E.BB24

Micronúcleos y anormalidades nucleares en mucosa bucal para
evaluar genotoxicidad y citototoxicidad
Torres Bugarín Olivia*
*
Programa Internacional, Facultad De Medicina. Universidad Autónoma De Guadalajara. Av. Patria
1201, Lomas del Valle, 3a Sección, C.P. 45129, Zapopan, Jalisco, México. Apdo. Postal 1-440.
[email protected]
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Torres Bugarín Olivia.
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Autor a quien la correspondencia deba ser enviada; Olivia Torres Bugarín. Tel: (33)36488824, ext
33152. Laboratorio 12, Evaluación de genotóxicos. Instituto de Ciencias Biológicas. Universidad
Autónoma de Guadalajara, Av. Patria 1201, Lomas del Valle, 3a Sección, C.P. 45129, Zapopan,
Jalisco, México. Apdo. Postal 1-440. [email protected].
Área del Conocimiento: Biomarcadores
Resumen en Español: La cavidad oral refleja la salud, la mucosa que la recubre se observan
cambios indicativos de enfermedad o exposición a sustancias tóxicas, puede revelar
condiciones sistémicas, efectos secundarios de tratamientos, lo que favorece su utilización en
pruebas para evaluar genotóxicos o citotóxicos. Y aunque es barrera protectora del resto del
organismo es punto de contacto de agentes potencialmente peligrosos por tanto se torna
susceptible de sufrir daños. Es de considerar que el epitelio de revestimiento oral (60 %) es
no queratinizado facilitando la observación al microscopio al permitir la penetración de
colorantes y e identificación de características morfológicas del núcleo y membrana, tiene
especial capacidad proliferativa, esta particularidad mantiene la población celular constante,
pero a su vez se vuelve más vulnerable al daño al ADN, esto cobra relevancia ya que el 90
% de los cánceres tienen origen epitelial, así que la mucosa bucal es usada para monitorear
eventos genotóxicos tempranos causados por cancerígenos inhalados o ingeridos; las células
del epitelio de la mucosa bucal presentan abundante citoplasma y conservan el núcleo; este
epitelio es de fácil acceso y obtenerlo es mínimamente invasivo por los que genera mínimo
estrés en los participantes en estudios, además los resultados son directos, sin necesidad de
cultivo, es una técnica sencilla, rápida y económica, esto mediante la técnica de
micronúcleos y detección de diversas anormalidades nucleares, entonces, el uso de la técnica
de micronucleos y anormalidades nucleares representa una oportunidad única para el estudio
epidemiológico en poblaciones de alto riesgo.
Palabras Clave: Micronúcleos, anormalidades nucleares, mucosa bucal, genotoxicidad
Resumen en Inglés: The oral cavity reflects the health, the overlying mucosa observed
changes indicative of disease or exposure to toxic substances, may reveal conditions
systemic side effects of treatments, which favors its use in tests to assess genotoxic or
cytotoxic. And while it's protective barrier from the rest of the agency point of contact is
potentially dangerous agents therefore becomes susceptible to damage. It is considered that
the oral surface epithelium (60%) is not keratinized facilitating microscopic observation to
allow penetration of dyes ye morphological identification of the nucleus and membrane, is
particularly proliferative capacity, this particular cell population remains constant, but in turn
becomes more vulnerable to DNA damage, it becomes important since 90% of cancers are
epithelial in origin, so the buccal mucosa is used to monitor early events caused by
genotoxic carcinogens inhaled or ingested; cells epithelium of the oral mucosa have
abundant cytoplasm and retain the core, this epithelium is easily accessible and get it is
minimally invasive which generates minimal stress in participating in studies, and the results
are direct, without cultivation, is a technique simple, fast and economical, this by the
micronucleus assay and detection of various nuclear abnormalities, then, using the technique
of micronuclei and nuclear abnormalities represents a unique opportunity for
epidemiological studies in high risk populations.
Keywords: Micronuclei, nuclear abnormalities, buccal mucosa, genotoxicity.
1. Introducción
Se ha descrito a la cavidad oral como el espejo que refleja la salud del individuo, pues en la mucosa
que recubre la boca se han observado cambios indicativos de enfermedad, además permite identificar
efectos locales de tabaco o alcoholismo, puede revelar condiciones sistémicas, como la diabetes o la
deficiencia vitamínica o, o bien podría mostrar efectos secundarios de tratamientos como la terapia
contra el cáncer (quimioterapéuticos y radioterapia) ya que estas limitan la capacidad proliferativa de
las células epiteliales, al punto de formar ulceras [1].
