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La autocompatibilidad en el almendro (Prunus amygdalus Batsch):
estructura genética del alelo Sf y modificaciones de su expresión
El estudio de la autocompatibilidad del almendro ha sido el objetivo principal
de esta tesis, aunque también se han abordado otros objetivos relacionados con la
mejora genética.
El almendro, Prunus amygdalus Batsch, es una especie diploide que pertenece al
género Prunus. Aunque la autoincompatibilidad (AI) es un carácter importante en el
reino vegetal desde el punto de vista evolutivo, la autocompatibilidad (AC) es un
carácter agronómico muy crítico para asegurar la producción. De este modo, la AC se
ha convertido en uno de los principales objetivos de los programas de mejora del
almendro en todo el mundo. Aunque la AC ha sido identificada en algunas variedades
de almendro, es muy poco frecuente (Socias i Company et al., 2010a). Los métodos
utilizados para determinar la AC en el almendro han sido la observación de los tubos
polínicos y el cuajado de frutos después de polinizaciones controladas.
Sin embargo, las nuevas técnicas moleculares se han ido aplicando cada vez más
durante estas dos últimas décadas. De este modo, se ha conseguido determinar el
genotipo de las variedades y selecciones de una manera muy rápida y eficaz. La AC se
ha relacionado con la presencia del alelo Sf, el cual pertenece a la serie alélica S, y es
dominante sobre los otros alelos de AI. Por ello siempre se había considerado que la
AI/AC era un carácter cualitativo y no cuantitativo.
Entre los individuos procedentes del cruzamiento de las variedades de almendro
‘Vivot’  ‘Blanquerna’, sólo un 25% han sido AC, mientras que la proporción esperada
era mucho mayor, un 50%. Un genotipado previo reveló que ‘Vivot’ poseía los
haplotipos Sf y S23 y ‘Blanquerna’ Sf y S8, por lo que las dos variedades deberían ser AC,
aunque sus fenotipos mostraron ser diferentes. Esta diferencia fenotípica llevó a
investigar los posibles distintos mecanismos de incompatibilidad que podrían intervenir
en estas plantas. Las dos diferentes versiones del haplotipo Sf, una activa y AI (Sfa) y la
otra inactiva y AC (Sfi), han mostrado un mutuo reconocimiento, por lo que la Sfa-RNasa
del estilo de ‘Vivot’ ha impedido el crecimiento del tubo polínico Sfi de ‘Blanquerna’ en
una población de 80 individuos. Estos resultados sugieren la presencia de un locus
modificador no ligado al locus S, el cual sería responsable del control de la AI/AC en
esta población. Para ello se propuso un modelo de reconocimiento por el cual el locus
modificador actúa de manera que concuerda con los fenotipos obtenidos en nuestra
familia (Fernández i Martí et al., 2009a).
Aunque últimamente se ha profundizado mucho en el estudio del locus S a nivel
molecular (Hanada et al., 2009b), su mecanismo de acción sigue sin estar del todo
establecido, por lo que se sugiere que otros genes externos son necesarios en la AI. Una
vez propuesto que un locus modificador podría intervenir en el mecanismo de la AC en
esta familia, durante esta tesis se ha pretendido localizarlo en el genoma del almendro.
Para ello se ha realizado un ‘genome scan’ usando un centenar de marcadores
microsatélites (SSR) distribuidos por los 8 cromosomas del genoma. Después de
construir los mapas de ligamiento, se llevaron a cabo análisis de QTLs asociados a los
fenotipos obtenidos y sorprendentemente se localizaron 2 QTL en nuestras selecciones.
Estos resultados proponen la localización por primera vez en la familia de las rosáceas
de dos nuevos loci situados fuera del locus S, y que se encuentran en los grupos 6 y 8
(Fig. 1). Ello permite sugerir que la AI es un carácter cuantitativo y no cualitativo, como
se consideraba hasta la fecha (Fernández i Martí et al., 2011).
Figura 1. Mapa de ligamiento de Vivot’  ‘Blanquerna’, incluyendo la posición del locus S y de los 2 nuevos loci identificados en
G6 y G8
Por otro lado, la construcción de una librería genómica (fósmido) en ‘Vivot’ y
‘Blanquerna’ ha permitido comprobar que tanto las secuencias de las Sf-RNasas como
de los SFBf eran completamente idénticas, a pesar de producir dos expresiones
fenotípicas tan distintas (Fernández i Martí et al., 2010b).
