aplicación de lacasa y mediadores naturales en el

V CONGRESO IBEROAMERICANO DE INVESTIGACION EN CELULOSA Y PAPEL 2008
CIADICYP Octubre 2008, Guadalajara, Jalisco, México
Departamento de Madera, Celulosa y Papel, Centro Universitario de Ciencias Exactas e Ingenierías
Universidad de Guadalajara
Km. 15.5 Carretera Guadalajara-Nogales, C.P. (45200), Zapopan, Jalisco, México
Tel: (52)33 -3682-0110, Ext.118, e-mail: [email protected]
APLICACIÓN DE LACASA Y MEDIADORES NATURALES EN EL
BLANQUEO DE PASTA DE LINO
APPLICATION OF LACCASE AND NATURAL MEDIATORS IN
BLEACHING OF FLAX PULPS
Vila, Carlos; Colom, Jose F; Vidal, Teresa
Universitat Politècnica de Catalunya, Departament d'Enginyeria Tèxtil i Paperera, Colom 11, 08222
Terrassa. España. Tlf.: +34937398190. Fax: +34937398101. e-mail: [email protected]
RESUMEN
En los ultimos años se han realizado muchos trabajos de investigación acerca del sistema lacasa-mediador
para el blanqueo de pastas madereras, pero poco es lo que se conoce del comportamiento de este sistema
en pastas no madereras. En este trabajo se estudia la efectividad como mediadores del acido galico
(GALAC), acido cafeico (CAFAC) y del acido p-hidroxibenzoico (HBAC), comparando las propiedades de
estas pastas (numero kappa, blancura y viscosidad) con las obtenidas mediante el uso como mediador del
1-Hidroxibenzotriazol (HBT).
La deslignificación enzimatica (etapa L) es completada con una etapa de blanqueo con peroxido de
hidrogeno (etapa P) para mejorar las propiedades de las pastas. El mediador HBT experimenta un descenso
final del numero kappa de un 82% y un incremento de la blancura del 46%. Los mediadores naturales
producen descensos del numero kappa (72-77%) e incrementos del blanqueo (34-44%) un poco menores
que los obtenidos con HBT.
PALABRAS CLAVES
Lacasa, mediadores naturales, lino, blanqueo, enzimas.
ABSTRACT
During the last years, much research are focused in the laccase-mediator system for wood pulp bleaching,
but little is known about the efficiency in the non-wood pulps. This work deals with the study of the
effectiveness of three plant phenols, namely gallic acid (GALAC), caffeic acid (CAFAC), p-hydrosybenzoic
acid (HBAC) as laccase mediators and compare it to the one exhibited by 1-hydroxybenzotriazole (HBT) in
terms of brightness, kappa number and viscosity modifications determined on the pulp treated.
The enzymatic stage (L stage) was followed by a peroxide treatment (P stage) in order to attain higher
brightness. After the L stage all the natural mediators produced an increase in kappa number, which denotes
a possible partial condensation of the mediator in the phenoxy radical form on the pulp. HBT resulted in a
82% decrease of final kappa number and a increase of 46% in brightness. Natural mediators produced a
minor decrease of final kappa number (72-76%) and a minor increase in brightness (34-44%).
KEYWORDS
Laccase, natural mediators, flax, bleaching, enzymes.
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Departamento de Madera, Celulosa y Papel, Centro Universitario de Ciencias Exactas e Ingenierías
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INTRODUCCIÓN
Durante los últimos años el blanqueo de pasta ha experimentado un gran numero de cambios con el fin de
reducir el volumen y toxicidad de los efluentes producidos. Así, en la mayor parte de los casos se ha
eliminado el blanqueo con Cl2 que fue durante muchos años el agente químico mas ampliamente utilizado
en el blanqueo. Actualmente las secuencias en las que el color se sustituye por ClO2, llamadas ECF (del
ingles elemental chlorine free), han reducido considerablemente la toxicidad de los efluentes pero no ha
conseguido una eliminación completa de los compuestos clorados. La eliminación completa de los
compuestos clorados de las secuencias de blanqueo ( blanqueo TCF, del ingles totally chlorine free) supone
la utilización del O2, H2O2 y el O3 como principales agentes blanqueadores.
