Determinación de Histamina por HPLC en Alimentos

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1- OBJETIVO
Cuantificar b-aminoetilimidazol asociado a la descomposición de alimentos marinos.
2- ALCANCE
Este método aplica para la determinación de histamina en especies histaminoproductoras, a saber, Atún (enlatado
y crudo), Sardina (enlatado y crudo), Dorado, Marlin, Macarela, Jurel, Bonito, Wahoo, Anchoa, Caballa, Arenque, Vela,
Morenillo; con un ámbito de trabajo de 5 mg/kg a 100 mg/kg.
3- RESPONSABILIDAD Y AUTORIDAD
3.1 Jefe de Sección: Supervisar la ejecución y los resultados de la prueba de determinación de histamina por HPLC.
3.2 Analista de laboratorio: Realizar el ensayo según lo descrito en este procedimiento, preparar las disoluciones
y los estándares y reportar los resultados obtenidos.
4- DEFINICIONES
No aplica
5- ABREVIATURAS Y/O SIGLAS
5.1. HPLC: Cromatógrafo Líquido de Alta Resolución
5.2. OPA: o- Phthalaldehyde (o – Ftaldehído)
5.3 IA: Inocuidad de Alimentos
5.4 RECAA: Residuos y Contaminantes en Alimentos de Origen Acuático
5.5 PE: Procedimiento Específico
5.6 PO: Procedimiento Operativo
5.7 RE: Registro
5.8 L: microlitro
5.9 HCl: Ácido Clorhídrico
6- REFERENCIAS Y/O BIBLIOGRAFIA
6.1. Método de Referencia: Food y Testing Analysis. Cation-Exchange Analysis of Foods and Beverages for Biogenic
Amines.1995-1996. Pickering, M.
6.2. Método 977.13. Histamine in Seafood. Official Methods of Analysis of AOAC INTERNATIONAL. 17th Edition, 2000
6.3. IA-RECAA-PT-001-RE-001 Hoja de Cálculo Histamina por HPLC
6.4.IA-RECAA-PT-001-RE-003. Controles de Histamina HPLC
6.5. IN-RECAA-PO-001.Procedimiento Operativo Cromatógrafo Líquido LC1200 acoplado a Reactor Post-Columna
6.6. IA-RECAA-PO-002-RE-001 Control de uso de Microcentrífuga
6.7. IA-RECAA-PO-003-RE-001 Control de uso baño de enfriamiento Eppendorf BEN -01
6.8. IA-RECAA-PE-001-RE-001 Reporte de Resultados
6.9. IA-RECAA-PE-002 Procedimiento llenado de resultados de análisis
6.8. IA-RECAA-PE-002-RE-001 Resultados de Análisis
6.9. IA-RECAA-PE-004 Aseguramiento de la Calidad
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6.10. IA-RECAA-PE-003-BT-001. Bitácora del analista Nº 1
6.11. IA-RECAA-PE-003-BT-002. Bitácora del analista Nº 2
6.12. IA-RECAA-PE-003-BT-003. Bitácora del analista Nº 3
6.13. IA-RECAA-PE-003-BT-004. Bitácora del analista Nº 4
6.14. LANASEVE-PG-022-RE-002 Control de uso de la balanza
6.15. SENASA-PG-002-RE-009 Seguimiento de Acciones Correctivas y/o preventivas
6.16. ECA-MC-P20-G01 Guía para el cálculo de la incertidumbre
6.17. EURACHEM / CITAC Guide CG 4, Quantifying Uncertainty in Analytical Measurement, Second Edition, 2000
Pag.11-31
6.18 Decisión de la Comisión Europea, Criterios microbiológicos aplicables a los productos alimenticios
2073/2005 CE, Noviembre 2005 Pág. L 338/11.
6.19. Chacón, J. Prácticas recomendadas para determinar y reportar la incertidumbre de las mediciones en
Química Analítica.
6.20. Decreto 34687-MAG: Reglamento de Límites Máximos Microbiológicos y de Residuos de Medicamentos y
Contaminantes para los Productos y Subproductos de la Pesca y de la Acuicultura destinados al consumo humano. Gaceta
N°160, 20 de agosto del 2008.
6.21. Department of health and human services, Public health service, Food and Drug Administration, Center for food safety