Como no ha sido posible encontrar ninguna mutación entre ambos Sf, a pesar de
una gran cantidad de técnicas realizadas (NepHGE, Análisis de transcripción, Southern
Blot, etc.) se ha sugerido la implicación de la metilación del ADN en esta población
(Fernandez i Marti et al., 2012, submitted). La metilación puede producir cambios en
los fenotipos o en la expresión de los genes sin alterar las secuencias del ADN. Los
ensayos llevados a cabo en el transcurso de esta tesis usando el tratamiento de bisulfito
para la conversión de las citosinas sugieren que el ADN metilado sería el responsable de
la activación y/o inactivación del haplotipo Sf, ya que se ha encontrado un mutación de
timina a citosina en la región ‘upstream’ de la RNasa.
De hecho, se ha podido comprobar que cuando la secuencia de la Sf-RNasa está
metilada, ésta inactiva la expresión, por lo que esta inhibición se traduciría en una
expresión AC, como es el caso de ‘Blanquerna’. En el caso contrario, si la secuencia de
ADN no está metilada, como es el caso de ‘Vivot’, la RNasa permanece activa y a
consecuencia la planta será AI. Este descubrimiento pone en evidencia que la
epigenética ha influido de manera positiva en la evolución de las especies y que
posiblemente, en su origen todas las variedades de las especies de Prunus estarían en su
forma incompatible, pero que con diferentes mutaciones, algunas de ellas silenciadas,
unas se ha convertido en compatibles y otras no.
También se han querido abordar aspectos de modelización de proteínas a lo
largo de este trabajo. Para ello se ha construido la estructura en 3D de las RNasas de los
alelos Sf, S23 y S8 mediante herramientas bioinformáticas. La principal diferencia
encontrada fue que en la estructura del Sf había un lazo más largo que en las otras dos
RNasas AI. En la bibliografía se ha descrito que los lazos grandes son susceptibles a la
degradación proteolítica, por lo que este mismo fenómeno podría tener lugar en estas
RNasas y tener una repercusión a nivel estructural y funcional entre alelos compatibles
e incompatibles en almendro (Fernandez i Marti et al., 2012).
Figura 2. Diagrama esteroscópico en 3D de la estructura modelizada de las RNasas S8, S23 y S8 del almendro, mostrando los
elementos de la estructura secundaria (a). Representación superficial de la estructura modelizada de las mismas RNasas.
Por otro lado, en el transcurso de esta tesis doctoral y de modo complementario a
los trabajos realizados para determinar la auto-compatibilidad, se han querido evaluar
otros caracteres que empiezan a tener una gran importancia tanto para el programa de
mejora del CITA como desde el punto de vista nutricional, y evidentemente de gran
relevancia para el consumidor. Estos caracteres son los relacionados con la calidad de la
almendra. Durante dos años se han evaluado en la misma población de ‘Vivot’ 
‘Blanquerna’ diversos componentes químicos, como los ácidos grasos (oleico, linoleico,
palmítico, esteárico y palmitoleico), tocoferoles (α y β), proteínas o contenido total en
aceite. Por otro lado se han evaluado de manera paralela otros caracteres físicos de la
pepita y de la cáscara, como peso, anchura, diámetro geométrico, tamaño, etc. Para
todos ellos, se ha determinado por primera vez en almendro su control genético,
encontrando alrededor de 25 QTLs con unos porcentajes de explicación superiores al
75% en la mayoría de los casos y cubriendo prácticamente todo el genoma del almendro
(Fernandez i Marti et al., 2012; Font i Forcada et al., 2012).
Figura 3. Mapa de ligamiento de Vivot’  ‘Blanquerna’, incluyendo la posición de los QTL asociados a la calidad del fruto
Por último, se examinó molecularmente el material vegetal del banco de germoplasma
del almendro ubicado en el CITA de Aragón, el cual es el de referencia de la FAO y el
INIA, siendo uno de los más importantes a nivel mundial (Fernandez i Marti et al.,
2009c).
Esta tesis ha sido multidisciplinar, en la cual se han trabajado con caracteres tan
importantes desde el punto de vista agronómico como nutricional (compatibilidad,
ácidos grasos, tocoferoles, etc). Todos estos resultados obtenidos están directamente
relacionados con los objetivos del proyecto de Mejora Genética del Almendro que se
viene desarrollando en el CITA de Aragón y del que han derivado las variedades de
almendro de mayor éxito actualmente en el cultivo del almendro en España y van a ser
servir para incrementar la eficacia de esta línea de investigación.
Bibliografia:
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