Las pastas no madereras son generalmente mas difíciles de blanquear que las pastas madereras debido a
sus características químicas y anatómicas (1) y el blanqueo mediante secuencias totalmente libres de cloro
(TCF) generalmente no es suficiente para obtener grados de blancura adecuados. La implementación de
etapas de blanqueo usando enzimas lignoliticas tienen un gran potencial debido a la posibilidad de obtener
buenos grados de blancura con un uso menor de reactivos químicos (2).
Las lacasas son enzimas que catalizan la oxidación de una gran cantidad de substratos fenólicos. Gran
parte de la lignina esta formada por compuestos no fenólicos que la lacasa por si sola no puede modificar.
El rango de acción de las lacasas puedes ser aumentado para incluir a los compuestos no fenólicos
mediante el uso de mediadores. Los mediadores son moléculas de bajo peso molecular fácilmente
oxidables por la enzima y que a su vez oxidan otras sustancias con potencial redox mayor que la lacasa.
Algunos mediadores sintéticos como ABTS, HBT o ácido vilurico muestran buenos resultados en
deslignificación, pero estos mediadores tienen un precio elevado y propiedades toxicas, y por otra parte la
enzima se desnaturaliza por la formación de radicales activos.
El uso de compuestos naturales como mediadores puede presentar ventajas desde el punto de vista
medioambiental y económico. El objetivo de este trabajo es evaluar la efectividad como mediadores de
ácido gálico, ácido cafeico y ácido p-hidroxibenzoidco, con el fin de obtener sistemas lacasa-mediador mas
baratos, eficientes y medioambientalmente mas favorables.
METODOLOGIA
La pasta de lino con un numero kappa de 6.5 y blancura de 36% ISO ha sido proporcionada por CELESA
(España). La lacasa (EC 1.10.3.2) de Trametes villosa 588 U/mL ha sido suministrada por Novozymes
(Dinamarca). Los mediadores empleados: 1-hidroxibenzotriazol (HBT), ácido gálico (GALAC), ácido cafeico
(CAFAC) y ácido p-hidroxibenzoico (HBAC), se han obtenido de Sigma-Aldrich.
Antes del tratamiento enzimático la pasta se somete a un lavado ácido con disolución de H2SO4 al 2% de
consistencia y pH 4.
El tratamiento enzimático de la pasta (etapa L) se ha llevado a cabo en un Ahiba Spectradye dyeing
apparatus de Datacolor International (Suiza) en reactores cerrados (250 mL) en las siguientes condiciones:
10 g de pasta seca a una consistencia del 5% se tratan con 20 U lacasa/g de pasta, 1,5 % y 3% de
mediador (HBT, GALAC, CAFAC, HBAC), 0,05% de Tween 20 (surfactante no iónico) en una disolución
tampón de pH 4 con tartrato sodico 50 mM, a 30 ºC y 50 ºC, con 50 oscilaciones por minuto durante 4h. Se
realizan experimentos control en las mismas condiciones sin añadir mediador. Una ver realizado el
tratamiento enzimático la pasta se filtra y se lava con agua.
Despues de la etapa L se ha realizado un tratamiento de blanqueo con peróxido de hidrógeno en medio
alcalino (etapa P). Estos tratamientos se han llevado a cabo en el mismo equipo (Ahiba Spectradiy dyeing
apparatus), usando reactores cerrados de 150 mL en las siguientes condiciones: 5 g de pasta a una
consistencia del 5% con 1,5% NaOH, 3% de H2O2, 1% de DTPA (ácido dietilen triaminopentaacético), 0,2%
de MgSO4 (todos los porcentajes respecto a pasta seca), 90 ºC con 50 oscilaciones por minuto durante 2
horas.
