flujo de trabajo de cromatografía con intercambio catiónico

FLUJO DE TRABAJO DE CROMATOGRAFÍA
CON INTERCAMBIO CATIÓNICO
COLUMNAS HPLC AGILENT BIO IEX
COLUMNAS HPLC AGILENT BIO MAB
En este documento, los químicos de aplicaciones de Agilent comparten sus recomendaciones
para optimizar los sistemas LC y su configuración para caracterizar biomoléculas. También
ofrecen consejos sobre un método general para comenzar e indican cómo puede optimizarse
este método para satisfacer sus objetivos específicos de separación.
Encontrará información adicional de las aplicaciones en www.agilent.com/chem/advancebio
Sistema LC bioinerte
Agilent 1260 Infinity
Directrices
• Proteínas básicas: SCX o WCX.
• Tenga en cuenta el punto isoeléctrico (pI)
de la proteína de interés a la hora de
elegir el pH de la fase móvil. Si pH < pI,
la proteína tendrá una carga neta positiva.
• El pH del tampón inicial deberá tener un
pH entre 0,5 y 1 unidades menor que
el pI (inferior al pI para el intercambio
catiónico).
• Si desconoce el pI, utilice un pH = 6 para
el intercambio catiónico.
• Comience utilizando columnas SCX, que
ofrecen el rango operativo más amplio;
las columnas WCX pueden usarse para
mejorar la selectividad.
• Los tampones para intercambio catiónico
(pH entre 4 y 7) incluyen formiato, acetato,
MES, fosfato y HEPS.
Fase ligada
SCX (intercambio catiónico fuerte): SO3H
WCX (intercambio catiónico débil): COOH
Muestras
Columna
Anticuerpos monoclonales
Bio MAb
Péptidos y proteínas
Bio SCX y WCX
Proteínas globulares y péptidos
PL-SCX 1000Å
Biomoléculas muy grandes/análisis PL-SCX 4000Å
de alta velocidad
Proteínas y anticuerpos
Bio-Monolith SO3
Nota: Para conocer las referencias de las columnas HPLC
Bio IEX y Bio MAb de acero inoxidable, consulte la guía de
selección de columnas Agilent BioHPLC (5990-9384EN).
Fases móviles
La fase móvil debe contener un tampón (con una
concentración típica de 20 mM) para mantener el pH
operativo. La sal de elución tiene habitualmente una
concentración entre 400 y 500 mM.
El software Agilent Buffer Advisor se utiliza para crear
el perfil de gradiente necesario mediante la mezcla en
diferentes proporciones de cuatro soluciones de partida.
Inyección de muestras (G5667A)
Inyección de 1 a 10 µl para obtener una resolución máxima.
La muestra debe ser soluble en la fase móvil.
Flujo (G5611A)
Flujo típico entre 0,5 y 1,0 ml/min para las columnas de
4,6 mm de d.i.
Temperatura de la columna (G1316C)
Temperatura máxima: 80 °C. Para optimizar la vida útil de la
columna, debe utilizarse a una temperatura entre 10 y 50 °C.
Detección (G1315C)
UV (G1315D) con una celda de flujo estándar bioinerte
de 10 mm.
Selección de columnas
Descripción
4,6 x 250 mm, 10 µm
4,6 x 50 mm, 10 µm
4,6 x 250 mm, 5 µm
4,6 x 50 mm, 5 µm
2,1 x 250 mm, 10 µm
2,1 x 50 mm, 10 µm
2,1 x 250 mm, 5 µm
2,1 x 50 mm, 5 µm
Columnas HPLC Bio IEX (PEEK)
Bio SCX
Bio WCX
Referencia
Referencia
5190-2435
5190-2455
5190-2436
5190-2456
5190-2427
5190-2447
5190-2428
5190-2448
5190-2439
5190-2459
5190-2440
5190-2460
5190-2431
5190-2451
5190-2432
5190-2452
Columnas HPLC Bio MAb
(PEEK)
Referencia
5190-2415
5190-2416
5190-2407
5190-2408
5190-2419
5190-2420
5190-2411
5190-2412
Condiciones iniciales recomendadas
Anticuerpos monoclonales,
proteínas y péptidos
Anticuerpos monoclonales
Gradiente salino
Gradiente de pH
Gradiente salino
Columnas
Bio WCX, 4,6 x 250 mm, 10 μm
Bio WCX, 4,6 x 250 mm, 5 μm
Bio MAb, 4,6 x 250 mm, 5 μm
Bio SCX, 4,6 x 50 mm, 3 μm
WCX, 4,6 x 50 mm, 3 µm
Bio MAb, 4,6 x 50 mm, 3 μm
Fase móvil
A: Agua
B: NaCl 1,6 M
C: NaH2PO4 40,0 mM
D: Na2HPO4 40,0 mM
A: Agua
B: NaCl 1,6 M
C: NaH2PO4 40,0 mM
D: Na2HPO4 40,0 mM
A: Fosfato sódico 20 mM (pH = 5,0
para columnas WCX; pH = 6,0 para columnas SCX)
B: Tampón A + NaCl 1 mM
Gradiente
De 0 a 50 % B, de 0 a 20 min
(pH constante; por ejemplo, pH = 6,0); 50 % B,
de 20 a 25 min; 0 % B, de 25 a 35 min
pH de 6,0 a 8,0, de 0 a 20 min
NaCl de 0 a 800 mM, de 20 a 25 min;
NaCl 800 mM, de 25 a 30 min
De 1 a 100 % B durante 30 min para las columnas
de 50 mm; durante 60 min para las columnas de
250 mm
Flujo
1 ml/min
1 ml/min
0,5 ml/min
Temperatura
Ambiente
Ambiente
Ambiente
Inyección
10 μl
10 μl
10 μl
Muestra
2 mg/ml
(en tampón de fosfato de sodio 20 mM, pH = 6,0)
2 mg/ml
(en tampón de fosfato de sodio 20 mM, pH = 6,0)
Detección
UV, 220 nm
UV, 220 nm
Separación de patrones de proteínas a pH = 7,0
con una columna Agilent Bio WCX, 4,6 × 250 mm,
10 μm.
Análisis de un anticuerpo monoclonal de IgG
con un gradiente de pH de 6,5 a 7,5 (0-20 min),
50 mM, Agilent Bio MAb, 4,6 x 50 mm, 5 μm
La combinación de C y D en proporciones
predeterminadas permite obtener disoluciones tampón
de 20 mM dentro del rango de pH deseado.
La combinación de C y D en proporciones predeterminadas
permite obtener disoluciones tampón dentro del rango de
pH deseado y con la concentración necesaria.
UV, 220 nm
Separación de patrones de proteínas en columnas
de intercambio iónico de 3 μm de Agilent mediante
cromatografía de intercambio catiónico
Ovoalbúmina (pI = 4,5)
Ribonucleasa (pI = 9,4)
Ribonucleasa (pI = 9,4)
Citocromo C (pI = 9,8)
Citocromo C (pI = 9,8)
Lisozima (pI = 11)
Lisozima (pI = 11)
SCX
WCX
MAb 1
3
3
2
3
1
2
2
1
5
10
15
min
20
25
6
8
10
12
min
14
16
6
8
12
10
14
min
Agilent no se hace responsable de ningún error incluido en este
documento ni de ningún daño incidental o consecuencial relacionado
con la distribución, la aplicación o el uso de este material.
La información, las descripciones y las especificaciones de esta
publicación están sujetas a modificación sin previo aviso.
© Agilent Technologies, Inc. 2015
Impreso en EE. UU. el 1 de agosto de 2015
Número de publicación 5991-6104ES