Caracterización de la coagulación enzimática de leche en polvo

Revista Argentina de Producción Animal Vol 33 (2): 117-128 (2013)
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Caracterización de la coagulación enzimática
de leche en polvo entera
Characterization of whole milk powder rennet coagulation properties
Sbodio1, O.A., Tercero1, E.J., Martinez2,3, E.D.,
Didier2,3, M.J. y Revelli1, G.R.
Instituto de Tecnología de Alimentos. Facultad de Ingeniería Química. Universidad Nacional del Litoral.
INTEC (UNL – CONICET). Santa Fe, Argentina.
CCT – CONICET. Santa Fe, Argentina.
Resumen
La autom atización en el proceso de elaboración de quesos requiere el desarrollo de dispositivos
para el m onitoreo de la etapa de coagulación. El uso de una sonda de hilo caliente de platino
es una alternativa valiosa en el estudio de la fase prim aria de la coagulación. Los efectos de las
variables críticas: tem peratura, concentración de enzim a coagulante y pH sobre las respuestas:
tiem po de coagulación (TC), tiem po al punto de m áxim a inflexión (tmax) y firm eza del coágulo en
unidades de voltaje a los 30 m inutos de agregado el coagulante (V 30), en el proceso de
coagulación por quim osina fueron estudiados usando la sonda m encionada. Leche en polvo
entera del tipo “com ercial” reconstituida durante 22 horas fue utilizada para realizar los ensayos.
En el experim ento se aplicó un diseño rotacional com puesto y m etodología de superficie de
respuesta. Usando análisis de regresión lineal, los m odelos de 2° orden obtenidos, predijeron
satisfactoriam ente los efectos de la tem peratura, concentración de enzim a coagulante y pH
sobre el log TC (R 2: 0,9473), tmax (R 2: 0,9550) y V 30 (R 2: 0,9560). El TC dism inuyó
significativam ente con el increm ento de la concentración enzim ática (p: 0,0020), la tem peratura
(p: 0,0259) y con la dism inución del pH (p: 0,0005). La respuesta tmax fue afectada
negativam ente por el pH (p: 0,0005) y la concentración enzim ática (p: 0,0022), adem ás se
increm entó con el aum ento de la tem peratura (p: 0,0190). La tem peratura fue el principal factor
que incidió negativam ente en el V 30 (p: 0,0039). En las condiciones estudiadas el voltaje no
alcanzó su valor m áxim o ni com portam iento asintótico en 60 m inutos. La evaluación subjetiva
de técnicos queseros indicó que las características del gel eran no apropiadas para su corte y
m anejo. La dism inución del pH inicial y el agregado de CaCl2 aum entarían los niveles de voltaje
y perm itirían m ejorar las propiedades del gel en el proceso de elaboración de queso a partir de
leche en polvo entera.
Palabras clave: leche en polvo, quim osina, coagulación, sonda de hilo caliente.
Summary
The autom ation in cheese m aking requires the developm ent of sensor devices to m onitor
coagulation process, especially the hydrolysis and firm ing phase. The use of a platinum hot wire
probe is an im portant alternative for studying the prim ary phase of renneting of reconstituted
Recibido: octubre de 2012
Aceptado: marzo de 2014
1. Instituto de Tecnología de Alimentos. Facultad de Ingeniería Química. Universidad Nacional del Litoral. 1° de Mayo
3250 (CP: 3000). Santa Fe, Argentina. e-mail: [email protected]
2. INTEC (UNL – CONICET). Güemes 3450 (CP: 3000). Santa Fe, Argentina.
3. CCT – CONICET. Ruta Nac. N° 168 S/N, Pje. El Pozo (CP: 3000). Santa Fe, Argentina.
118
Sbodio, O.A. et al
whole m ilk powder com m ercial type. In this study, we m easured the effects of the critical
variables (tem perature, enzym e concentration and pH) on the responses: coagulation tim e (CT),
tim e of m axim um inflection point (tmax) and clot firm ness in voltage units at to the 30 m inutes of
aggregate the quim osine (V 30) of renneting m ilk process using a platinum hot wire probe and a
central com posite design. Com m ercial dry whole m ilk was reconstituted for 22 hours and
coagulated using quim osine. A linear regression analysis, 2 nd order m odel, was able to predict
satisfactorily the effects of tem perature, enzym e concentration and pH on log CT (R 2: 0. 9473),
tmax (R 2: 0.9550) y V 30 (R 2: 0.9560). W e observed a significant decrease in CT when the enzym e
concentration (p: 0.0020) and tem perature (p: 0.0259) were increased and also when the pH was
decreased (p: 0.0005). The value of tmax was negatively affected by the pH (p: 0.0005) and the
enzym e concentration (p: 0.0022). In addition, the response tmax increased with higher
tem perature (p: 0.0190). This study shows that the tem perature was the m ain variable that
induced a decrease in V 30 (p: 0.0039). Under these conditions, the voltage did not reach the
m axim um asym ptotic value in 60 m inutes. Since the cheesem aker are unable to observe the
appropriate voltage for cutting and curd m anagem ent, the addition of CaCl2 and the lowering pH
could im prove the dry whole m ilk powder coagulation properties.
