487000
3
880000
883000
886000
909000
908000
910000
4
208000
206000
205000
247000
247000
248000
5
432000
429000
433000
451000
452000
451000
6
960000
962000
958000
920000
920000
920000
7
480000
481000
478000
522000
520000
521000
8
816000
813000
817000
839000
838000
838000
9
448000
450000
447000
397000
395000
393000
10
528000
529000
526000
523000
526000
525000
11
80000
79000
80000
105000
106000
105000
12
288000
289000
286000
228000
229000
227000
13
368000
366000
371000
405000
404000
406000
14
48000
49000
46000
73000
73000
72000
15
1184000
1186000
1182000
1002000
1002000
1005000
16
352000
351000
349000
299000
298000
296000
17
816000
814000
818000
863000
865000
866000
18
384000
385000
382000
334000
335000
336000
19
1280000
1290000
1260000
1159000
1161000
1158000
20
320000
322000
381000
278000
277000
278000
21
336000
338000
335000
376000
378000
377000
22
912000
915000
913000
886000
889000
888000
23
112000
111000
114000
89000
88000
89000
24
304000
303000
301000
241000
245000
243000
65
DÍA
4
DÍA
5
DÍA
6
DÍA
7
25
176000
176000
179000
164000
166000
163000
26
624000
622000
625000
586000
588000
585000
27
368000
365000
366000
322000
321000
320000
28
384000
385000
387000
366000
365000
368000
29
1104000
1105000
1102000
1070000
1069000
1071000
30
224000
222000
220000
295000
296000
298000
31
912000
915000
910000
940000
941000
938000
32
896000
900000
895000
863000
863000
865000
33
464000
465000
462000
448000
447000
449000
34
1072000
1075000
1071000
901000
902000
900000
35
176000
178000
174000
234000
235000
234000
36
320000
321000
324000
383000
382000
385000
37
432000
431000
430000
354000
355000
351000
38
512000
500000
514000
439000
436000
436000
39
880000
879000
886000
823000
825000
821000
40
640000
642000
638000
598000
600000
599000
41
720000
718000
725000
760000
761000
758000
42
736000
735000
741000
780000
780000
779000
43
224000
223000
219000
304000
306000
305000
44
880000
882000
878000
900000
901000
899000
45
1872000
1845000
1862000
2024000
2019000
2025000
46
240000
239000
245000
333000
336000
335000
47
368000
365000
371000
440000
441000
439000
48
3744000
3746000
3716000
3982000
3978000
3981000
49
640000
645000
639000
617000
619000
618000
50
224000
221000
230000
286000
289000
285000
51
592000
596000
591000
590000
591000
589000
52
608000
603000
609000
531000
529000
534000
53
1056000
1049000
1053000
996000
998000
995000
54
464000
463000
462000
517000
518000
520000
55
288000
286000
291000
352000
351000
355000
56
400000
405000
398000
387000
388000
385000
57
384000
386000
381000
360000
361000
361000
58
416000
414000
422000
445000
446000
448000
66
DÍA
8
59
304000
302000
306000
386000
385000
388000
60
384000
385000
388000
432000
430000
435000
61
512000
513000
509000
543000
541000
545000
62
400000
398000
402000
391000
395000
390000
63
528000
526000
519000
495000
496000
492000
64
240000
245000
243000
287000
286000
288000
65
496000
493000
492000
462000
465000
469000
66
368000
365000
372000
353000
356000
355000
67
464000
469000
462000
443000
445000
441000
68
992000
995000
998000
802000
800000
801000
69
384000
382000
388000
409000
405000
406000
70
336000
335000
341000
380000
382000
378000
71
320000
318000
325000
350000
352000
355000
72
368000
365000
364000
341000
342000
341000
73
336000
330000
342000
324000
326000
325000
74
1376000
1381000
1375000
1333000
1336000
1332000
75
400000
402000
398000
353000
356000
350000
76
416000
421000
411000
388000
385000
382000
77
352000
356000
348000
398000
396000
396000
78
330000
332000
329000
384000
384000
386000
79
441000
446000
445000
480000
485000
479000
80
320000
321000
318000
341000
342000
345000
81
384000
381000
386000
367000
368000
365000
82
368000
362000
371000
341000
344000
340000
83
592000
593000
589000
563000
562000
566000
84
640000
645000
649000
603000
602000
605000
85
576000
578000
573000
549000
549000
546000
86
528000
526000
532000
528000
526000
529000
87
360000
365000
359000
Fuente: Autor
364000
362000
365000
67
Para poder evidenciar la concordancia que hubo entre las mediciones conseguidas
tanto en Microscopio como en Equipo en el recuento de células somáticas, se
determinó el promedio de cada una de las réplicas obtenidas con los métodos
evaluados y se obtuvieron los siguientes datos:
Tabla 2. Promedio de lecturas de células somáticas por microscopio y equipo
Muestra
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
PROMEDIO
MICROSCOPIO
Células/mL
305667
414000
883000
206333
431333
960000
479667
815333
448333
527667
79667
287667
368333
47667
1184000
350667
816000
383667
1276667
341000
336333
913333
112333
302667
177000
623667
366333
385333
1103667
222000
912333
PROMEDIO
EQUIPO
Células/mL
362333
487333
909000
247333
451333
920000
521000
838333
395000
524667
105333
228000
405000
72667
1003000
297667
864667
335000
1159333
277667
377000
887667
88667
243000
164333
586333
321000
366333
1070000
296333
939667
68
32
33
34
35
36
37
38
39
40
41
42
43
44
45
46
47
48
49
50
51
52
53
54
55
56
57
58
59
60
61
62
63
64
65
66
67
68
69
70
71
72
73
897000
463667
1072667
176000
321667
431000
508667
881667
640000
721000
737333
222000
880000
1859667
241333
368000
3735333
641333
225000
593000
606667
1052667
463000
288333
401000
383667
417333
304000
385667
511333
400000
524333
242667
493667
368333
465000
995000
384667
337333
321000
365667
336000
863667
448000
901000
234333
383333
353333
437000
823000
599000
759667
779667
305000
900000
2022667
334667
440000
3980333
618000
286667
590000
531333
996333
518333
352667
386667
360667
446333
386333
432333
543000
392000
494333
287000
465333
354667
443000
801000
406667
380000
352333
341333
325000
69
74
75
76
77
78
79
80
81
82
83
84
85
86
1377333
400000
416000
352000
330333
444000
319667
383667
367000
591333
644667
575667
528667
1333667
353000
385000
396667
384667
481333
342667
366667
341667
563667
603333
548000
527667
87
361333
Fuente: Autor
363667
Según los datos presentados en la tabla 2, los promedios de las réplicas obtenidas por
cada método son muy similares, lo que indica que hay proximidad entre los
resultados obtenidos de recuento de células somáticas por medio del Microscopio y
por medio del Equipo DCC DeLaval, tal y como se muestra en la Figura 1.
70
Figura 1. Representación gráfica del promedio de lecturas obtenidas de células somáticas con
Microscopio y Equipo DCC DeLaval
6.3. Ensayos para la validación de la técnica
6.3.1. Ensayo de precisión
Mediante este ensayo fue posible relacionar la dispersión de cada una de las
mediciones alrededor de un valor medio o central, los cuales fueron expresados en
términos de varianza, desviación estándar y coeficientes de variación.
Para este ensayo se determinaron los parámetros estadísticos de repetibilidad y
reproducibilidad con cada uno de dos métodos (Alterno y Referencia), y de esta
manera fue posible evaluar los parámetros estadísticos nombrados anteriormente.
6.3.1.1. Ensayo de repetibilidad
Se determinó la medida de la precisión de cada una de los métodos, realizando
mediciones sucesivas por el mismo analista, estas mediciones fueron obtenidas en un
intervalo de 8 días usando los mismos reactivos, los mismos instrumentos e iguales
condiciones de medición y de esta forma pudo ser establecida la precisión dentro del
ensayo.