Entre las características del epitelio de la mucosa bucal que favorecen su utilización en pruebas para
evaluar genotóxicos o citotóxicos se encuentra que; Es un punto de contacto de muchos agentes
potencialmente peligrosos por lo tanto representa una barrera protectora para potenciales carcinógenos
los que al ser metabolizados generarían múltiples metabolitos reactivos, si bien protege al resto del
organismo de que estos compuestos penetren, este tejido si esta expuesto y por lo tanto si es susceptible
de sufrir daños [1], tiene especial capacidad proliferativa, esta particularidad mantiene la población
celular constante, pero a su vez vuelve a este tejido más vulnerable al daño al ADN, esto cobra
relevancia ya que se sabe que el 90 % de todos los tipos de cáncer tienen origen epitelial, así que la
mucosa bucal podría ser usada para monitorear eventos genotóxicos tempranos causados por
cancerígenos inhalados o ingeridos [2], además aproximadamente el 60 % del total de la superficie de
revestimiento oral es un epitelio no queratinizado, esto favorece su observación al microscopio ya que
facilita la penetración de colorantes, lo que permite identificar características morfológicas del núcleo y
membrana [3]; Una propiedad mas es que las células del epitelio de la mucosa bucal presentan
abundante citoplasma y conservan el núcleo al momento de ser exfoliadas [1], otra peculiaridad de este
epitelio es que es de fácil acceso, es posible colectarlas mediante técnicas mínimamente invasivas por
lo que es ampliamente aceptado ya que produce mínimo estrés a las personas que se les toma la
muestra, además de todo esto, en un momento determinado pudieran reflejar lo que esta ocurriendo en
el todo el organismo, esto de una forma directa, sin necesidad de cultivo [4].
Por lo tanto, es posible utilizar las células exfoliadas del tejido epitelial de la mucosa bucal para
evaluar el efecto genotóxico y citotóxico en poblaciones en alto riesgo, de forma sencilla, rápida y
económica, esto mediante la técnica de micronúcleos (MN) y detección de diversas anormalidades
nucleares [5], entonces, el uso de la técnica representa una oportunidad única y cada día se utiliza con
mayor frecuencia en todo el mundo para el estudio epidemiológico del impacto de la nutrición, estilos
de vida, evolución de enfermedades crónico degenerativas, exposición a genotóxicos, como
medicamentos, radioterapia, tabaco, alcohol, exposición ocupacional, envejecimiento y por supuesto
cáncer y tratamientos antineoplásicos, entre otros.
2. CÉLULAS MICRONUCLEADAS EN CÉLULAS EXFOLIADAS DE MUCOSA ORAL
COMO PARÁMETRO DE DAÑO GENOTÓXICO.
El monitoreo del daño genético mediante la utilización de biomarcadores se vislumbra como
una herramienta útil en la prevención de tumores, en la detección temprana de efectos secundarios de
enfermedades crónicos degenerativas y en el envejecimiento precoz. Por lo tanto la prueba de
micronúcleos (MN) constituye uno de los biomarcadores de efecto mas utilizados para monitorear el
daño al ADN. Los MN se forman durante la transición de metafase – anafase en mitosis, pueden ser
cromosomas completos rezagados debido a un daño al uso mitótico o bien fragmentos de cromosomas
acéntricos, en ambos casos no lograron incorporarse al núcleo de las células hijas [6]. Por lo tanto la
prueba de MN, se utiliza como parámetro para medir genotoxicidad y teratogenicidad [6,7] y detecta
tanto agentes clastogénicos (que fracturan cromosomas), como aneuploidogénicos (que afectan el huso
mitótico) pudiéndose diferenciar unos de otros por el tamaño de los MN [8] o la presencia del
centrómero o cinetócoro [9].
Estos eventos pueden ocurrir espontáneamente, sin embargo en presencia de ciertos agentes
endógenos [8-12] o exógenos [4, 12-14] dichos fenómenos se incrementan, así la presencia de MN se
transforma en indicador del efecto de agentes mutágenos, genotóxicos o teratógenos principalmente
micronucleogénicos [6,7]. El conteo de los MN es llevado a cabo fácilmente en cualquier tejido que se
divida [6-7], como ocurre en el epitelio de mucosa bucal [12-14]. Los MN observados en células
exfoliadas no se forman cuando las células se encuentran en la superficie del epitelio, pero si se
inducen en las células de la capa basal donde se lleva a cabo la división celular, de tal suerte que el
monitoreo de poblaciones en este tejido puede reflejar el daño ocurrido en el transcurso de 5 a 14 días
[15] esta prueba puede realizarse en frotis de células de mucosa bucal en el que se cuentan de 500 a
4000 células y se registran los micronúcleos encontrados [16].