Key words: dry whole m ilk, quim osine, coagulation, platinum hot wire probe.
Introducción
La elaboración de queso es un proceso
com plejo, que im plica en esencia, la rem oción
de agua o suero de la leche. De esta m anera,
los sólidos obtenidos pueden ser m anejados
en form a controlada. El proceso es acelerado
por el desarrollo de acidez producida por
bacterias lácticas y el aum ento de la tem peratura (Payne et al, 1993). La producción de
queso tiene im portancia económ ica y nutricional significativa para la industria de los alim entos. Económ ica, por la gran cantidad de toneladas que se producen en el m undo, y nutricional porque es un producto que aporta
nutrientes esenciales (Ca, P, proteínas de alto
valor biológico, entre otros).
Para controlar la elaboración de queso, es
necesario conocer con rigurosidad la com posición de la leche, sus aspectos m icrobiológicos y especialm ente m anejar las variables
críticas que caracterizan el proceso. Particularm ente, el pH inicial, la tem peratura, la
concentración y tipo de enzim a coagulante y el
CaCl2 adicionado. Una vez determ inados
correctam ente los niveles de las variables, es
im portante controlar las respuestas: tiem po de
coagulación (TC), tiem po al punto de m áxim a
inflexión (tmax, parám etro directam ente relacionado al tiem po de corte) y voltaje o firm eza del
coágulo (V 30). Esta últim a, es crítica para la
calidad y el rendim iento del producto final
(Bynum y Olson, 1982; Hori, 1985). Cortar
antes de que el coagulo alcance la firm eza
apropiada causa pérdidas de grasa y “finos”
(Mayes y Sutherland, 1984; Riddell-Lawrence
y Hicks, 1988) m ientras que cortando dem asiado tarde, se observa retención de suero y
por consiguiente m ayor velocidad de acidificación (Van Slyke y Price, 1952; W ilson y
Reinbold, 1965). Lograr optim izar el tiem po de
corte, m ejora el rendim iento, pudiéndose
controlar la hum edad del coágulo (Ustunol et
al, 1991).
La caracterización de la coagulación por
quim osina de leche en polvo entera del m ercado, perm itiría estudiar la viabilidad de elaborar algunos tipos de quesos a partir de ella. La
utilización de este tipo de sustrato observa
escaso tratam iento en la Literatura. El com portam iento de este tipo de sustrato está
sujeto a las condiciones térm icas a las que es
sometida la leche antes de su secado (en
genera reciben un tratam iento de entre 90 y
92 °C, 2 m inutos, que le aseguran a las em presas una buena reducción de la carga
bacteriana en el producto final), al proceso de
deshidratación y rehidratación, y probablem ente, al m anejo de los niveles de las varia-
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bles que son necesarios m odificar. El tratam iento térm ico m encionado, produce im portantes cam bios en las características de la
leche en polvo. La rem oción de agua durante
el proceso de secado prom ueve el pasaje de
Ca desde el suero hacia las m icelas, que
adem ás aum entan su tam año (Martin et al,
2007). La coagulación por quim osina de leche
reconstituida es m ás lenta que la de leche
cruda. La firm eza del gel es m ejorada increm entando el tiem po de reconstitución. Sin
em bargo, el gel producido por leche cruda
presenta m ayor firm eza que el de la leche
reconstituida (Martin et al, 2008). Las condiciones del tratam iento térm ico provoca
desnaturalización de las proteínas solubles y
com plejas interacciones entre proteínas del
suero, m icelas de caseína, m inerales y glóbulos grasos (Singh y W aungana, 2001) que
resultan en prolongados tiem pos de coagulación y reducidas firm ezas de los geles (Dalgleish, 1992).
El objetivo de este trabajo fue estudiar la
influencia de las variables tem peratura, pH
inicial y concentración de enzim a coagulante
sobre las respuestas TC, tmax y V 30 en la
coagulación enzim ática de leche en polvo
entera del tipo com ercial reconstituida.