6.3.1.1.1. Ensayo de repetibilidad dentro del método de microscopía directa
(análisis de parámetros estadísticos)
En el ensayo de repetibilidad con el método de microscopia directa se determinaron
los parámetros estadísticos de valor medio o central, desviación estándar, varianza,
coeficiente de variación, valor mínimo y valor máximo. Se hicieron tres
71
determinaciones (réplicas) por cada una de las muestras analizadas. Los resultados
fueron los siguientes:
- Determinaciones del día 1
Tabla 3. Análisis de desviación estándar, varianza, coeficiente de variación y valores mínimos y
máximos de la prueba de repetibilidad con el ensayo de microscopía directa
Varianza
Coeficiente
de
Variación
(%)
Valor
Mínimo
Valor
Máximo
2082
4333333
0,68
304000
308000
414000
2000
4000000
0,48
412000
416000
3
883000
3000
9000000
0,34
880000
886000
4
3
206333
1528
2333333
0,74
205000
208000
5
3
431333
2082
4333333
0,48
429000
433000
6
3
960000
2000
4000000
0,21
958000
962000
7
3
479667
1528
2333333
0,32
478000
481000
8
3
815333
2082
4333333
Fuente: Autor
0,26
813000
817000
Muestra
Número
de
Replicas
1
Media
Desviación
Estándar
3
305667
2
3
3
- Determinaciones del día 2
Tabla 4. Análisis de desviación estándar, varianza, coeficiente de variación y valores mínimos y
máximos de la prueba de repetibilidad con el ensayo de microscopía directa
Media
Desviación
Estándar
Varianza
3
448333
1528
2333333
Coeficiente
de
Variación
(%)
0,34
10
3
527667
1528
2333333
11
3
79667
577
12
3
287667
13
3
14
15
Muestra
Número
de
Replicas
9
Valor
Mínimo
Valor
Máximo
447000
450000
0,29
526000
529000
333333
0,72
79000
80000
1528
2333333
0,53
286000
289000
368333
2517
6333333
0,68
366000
371000
3
47667
1528
2333333
3,2
46000
49000
3
1184000
2000
4000000
0,17
1182000
1186000
72
16
3
350667
1528
2333333
0,44
349000
352000
17
3
816000
2000
4000000
0,25
814000
818000
18
3
383667
1528
2333333
0,4
382000
385000
19
3
1276666
15275
233333333
1,96
1260000
1290000
20
3
321000
1000
1000000
0,31
320000
321000
21
3
336333
1528
0,45
335000
338000
2333333
Fuente: Autor
- Determinaciones del día 3
Tabla 5. Análisis de desviación estándar, varianza, coeficiente de variación y valores mínimos y
máximos de la prueba de repetibilidad con el ensayo de microscopía directa
Varianza
Coeficiente
de
Variación
(%)
Valor
Mínimo
Valor
Máximo
1528
2333333
0,17
912000
915000
112333
1528
2333333
1,36
111000
114000
3
302667
1528
2333333
0,5
301000
304000
25
3
177000
1732
3000000
0,98
176000
179000
26
3
623667
1528
2333333
0,24
622000
625000
27
3
366333
1528
2333333
0,42
365000
368000
28
3
385333
1528
2333333
0,4
384000
387000
29
3
1103667
1528
2333333
0,14
1102000
1105000
30
3
222000
2000
4000000
0,9
220000
224000
31
3
912333
2517
6333333
0,28
Fuente: Autor
910000
915000
Muestra
Número
de
Replicas
22
Media
Desviación
Estándar
3
913333
23
3
24
- Determinaciones del día 4
Tabla 6. Análisis de desviación estándar, varianza, coeficiente de variación y valores mínimos y
máximos de la prueba de repetibilidad con el ensayo de microscopía directa
Muestra
32
33
Número
de
Replicas
3
3
Media
897000
463667
Desviación
Varianza
Estándar
2646
1528
7000000
2333333
Coeficiente
de
Variación
0,29
0,33
Valor
Mínimo
Valor
Máximo
895000
462000
900000
465000
73
34
35
36
37
3
3
3
3
1072667
176000
321667
431000
2082
2000
2082
1000
4333333
4000000
4333333
1000000
Fuente: Autor
0,19
1,14
0,65
0,23
1072000
174000
320000
430000
1071000
178000
324000
432000
- Determinaciones del día 5
Tabla 7. Análisis de desviación estándar, varianza, coeficiente de variación y valores
mínimos y máximos de la prueba de repetibilidad con el ensayo de microscopía directa
Media
Desviación
Estándar
Varianza
38
Número
de
Replicas
3
508667
7572
57333333
Coeficiente
de
Variación
1,49
39
3
881667
3786
14333333
40
3
640000
2000
41
3
721000
42
3
43
Valor
Mínimo
Valor
Máximo
500000
514000
0,43
879000
886000
4000000
0,31
638000
642000
3606
13000000
0,5
718000
725000
737333
3215
10333333
0,44
735000
741000
3
222000
2646
7000000
1,19
219000
224000
44
3
880000
2000
4000000
0,23
878000
882000
45
3
1859667
13650
186333333
0,73
1845000
1872000
46
3
241333
3215
10333333
1,33
239000
245000
47
3
368000
3000
9000000
0,82
365000
371000
48
3
3735333
16773
281333333
0,45
3716000
3746000
49
3
641333
3215
10333333
Fuente: Autor
0,5
639000
645000
Muestra
- Determinaciones del día 6
Tabla 8. Análisis de desviación estándar, varianza, coeficiente de variación y valores mínimos y
máximos de la prueba de repetibilidad con el ensayo de microscopía directa
50
Número
de
Replicas
3
225000
4583
21000000
51
3
593000
2646
52
3
610000
53
3
1052667
Muestra
Media
Desviación
Coeficiente
Varianza
Estándar
de Variación
Valor
Mínimo
Valor
Máximo
2,04
221000
230000
7000000
0,45
591000
596000
8185
67000000
1,34
603000
619000
3512
12333333
0,33
1049000
1056000
74
54
3
459667
5859
34333333
Fuente: Autor
1,27
453000
464000
- Determinaciones del día 7
Tabla 9. Análisis de desviación estándar, varianza, coeficiente de variación y valores mínimos y
máximos de la prueba de repetibilidad con el ensayo de microscopía directa
Media
Desviación
Estándar
Varianza
55
Número
de
Replicas
3
288333
2517
6333333
Coeficiente
de
Variación
0,87
56
3
401000
3606
13000000
57
3
383667
2517
58
3
417333
4163
59
3
304000
2000
60
3
385667
61
3
62
Valor
Mínimo
Valor
Máximo
286000
291000
0,9
398000
405000
6333333
0,66
381000
386000
17333333
1
414000
422000
4000000
0,66
302000
306000
2082
4333333
0,54
384000
388000
511333
2082
4333333
0,41
509000
513000
3
400000
2000
4000000
0,5
398000
402000
63
3
524333
4726
22333333
0,9
519000
528000
64
3
242667
2517
6333333
1,04
240000
245000
65
3
493667
2082
4333333
0,42
492000
496000
66
3
368333
3512
12333333
0,95
365000
372000
67
3
465000
3606
13000000
0,78
462000
469000
68
3
995000
3000
9000000
0,3
992000
998000
69
3
384667
3055
9333333
0,79
382000
388000
70
3
337333
3215
10333333
0,95
335000
341000
71
3
321000
3606
13000000
1,12
318000
325000
72
3
365667
2082
4333333
0,57
364000
368000
73
3
336000
6000
36000000
1,79
330000
342000
74
3
1377333
3215
10333333
0,23
1375000
1381000
75
3
400000
2000
4000000
0,5
398000
402000
76
3
416000
5000
25000000
1,2
411000
421000
77
3
352000
4000
16000000
1,14
348000
356000
78
3
330333
1528
2333333
0,46
329000
332000
79
3
444000
2646
7000000
0,6
441000
446000
80
3
319667
1528
2333333
0,48
318000
321000
Muestra
75
Fuente: Autor
- Determinaciones del día 8
Tabla 10. Análisis de desviación estándar, varianza, coeficiente de variación y valores mínimos y
máximos de la prueba de repetibilidad con el ensayo de microscopía directa
Media
Desviación
Estándar
81
Número
de
Replicas
3
383667
2517
6333333
Coeficiente
de
Variación
0,66
82
3
367000
4583
21000000
1,25
83
3
591333
2082
4333333
84
3
644667
4509
85
3
575667
86
3
87
3
Muestra
Valor
Mínimo
Valor
Máximo
381000
386000
362000
371000
0,35
589000
593000
20333333
0,7
640000
649000
2517
6333333
0,44
573000
578000
528667
3055
9333333
0,58
526000
532000
361333
3215
10333333
0,89
Fuente: Autor
359000
365000
Varianza
La dispersión de un conjunto de observaciones se refiere a la variedad que muestran
estas. Una medida de dispersión conlleva información respecto a la cantidad total de
variabilidad presente en el conjunto de datos. Si todos los valores son iguales, no hay
dispersión en los datos, la magnitud de la dispersión es pequeña cuando los valores,
aunque diferentes, son cercanos entre sí (Padilla, 2007).