and applied nutrition, Office of food safety, USA. 2011. Fish and Fishery Products Hazards and Controls Guidance. Fourth
Edition. 468 p. En: http://www.fda.gov/FoodGuidances.
7- DESCRIPCIÓN DEL PROCEDIMIENTO
FUNDAMENTO TEÓRICO
La histamina se produce como resultado de la descarboxilación de la histidina libre, por la acción de enzimas
bacterianas (descarboxilasas).
Este método se basa en la extracción de la muestra con metanol y HCl 0,1 M. El extracto es inyectado en un HPLC
acoplado a un sistema de derivatización post columna Pickering, donde la muestra pasa a través de una columna de
intercambio catiónico, y la histamina ya separada reacciona con el OPA a 45 ºC para formar un compuesto fluorescente. La
intensidad de esa fluorescencia se mide con un fluorómetro, la histamina se cuantifica utilizando las áreas de la muestra y
una curva de calibración.
Figura 1. Estructura química del b-aminoetilimidazol
MATERIALES, EQUIPO, REACTIVOS Y DISOLUCIONES
MATERIALES
 Cuchillo
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Tabla de picar
Pipeta de vidrio volumétrica aforada (Clase A) 50 mL
Tubos plásticos para micro centrífuga de 1,5 mL.
Filtros de nylon tipo disco para muestras de 0,22 m
Jeringas plásticas desechables de 3 mL
Viales para automuestreador.
Balones de vidrio aforados (Clase A ) de 50 mL
Balones de vidrio aforados (Clase A ) de 100 mL con tapa
Balones de vidrio aforados (Clase A ) de 1000 mL con tapa
Pipetas de vidrio volumétricas aforadas (Clase A) de 2 mL, 5 mL y 7 mL
Pipeta de vidrio graduada (Clase B) de 10 mL
Probeta de vidrio graduada de 500 mL y 1000 mL
Beakers de vidrio de 10 mL
Papel toalla
Micropipetas de (10-100) L y de (100-1000) L
Filtros de Nylon 0,22 m para solventes
Sistema de filtración al vacío
Frascos de licuadora de acero inoxidable tipo copa
Reservorios de vidrio de 1 L
EQUIPO
 Cromatógrafo líquido de alta resolución:
Marca: Agilent Modelo: LC 1200 Código: HPLC-1
 Bomba cuaternaria:
Marca: Agilent Modelo: G1311A Código: B-1
 Detector de fluorescencia:
Marca: Agilent Modelo: G1321A Código: DF-1
 Automuestreador:
Marca: Agilent Modelo: G1329A Código: AM-1
 Desgasificador :
Marca: Agilent Modelo: G1322A Código: DES-1
 Sistema de derivatización post columna:
Marca: Pickering Modelo: Pinnacle PCX Código: PC-1
 Precolumna, para columna analítica ALKION de 3 X 20 mm Catálogo Pickering 9493020.
 Columna de intercambio catiónico ALKION, en forma K+ de 4 X 150 mm Catálogo Pickering 9410917.
 Balanza analítica 110 g :
Marca: Sartorius Modelo: BP 110S Código: BA - 1
 Balanza electrónica 600 g
Marca: Ohaus Modelo: Scout II Código: BE – 1
 Balanza electrónica 4200 g
Marca: Sartorius Modelo: CP4201 Código: BE – 2
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 Procesador de Muestras
Marca: Retsch Modelo: GM200
 Microcentrífuga:
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Código: PM – 1
Marca: Digisystem Lab Instruments INC Modelo: DSC-01524SMD Código: MC - 1
 Baño de Enfriamiento:
Marca: Eppendorf Modelo: Termo Stat Plus Código: BEN – 1
 Licuadora velocidad variable:
Marca: Waring Modelo: 31BL92 Código: LI-1
REACTIVOS
 Buffer de fosfato de potasio, Catálogo Pickering K 600.
 Regenerador de Columna, Catálogo Pickering K 130.