Materiales y Métodos
Diseño experimental
Los efectos sobre el tiem po de coagulación (TC), tiem po al punto de m áxim a inflexión
119
(tmax) y voltaje a los 30 m inutos de agregado el
coagulante (V 30) de las tres variables críticas:
tem peratura, concentración enzim ática y pH
que caracterizan el proceso de la coagulación
enzim ática, fueron estudiados utilizando un
diseño rotacional centrado (Myers y Montgom ery, 1995), totalm ente al azar, de m anera de
m inim izar la incidencia de factores extraños
sobre la variabilidad. El diseño rotacional
corresponde a un factorial, que para el caso
de este experim ento es 2 3 (2 niveles, 3 variables) con dos puntos axiales (-1,682 y
+1,682). Los valores seleccionados para
iniciar el experim ento son -1 y +1, estos niveles observan el lím ite de la región de trabajo
real. Los rangos de las tres variables independientes tem peratura, concentración de enzima
coagulante y pH se presentan en el Cuadro 1.
Estos, fueron considerados de acuerdo a los
niveles que utiliza la industria quesera en el
proceso de elaboración de los tres tipos de
pasta (dura, sem idura y blanda). El diseño fue
reordenado de tal m anera de lograr ajustar un
polinom io de 2° orden en tem peratura (x 1),
concentración enzim ática (x 2) y pH (x 3). En las
condiciones del centro del diseño se realizaron 4 réplicas (4, 7, 8 y 12) de m anera de
estim ar el error experim ental. La conversión
de las variables codificadas a variables no
codificadas está dada por las siguientes
ecuaciones: Tem peratura= 3 . x 1 + 35, Concentración enzim ática = 0,010 . x 2 + 0,025 y
pH = 0,10 . x 3 + 6,50.
Cuadro 1: Variables independientes y sus niveles. Diseño central compuesto.
Table 1: Independent variables and their levels. Central composite design.
Variables
Símbolos
Temperatura (°C)
Concentración enzimática (UR/ml)
pH
x1
x2
x3
-1,682
29,94
0,0082
6,33
Niveles de variables codificadas
-1
0
1
+1,682
32
35
38
40,04
0,015
0,025
0,035
0,042
6,40
6,50
6,60
6,67
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Ensayo de coagulación
Leche en polvo entera instantánea del tipo
com ercial, de alto grado de calentam iento
(W PNI < 1,4), provista por la em presa Milkaut
(MILKAUT S.A., Frank, Santa Fe, Argentina),
fue utilizada para preparar el sustrato. El
m ism o se obtuvo disolviendo 240 g de polvo
en dos litros de agua destilada a 40 °C. Se
agregó com o conservante, azida sódica (Cicarelli, Santa Fe, Argentina) en dosis de 200 m g
por litro de leche. La com pleta disolución se
logró con vigorosa agitación durante 15 – 20
m inutos. El sustrato fue preservado a tem peratura am biente (15 – 18 °C) durante 22 horas
con el objeto de obtener la m ayor fuerza del
gel, de acuerdo a lo propuesto por Martin et al
(2008).
Un vaso de precipitado con dos litros del
sustrato -leche reconstituida- fue inm erso en
un baño term ostático (Haake F2-C, Germ any,
precisión 0,1 °C) a las diferentes tem peraturas
del ensayo (30, 32, 35, 38 y 40 °C) de acuerdo
al diseño, de m anera de cum plir con las 22
horas de tiem po de disolución. Una cantidad
fija de CaCl2 (3,6 m M ) (Cicarelli, Santa Fe,
Argentina) fue agregado al sustrato. Una vez
alcanzada la tem peratura deseada, se ajustaron los diferentes niveles de pH propuestos
por el diseño (6,33, 6,40, 6,50, 6,60 y 6,67)
utilizando ácido láctico al 85% (Mallinckrodt,
Chem ical W ork, Argentina) y/o NaOH al 40%
(Cicarelli, Santa Fe, Argentina). Un peachím etro Orion Research EA 940, equipado con un
electrodo Ham ilton Bonaduz AG, CH-7402
(Bonaduz, Switzerland) y calibrado con tres
soluciones buffer (pH: 4,01, 7,00 y 10,00)
(Ham ilton Bonaduz, Switzerland) fue utilizado
para el ajuste del pH.
El sensor que registra los cam bios de
viscosidad durante la coagulación enzim ática,
está por una sonda de hilo caliente de platino
(diám etro 0,025 m m ) de 50 Ù alojada en una
term ovaina de acero inoxidable 3A, EHEDG
(Intem pco Controls Ltd., Quebec, Canada).
Los m ateriales usados para alojar la term orresistencia corresponden a aquellos que no
m odifican la transferencia térm ica (patente
en trám ite) y, que en conjunto constituyen el
Sbodio, O.A. et al
sensor de viscosidad. El m ism o observa
conexión Kelvin de 4 hilos, por un par de ellos
se excita con una corriente continua constante
de 130 m A, provista por un generador de
corriente (6177C, 0 a 50 V, 0 – 500 m A, Hewlett Packard, Santa Clara, California, USA), y
por el otro se tom a los cam bios de la señal
m edidos en m ilivolts, característicos de los
cam bios de viscosidad en el sistem a Hori
(1985). La m edición es obtenida a través de
un m ultím etro (Keitley Instrum ents Inc., Cleveland, Ohio, USA) que digitaliza la inform ación.