Según los datos observados desde la tabla 3 a la 10, se evidencia una dispersión
mínima entre ellos, ya que las réplicas para cada una de las muestras en el ensayo de
repetibilidad para el método de microscopia directa, se encuentran dentro de un rango
similar, lo que permite ver la homogeneidad de los datos obtenidos entre repeticiones
de una misma prueba con una misma muestra. Cabe resaltar que en este caso, las
mediciones de repetibilidad se hacen y evalúan por cada muestra, ya que no se espera
que las muestras analizadas tengan entre ellas recuentos de células somáticas
76
similares, pues cada una proviene de hatos diferentes y esto no es relevante para la
validación.
6.3.1.1.2. Ensayo de repetibilidad dentro del método de microscopía directa
(prueba de hipótesis)
Para hacer la prueba de hipótesis en el ensayo de repetibilidad dentro del método de
microscopía directa, se realizó un estudio de pruebas pareadas entre las tres réplicas
de las 87 muestras analizadas, Se estableció una comparación de diferencia de medias
entre los grupos de las réplicas de cada una de las muestras, las cuales son
independientes entre sí. El nivel de confianza establecido para estas pruebas fue del
99%. Por medio de las siguientes tablas y figuras se podrán observar los resultados
obtenidos.
Tabla 11. Resultados de pruebas pareadas para las réplicas 1 y 2 del método de microscopía directa
NÚMERO
MEDIA
DESVIACIÓN
DE
Células/mL
ESTÁNDAR
MUESTRAS
RÉPLICA 1
87
561046
466041
RÉPLICA 2
87
560839
465857
DIFERENCIA
87
207
4573
Fuente: Autor
Tabla 12. Resultados de pruebas pareadas para las réplicas 2 y 3 del método de microscopía directa
NÚMERO
MEDIA
DESVIACIÓN
DE
Células/mL
ESTÁNDAR
MUESTRAS
RÉPLICA 2
87
560839
465857
RÉPLICA 3
87
555667
471960
DIFERENCIA
87
5172
142711
77
Tabla 13. Resultados de intervalos de confianza y pruebas T para las réplicas 1 y 2 del método de
microscopía directa
(-1085. 1498)
INTERVALOS DE
CONFIANZA
T-VALUE
0,42
P-VALUE
0,674
Fuente: Autor
Tabla 14. Resultados de intervalos de confianza y pruebas T para las réplicas 2 y 3 del método de
microscopía directa
(-35132. 45476)
INTERVALOS DE
CONFIANZA
T-VALUE
0,34
P-VALUE
0,736
Fuente: Autor
A continuación se observarán las figuras que ilustran el rechazo o no de las hipótesis
planteadas para evaluar la repetibilidad dentro del método de microscopia directa:
Histogram of Differences
(with Ho and 99% t-confidence interval for the mean)
25
Frequency
20
15
10
5
0
_
X
Ho
-10000
-5000
0
5000
10000
Differences
15000
20000
25000
Figura 2. Prueba de hipótesis para evaluación de repetibilidad entre réplicas 1 y 2 del método de
microscopia directa
78
His togr a m of D iffe r e nc e s
(w ith Ho a nd 99% t-confide nce inte rva l fo r the m e a n)
80
Frequency
60
40
20
0
_
X
Ho
-40 0000
0
400000
Diffe r e nc e s
8 00000
1 200000
Figura 3. Prueba de hipótesis para evaluación de repetibilidad entre réplicas 2 y 3 del método de
microscopia directa
Las hipótesis planteadas para evaluar la repetibilidad dentro del método de
microscopía directa fueron:
Para poder probar estas hipótesis se deben observar las tablas 13 y 14, y las figuras 2
y 3, donde los intervalos de confianza obtenidos para las réplicas 1 y 2 fueron (--1085
a 1498), y para las réplicas 2 y 3 fueron (-35132. 45476), es posible notar que el cero
cae dentro de estos intervalos, por lo tanto se puede afirmar que la hipótesis nula
(Ho), no se rechaza. Además, no se evidencia una diferencia estadística significativa
entre los promedios (Media) por réplicas, dado que la probabilidad de equivocarse
rechazando la hipótesis nula, es del 67.4% (P-Value) para las réplicas 1 y 2, y del
73.6% (P-Value) para las réplicas 2 y 3. Debido a este alto porcentaje de equivocarse,
no se rechaza la hipótesis nula (Ho), lo que indica que no hay diferencia estadística
entre las Medias de cada una de las réplicas, en el método de microscopia directa,
afirmando de esta manera que el proceso si es repetible.
Esta repetibilidad también se prueba gracias al nivel de confianza establecido (99%;
α=0,01), pues tampoco se encuentra suficiente evidencia estadística para rechazar la
79
hipótesis nula (Ho), debido a que el T-value, tanto en las réplicas 1 y 2 (0,42), como
en las réplicas 2 y 3 (0,34) es menor al cuantil de alfa (α), el cual tiene un valor de 2,8
(Risk, 2003).