3.
OTRAS ANORMALIDADES NUCLEARES EN CÉLULAS EXFOLIADAS DE MUCOSA
BUCAL
Además de los micronúcleos en células exfoliadas, Tolbert en 1991 describe otras anormalidades
nucleares las que son indicadores de genotoxicidad y/o citotoxicidad ya que las alteraciones más
sugestivas en la morfología de las células neoplásicas se producen en el núcleo, donde las
modificaciones son en el tamaño, densidad y distribución de la cromatina, además son fenómenos que
podrían ocurrir en procesos normales de diferenciación celular [5]. Estas anormalidades se pueden
distinguir de células normales por sus alteraciones ya sea en el citoplasma o en la morfología del
núcleo, entonces entre ellas se encuentran la cromatina condensada (CC), cariorrexis (CR), núcleo
picnótico (NP), cariolisis (CL), núcleo lobulado o también llamado prolongación nuclear (BE-NL), y la
presencia de células con dos núcleos, llamadas células binucleadas (BN). El mecanismo de formación o
su significado biológico de cada una de estas anormalidades no esta muy bien esclarecido, sin embargo
bajo condiciones patológicas (obesidad, artritis reumatoide, lupus eritematoso sistémico, diferentes
tipos del cáncer, problemas hematológicos como linfoma Inmunoblástico, leucemia aguda
megaloblástica; linfoma Hodgkin, leucemia granulocítica crónica, anemia linfocítica, mieloma
múltiple, anemia trombocitopénica, púrpura trombocitopénica idiopática, leucemia linfocítica aguda,
entre otras) o de exposición (tabaco, alcohol, drogas, quimioterapia antineoplásica) se observan altas
frecuencias, e incluso se Raj y cols, describieron, al aplicar radioterapia en pacientes con cáncer oral
efecto dosis- respuesta en la formación tanto de MN como de anormalidades nucleares, hecho que
podría ser utilizado como marcador de radiosensiblilad [17], además también se observan en procesos
de envejecimiento, como lo describieron Thomas y cols, en donde los MN, NL y las BN están
elevadas tanto en pacientes con síndrome de Down como en pacientes de edad avanzada (64 a 75 años
de edad), [18],. Por todas estas características, la prueba de identificación de anormalidades nucleares
es usada con mucha frecuencia como marcador de daño al ADN (MN y NL), defectos en la citocinesis
(BN), evidencia de muerte celular (CC, CR, PN, y CL), indicadores de diferentes etapas de necrosis,
(PN, CC, CR, CL), como un identificador de respuesta al daño celular (PN y CC) y para su
identificación básicamente se usan los criterios establecidos por Tolbert [5,18].
• Células Normales-(CN): El núcleo esta uniformemente teñido, es redondo u oval, se distinguen de
las células basales por que son de mayor tamaño, y el núcleo es mas pequeño en relación al
citoplasma. No contienen ningún otro cuerpo o estructura aparte del núcleo que contenga ADN,
estas células son consideradas como células totalmente diferenciadas y no se observan divisiones
celulares (figura No. 1).
• Célula Micronucleada-(CMN): Se caracteriza por la presencia de un núcleo principal y uno o mas
pequeñas estructuras nucleares denominadas MN. Un MN tiene la forma redonda o almendrada y
mide entre 1/3 y 1/16 del núcleo principal, presenta la misma intensidad, textura y plano focal que el
núcleo. Un MN es un fragmento o un cromosoma completo que al momento de la división celular
no logra ser integrado a uno de los núcleos de las células hijas (figura No. 2).
• Cromatina Condensada-(CC): Estas células tienen núcleos intensamente teñidos, con regiones
condensadas o cromatina agregada, con un patrón nuclear moteado o estriado, es evidente que la
cromatina está agregando en algunas regiones del núcleo, mientras que se pierde en otras áreas, y
algo característico es que la membrana nuclear aparentemente esta integra, cuando la condensación
es extensa da la apariencia de un núcleo fragmentado, estas células al igual que las células en
carriorexis terminan con la fragmentación del núcleo, lo que conlleva la desintegración eventual y
algunas veces aparecen como estructurar similares a los MN, pero estas no deben de ser
contabilizados como MN ya que su origen aun no es determinado, tal vez están en etapas tempranas
de la apoptosis, pero no es concluyente (figura No. 3).