La señal es tom ada por una PC, utilizando un
software desarrollado por el grupo de investigación de form a tal de obtener los perfiles de
voltaje vs tiem po. Con estos perfiles, el software determ ina el tiem po de coagulación (TC)
de acuerdo a Kopelm an y Cogan (1975), t max,
que corresponde al tiem po en el punto de
m áxim a inflexión (cam bio de signo de la
derivada dv/dt) y V 30 (voltaje a los treinta
m inutos de agregado el coagulante). Una vez
ajustada las variables del diseño, el sensor
descrito previam ente, es inm erso en la leche.
La estabilización de la tem peratura se logra
entre 30 y 40 m inutos. Alcanzado el estado
estacionario, se adiciona el coagulante quim osina (Chy-Max 950 IMCU. Chr. Hansen SAIC,
Buenos Aires, Argentina) m anteniendo agitación suave y en cantidades que determ inan la
concentración final de acuerdo al diseño
(0,0082, 0,015, 0,025, 0,035 y 0,042 UR/m l de
leche). El agregado del coagulante determ ina
el inicio del experim ento, y el voltaje m edido
se registra autom áticam ente a intervalos de
10 segundos, durante 60 m inutos. El perfil de
voltaje vs tiem po que genera el sensor fue
empleado para seleccionar los niveles de las
tres respuestas TC, tmax y V 30.
Las m etodologías analíticas aplicadas
para realizar el análisis com posicional y
m icrobiológico de la leche en polvo utilizada
en la experiencia fueron las siguientes: para
determ inar m ateria grasa se utilizó la Norm a
FIL-IDF 9C (FIL-IDF, 1987), para determ inar
proteínas totales verdaderas la Norm a FIL-IDF
20B (FIL-IDF, 1993), hum edad según Norm a
FIL-IDF 26 (FIL-IDF, 1982), la determ inación
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de m icroorganism os aerobios m esófilos viables se realizó según la Norm a FIL-IDF 100B
(FIL-IDF, 1991), coliform es totales según
Norm a FIL-IDF 73A (FIL-IDF, 1985) y coliform es fecales de acuerdo a la Norm a APHA
(APHA, 1992). El grado de calentam iento
(W PNI) se realizó de acuerdo a la Norm a FILIDF 114 (FIL-IDF, 1982).
El perfil de voltaje vs tiem po que genera el
sensor fue em pleado para registrar el com portam iento de respuesta durante 60 m inutos y
seleccionar los diferentes niveles de TC, tmax y
V 30. El Cuadro 2 m uestra los niveles de las
121
variables codificadas y las correspondientes
respuestas experim entales.
Análisis estadístico
Para el análisis de regresión, el ajuste de
los m odelos de 2° orden y la generación de
las superficies de respuestas, se utilizó el
program a Statgraphics Plus versión 7.1
(1994). Los ensayos para verificar que los
residuos satisfacen la asunción de norm alidad, independencia y aleatoriedad, se realizaron de acuerdo a Montgom ery (1991).
Cuadro 2: Variables codificadas de Temperatura, Concentración de enzima coagulante y pH con las
respuestas experimentales TC, tmax y V30 .
Table 2: Coded variables of Temperature, Enzyme concentration and pH with experimental responses
CT, tmax and V30.
Corrida
N°
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
Niveles de las variables
Temperatura Concentración de enzima coagu(x1)
lante (x2)
-1
-1
-1,682
0
1
1
0
0
1
-1
0
0
0
1
-1
0
1,682
0
-1
1
0
0
-1
1
0
0
-1
-1
-1,682
0
0
1
1
1,682
0
0
pH
(x3 )
TC
(min)
-1
-1
0
0
1
1
0
0
-1
1
0
0
-1,682
-1
1
0
0
1,682
2,08
1,65
2,91
2,17
4,21
2,52
2,30
2,16
1,74
4,23
45,6
1,94
1,61
1,49
3,15
1,85
2,07
4,01
Respuestas
tmax
V30
(min)
(mV)
3,08
1,68
4,27
3,07
5,22
3,48
3,28
3,28
2,27
5,90
5,92
2,68
1,67
1,67
4,82
2,68
3,08
5,50
155
147
148
140
127
131
129
134
124
143
139
138
134
114
149
140
112
141
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Sbodio, O.A. et al
Resultados y Discusión
La com posición de la leche en polvo
entera com ercial utilizada para preparar el
sustrato, observó los siguientes indicadores:
m ateria grasa: 27,16% , proteínas totales
verdaderas: 26,47%, hum edad 2,95%, recuento de m icroorganism os aerobios m esófilos viables: 3,1 x 10 3 UFC/g, coliform es totales
< 0,4 UFC/g y coliform es fecales < 0,3 UFC/g.
