BASES BIOQUIMICAS PARA DETERMINACION DE

Tarea.
Describir las bases bioquímicas de los métodos para la determinación
de hemoglobina glicosilada y lípidos.
La hemoglobina glicosilada es una prueba para el seguimiento y control en
Diabetes mellitus
En los últimos 50 años se encontró que la hemoglobina puede combinarse
de manera no enzimática e irreversible con la glucosa.
La hemoglobina de los individuos sanos adultos está compuesta por tres
variedades denominadas hemoglobina A del adulto (HbA), hemoglobina A2
(HbA2) y hemoglobina F o fetal (HbF). La hemoglobina A es la más abundante
(97 %). Se han observado variedades de hemoglobina A denominadas HbA1a,
HbA1b y HbA1c. Existen combinaciones de grupos de aminoácidos y
carbohidratos que dan lugar a diversas formas moleculares de hemoglobina
glicosilada y ésta se puede encontrar en la literatura con otros nombres, como por
ejemplo: Índice de control diabético; HbG; Gluco-hemoglobina; A1C
La HbA1c es la más abundante de las hemoglobinas del tipo A1. Se trata de
una molécula de hemoglobina que incorporó glucosa en la porción N-terminal de la
cadena beta.
Debido a que el promedio de vida de un eritrocito es de 120 días, se puede
analizar (medir, cuantificar) el porcentaje de hemoglobina que se ha glucosilado en
este periodo de tiempo. La prueba de hemoglobina glicosilada es muy importante,
puesto que con ella se evalúa el comportamiento en el tiempo de los valores de
glucosa, es decir, la adherencia del paciente con respecto a la terapéutica y su
respuesta ante ella. Sin embargo, la medición del porcentaje de hemoglobina
glucosilada no puede sustituir al monitoreo de glucemias, ya que ésta no puede
medir su control diario y, por lo tanto, no le permite ajustar sus dosis de insulina e
ingesta de alimentos en el día a día a aquellos pacientes que así lo necesiten.
Estas dos pruebas se complementan, ya que buscan evaluar al paciente desde
perspectivas distintas.
VALORES NORMALES DE HEMOGLOBINA GLUCOSILADA (HBA1C)
Adultos normales
2,2 a 4,8 %
Niños normales
1,8 a 4 %
Diabéticos bien controlados 2,5 a 5,9 %
Diabéticos
con
control6 a 8 %
suficiente
Diabéticos mal controlados Mayor de 8 %
Existen varias técnicas que se utilizan para medir esta fracción de la
hemoglobina y los diferentes métodos analíticos detectan diversas fracciones:
• Procedimientos Inmunológicos (inmunoturbidimétricos)
• Electroforesis, Isoelectroenfoque
• Cromatografía:
1. Cromatografía de intercambio iónico: Este tipo de cromatografía se basa
en los puntos isoeléctricos de los compuestos químicos (moléculas polares
e iones). De acuerdo al pH que se trabaje cambiará la polaridad de la
molécula y será atraída por resinas cargadas eléctricamente. Es por ello
que se habla de dos tipos de
cromatografías:
 Cromatografía
de intercambio
aniónico: Atraerá aniones a determinados
pH, eluyendo los cationes.
 Cromatografía
de intercambio
catiónico: Atraerá cationes a determinado
pH, eluyendo los aniones.
2.- Cromatografía de Afinidad: Cromatografía cuya base está en que la
sustancia de naturaleza bioquímica denominadas ligandos de afinidad y enlazados
químicamente en soportes sólidos adecuados, retienen a los solutos, de manera
reversible
y
selectiva.
Las
separaciones se basan en el
acoplamiento
¨llave-cerradura¨,
modelo típico empleado en esta
rama.
FUNDAMENTO: El volumen de la
mezcla que se desea separar se
introduce en la columna que contiene un soporte polimérico inerte que retienen a
la sustancia activa enlazado covalentemente y que se conoce como ligando de
afinidad. Sólo existe interacción específica entre este ligando y un soluto-analito
(proteína) de la muestra insertada que queda retenido. Se procede a eluir los
demás componentes de la muestra (Esta fase no influye en el acoplamiento). A
continuación se introduce una nueva fase móvil que desactiva el acoplamiento por
alteración reversible de los sitios activos del inhibidor-ligando, del soluto (proteína)
o de ambos; generalmente se utiliza un cambio de pH que modifica las
características de los sitios activos; se eluye así el soluto de interés.
3.- Cromatografía liquida de alta resolución. En la cromatografía liquida
de alta resolución (HPLC), la mezcla de componente, en disolución, que se quiere
identificar o separar se pasa a través de una columna densamente empaquetada
con pequeñas cuentas de resina insoluble.
En la cromatografía en columna cuanto más pequeñas sean las cuentas de
resina y más empaquetadas se encuentren mejor será la resolución de esta
técnica separatista.
En esta técnica en particular; la resina esta densamente empaquetada que
para superar la resistencia que la columna ofrece al paso de líquido esta debe ser
bombeada a alta presión.
La Asociación Americana de Diabetes (ADA) reconoció la importancia de la
medición de la hemoglobina glicosilada en el control de la diabetes en el año 1986,
cuando recomendó el uso de dos medidas anuales de hemoglobina glicosilada
para realizar el seguimiento de la patología. En el año 1993 se presentaron los
resultados de un trabajo conocido como Estudio de Control y Complicaciones de la
Diabetes (Diabetes Control and Complications Trial o DCCT). En esta
investigación se observó por primera vez que la reducción en el valor de la
hemoglobina glicosilada estaba asociada con una disminución en el riesgo de
desarrollar complicaciones de la diabetes a largo plazo.