 o- Phthalaldehyde (OPA), grado cromatográfico en cristales 5 g. Catálogo Pickering O120.
 Diluyente del OPA Catálogo Pickering OD 104.
 Thiofluor, grado cromatográfico en cristales, 10 g. Catálogo Pickering 3700-2000.
 Metanol grado HPLC.
 Ácido Clorhídrico concentrado para análisis de trazas de metales
 Brij 35 solution al 30 % m/v
 Agua desionizada
DISOLUCIONES
 Ácido Clorhídrico 0,1 mol/L: Pipetear 8,3 mL de HCl concentrado en un balón aforado de 1 L el cual ya contiene
agua y aforar con agua desionizada.
 Disolución Extractora: Para 800 mL de metanol, adicionar HCl 0,1 mol/L y llevar hasta 1000 mL. Agitar hasta
homogenizar.
 Disolución OPA:
Debe prepararse en el reservorio de 1 L incluido en el Reactor post –columna Pickering.
-Agregar 297 mL de diluente de o-phaftaldehido (filtrado al vacío con 0,22 m) en el reservorio.
-Pesar en balanza analítica aproximadamente 0,0947 g de OPA en un recipiente limpio y seco, disolver con 1,5 mL de
Metanol grado HPLC. Mezcle hasta homogenizar y adicionar el reservorio.
-Disolver aproximadamente 0,6316 g de Thiofluor en 1,5 mL de o-phthaldehyde Diluent y adicionar al reservorio.
-Agregar 952 L de Brij 35. Agitar despacio para evitar espuma.
-Desgasificar con helio por 10 minutos de la siguiente manera:
Abrir la llave del cilindro girando hacia la derecha, (el cilindro debe mantener una presión superior a los 500 psi, de no
ser así informar al encargado para realizar el cambio), la válvula de entrada al reactor debe estar ajustada en 50 psi,
aproximadamente, además la entrada de gas al reactor debe estar en posición ON. La válvula de entrada de gas al
reservorio debe colocarse en posición vertical, para permitir la entrada de helio; pasados 10 min se coloca dicha válvula
en posición horizontal para presurizar.
-Una vez desgasificado y presurizado, cerrar el cilindro de helio y la entrada de gas al reactor.
NOTA Nº1: El reactivo preparado es sensible al oxígeno. Usar el reactivo preparado bajo un gas inerte, preparar el reactivo
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cada día de uso.
CURVA DE CALIBRACIÓN
 El reactivo de Histamina que se emplea como estándar debe almacenarse en refrigeración de 2 °C a 8 °C.
 DISOLUCION STOCK: (1000 mg/L Histamina)
Pesar 0,1674 g de estándar de histamina diclorhidrato al 99 % y transvasar cuantitativamente a un balón de 100 mL,
disolver y llevar a la marca de aforo con HCl 0,1 mol/L, anotarse en el LANASEVE-PG-022-RE-002 Control de uso de la
balanza (ver NOTA Nº2).
 DISOLUCIÓN INTERMEDIA (100 mg/L) Histamina.
Pipetear 5,00 mL de la solución de 1000 mg/L de Histamina en un balón aforado de 50 mL y llevar a la marca de aforo con
HCl 0,1 mol/L (ver NOTA Nº2).
 DISOLUCIONES DE TRABAJO (0,5; 1; 3; 5; 7; 10) mg/L de Histamina.
Pipetar el volumen respectivo en el balón correspondiente según se indica en la tabla, y llevar a la marca de aforo con HCl
0,1 mol/L (ver NOTA Nº2).
Concentración del Patrón
0,5 mg/L Histamina
1 mg/L Histamina
3 mg/L Histamina
5 mg/L Histamina
7 mg/L Histamina
10 mg/L Histamina
Disolución a pipetear
Disolución Stock 1000
mg/L Histamina
Disolución Stock 1000
mg/L Histamina
Disolución Stock 1000
mg/L Histamina
Disolución Stock 1000
mg/L Histamina.
Disolución Stock 1000
mg/L Histamina.
Disolución Stock 1000
mg/L Histamina.
Volumen de la disolución