Tiem po de coagulación, tmax y V 30 son
im portantes parám etros, toda vez que sus
niveles m uestran una estrecha relación con la
calidad y el rendim iento del producto final. Las
tres m ejores ecuaciones, para estas respuestas, fueron obtenidas usando el procedim iento
del m áxim o coeficiente de determ inación (R 2),
incluyendo las variables independientes (tem peratura, concentración enzim ática y pH, y
considerando una adición constante de CaCl2
(1,8 m M). Los resultados del ANOVA para los
m odelos ajustados son ilustrados en el Cuadro 3.
El test de Fisher indica, que en térm inos
de la superficie de respuesta para TC, hubo
falta de ajuste significativo (p < 0,05). Por esta
razón los resultados experim entales fueron
m odificados a través de transform aciones
m atem áticas, adoptando log TC en lugar de
TC. Las respuestas log TC, tmax y V 30 de
acuerdo al F-test fueron significativas a un
nivel de confianza del 5%. Los coeficientes de
variación fueron relativam ente bajos, com o lo
m uestra el Cuadro 3, por consiguiente m idieron razonablem ente la reproducibilidad de los
m odelos. En el Cuadro 4 se reportan las
m ejores ecuaciones de predicción para cada
una de las variables, todas exhiben falta de
ajuste no significativo m ayor que 0,05, de lo
que se infiere que los m odelos parecen ser
adecuados, para los datos observados, al
nivel de confianza del 95%.
El análisis de varianza (ANOVA, Cuadro
3) y los coeficientes de regresión (Cuadro 4)
para log TC, explican el 94,73% de la variabi-
Cuadro 3: ANOVA para los modelos ajustados log TC (min), tmax (min) y V30 (mV).
Table 3: ANOVA for the fitted models log CT (min), tmax (min) and V30 (mV).
log TC
gl
sc
F
gl
x1
1
0,0161449
17*
1
x2
1
0,100733
106,08*
1
x3
1
0,255388
268,94*
1
x1 . x2
1
0,000475
0,50
1
x1 . x3
1
0,00007
0,07
1
x2 . x3
1
0,0041847
4,41
1
2
x1
1
0,0022018
2,32*
1
x22
1
0,0187837
19,78
1
x32
1
0,0043363
4,57
1
Falta de ajuste
5
0,019246
4,05
5
Error puro
3
0,0028489
3
Total
17
0,41946
17
R2
0,9473
CV (%)
8
*Significativo a nivel del 5%, CV (%): coeficiente de
grados de libertad, sc: suma de cuadrados.
Coeficientes
tmax
sc
F
gl
1,71624
21,45*
1
7,7118
96,49*
1
21,5647 269,47*
1
0,00245
0,03
1
0,18
2,25
1
0,08405
1,05
1
0,206782
2,58*
1
1,53902
19,23
1
0,116671
1,46
1
1,30558
3,26
5
0,240075
3
34,3961
17
0,955
8,01
variación, R2: coeficiente de
Revista Argentina de Producción Animal Vol 33 (2): 117-128 (2013)
V30
sc
F
1863,41 66,49*
2,58639
0,09
42
1,52
3,05245
0,11
105,825
3,78
91,4753
3,26
44,1685
1,58
34,1924
1,22
11,1763
0,40
18,1013
0,13
84,0719
2323,09
0,9560
3,89
determinación, gl:
Caracterización de la coagulación enzimática de leche ...............
lidad, y dado que el valor de P para la falta de
ajuste es > 0,05, concluim os que el m odelo,
así ajustado, es adecuado en las condiciones
ensayadas. Cuatro efectos, a saber, x 1 (p:
0,0259), x 2 (p: 0,0020), x 3 (p: 0,0005) y x 22 (p:
0,0211), observan que son significativam ente
diferentes de cero a un nivel de confianza del
95%. Los coeficientes de las ecuaciones de
predicción nos indican que la influencia positiva m ayor la determ ina el pH, resultando en un
increm ento del TC a m edida que aum enta el
pH, y la influencia negativa m ayor esta dada
por la concentración de enzim a coagulante. La
fórm ula de regresión sugiere que el pH de la
leche es el factor fundam ental a controlar, en
coincidencia con Hori (1985) que estudió el
efecto en leche en polvo y Okigbo et al (1985)
que lo hicieron en leche fluida. La influencia
negativa de la concentración enzim ática
coincide con hallazgos reportados, para diferentes sustratos, con Storry y Ford (1982),
Hori (1985), Okigbo et al (1985) y Brown y
Collinge (1986). La m edida de la respuesta del
TC proporcionada por el sensor confirm a el
cum plim iento de la Ley de Holter que expresa
que el TC está correlacionado linealm ente con
la inversa de la concentración enzim ática
(Holter, 1932).