6.3.1.1.3. Ensayo de repetibilidad dentro del método de equipo DCC DeLaval
(análisis de parámetros estadísticos)
En el ensayo de repetibilidad con el método de equipo DCC DeLaval se determinaron
los parámetros estadísticos de valor medio o central, desviación estándar, varianza,
coeficiente de variación, valor mínimo y valor máximo. Se hicieron tres
determinaciones (réplicas) por cada una de las muestras analizadas. Los resultados
fueron los siguientes:
- Determinaciones del día 1
Tabla 15. Análisis de desviación estándar, varianza, coeficiente de variación y valores mínimos y
máximos de la prueba de repetibilidad con el ensayo del Equipo DCC DeLaval
Número
Muestra
de
Replicas
1
2
3
4
5
6
7
8
3
3
3
3
3
3
3
3
Media
362333
487333
909000
247333
451333
920000
521000
838333
Coeficiente
de
Valor
Valor
Variación Mínimo Máximo
(%)
1155
1333333
0,32
361000 363000
577
333333
0,12
487000 488000
1000
1000000
0,11
908000 910000
577
333333
0,23
247000 248000
577
333333
0,13
451000 452000
0
0
0
920000 920000
1000
1000000
0,19
520000 522000
577
333333
0,07
838000 839000
Fuente: Autor
Desviación
Varianza
Estándar
80
Determinaciones del día 2
Tabla 16. Análisis de desviación estándar, varianza, coeficiente de variación y valores mínimos y
máximos de la prueba de repetibilidad con el ensayo del Equipo DCC DeLaval
Muestra
Número
de
Replicas
Media
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
395000
524667
105333
228000
405000
72667
1003000
297667
864667
335000
1159333
277667
377000
Desviación
Varianza
Estándar
2000
4000000
1528
2333333
577
333333
1000
1000000
1000
1000000
577
333333
1732
3000000
1528
2333333
1528
2333333
1000
1000000
1528
2333333
577
333333
1000
1000000
Fuente: Autor
Coeficiente
de
Valor
Variación Mínimo
(%)
0,51
393000
0,29
523000
0,55
105000
0,44
227000
0,25
404000
0,79
72000
0,17
1002000
0,51
296000
0,18
863000
0,3
334000
0,13
1158000
0,21
277000
0,27
376000
Valor
Máximo
397000
526000
106000
229000
406000
73000
1005000
299000
866000
336000
1161000
278000
378000
Determinaciones del día 3
Tabla 17. Análisis de desviación estándar, varianza, coeficiente de variación y valores mínimos y
máximos de la prueba de repetibilidad con el ensayo del Equipo DCC DeLaval
Muestra
Número
de
Replicas
Media
22
23
24
25
26
27
28
29
3
3
3
3
3
3
3
3
887667
88667
243000
164333
586333
321000
366333
1070000
Desviación
Varianza
Estándar
1528
577
2000
1528
1528
1000
1528
1000
2333333
333333
4000000
2333333
2333333
1000000
2333333
1000000
Coeficiente
de
Variación
(%)
0,17
0,65
0,82
0,93
0,26
0,31
0,42
0,09
Valor
Mínimo
Valor
Máximo
886000
88000
241000
163000
585000
320000
365000
1069000
889000
89000
245000
166000
588000
322000
368000
1071000
81
30
31
3
3
296333
939667
1528
2333333
1528
2333333
Fuente: Autor
0,52
0,16
295000
938000
298000
941000
Determinaciones del día 4
Tabla 18. Análisis de desviación estándar, varianza, coeficiente de variación y valores mínimos y
máximos de la prueba de repetibilidad con el ensayo del Equipo DCC DeLaval
Muestra
Número
de
Replicas
Media
32
33
34
35
36
37
3
3
3
3
3
3
863667
448000
901000
234333
383333
353333
Desviación
Varianza
Estándar
1155
1333333
1000
1000000
1000
1000000
577
333333
1528
2333333
2082
4333333
Fuente: Autor
Coeficiente
de
Variación
(%)
0,13
0,22
0,11
0,25
0,4
0,59
Valor
Mínimo
Valor
Máximo
863000
447000
900000
234000
382000
351000
865000
449000
902000
235000
385000
355000
Determinaciones del día 5
Tabla 19. Análisis de desviación estándar, varianza, coeficiente de variación y valores mínimos y máximos de la
prueba de repetibilidad con el ensayo del Equipo DCC DeLaval
Número
Muestra
de
Replicas
38
39
40
41
42
43
44
45
46
47
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
Media
Desviación
Estándar
437000
823000
599000
759667
779667
305000
900000
2022667
334667
440000
1732
2000
1000
1528
577
1000
1000
3215
1528
1000
Coeficiente
de
Valor
Varianza
Variación Mínimo
(%)
3000000
0,4
436000
4000000
0,24
821000
1000000
0,17
598000
2333333
0,2
758000
333333
0,07
779000
1000000
0,33
304000
1000000
0,11
899000
10333333
0,16
2019000
2333333
0,46
333000
1000000
0,22
439000
Valor
Máximo
439000
825000
600000
761000
780000
306000
901000
2025000
336000
441000
82
48
49
3
3
3980333
618000
2082
4333333
1000
1000000
Fuente: Autor
0,05
0,16
3978000
617000
3982000
619000
Determinaciones del día 6
Tabla 20. Análisis de desviación estándar, varianza, coeficiente de variación y valores mínimos y
máximos de la prueba de repetibilidad con el ensayo del Equipo DCC DeLaval
Coeficiente
de
Variación
(%)
Valor
Mínimo
Valor
Máximo
4333333
0,73
285000
289000
1000
1000000
0,17
589000
591000
2517
6333333
0,47
529000
534000
996333
1528
2333333
0,15
995000
998000
518333
1528
2333333
Fuente: Autor
0,29
517000
520000
Muestra
Número
de
Replicas
Media
50
3
286667
2082
51
3
590000
52
3
531333
53
3
54
3
Desviación
Varianza
Estándar
Determinaciones del día 7
Tabla 21. Análisis de desviación estándar, varianza, coeficiente de variación y valores mínimos y
máximos de la prueba de repetibilidad con el ensayo del Equipo DCC DeLaval
Muestra
Número
de
Replicas
Media
55
3
352667
2082
4333333
Coeficiente
de
Variación
(%)
0,59
56
3
386667
1528
2333333
57
3
360667
577
58
3
446333
59
3
60
Desviación
Varianza
Estándar
Valor
Mínimo
Valor
Máximo
351000
355000
0,4
385000
388000
333333
0,16
360000
361000
1528
2333333
0,34
445000
448000
386333
1528
2333333
0,4
385000
388000
3
432333
2517
6333333
0,58
430000
435000
61
3
543000
2000
4000000
0,37
541000
545000
62
3
392000
2646
7000000
0,67
390000
395000
63
3
494333
2082
4333333
0,42
492000
496000
64
3
287000
1000
1000000
0,35
286000
288000
83
65
3
465333
3512
12333333
0,75
462000
469000
66
3
354667
1528
2333333
0,43
353000
356000
67
3
443000
2000
4000000
0,45
441000
445000
68
3
801000
1000
1000000
0,12
800000
802000
69
3
406667
2082
4333333
0,51
405000
409000
70
3
380000
2000
4000000
0,53
378000
382000
71
3
352333
2517
6333333
0,71
350000
355000
72
3
341333
577
333333
0,17
341000
342000
73
3
325000
1000
1000000
0,31
324000
326000
74
3
1333667
2082
4333333
0,16
1332000
1336000
75
3
353000
3000
9000000
0,85
350000
356000
76
3
385000
3000
9000000
0,78
382000
388000
77
3
396667
1155
1333333
0,29
396000
398000
78
3
384667
1155
1333333
0,3
384000
386000
79
3
481333
3215
10333333
0,67
479000
485000
80
3
342667
2082
4333333
Fuente: Autor
0,61
341000
345000
Determinaciones del día 8
Tabla 22. Análisis de desviación estándar, varianza, coeficiente de variación y valores mínimos y
máximos de la prueba de repetibilidad con el ensayo del Equipo DCC DeLaval
Muestra
Número
de
Replicas
Media
81
82
83
84
85
86
3
3
3
3
3
3
366667
341667
563667
603333
548000
527667
1528
2082
2082
1528
1732
1528
87
3
363667
1528
2333333
Fuente: Autor
Desviación
Varianza
Estándar
2333333
4333333
4333333
2333333
3000000
2333333
Coeficiente
de
Variación
(%)
0,42
0,61
0,37
0,25
0,32
0,29
0,42
Valor
Mínimo
Valor
Máximo
365000
340000
562000
602000
546000
526000
368000
344000
566000
605000
549000
529000
362000
365000
84
Al igual que con el método de microscopio, los resultados arrojados con el equipo
DCC DeLaval, se demuestra en las tablas 15 a 22, que la dispersión de los datos
obtenidos en estas lecturas de cada una de las réplicas, también es mínima, ya que se
encuentran dentro de un rango similar y por ende se asume que los datos arrojados
por cada una de las muestras son homogéneos. También en este caso, las mediciones
de repetibilidad se hacen y evalúan por cada muestra, pues tampoco por este método
se espera que las muestras analizadas tengan entre ellas recuentos de células
somáticas similares, pues cada una proviene de hatos diferentes y esto no es relevante
para la validación.