a pipetear
Balón aforado a utilizar
25 L
50 mL
50 L
50 mL
150 L
50 mL
250 L
50 mL
350 L
50 mL
500 L
50 mL
NOTA Nº2: La disolución Stock, la disolución intermedia y la curva de calibración se deben preparar cada día.
7.1 DESCRIPCIÓN DEL ANALISIS
EXTRACCIÓN DE LA MUESTRA
7.1.1. Si el pescado es entero, quitar escamas, piel y vísceras y partir en cuadritos; tomando de forma aleatoria de
diferentes lugares de la muestra total. Si el pescado viene en filete o en trozos, partir en cuadritos; tomando de forma
aleatoria de diferentes lugares de la muestra total.
7.1.2. Homogenizar los trozos en el homogenizador hasta obtener un puré.
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7.1.3 Una vez procesadas las muestras, el puré se coloca en una bolsa debidamente identificada (por ejemplo, el protocolo,
el nombre del análisis, la especie, fecha de ingreso); esto constituye la contramuestra.
7.1.4. Pesar aproximadamente 10,0 g de muestra en vasos de licuadora de acero inoxidable, además de las muestras se
incluye una muestra de referencia, dos muestras control y un blanco reactivo. Anotarse en el LANASEVE-PG-022-RE-002
Control de uso de la balanza.
7.1.5 Los controles deben marcarse en este punto, con volúmenes de 0,5 mL a 10 mL de la disolución intermedia de 100
mg/L para obtener concentraciones de aproximadamente 5 mg/kg a 100 mg/kg.
7.1.6. El volumen con que se marcó, debe anotarse en la bitácora del analista.
7.1.7. Adicionar 50 mL de disolución extractora y licuar a alta velocidad por 2 min.
7.1.8. Centrifugar una alícuota de 1,5 mL en tubo de micro centrífuga por 10 minutos de 9000 a 10500 s-1 y anotarse en el
control de uso de Microcentrífuga IA-RECAA-PO-002-RE-001.
7.1.9. Mezclar 0,75 mL del supernatante con 0,75 mL del Buffer de fosfato de potasio (K600) en un tubo de 1,5 mL de micro
centrifuga.
7.1.10. Dejar coagular a - 4 ± 1 ºC por 15 minutos en baño de enfriamiento y anotarse en el control de uso baño de
enfriamiento Eppendorf BEN -01 IA-RECAA-PO-003-RE-001.
7.1.11. Centrifugar por 5 min a una velocidad de 9 000 s-1 a 10500 s-1.
7.1.12. Filtrar el sobrenadante por un filtro de 0,22 m de diámetro y recoger en un vial.
7.1.13. Colocar en el automuestreador.
7.1.14. Se filtra al vacío y por separado: el agua desionizada, el metanol, el K-600 y el K-130 con filtro de 0,22 m y se
colocan en los respectivos reservorios.
7.1.15. La curva de calibración, los blancos, los controles y las muestras que se deban cuantificar se inyectan en el equipo,
en el siguiente orden:
Orden de inyección
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
Identificación
Estándar de 0 mg/L
Estándar de 0,5 mg/L
Estándar de 1 mg/L
Estándar de 3 mg/L
Estándar de 5 mg/L
Estándar de 7 mg/L
Estándar de 10 mg/L
Blanco
Referencia
Control interno 1
Control interno 2
Muestra 1 a la n
Blanco
Referencia
Control (1 ó 2)
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7.1.16. Para la lectura de las muestras en el HPLC se sigue el Procedimiento Operativo Cromatógrafo Líquido LC1200
acoplado a Reactor Post-Columna IA-RECAA- PO-001
7.2. CONDICIONES Y PARÁMETROS INSTRUMENTALES
7.2.1. Condiciones Analíticas:
 Columna de intercambio catiónico ALKION, Catálogo Pickering 9410917
 Precolumna de intercambio catiónico ALKION, Catálogo Pickering 9493020