123
El m ism o análisis de varianza para tmax
m uestra que las variables x 1 (p: 0,0190), x 2
(p: 0,0022), x 3 (p: 0,0005) y x 22 (p: 0,0022),
son significativam ente diferentes de cero al
nivel de confianza del 95%. El nivel de significación P para la falta de ajuste (Cuadro 4) es
m ayor que 0,05, lo que indica que el m odelo
es adecuado en las condiciones estudiadas.
Adem ás, el coeficiente de determ inación R 2:
0,9550, explica que el m odelo contem pla el
95,5% de la variabilidad de tmax es decir es
altam ente satisfactorio. El factor positivo que
afecta la variable pH, es el m ás im portante,
dem ostrando que cuando el pH se increm enta
aum enta sustancialm ente el valor de la respuesta tmax. Las pendientes negativas, que
afectan a las variables tem peratura y concentración enzim ática, nos m uestran que la respuesta dism inuye con el aum ento de las
m ism as. Los estim ados m uestran que las
influencias decrecen en el orden: pH, concentración enzim ática y tem peratura. El tiem po de
corte de la cuajada está tam bién relacionado
al tmax. Payne et al (1993) m ostraron que el
tiem po de corte se puede expresar de m anera sim ple com o: Tiem po de Corte = â . t max.
Cuadro 4: Mejores ecuaciones de predicción para log TC, tmax y V30 usando tres variables independientes:
Temperatura, Concentración enzimática y pH.
Table 4: Best prediction equations for log CT, tmax and V30 using three independent variables:
Temperarature, Enzyme concentration and pH.
Variables
dependientes
Ecuaciones de predicción
R2
p
log TC = 0,331882 - 0,0343812 . x1 - 0,0858791 . x2 + 0,136742 . x3 +
0,0131911 . x1 2 - 0,0077045 . x1 . x2 + 0,0028555 . x1 . x3 + 0,0385288 . 0,9473 0,1394
x2 - 0,022871 . x2 . x3 + 0,018512 . x32
tmax = 3,09606 - 0,35448 . x1 - 0,7519 . x2 + 1,56653 . x3 + 0,127835 .
tmax
x12 + 0,0175 . x1 . x2 - 0,15 . x1 . x3 + 0,34875 . x22 - 0,1025 . x2 . x3 +
0,9550 0,1796
0,09602 . x32
V30 = 135,387 - 11,6804 . x1 - 0,435161 . x2 + 1,76417 . x3 - 1,86832 .
V30
x12 - 0,617703 . x1 . x2 + 3,63705 . x1 . x3 + 1,64384 . x22 + 3,38148 . x1 . 0,9560 0,9749
x3 + 0,939818 . x32
p: Falta de ajuste.
log TC
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124
Recientem ente, Fagan et al (2007) reportaron
ecuaciones que perm iten predecir las pérdidas de grasa, hum edad y el rendim iento de la
cuajada en función de tmax, concluyen que a
tiem pos prolongados de tmax m ayores serán
las pérdidas de grasa, m ayor el contenido de
hum edad y m ayor el rendim iento de la cuajada. En general, los técnicos queseros tam bién
sostienen que el tiem po de corte de la cuajada
es entre 1,5 y 2 veces el tiem po de coagulación. Por consiguiente el m onitoreo del TC y
tmax durante el proceso puede contribuir a
estim ar el tiem po de corte.
El m odelo ajustado para la respuesta V 30
m uestra que un solo efecto (x 1) es < 0,05,
siendo entonces la tem peratura la única
variable significativam ente diferente de cero a
un nivel de confianza del 95% . El valor de P
para la falta de ajuste es > 0,05 (p: 0, 9749),
por lo que podem os considerar que el m odelo
es adecuado. De la observación de las pendientes, inferim os que la tem peratura es la
variable m ás influyente (Cuadro 4). El efecto
x 1 m uestra el coeficiente m ás alto (11,6804),
es decir la variable tem peratura m uestra la
influencia negativa m ayor, casi de m anera
excluyente. En sum a, de acuerdo al m odelo,
el aum ento de la tem peratura im plica una
dism inución de V 30. Este com portam iento
podría explicarse porque la fase de agregación está relacionada a la dism inución de la
carga neta, con predom inio de enlaces hidrofóbicos (W alstra, 1993), que juegan un rol
im portante en m odular las interacciones entre
las m icelas coaguladas (Zoon et al, 1988). Los
enlaces hidrofóbicos de la caseína y la fijación
de iones Ca son m uy dependientes de la
tem peratura (Peri et al, 1990). Se puede
concluir que el desarrollo de la firm eza es un
proceso com plejo. Los resultados en este
ensayo son contradictorios con los hallazgos
de Taifi et al (2006), estos autores usaron
ultrasonido para estudiar la firm eza de un gel
de leche en polvo com ercial, y reportaron que
la m ism a se increm enta con el aum ento de la
tem peratura. En otro ensayo, utilizando leche
cruda y registrando el proceso con un viscosím etro Brookfield, Kowalchyk y Olson (1977)
observaron un dram ático efecto positivo de la
Sbodio, O.A. et al
tem peratura sobre la m ism a propiedad. Sin
em bargo, otros autores, entre ellos Ram et y
W eber (1980) y Storry y Ford (1982) usando
ultrasonido y el Form agraph, respectivam ente,
m ostraron que la fuerza de un gel, se reduce
con el increm ento de la tem peratura, en coincidencia que las observaciones de este ensayo.