6.3.1.1.4. Ensayo de repetibilidad dentro del método de equipo DCC DeLaval
(prueba de hipótesis)
Para hacer la prueba de hipótesis en el ensayo de repetibilidad dentro del método de
equipo DCC DeLaval, se realizó también un estudio de pruebas pareadas entre las
tres réplicas de las 87 muestras analizadas, Se estableció una comparación de
diferencia de medias entre los grupos de las réplicas de cada una de las muestras, las
cuales son independientes entre sí. El nivel de confianza establecido para estas
pruebas fue del 99%. Por medio de las siguientes tablas y figuras se podrán observar
los resultados obtenidos.
Tabla 23. Resultados de pruebas pareadas para las réplicas 1 y 2 del método de Equipo DCC DeLaval
NÚMERO
MEDIA
DESVIACIÓN
DE
Células/mL
ESTÁNDAR
MUESTRAS
RÉPLICA 1
87
560644
477265
RÉPLICA 2
87
561069
476738
DIFERENCIA
87
425
1951
Fuente: Autor
85
Tabla 24. Resultados de pruebas pareadas para las réplicas 2 y 3 del método de Equipo DCC DeLaval
NÚMERO
MEDIA
DESVIACIÓN
DE
Células/mL
ESTÁNDAR
MUESTRAS
RÉPLICA 2
87
561069
476738
RÉPLICA 3
87
560333
477324
DIFERENCIA
87
736
5248
Fuente: Autor
Tabla 25. Resultados de intervalos de confianza y pruebas T para las réplicas 1 y 2 del método de
Equipo DCC DeLaval
INTERVALOS DE
(-976. 126)
CONFIANZA
T-VALUE
0,03
P-VALUE
0,045
Fuente: Autor
Tabla 26. Resultados de intervalos de confianza y pruebas T para las réplicas 2 y 3 del método de
Equipo DCC DeLaval
INTERVALOS DE
(-747. 2218)
CONFIANZA
T-VALUE
0,131
P-VALUE
0,295
Fuente: Autor
A continuación se observarán las figuras que ilustran el rechazo o no de las hipótesis
planteadas para evaluar la repetibilidad dentro del método de microscopia directa:
86
Histogram of Differences
(with Ho and 99% t-confidence interval for the mean)
25
Frequency
20
15
10
5
_
X
0
Ho
-4000
-2000
0
Differences
2000
4000
Figura 4. Prueba de hipótesis para evaluación de repetibilidad entre réplicas 1 y 2 del método de
Equipo DCC DeLaval
Histogram of Differences
(with Ho and 99% t-confidence interval for the mean)
50
Frequency
40
30
20
10
0
_
X
Ho
0
10000
20000
Differences
30000
40000
Figura 5. Prueba de hipótesis para evaluación de repetibilidad entre réplicas 2 y 3 del método de
Equipo DCC DeLaval
Las hipótesis planteadas para evaluar la repetibilidad dentro del método de Equipo
DCC DeLaval fueron:
87
Para poder probar estas hipótesis se deben observar las tablas 25 y 26 y las figuras 4 y
5, donde los intervalos de confianza obtenidos para las réplicas 1 y 2 fueron (-976 a
126), y para las réplicas 2 y 3 fueron (-747 a 2218), es posible notar que el cero cae
dentro de estos intervalos, por lo tanto se puede afirmar que la hipótesis nula (Ho),
no se rechaza. Además, no se evidencia una diferencia estadística significativa entre
los promedios (Media) por réplicas, dado que la probabilidad de equivocarse
rechazando la hipótesis nula, es del 4,5% (P-Value) para las réplicas 1 y 2, y del
29,5% (P-Value) para las réplicas 2 y 3. Debido a este porcentaje de equivocarse, no
se rechaza la hipótesis nula (Ho), lo que indica que no hay diferencia estadística entre
las Medias de cada una de las réplicas, en el método de Equipo DCC DeLaval,
afirmando de esta manera que el proceso si es repetible. Esta repetibilidad también se
prueba gracias al nivel de confianza establecido (99%; α=0,01), pues tampoco se
encuentra suficiente evidencia estadística para rechazar la hipótesis nula (Ho), debido
a que el T-value, tanto en las réplicas 1 y 2 (0,03), como en las réplicas 2 y 3 (0,131)
es menor al cuantil de alfa (α), el cual tiene un valor de 2,8 (Risk, 2003).
6.3.1.1.5. Ensayo de repetibilidad entre método de microscopia directa y equipo
DCC DeLaval
Para determinar la repetibilidad entre métodos se hicieron dos pruebas, una de ellas
fue un estudio de pruebas pareadas entre los promedios de las tres réplicas obtenidas
por cada uno de los métodos (Microscopia Directa y equipo DCC DeLaval), pues
como ya se había probado que entre cada método había repetibilidad, se buscaba
también probar que entre método y método también la había. El nivel de confianza
establecido para estas pruebas también fue del 99%. Por medio de las siguientes
tablas y figuras se podrán observar los resultados obtenidos:
88
Tabla 27. Resultados de pruebas pareadas para los métodos de Microscopia Directa y Equipo DCC
DeLaval
NÚMERO
MEDIA
DESVIACIÓN
DE
Células/mL
ESTÁNDAR
87
560682
477103
87
559184
463127
87
1498
78425
MUESTRAS
PROMEDIO
EQUIPO
PROMEDIO
MICROSCOPIO
DIFERENCIA
Fuente: Autor
Tabla 28. Resultados de intervalos de confianza y pruebas T para los métodos de Microscopia Directa
y Equipo DCC DeLaval
INTERVALOS
(-20651. 23647)
DE
CONFIANZA
T-VALUE
0,18
P-VALUE
0,859
(85.9%)
Fuente: Autor
A continuación se observa la figura que ilustra el rechazo o no de las hipótesis
planteadas para evaluar la repetibilidad entre métodos:
Histogram of Differences
(w ith Ho and 99% t-confidence interval for the mean)
30
25
Frequency
20
15
10
5
0
_
X
Ho
-400000
-300000
-200000
-100000
0
Differences
100000
200000
Figura 6. Prueba de hipótesis para evaluación de repetibilidad entre Métodos
89
Las hipótesis planteadas para evaluar la repetibilidad entre métodos fueron:
Para poder probar estas hipótesis se deben observar las tablas 27 y 28, y la figura 6,
donde los intervalos de confianza obtenidos para los promedios de los métodos
fueron (-20651 a 23647), es posible notar que el cero cae dentro de estos intervalos,
por lo tanto se puede afirmar que la hipótesis nula (Ho), no se rechaza. Además, no
se evidencia una diferencia estadística significativa entre los promedios (Media) del
método de microscopía directa y el método del Equipo DCC DeLaval, dado que la
probabilidad de equivocarse rechazando la hipótesis nula, es del 85.9% (P-Value).
Debido a este alto porcentaje de equivocarse, no se rechaza la hipótesis nula (Ho), lo
que indica que no hay diferencia estadística entre las Medias de cada uno de las
métodos, afirmando de esta manera que el recuento de células somáticas entre un
método y otro si es repetible. Esta repetibilidad también se prueba gracias al nivel de
confianza establecido (99%; α=0,01), pues tampoco se hay suficiente evidencia
estadística para rechazar la hipótesis nula (Ho), debido a que el T-value, (0,18) es
menor al cuantil de alfa (α), el cual tiene un valor de 2,8 (Risk, 2003).