Temperatura: 40 ºC

Flujo: 0,8 mL/min

Fase Móvil: Buffer de fosfato de potasio, Catálogo Pickering K 600.

Volumen de inyección: 5 µL

Tiempo de corrida: 30 min

Gradiente:
Tiempo (minutos)
0,0
10,0
10,1
13,0
13,1
30,0
% K600
100
100
0
0
100
100
% K130
0
0
100
100
0
0
7.2.2. Condiciones Post - Columnares:
 Reactor Post-Columna: Pickering

Temperatura: 45 ºC

Reactivo: Diluyente del OPA /o-Phthalaldehyde/Thiolfluor/Brij-35

Flujo: 0,3 mL/min
7.2.3. Detector de fluorescencia:

Longitud de onda de excitación: 330 nm

Longitud de onda de emisión: 465 nm
7.3- CÁLCULOS
A continuación, se detalla el modelo matemático utilizado para determinar la concentración de Histamina en
mg/kg en una muestra por Cromatografía Liquida de Alta Resolución.
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𝐶𝑛(𝐻𝑃𝐿𝐶)
𝐴−𝑏
( 𝑚 ) × 𝑉𝑓 × 𝑉1 × 100
𝑚𝑔
𝐶𝑛 ( ) =
𝑘𝑔
𝑚𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎 × 𝑉2 × %𝑅
 Donde:
1- Concentración de histamina en la muestra, Cn (mg/kg):
 A: Área (dada por el equipo) de la muestra en LU*s (Unidades de Luminiscencia por segundo).
 b: Intercepto de la curva de calibración.
 m: pendiente de la curva de calibración.
2- Volumen final (µL):
 Vf: volumen final al que se lleva la alícuota del extracto, en µL.
3- Volumen 1 (mL):
 V1: volumen agregado de disolución extractora, en mL.
4- Volumen 2 (µL):
 V2: volumen de la alícuota tomada del extracto, en µL.
5- Masa de la muestra (g):
 mmuestra: masa de la muestra pesada en balanza, en g.
6- Porcentaje de Recuperación (%):
% R: Porcentaje de recuperación obtenido a partir de los controles
7.3.1. Los datos obtenidos (áreas proporcionadas por el equipo, volúmenes, masas de las muestras), se deben ingresar en
el IA-RECAA-PT-001-RE-001 Hoja de Cálculo de Histamina por HPLC, la cual calcula las concentraciones de histamina en
las muestras y los controles diarios, así como los porcentajes de recuperación en estos últimos.
En el caso de realizar controles intralaboratoriales, se debe ingresar el volumen de marcado, así como la masa de cada
muestra (referencia y fortificados), en el IA-RECAA-PT-001-RE-003. Controles de Histamina HPLC.
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7.3.2. El reporte de los resultados se hace utilizando el formulario IA-RECAA-PE-002-RE-001 Resultados de Análisis y se le
entrega al jefe de sección para la revisión con la evidencia proporcionada por el equipo. Una vez realizada esta acción, se
transfiere el registro a la oficinista de la sección, para que elabore el Reporte de Resultados en el IA-RECAA-PE-001-RE001 que se le entrega al cliente. En caso de resultados que sobrepasen el límite máximo proceder tal como lo menciona el
Procedimiento llenado de resultados de análisis IA-RECAA-PE-002.
7.3.3. Expresión de los Resultados: Los resultados se deben reportar tomando como referencia el valor obtenido en la
incertidumbre, en la cual se considerarán dos cifras significativas.
7.4-EVALUACIÓN DE DESEMPEÑO Y ACCIONES CORRECTIVAS
7.4.1. El control de calidad se realiza según lo establecido en el documento de Aseguramiento de la Calidad IA-RECAA-PE004.
7.5- PARÁMETROS
7.5.1.
El Nivel Máximo permitido para pescados histamino-productores, es de 100 mg/kg, según el Reglamento de
Límites Máximos Microbiológicos y de Residuos de Medicamentos y Contaminantes para los Productos y
Subproductos de la Pesca y de la Acuicultura destinados al consumo humano.
7.6- EQUIPOS DE PROTECCIÓN
 Campana de extracción.
 Gabacha.
 Mascarilla para solventes orgánicos y ácidos.
 Guantes de seguridad resistentes a solventes y ácidos.
 Anteojos de seguridad.
7.7-CRITERIOS DE ACEPTACIÓN DE RESULTADOS
 Exactitud: Se evaluán el porcentaje de recuperación de los controles del set de muestras y el z-score de los
ensayos interlaboratoriales.
 El porcentaje de recuperación obtenido para el set de muestras no debe superar los límites superior e
inferior de acción del Gráfico de Control IA-RECAA-PE-004-RE-004, correspondiente para el análisis
de histamina; en caso de sobrepasar dichos límites se debe realizar nuevamente la determinación de
todo el set de muestras y levantar un trabajo no conforme para evaluar las causas y proponer las
acciones correctivas correspondientes utilizando el formulario SENASA-PG-002-RE-009 Seguimiento
de Acciones Correctivas y/o preventivas.