Si asum im os que el voltaje representa el
valor de la firm eza del coágulo, el m onitoreo
de V 30 adquiere relevancia debido a que está
dem ostrado que las propiedades físicas en el
m om ento del corte de la cuajada son factores
que influyen en la pérdida de grasa en el
suero (Ridell-Lawrence y Hicks, 1988; Fagan,
2007) y la calidad del queso (Van Slyke y
Price, 1952; W ilson y Rainbold, 1965; Bynum
y Olson, 1982; Hori, 1985; Okigbo et al, 1985).
La Figura 1, ilustra que bajo condiciones
estándares de elaboración de quesos, cuando
la leche en polvo entera reconstituida es
coagulada a pH: 6,6, tem peratura: 35 °C,
concentración de enzim a 0,004 UR/m l de
leche y el agregado de 1,8 m M de CaCl2
(condición 3) la señal que em ite el sensor,
m uestra un crecim iento constante de la firm eza durante 60 m inutos de ensayo, es decir que
la coagulación no alcanza un nivel m áxim o de
firm eza ni el característico com portam iento
asintótico que se logra con leche cruda som etida a pasteurización. Adem ás, en las condiciones estudiadas, las evaluaciones de los
técnicos queseros no observaron una firm eza
apropiada para el corte y operaciones sobre el
gel, en concordancia con Hori (1985), quien
utilizando un dispositivo que usa el m ism o
principio, reportó que la viscosidad de m uestras de leche en polvo reconstituida coagulada
por la acción de enzim as, nunca alcanza el
valor requerido de firm eza apropiado para el
corte.
En relación a los resultados presentados,
se puede inferir que estam os en presencia de
un sustrato que ha sufrido m odificaciones de
sus propiedades para coagular. Estas alteraciones, pueden ser atribuidas al proceso de
elaboración de leche en polvo. Se reporta que
la deshidratación prom ueve la transición de
Ca del suero a las m icelas de caseínas, que a
Revista Argentina de Producción Animal Vol 33 (2): 117-128 (2013)
Caracterización de la coagulación enzimática de leche ...............
125
Las condiciones 1, 2 y 3 se coagularon a una Temperatura de 35 °C y una Concentración enzimática de
0,004 UR/ml de leche.
Figura 1: Perfiles comparativos de coagulación enzimática de leche en polvo entera.
Figure 1: Comparative profiles of enzyme whole milk powder rennet coagulation.
su vez aum entan su tam año y no revierten
después de la rehidratación. La reconstitución
de leche en polvo no form a un gel fuerte, aún
después de 22 horas y no alcanza el valor de
firm eza que m uestra la leche cruda original
(Martin et al, 2007, 2008). Adem ás, altos
tratam ientos térm icos (tem peraturas superiores a los 70 °C) producen desnaturalización
de la á-lactoalbúm ina y â-lactoglobulinas.
Estas proteínas desnaturalizadas se ligan a la
ê-caseína en la superficie de la m icela, form ando com plejos solubles y tam bién com plejos solubles de proteínas de suero. Reciente-
m ente Kethireddipalli et al (2010), dem ostraron que la incapacidad de coagular por acción
de la quim osina, en leche tratada térm icam ente, es atribuible al efecto sinérgico de las
m icelas m odificadas por acción del calor, los
complejos solubles form ados entre ê-caseína
y proteínas solubles y otros com ponentes
dializables del suero.
Los antecedentes de dism inución del Ca
sérico y aum ento del tam año de las m icelas
de caseína, sum ado a experiencias que indican que las leches sufren m odificaciones por
la aplicación de diferentes tratam ientos térm i-
Revista Argentina de Producción Animal Vol 33 (2): 117-128 (2013)
126
cos, dem uestran que se puede recuperar su
coagulabilidad usando diferentes alternativas,
entre ellas el agregado de CaCl2. La propiedad de coagular puede ser restaurada con el
agregado de CaCl2 (Udabage et al, 2001).