La otra prueba realizada para determinar si había o no repetibilidad entre los dos
métodos fue la prueba de distribución F, la cual compara varianzas e indica si dos
poblaciones independientes tienen la misma variabilidad y además demuestra si se
distribuyen de forma normal.
Las hipótesis planteadas para esta prueba fueron las siguientes:
90
Estas hipótesis fueron probadas mediante los resultados que se muestran en la
siguiente figura:
Test
for EqualENTRE
Variances
E. MEDIA
ANÁLISIS
DE VARIANZAS
EQUIPOfor
(E) YMEDIA
MICROSCOPIO
(M)
M
F -Test
Test S tatistic
P -Valu e
M EVAR-E
D IA E
1,06
0,783
Lev en e's Test
Test S tatistic
P -Valu e
M EVAR-M
D IA M
400000
450000
500000
550000
9 5 % Bonfer r oni C onfidence Inter vals for StD evs
0,02
0,885
600000
M EVAR-E
D IA E
M EVAR-M
D IA M
0
1000000
2000000
D ata
3000000
4000000
Figura 7. Análisis de varianzas entre los métodos de Equipo y Microscopio
Según la figura 7, no hay evidencia estadísticamente significativa para rechazar la
hipótesis nula (Ho), dado que la probabilidad de equivocarse rechazándola es de
78,3% (P-Value), lo cual indica que no hay variabilidad entre un método y otro, es
decir, se confirma nuevamente que existe repetibilidad entre los métodos (Risk,
2003).
6.3.1.2. Ensayo de reproducibilidad
Para determinar la medida de reproducibilidad entre los métodos, se realizaron
mediciones sucesivas durante tres días, por dos analistas diferentes, usando los
mismos reactivos, los mismos instrumentos e iguales condiciones de medición.
91
6.3.1.2.1. Ensayo de reproducibilidad dentro del método de microscopía directa
(análisis de parámetros estadísticos)
En el ensayo de reproducibilidad con el método de microscopia directa se
determinaron los parámetros estadísticos de valor medio o central, desviación
estándar, varianza y coeficiente de variación. Se analizaron 31 muestras, en un
intervalo de tres días, cada muestra fue medida por dos analistas diferentes, al mismo
tiempo y con los mismos equipos.
Determinaciones del día 1
Tabla 29. Resultados de reproducibilidad entre analistas en el método de Microscopía Directa
Lectura (células/mL)
Muestra
Media
Desviación
Estándar
Varianza
ANALISTA ANALISTA
1
2
Coeficiente
de
Variación
%
1
304000
306000
305000
1414
2000000
0,46
2
416000
420000
418000
2828
8000000
0,68
3
880000
881000
880500
707
500000
0,08
4
208000
206000
207000
1414
2000000
0,68
5
432000
433000
432500
707
500000
0,16
6
960000
956000
958000
2828
8000000
0,30
7
480000
485000
482500
3536
12500000
0,73
8
816000
799000
807500
12021
144500000
1,49
Fuente: Autor
Determinaciones del día 2
Tabla 30. Resultados de reproducibilidad entre analistas en el método de Microscopía Directa
Lectura (células/mL)
Muestra
9
Media
Desviación
Estándar
Varianza
446500
2121
4500000
ANALISTA ANALISTA
1
2
448000
445000
Coeficiente
de
Variación
%
0,48
92
10
528000
519000
523500
6364
40500000
1,22
11
80000
78000
79000
1414
2000000
1,79
12
288000
279000
283500
6364
40500000
2,24
13
368000
365000
366500
2121
4500000
0,58
14
48000
49000
48500
707
500000
1,46
15
1184000
1175000
1179500
6364
40500000
0,54
16
352000
350000
351000
1414
2000000
0,4
17
816000
820000
818000
2828
8000000
0,35
18
384000
389000
386500
3536
12500000
0,91
19
1280000
1296000
1288000
11314
128000000
0,88
20
320000
311000
315500
6364
40500000
2,02
Fuente: Autor
Determinaciones del día 3
Tabla 31. Resultados de reproducibilidad entre analistas en el método de Microscopía Directa
21
336000
342000
339000
4243
18000000
Coeficiente
de
Variación
%
1,25
22
912000
901000
906500
7778
60500000
0,86
23
112000
119000
115500
4950
24500000
4,29
24
304000
309000
306500
3536
12500000
1,15
25
176000
180000
178000
2828
8000000
1,59
26
624000
631000
627500
4950
24500000
0,79
27
368000
359000
363500
6364
40500000
1,75
28
384000
388000
386000
2828
8000000
0,73
29
1104000
1119000
1111500
10607
112500000
0,95
30
224000
229000
226500
3536
12500000
1,56
31
912000
901000
906500
7778
60500000
0,86
Lectura (células/mL)
Muestra ANALISTA ANALISTA
1
2
Media
Desviación
Estándar
Varianza
Fuente: Autor
93
Con estas tablas se puede observar que hay un buen grado de concordancia entre los
resultados de las mediciones de la misma muestra, hechas por dos analistas
diferentes, pues el coeficiente de variación es muy bajo entre las lecturas de un
analista y otro.(Padilla, 2007). En este caso el único cambio que hubo en la medición,
fue el de analistas, debido a que por las condiciones de la prueba, no era posible
cambiar los tiempos de análisis entre una misma muestra, pues como se explicó
anteriormente, la acidez de leche aumenta a medida que pasa el tiempo y esto afecta
la presencia de células somáticas. Tampoco se contaba con equipos diferentes para la
realización de las pruebas.
6.3.1.2.2. Ensayo de reproducibilidad dentro del método de microscopía directa
(prueba de hipótesis)
Para hacer la prueba de hipótesis en el ensayo de reproducibilidad dentro del método
de microscopía directa, se realizó un estudio de pruebas pareadas entre los resultados
obtenidos por el analista 1 y el analista 2, de las 31 muestras analizadas. Se estableció
una comparación de diferencia de medias entre las lecturas hechas por cada analista
para cada una de las muestras, las cuales son independientes entre sí. El nivel de
confianza establecido para estas pruebas fue del 99%. A continuación se muestran los
resultados obtenidos:
Tabla 32. Resultados de pruebas pareadas entre analistas por el método de microscopía directa
NÚMERO
MEDIA
DESVIACIÓN
DE
Células/mL
ESTÁNDAR
MUESTRAS
ANALISTA 1
31
517677
337635
ANALISTA 2
31
517419
337599
DIFERENCIA
31
258
7672
Fuente: Autor
94
Tabla 33. Resultados de intervalos de confianza y pruebas T para los analistas 1 y 2 en el método de
microscopía directa
(-3531. 4048)
INTERVALOS DE
CONFIANZA
T-VALUE
0,19
P-VALUE
0,835
Fuente: Autor
A continuación se muestra una figura que ilustra el rechazo o no de las hipótesis
planteadas para evaluar la reproducibilidad dentro del método de microscopia directa:
Histogram of Differences
(w ith Ho and 99% t-confidence interval for the m ean)
12
10
Frequency
8
6
4
2
_
X
0
Ho
-15000
-10000
-5000
0
Differences
5000
10000
15000
Figura 8. Prueba de hipótesis para evaluación de reproducibilidad entre analistas en el Método de
Microscopia Directa
Las hipótesis planteadas para evaluar la reproducibilidad entre analistas para el
método de microscopia directa fueron:
Para poder probar estas hipótesis se debe observar la tabla 32 y la figura 8, donde los
intervalos de confianza obtenidos para los promedios de los analistas fueron (de -
95
3531 a 4048), es posible notar que el cero cae dentro de estos intervalos, por lo tanto
se puede afirmar que la hipótesis nula (Ho), no se rechaza. Además, no se evidencia
una diferencia estadística significativa entre los analistas, dado que la probabilidad de
equivocarse rechazando la hipótesis nula, es del 83,5% (P-Value), debido a este alto
porcentaje no se rechaza la hipótesis nula, afirmando de esta manera, que no hay
diferencia estadística entre los resultados obtenidos por un analista y otro y esto
indica que el proceso si es reproducible (Risk, 2003). Esta reproducibilidad también
se prueba gracias al nivel de confianza establecido (99%; α=0,01), pues tampoco se
encuentra suficiente evidencia estadística para rechazar la hipótesis nula (Ho), debido
a que el T-value (0,19) es menor al cuantil de alfa (α), el cual tiene un valor de 2,8.