El valor absoluto del z score (valor z) de los ensayos interlaboratoriales debe ser menor o igual a 2
para(|𝑧| ≤ 2) para ser satisfactorio; en caso de que este valor sea mayor que 2 y menor que 3, el
resultado se considera como cuestionable. En caso de que ocurra lo anterior, se debe levantar un
trabajo no conforme para evaluar las causas y proponer las acciones correctivas correspondientes.
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 El rango (diferencia) entre los porcentajes de recuperación obtenidos para las muestras fortificadas para el set de
muestras no debe superar el límite superior del Gráfico de Control de Rangos IA-RECAA-PE-004-RE-005,
correspondiente para el análisis de histamina, en caso de sobrepasar dicho límite se debe se debe realizar
nuevamente la determinación de todo el set de muestras, tratando de corregir los posibles errores.
 Si el coeficiente de linealidad, R2, obtenido en la curva de calibración sobrepasa el límite inferior de acción
del Gráfico de Control Linealidad IA-RECAA-PE-004-RE-006, correspondiente para el análisis de histamina se
debe realizar nuevamente la determinación de todo el set de muestras, tratando de corregir los posibles errores.
 Si la pendiente obtenida en la curva de calibración sobrepasa los límites superior e inferior de acción del
Gráfico de Control Sensibilidad IA-RECAA-PE-004-RE-007, correspondiente para el análisis de histamina, se debe
realizar nuevamente la determinación de todo el set de muestras, tratando de corregir los posibles errores.
 Si el área obtenida en un estándar determinado sobrepasa los límites superior e inferior de acción del Gráfico de
Control de Señal A-RECAA-PE-004-RE-008, correspondiente para el análisis de histamina se debe realizar
nuevamente la determinación de todo el set de muestras, tratando de corregir los posibles errores.
 Si el tiempo de retención obtenido para el estándar de 0,5 mg/kg sobrepasa los límites superior e inferior de acción
del Gráfico de Control de Tiempos de Retención A-RECAA-PE-004-RE-009, correspondiente para el análisis de
histamina se debe realizar nuevamente la determinación de todo el set de muestras, tratando de corregir los
posibles errores.
7.7- ESTIMACIÓN DE LA INCERTIDUMBRE
La incertidumbre se estima considerando los aportes por precisión y exactitud a partir de los resultados de
validación y del ensayo interlaboratorial más reciente, los cuales se ven afectados por todos los parámetros
incluidos en el modelo matemático e incluyen de forma integral todas las fuentes de incertidumbre (masa,
volúmenes, curva de calibración).
Precisión:
Para el aporte de la precisión se toma la reproducibilidad intralaboratorial o precisión intermedia como el mejor
estimado de la variación del método. Ésta se obtiene del informe de validación y se expresa como Coeficiente de
Variación (CV) de 3,0 %.
