Curso Teórico Práctico Transformación genética: Nuevos conceptos

 Curso Teórico Práctico
Transformación genética: Nuevos conceptos y herramientas
Curso dirigido por Rodrigo Caroca, PhD. Instituto Max Planck, Alemania
Agenda Programada
Quito, 29 junio al 5 julio 2015
Lunes 29 de junio
8:30- 9:00
Inscripción de participantes
9:00- 13:00 Transformación nuclear I
9:00 – 9:15
Introducción al curso. Presentación de objetivos y actividades
9:15-11:00
-­‐ Utilidad de la transformación genética de plantas (Sobreexpresión y silenciamiento de genes, knock out, identificación
de promotores, localización sub-celular de proteínas).
-­‐
Transformación genética mediada por Agrobacterium
tumefaciens: historia, mecanismos moleculares, protocolos de
transformación.
11:00-11:20
11:20-13:00
Coffee break
-­‐ Diseño de vectores para transformación con Agrobacterium.
Descripción de distintos tipos de vectores, selección de
promotores (constitutivos, tejido-específicos, inducibles),
optimización de secuencias, clonación molecular.
-­‐ Vectores binarios compatibles con el sistema de clonación
Gateway. Cómo funciona y vectores disponibles.
13:00-14:30
Almuerzo
14:30- 17:00 Práctica I Diseño y construcción de vectores para transformación
genética de plantas
Temas
Bioinformática y presentación de los pasos previos a la transformación
genética de plantas
Actividades
-­‐ Uso de herramientas bioinformáticas para análisis de
secuencias.
-­‐ Identificación de sitios de restricción y recombinación
homóloga, clonamiento in silico.
-­‐ Diferentes tipos de clonamiento molecular.
Martes 30 de junio
9:00- 13:00 Transformación nuclear II
9:00-11:00
Transformación por biobalística:
-­‐ Fundamentos teóricos y mecanismos moleculares
-­‐ Diseño de vectores para transformación con biobalística
-­‐ Procedimientos para llevar a cabo transformación
Transformación múltiple:
-­‐ Modificación de varios caracteres en un sólo evento de
transformación
Ventajas, desventajas respecto a Agrobacterium tumefaciens
11:00-11:20
11:20-13:00
Actividad 1
13:00-14:30
Coffee break
Transformación transiente:
-­‐ Utilidad, métodos de transformación, ventajas y desventajas
respecto a la transformación estable
Magnifection, una herramienta para obtener niveles muy elevados de
proteínas recombinantes en plantas
Definir un mini-proyecto para generar una planta transgénica.
Objetivo, especie, método de transformación, etc.
Almuerzo
14:30- 17:00 Práctica II Introducción estable y transitoria de ADN en células
vegetales
Temas
Transformación genética, agroinflitración, Agrobacterium, gen
reportero GUS
Actividades
-­‐ Llevar a cabo transformación de explantes de tomate de árbol.
-­‐ Agroinfiltración de hojas de tabaco con un vector que contenga
el gen GUS.
Miércoles 1 de julio
9:00- 13:00 Transformación genética de plastidios
9:00-11:00
-­‐ El genoma del cloroplasto y expresión génica dentro de este
organelo.
-­‐ Diseño de vectores para transformación de cloroplastos
(regiones homólogas, regiones regulatorias de la expresión
génica, optimización de codones).
11:00-11:20 Coffee break
11:20-13:00
-­‐ Métodos de transformación del genoma del cloroplasto.
-­‐ Ventajas y desventajas respecto a transformación nuclear.
Actividad 2 Avanzar en los proyectos de generación de plantas transgénicas.
13:00-14:30 Almuerzo
14:30- 17:00 Práctica III Detección de transgenes expresados en plantas
genéticamente modificadas
Temas
Identificación de plantas transgénicas, transcripción reversa, PCR en
tiempo real, análisis de expresión del gen GUS.
Actividades
-­‐ Usando ADN genómico extraído de tomate de árbol como
molde, se llevará a cabo una PCR convencional para detectar
si el material analizado está modificado genéticamente.
-­‐ Usando mRNA previamente aislado se realizará una reacción
de transcripción reversa con primers poliT. El cDNA sintetizado
se usará como molde para llevar a cabo una reacción de qPCR
para detección de la expresión del gen GUS.
Jueves 2 de julio
9:00- 13:00 Plantas transgénicas y su impacto en la agricultura
9:00-11:00
-­‐ Ejemplos concretos de plantas transgénicas disponibles
comercialmente.
-­‐ Impacto comercial y ambiental.
-­‐ Eliminación de los marcadores de selección y estrategias para
evitar dispersión de transgenes.
11:00-11:20 Coffee break
11:20-13:00 Finalización de los proyectos de transformación y discusión de los
Actividad 3 contenidos del curso.
13:00-14:30 Almuerzo
14:30- 17:00 Práctica IV Ensayo fluorométrico para detección del gen reportero
GUS I
Temas
Usos del gen reportero GUS, ensayos enzimáticos para su detección
en plantas transformadas de manera transiente y estable.
Actividades
-­‐ Purificación de proteínas desde de las hojas agroinfiltradas en
la práctica II.
-­‐ Ensayo de actividad para detectar la expresión de GUS por
fluorometría.
Viernes 3 de julio
9:00- 13:00 Presentación y defensa de proyectos
9:00-11:00
-­‐ Cada grupo tendrá 15 minutos para presentar su proyecto y 5
minutos para discutirlo con sus compañeros*
11:00-11:20 Coffee break
11:20-13:00
-­‐ Continuación de las presentaciones.
13:00-13:30 Entrega de certificados.
13:00-14:30 Almuerzo
14:30- 17:00 Práctica V Ensayo fluorométrico para detección del gen reportero
GUS II
Temas
Continuación de la práctica IV.
Actividades
-­‐ Visualización de los resultados del ensayo de actividad de GUS
por medio de un ensayo fluorométrico.
* La presentación del proyecto es requisito para la entrega de certificado del participación en el curso