W aungana (1995) m ostró que la adición de
CaCl2 resulta en la dism inución del TC y
form ación de geles fuertes en leches tratadas
y no tratadas. La acidificación de leche que ha
sufrido un tratam iento térm ico resulta en
cortos tiem pos de coagulación e increm ento
de la firm eza del gel (Singh et al, 1988). Recientem ente, Sbodio et al (2010) m ostraron
que leches con m oderado tratam iento térm ico
(20% de desnaturalización) revierten su com portam iento a la coagulación con el agregado
de 3,6 m M de CaCl 2 y bajando el pH a 6,4.
Teniendo en cuenta esta experiencia y con el
propósito de m ejorar su com portam iento a la
coagulación del sustrato leche en polvo entera
reconstituida, se coaguló a pH 6,4 con el
agregado de 3,6 y 5,2 m M de CaCl2. En la
Figura 1 se representan los perfiles obtenidos
bajo tres condiciones. La condición 1 representa la coagulación a tem peratura (35 °C),
concentración enzim ática (0,004 UR/m l leche), a bajo pH (6,4) y una concentración de
3,6 m M de CaCl2. La respuesta V 30 resulta en
un nivel de 118 m V, no obstante no constituye, a juicio de los técnicos queseros, condición adecuada de firm eza para el corte de la
cuajada. La señal del sensor, observa que la
m ism a alcanza un determ inado valor y luego
decae, debido probablem ente a la presencia
de m icrosinéresis. En cam bio, a pH 6,4 con el
agregado de 5,2 m M de CaCl2 (condición 2),
a tem peratura y concentración enzim ática
sim ilar a la condición 1, la firm eza se increm enta sustancialm ente, V 30 alcanza un valor
de 130 m V, es decir 8% superior al nivel
obtenido en la condición anterior. Logra un
valor m áxim o a partir de los 50 m inutos y un
com portam iento asintótico. En estas condiciones los técnicos queseros determ inaron que,
aproxim adam ente a los 30 m inutos, las características del coágulo son las apropiadas para
el corte. De la com paración de los perfiles
obtenidos bajo las tres condiciones surge
claram ente el mejoram iento de la coagulación.
Sbodio, O.A. et al
En general, los técnicos queseros cortan
la cuajada entre 1,5 y 2 veces el TC. En cam bio, para este tipo de sustrato el tiem po de
corte es m ás prolongado que aquel producido
con leche fluida. Se podría inferir que al no
descender la señal, el gel retendría m ayor
hum edad, por consiguiente será necesaria
m odificar las operaciones de corte y agitación.
En suma, bajar el pH y agregar 5,2 m M de
CaCl2 m odifican las características del gel,
m ejora su firm eza y retiene m ás hum edad
debido probablem ente al predom inio de enlaces puente Ca en lugar de enlaces hidrofóbicos.
Conclusiones
El uso de un sensor de estas características y el diseño rotacional centrado perm itieron
estudiar la influencia de las variables críticas
tem peratura, concentración enzim ática y pH
sobre las tres respuestas de interés tecnológico TC, t max y V 30 utilizando leche en polvo
entera.
El TC y tmax estuvieron significativam ente
influenciados por las tres variables estudiadas. En cam bio, la tem peratura es la variable
que m ostró la principal influencia sobre V 30. El
voltaje, en las condiciones estudiadas creció
indefinidam ente, durante 60 m inutos de experiencia y no alcanzó el valor m áxim o ni un
com portam iento asintótico característico de la
respuesta. En condiciones estándares de
elaboración industrial, a juicio de los técnicos
queseros, las características del coágulo no
perm itirían determ inar el m om ento del corte.
Se puede inferir que el sustrato está fuertem ente m odificado, consecuencia del tratam iento térm ico y el proceso de deshidratación.
La m odificación de los niveles de las variables
pH (6,4) y el agregado de cantidades superiores de CaCl2 (5,2 m M) perm itieron observar
un im portante m ejoram iento de la coagulabilidad, de esa m anera perm itirían el procesam iento de la cuajada. Concluim os que es
necesario profundizar m ás aún en el com portam iento de este tipo de sustratos, particularm ente en las operaciones poscorte de la
cuajada.
Revista Argentina de Producción Animal Vol 33 (2): 117-128 (2013)
Caracterización de la coagulación enzimática de leche ...............
Agradecimientos
El presente estudio se desarrolló en el
m arco del proyecto CAI + D 2009. Proyecto
especial, no subsidiado (Universidad Nacional
del Litoral). Los autores expresan su agradecim iento al Dr. Mario Chiovetta (CCT – CONICET, Santa Fe) por el apoyo financiero, y al
Ing. Carlos Meinardi (Facultad de Ingeniería
Quím ica, Universidad Nacional del Litoral) por
su excelente asistencia técnica.
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