Este CV fue obtenido a partir de 34 análisis realizados en diferentes días por diferentes analistas. Por lo tanto la
incertidumbre por precisión (Upres) se calcula:
0,03
𝑈𝑝𝑟𝑒𝑠 =
= 𝟎, 𝟎𝟎𝟓𝟏𝟒𝟓
√34
Exactitud:
Para el aporte por exactitud se toma el porcentaje de recuperación obtenido a partir del material de referencia del
último interlaboratorial realizado por el laboratorio, el cual se somete al mismo tratamiento que reciben las
muestras del laboratorio.
Los datos del material de referencia sobrante del Interlaboratorial FAPAS 2782, cuya matriz fue sardina en salsa
de tomate, son los siguientes.
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no controlada
LANASEVE
Rige a partir de:
22-07-11
Código:
IA-RECAA-PT-001
Determinación de Histamina por HPLC en Alimentos
Marinos
Versión 08
Página - 11 - de 12
Elaborado por: Analista de Laboratorio
Revisado por: Analista de Laboratorio
Aprobado por: Jefe de Sección
Identificación del material
certificado
Concentración de
histamina, (mg/kg)
Incertidumbre al 95
% de confianza
(mg/kg)
Desviación estándar
de la población, σp
FAPAS 2782
32,2
± 0,58
3,05
Los valores reportados por el laboratorio en el ensayo interlaboratorial para 6 réplicas, se muestran a
continuación.
Identificación del
material
certificado
Desviación
Concentración
Desviación estándar Coeficiente
% de
del
de histamina Número de estándar
de
recuperación,
̅ 𝒐𝒃𝒔 , réplicas, n
promedio, Variación,
de las
obtenida, 𝑪
%R
Sobs,
réplicas, s
CV %
(mg/kg)
𝒔/√𝒏
FAPAS 2782
30
6
0,46
0,1878
1,52
93,2
Para el valor de recuperación obtenida, la incertidumbre se calcula a partir de la siguiente ecuación:
𝑆2
𝑢(𝐶𝑀𝑅 )2
𝑢𝑅𝑒𝑐 = 𝑅𝑒𝑐√ 𝑜𝑏𝑠
+
2
̅2
𝐶𝑀𝑅
𝐶𝑜𝑏𝑠
𝑢𝑅𝑒𝑐 = 0,932 ×
√
0,18782
302
0,58 2
( 2 )
+
32,22
𝑢𝑅𝑒𝑐 = 0,932 × 0,01097 = 𝟎, 𝟎𝟏𝟎𝟐𝟐
Incertidumbre combinada:
𝑢𝐶𝑛
2
2
= √(𝑢𝑝𝑟𝑒𝑠 ⁄𝑝𝑟𝑒𝑠) + (𝑢𝑟𝑒𝑐 ⁄𝑅𝑒𝑐) = √(0,0051)2 + (0,01022)2 = 𝟎, 𝟎𝟏𝟏𝟒𝟒
𝐶𝑛
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Incertidumbre expandida:
Una vez obtenida la incertidumbre combinada se multiplica por un factor de cobertura de 2 (k=2) el cual da un
nivel de confianza de 95%, para obtener la incertidumbre expandida que se expresa con la letra U en mayúscula:
𝑈(𝐶𝑛) =
𝑢𝐶𝑛
× 𝐶𝑛 × 2
𝐶𝑛
La incertidumbre se calcula para cada concentración obtenida utilizando la fórmula anterior, por ejemplo para un
concentración obtenida de 5,0 mg/kg se tiene:
𝑢(𝐶𝑛) = 0,01144 × 5 × 2 = 0,11
Por lo tanto el resultado es 5,00 ± 0,11 mg/kg.
Comparación de aportes:
Se realiza la siguiente gráfica con el fin de comparar de una forma más clara los aportes de las incertidumbres
relativas de cada una de las fuentes de incertidumbre. En el gráfico, la columna de la derecha corresponde a la
incertidumbre relativa de la concentración de histamina en las muestras.
Incertidumbre relativa
Aportes a la incertidumbre
0.012
0.01
0.008
0.006
0.004
Precisión
Exactitud
Incertidumbre
combinada
0.002
0
8- ANEXOS
No Aplica
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