Lípidos
Para las determinaciones de lípidos es conveniente que el paciente lleve un
estilo de vida cotidiano los días previos a la extracción, manteniendo la dieta
habitual, y que el peso esté estable durante 2-3 semanas antes de la extracción.
Por otra parte, se debe evitar el ejercicio físico intenso durante las horas previas a
la extracción, ayunar durante 10-15 horas y suspender los tratamientos.
Determinación de la concentración de colesterol.
El colesterol es uno de los lípidos más importantes. Una de sus principales
funciones es formar parte de la membrana plasmática de las células eucariotas.
También
es
esencial
para
el
crecimiento
y
viabilidad
celular.
Se trata de una molécula que sólo es peligrosa cuando se encuentra en
exceso en la sangre, normalmente por comer demasiadas grasas animales,
cuando además se hace muy poco ejercicio. Para poder circular por la sangre, el
colesterol se combina con unas proteínas denominadas LDL. Podremos identificar,
pues, el colesterol que está en sangre por su asociación a esta lipoproteína.
Existen métodos tanto de tipo químico como enzimático. Los químicos se
utilizaron durante mucho tiempo para determinar el colesterol colorimétricamente,
aunque suelen ser poco precisos, presentan interferencias, y resultan difícilmente
automatizables. Por ello se han sustituido casi por completo por los métodos
enzimáticos, que determinan el colesterol total directamente en plasma en una
serie de reacciones en que se hidrolizan los ésteres de colesterol, se oxida el
colesterol y el agua oxigenada resultante se determina enzimáticamente.
Determinación de la concentración de triglicéridos.
Los triglicéridos (TAG) se acumulan principalmente en las células grasas
(adipocitos) y constituyen un depósito de combustible metabólico. Para su
determinación se utilizan métodos químicos y, sobre todo, enzimáticos:
1.- Métodos químicos: Se extraen los TAG y otros lípidos con disolventes
orgánicos. Después se aíslan los TAG y finalmente se hidrolizan a glicerol y ácidos
grasos. El glicerol obtenido es oxidado a formaldehído, que puede ser
determinado por diferentes métodos.
2.- Métodos enzimáticos: Se hidrolizan los triglicéridos de la muestra y el
glicerol que se obtiene es sometido a una serie de reacciones enzimáticos
acopladas, en las que se forma un compuesto llamado NADP (nicotinamida
adenina di nucleótido fosfato), que se puede medir por espectrofotometría.
Determinación de la concentración de lipoproteínas.
En los casos en que existe un exceso de colesterol (hipercolesterolemia) o de
triglicéridos (hipertrigliceridemia), se realiza un análisis de las lipoproteínas, es
decir, proteínas que van asociadas a lípidos. Para poder ser analizadas, las
lipoproteínas requieren una etapa previa de separación.
Existen diferentes métodos de separación:
1.- Por ultracentrifugación: Esta técnica permite separar las diferentes
familias de lipoproteínas en base a sus densidades. Está basada en dos
propiedades, una es la baja densidad que tienen las lipoproteínas respecto a otras
macromoléculas plasmáticas y otra es que cada tipo de lipoproteína tiene una
densidad diferente; así las lipoproteínas pueden ser separadas de otras proteínas
plasmáticas y a su vez ser separadas entre ellas. Por este motivo es un método
que se emplea con frecuencia.
2.- Por precipitación: Las proteínas precipitan como el sulfato de heparina o
en presencia de cationes divalentes como el Ca +2, Mg +2, y Mn +2. Dicha
precipitación ocurre bajo la influencia de varios factores los cuales permiten que
las principales proteínas precipiten escalonadamente, empezando por las de
menor densidad en presencia de poli aniones
Determinación de la concentración de fosfolípidos.
Los fosfolípidos (combinaciones de lípidos con fosfatos) son otro componente
de las membranas plasmáticas. Se puede determinar su presencia en sangre por
métodos químicos y enzimáticos. Los primeros se basan en la determinación del
contenido de fósforo de los fosfolípidos. Los segundos se basan en la hidrólisis de
los fosfolípidos y en la posterior determinación de algún producto de la reacción
(glicerol, fosfato, etc.)
Niveles normales de lípidos en sangre.
VALORES DE COLESTEROL TOTAL Y LDL-, HDL- COLESTEROL EN
PLASMA
Colesterol Total
Normal: < 200 mg/100 ml
Limite elevado: 200-240 mg/100 ml
Anormal: >240 mg/100 ml
LDL
Normal: < 130 mg/100 ml
Limite elevado: 130-159 mg/100 ml
Anormal: >160 mg/100 ml
HDL
Normal: > 35 mg/100ml
Limite elevado: 34- 25 mg/100 ml
Anormal: < 25 mg/100 ml
Triglicéridos: 40-150 mg/100 ml
Anexos.
Prueba de Hemoglobina
Glicosilada Promedio de
Glicemias Calificación
5-6 % 80-120 mg/dl. Excelente
6-7 % 120-150 mg/dl.
Muy Bueno
7-8 % 150-180 mg/dl. Bueno
8-9 % 180-210 mg/dl. Regular
9-10 % 210-240 mg/dl. Problemático
10-11 % 240-270 mg/dl. Malo
11-12 % 270-300 mg/dl. Muy Malo
http://www.estudiabetes.org/forum/topics/hemoglobina-glicosilada-en