• Cariorrexis-(CR): Presentan un núcleo que se caracteriza por fragmentación nuclear además de que
la membrana nuclear también esta fracturada o ausente. Estas células tal vez están pasando por una
fase avanzada de apoptosis pero esto no ha sido probado, (figura No. 4).
• Núcleo picnótico-(PN): Estas células se caracterizan por un núcleo pequeño, con alta densidad de
material nuclear que es uniforme, pero intensamente teñido. El diámetro del núcleo es
aproximadamente de 1/3 del núcleo normal, el significado biológico es desconocido pero se piensa
que estas células tal vez son una forma de muerte celular; sin embargo el mecanismo preciso sigue
siendo desconocido. Se correlaciona con diferenciación y maduración de las células epiteliales (ver
figura No. 5).
• Células binucleadas-(BN): Son células con dos núcleos en lugar de uno, usualmente los núcleos
están muy próximos e incluso podrían hacer contacto, con morfología similar a un núcleo normal, se
forman al con la división celular tardía. Las consecuencias de que se encuentren células binucleadas
son desconocidas, pero se piensa que es un evento que tiene lugar en dos etapas, en primer lugar
ocurre la mitosis que dará origen a dos núcleos pero el citoplasma no se divide, en consecuencia, se
forman una célula binucleada, misma que será eliminada si pertenece a un epitelio de revestimiento,
pero si este fenómeno ocurre en una célula del epitelio basal o pertenece a otro tejido entonces
ambos núcleos de la célula binucleada entraran en mitosis al mismo tiempo,los cromosomas de
ambos núcleos quedaran incluidos en el mismo huso y son arrastrados juntos, en el momento de que
la mitosis es completada habrá dos células con doble material genético cada una o bien una célula
tetrapaploide, si se repite la interrupción de la citocinesis, figura No. 6, [19].
• Cariolisis–(CL): En estas células el núcleo está completamente vacío de ADN y por lo tanto no
tienen núcleo, es probable que representen una fase muy avanzada en el proceso de muerte celular.
La correlación positiva entre células picnóticas y células con cariolisis sugiere que las células con
cariolisis derivan directamente a partir de células con cromatina condensada o indirectamente a
través de células picnóticas (figura No. 7).
• Núcleo lobulado o Prolongación nuclear, Broken eggs-(NL-BE). El núcleo presenta una fuerte
constricción en un extremo, sugestivos de una incipiente proceso de eliminación de material nuclear
por gemación, el lóbulo presenta las mismas características morfológicas y de tensión que el núcleo,
pero el tamaño es de 1/3 a ¼ del núcleo [5], Tolbert y cols los definieron como “Broken egg” mas
en 1998 Bhattathiri y colaboradores en células exfoliadas describe estos fenómenos como “Nuclear
buds” reconociéndolas como anormalidades nucleares, ellas describen estos fenómenos como
gemaciones de material nuclear muy próximas al núcleo sin una separación clara de este [20].,
posteriormente Cerqueira en 2004, describe a estos eventos como eventos diferentes. El origen y
significado biológico de los BE en células exfoliadas aun no es totalmente comprendido y existen
muy pocas publicaciones concernientes a este tema [21]. Algunos investigadores consideran los
“nuclear buds” en linfocitos como indicadores de genotoxicidad, sin embargo en células exfoliadas
no es claro ya que frecuentemente en diversos procesos de salud y enfermedad aparece en mayor
frecuencia los células micronucleados y los “Bud cells” muy disminuidos, o viceversa, por lo tanto
se puede asumir que
los BE-NL no están asociados a eventos genotóxicos, clastogénicos o
aneuploidogénicos, pero tal vez si a procesos degenerativas
epiteliales, (estrato germinativo), ver figura No. 7 [22].
en la primera capa de células
Células Exfoliadas de Mucosa Bucal
Fig. No 1: Célula Normal; Fig. No. 2: Célula micronucleada; Fig. No. 3: Cromatina
anormalmente condensada; Fig. No. 4: Cariorrexis, Fig No. 5: Picnosis; Fig. No.6 Binucleada:
Fig No. 7: Cariolisis: Fig. No. 8 Núcleo Lobulado–Broken egg-Bud cells
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