La otra prueba realizada para determinar si había o no reproducibilidad entre los
analistas en el método de microscopio fue la prueba de distribución F, la cual
compara varianzas e indica si dos poblaciones independientes tienen la misma
variabilidad y además demuestra si se distribuyen de forma normal.
Las hipótesis planteadas para esta prueba fueron las siguientes:
Estas hipótesis fueron probadas mediante los resultados que se muestran en la
siguiente figura:
96
ANÁLISIS
DE VARIANZAS
ENTRE
ANALISTAS
Test for Equal
Variances
for AN ALIS
TA
1 M. AN ALIS TA 2 M
F -Test
Test S tatistic
P -Valu e
A NA LIS
A.1TA 1 M
1,00
1,000
Lev en e's Test
Test S tatistic
P -Valu e
A NA LIS
A.2TA 2 M
250000
300000
350000
400000
450000
9 5 % Bonfer r oni C onfidence Inter vals for StD evs
0,00
0,996
500000
A.1TA 1 M
A NA LIS
A NA LIS TA 2 M
A.2
0
200000
400000
600000
800000
D ata
1000000
1200000
1400000
Figura 9. Análisis de varianzas entre analistas dentro del método de microscopio
Según la figura 9, no hay evidencia estadísticamente significativa para rechazar la
hipótesis nula (Ho), dado que la probabilidad de equivocarse rechazándola es del
100% (P-Value), lo cual indica que no hay variabilidad entre un analista y otro, es
decir, se confirma nuevamente que existe reproducibilidad entre analistas dentro del
método de microscopía directa (Risk, 2003).
6.3.1.2.3. Ensayo de reproducibilidad dentro del método de Equipo DCC
DeLaval (análisis de parámetros estadísticos)
En el ensayo de reproducibilidad con el método de equipo DCC DeLaval se
determinaron los parámetros estadísticos de valor medio o central, desviación
estándar, varianza y coeficiente de variación. Se analizaron 31 muestras, en un
intervalo de tres días, cada muestra fue medida por dos analistas diferentes, al mismo
tiempo y con los mismos instrumentos.
97
Determinaciones del día 1
Tabla 34. Resultados de reproducibilidad entre analistas en el método de Equipo DCC DeLaval
1
363000
361000
362000
1414
2000000
Coeficiente
de
Variación
%
0,39
2
487000
485000
486000
1414
2000000
0,29
3
909000
906000
907500
2121
4500000
0,23
4
247000
245000
246000
1414
2000000
0,57
5
451000
455000
453000
2828
8000000
0,62
6
920000
925000
922500
3536
12500000
0,38
7
522000
526000
524000
2828
8000000
0,54
8
839000
842000
840500
2121
4500000
0,25
Lectura (células/mL)
Muestra ANALISTA ANALISTA
1
2
Media
Desviación Varianza
Estándar
Fuente: Autor
Determinaciones del día 2
Tabla 35. Resultados de reproducibilidad entre analistas en el método de Equipo DCC DeLaval
9
397000
399000
398000
1414
2000000
Coeficiente
de
Variación
%
0,36
10
11
523000
526000
524500
2121
4500000
0,40
105000
106000
105500
707
500000
0,67
12
228000
229000
228500
707
500000
0,31
13
405000
408000
406500
2121
4500000
0,52
14
73000
72000
72500
707
500000
0,98
15
1002000
1010000
1006000
5657
32000000
0,56
16
299000
295000
297000
2828
8000000
0,95
17
863000
859000
861000
2828
8000000
0,33
18
334000
336000
335000
1414
2000000
0,42
19
1159000
1163000
1161000
2828
8000000
0,24
20
278000
281000
2121
4500000
0,76
Lectura (células/mL)
Muestra
ANALISTA ANALISTA
1
2
Media
279500
Fuente: Autor
Desviación Varianza
Estándar
98
Determinaciones del día 3
Tabla 36. Resultados de reproducibilidad entre analistas en el método de Equipo DCC DeLaval
Muestra
ANALISTA
1
ANALISTA
2
21
376000
379000
377500
2121
4500000
Coeficiente
de
Variación
%
0,56
22
886000
889000
887500
2121
4500000
0,24
23
89000
87000
88000
1414
2000000
1,61
24
241000
245000
243000
2828
8000000
1,16
25
164000
167000
165500
2121
4500000
1,28
26
586000
588000
587000
1414
2000000
0,24
27
322000
319000
320500
2121
4500000
0,66
28
366000
362000
364000
2828
8000000
0,78
29
1070000
1090000
1080000
14142
200000000
1,31
30
295000
298000
296500
2121
4500000
0,72
31
940000
945000
942500
3536
12500000
0,38
Lectura (células/mL)
Media
Desviación
Estándar
Varianza
Fuente: Autor
Con estas tablas se puede observar, igual que con el método de microscopia directa,
que hay un buen grado de concordancia entre los resultados de las mediciones de una
misma muestra, hechas por dos analistas diferentes, pues el coeficiente de variación
es muy bajo entre las lecturas de un analista u otro (Padilla, 2007). También para este
caso el único cambio que hubo en la medición, fue el de analistas, debido a que por
las condiciones de la prueba, no era posible cambiar los tiempos de análisis entre una
misma muestra, pues como se explicó anteriormente, la acidez de leche aumenta a
medida que pasa el tiempo y esto afecta la presencia de células somáticas. Tampoco
se contaba con equipos diferentes para la realización de las pruebas.
99
6.3.1.2.4. Ensayo de reproducibilidad dentro del método de Equipo DCC
DeLaval (prueba de hipótesis)
Para hacer la prueba de hipótesis en el ensayo de reproducibilidad dentro del método
de equipo DCC DeLaval, se realizó un estudio de pruebas pareadas entre los
resultados obtenidos por el analista 1 y el analista 2, de las 31 muestras analizadas. Se
estableció una comparación de diferencia de medias entre las lecturas hechas por cada
analista para cada una de las muestras, las cuales son independientes entre sí. El nivel
de confianza establecido para estas pruebas fue del 99%. A continuación se muestran
los resultados obtenidos:
Tabla 37. Resultados de pruebas pareadas entre analistas por el método de Equipo DCC DeLaval
NÚMERO
MEDIA
DESVIACIÓN
DE
Células/mL
ESTÁNDAR
MUESTRAS
ANALISTA 1
31
507710
318393
ANALISTA 2
31
507290
315754
DIFERENCIA
31
419
11381
Fuente: Autor
Tabla 38. Resultados de intervalos de confianza y pruebas T para los analistas 1 y 2 en el método de
Equipo DCC DeLaval
INTERVALOS DE
(-5202. 6040)
CONFIANZA
T-VALUE
0,21
P-VALUE
0,839
Fuente: Autor
100
A continuación se muestra una figura que ilustra el rechazo o no de las hipótesis
planteadas para evaluar la reproducibilidad dentro del método de equipo DCC
DeLaval:
Histogram of Differences
(with Ho and 99% t-confidence interval for the mean)
30
25
Frequency
20
15
10
5
0
_
X
Ho
-10000
0
10000
20000
30000
Differences
40000
50000
60000
Figura 10. Prueba de hipótesis para evaluación de reproducibilidad entre analistas en el Método de
Equipo DCC DeLaval
Las hipótesis planteadas para evaluar la reproducibilidad entre analistas para el
método de equipo DCC DeLaval fueron:
Para poder probar estas hipótesis se debe observar la tabla 37 y la figura 10, donde los
intervalos de confianza obtenidos para los promedios de los analistas fueron (de 5202. 6040), es posible notar que el cero cae dentro de estos intervalos, por lo tanto se
puede afirmar que la hipótesis nula (Ho), no se rechaza. Además, no se evidencia una
diferencia estadística significativa entre los analistas, dado que la probabilidad de
equivocarse rechazando la hipótesis nula, es del 83,9% (P-Value), debido a este alto
101
porcentaje no se rechaza la hipótesis nula, afirmando de esta manera, que no hay
diferencia estadística entre los resultados obtenidos por un analista y otro dentro del
método de Equipo DCC DeLaval y esto indica que el proceso si es reproducible
(Risk, 2003). Esta reproducibilidad también se prueba gracias al nivel de confianza
establecido (99%; α=0,01), pues tampoco se encuentra suficiente evidencia
estadística para rechazar la hipótesis nula (Ho), debido a que el T-value (0,21) es
menor al cuantil de alfa (α), el cual tiene un valor de 2,8.
La otra prueba realizada para determinar si había o no reproducibilidad entre analistas
en el método de equipo fue la prueba de distribución F, la cual compara varianzas e
indica si dos poblaciones independientes tienen la misma variabilidad y además
demuestra si se distribuyen de forma normal.
Las hipótesis planteadas para esta prueba fueron las siguientes:
Estas hipótesis fueron probadas mediante los resultados que se muestran en la
siguiente figura:
102
ANÁLISIS
DE VARIANZAS
ANALISTAS
Test for Equal
Variances
for ANENTRE
ALIS TA
1 E. AN ALIS TA 2 E
F -Test
Test S tatistic
P -Valu e
A N A LIS
A.1TA 1 E
1,02
0,964
Lev en e's Test
Test S tatistic
P -Valu e
A N A LIS
A.2TA 2 E
250000
300000
350000
400000
9 5 % Bonfer r oni C onfidence Inter vals for StD evs
0,00
0,985
450000
A N A LIS
A.1TA 1 E
A N A LIS
A.2TA 2 E
0
200000
400000
600000
D ata
800000
1000000
1200000
Figura 11. Análisis de varianzas entre analistas dentro del método de equipo
Según la figura 11, no hay evidencia estadísticamente significativa para rechazar la
hipótesis nula (Ho), dado que la probabilidad de equivocarse rechazándola es del
96,4% (P-Value), lo cual indica que no hay variabilidad entre un analista y otro, es
decir, se confirma nuevamente que existe reproducibilidad entre analistas dentro del
método de Equipo DCC DeLaval (Risk, 2003).
6.3.2. Ensayo de exactitud
La exactitud para esta validación se puntualizó como los valores aceptados de
referencia dentro de una definición de veracidad, la cual se obtuvo solamente con los
resultados logrados con el método de referencia (Microscopía directa) y muestras
idénticas. Así las desviaciones que se obtuvieron con el método alterno (Equipo DCC
DeLaval) corresponden a la exactitud para la validación de este método. Para esto se
plantearon dos hipótesis, una alterna (Ha) y una nula (Ho):
103
Estas hipótesis se analizaron mediante una tabla de t Student, por medio de una
prueba pareada, con una confiabilidad del 99%. Los resultados fueron los siguientes:
Tabla 39. Resultados de pruebas pareadas para la medición de exactitud
NÚMERO
MEDIA
DESVIACIÓN
DE
Células/mL
ESTÁNDAR
87
559184
463127
87
560682
477103
87
1498
78425
MUESTRAS
PROMEDIO
MICROSCOPIO
PROMEDIO
EQUIPO
DIFERENCIA
Fuente: Autor
Tabla 40. Resultados de intervalos de confianza y pruebas T para la medición de exactitud
INTERVALOS DE
(-23647. 20651)
CONFIANZA
T-VALUE
0,18
P-VALUE
0,859
Fuente: Autor
A continuación se muestra una figura donde también se ilustra el rechazo o no de las
hipótesis planteadas para evaluar la exactitud del método alterno con respecto al
método de referencia:
104
Histogram of Differences
(w ith Ho and 99% t-confidence interval for the m ean)
30
25
Frequency
20
15
10
5
0
_
X
Ho
-200000
-100000
0
100000
Differences
200000
300000
400000
Figura 12. Prueba de hipótesis para evaluación de exactitud
Por medio de la tabla 38, donde los intervalos de confianza obtenidos para los
promedios de cada uno de los métodos (alterno y referencia) fueron (de -23647a
20651), es posible notar que el cero cae dentro de estos intervalos, por lo tanto se
puede afirmar que la hipótesis nula (Ho), no se rechaza. Además, no se evidencia una
diferencia estadística significativa entre la media del método de referencia y la del
método alterno, dado que la probabilidad de equivocarse rechazando la hipótesis nula,
es del 85,9% (P-Value). Debido a este alto porcentaje, no se rechaza la hipótesis nula,
afirmando de esta manera, que no hay diferencia estadística que indique que no hay
exactitud entre el método alterno y el método de referencia. Esta exactitud también se
prueba gracias al nivel de confianza establecido (99%; α=0,01), pues tampoco se
encuentra suficiente evidencia estadística para rechazar la hipótesis nula (Ho), debido
a que el T-value (0,18) es menor al cuantil de alfa (α), el cual tiene un valor de 2,8
(Risk, 2003).
105
7. CONCLUSIONES
•
La evaluación de repetibilidad tanto en la técnica de recuento por microscopia
directa, como la técnica del equipo DCC DeLaval para el conteo de células
somáticas, arrojó coeficientes de variación con altos grados de concordancia,
lo que significa que existe repetibilidad entre cada una de las técnicas.
•
La evaluación de repetibilidad entre las dos técnicas (recuento por
microscopia directa y equipo DCC DeLaval) para el conteo de células
somáticas, también arrojó altos grados de concordancia, lo que significa que
entre estas dos técnicas existe una variación menor al 5%.
•
La evaluación de reproducibilidad tanto en la técnica de recuento por
microscopia directa, como la técnica del equipo DCC DeLaval para el conteo
de células somáticas, arrojó coeficientes de variación con altos grados de
concordancia, lo que significa que existe reproducibilidad entre analistas para
cada una de las técnicas.
•
Se comprobó que el método alterno (Equipo DCC DeLaval) no carece de
exactitud frente al método de referencia, ya que no se rechazó la hipótesis
nula (Ho), la cual indicaba que no había diferencia entre estos dos métodos.
•
Fue posible estandarizar y validar la técnica de recuento de células somáticas
por medio del equipo DCC DeLaval (método alterno) frente a la técnica de
microscopía directa (método de referencia) en la empresa La Alquería S.A.,
ya que por medio del análisis estadístico se pudo evidenciar que hay un alto
grado de concordancia entre estas técnicas y los resultados que arrija cada una
son equivalentes.
RECOMENDACIÓN
Se recomienda a la empresa Alquería el uso del método validado (RECUENTO DE
CÉLULAS SOMÁTICAS MEDIANTE EL EQUIPO DCC DeLaval), debido a la cantidad
de muestras de leche que llegan diariamente a la empresa para su análisis, pues con este
método la lectura será mucho más rápida y los resultados serán verídicos. De esta manera la
cantidad de muestras analizadas en un tiempo determinado será mayor a las analizadas
mediante el Método de Microscopía Directa.
107
9. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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