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La blancura y el numero kappa se han medido de acuerdo a las normas ISO 3688 e ISO 302
respectivamente (ISO, 1998). Las propiedades ópticas de la pasta se han medido usando un
Espctrofotómetro Technidyne Colour Touch con el iluminante estándar D65.
RESULTADOS
El índice Kappa obtenido para la pasta inicial después del lavado ácido es de 4.70 y la blancura obtenida
para esta pasta es de 36% ISO.
Los resultados obtenidos tanto en la etapa de deslignificación enzimática como en la etapa de blanqueo con
peróxido de hidrógeno del índice de kappa y blancura se muestran en la Tabla 1 y en las figuras 1 y 2.
Experimentos a 30°C
Etapa L
Kappa Blancura
Control
HBT 1.5%
GALAC 1.5%
CAFAC 1.5 %
HBAC 1.5 %
HBT 3 %
GALAC 3 %
CAFAC 3 %
HBAC 3 %
4.68
3,27
4,99
6,59
5,46
2,79
5,58
6,74
6,17
35.69
40,74
29,33
28,21
33,43
41,41
37,31
32,15
38,04
Experimentos a 50°C
Etapa P
Kappa Blancura
1,17
0,81
1,22
1,05
1,62
0,72
1,05
1,05
1,65
64,06
76,97
66,47
62,60
64,48
74,55
63,45
61,37
66,68
Etapa L
Kappa Blancura
4,13
2,73
6,4
7,69
6,69
3,27
5,18
7,49
5,56
35.64
41,57
28,97
23,31
37,38
41,11
30,19
25,14
35,43
Etapa P
Kappa Blancura
1,07
0,73
1,07
1,47
0,79
0,84
1,03
1,33
2,06
64,48
75,99
64,81
61,91
67,04
73,34
73,15
62,28
68,62
Tabla 1: Tabla de datos de índice kappa y blancura para experimentos realizados a 30°C y 50°C sobre pasta
de lino con kappa 6.25.
En la figura 1(a) se representan los resultados obtenidos en lo experimentos realizados a 30°C con
concentraciones de mediadores de 1.5% y 3%. Comparando los resultados obtenidos frente al control
lacasa, el mediador HBT es el único que reduce el índice Kappa (31% de disminución) en la etapa de
deslignificación enzimática. De los mediadores naturales el GALAC es el que tiene un aumento de índice
Kappa menor (incrementa un 6% su índice kappa) y el CAFAC el que tiene un mayor incremento del mismo
(40% de incremento). Los experimentos realizados a 50°C (figura 1(b)) tienen un comportamiento similar,
con reducción en el índice Kappa para el HBT del 33% y aumento del mismo en los mediadores naturales,
siendo este aumento en este caso mayor (aumento del 54% en GALAC, 86% en CAFAC y 61% en HBAC).
En la secuencia LP todos los mediadores comparados con el control lacasa, excepto con HBAC tienen
valores del índice kappa menores. En los experimentos realizados a 30°C el valor mas bajo de índice kappa
se obtiene con el HBT ( 28% inferior de índice kappa a concentraciones de 1.5% y un 38% inferior a
concentraciones del 3% con respecto al control lacasa) como mediador. Con respecto a la pasta inicial la
reducción del índice kappa es del 82% a concentraciones de 1.5% y del 84% con un 3%. De los mediadores
naturales el CAFAC es el que presenta mejores valores con índice kappa un 10% y 9% menor con respecto
al control lacasa y reducción con respecto a la pasta inicial del 77% en ambas concentraciones. Con el
mediador GALAC el valor obtenido con un 1.5% de concentración es un 4% superior al control lacasa y
supone una reducción del 74% con respecto a la pasta inicial. Al 3% de concentración la reducción con
respecto a pasta inicial es del 77%. En los experimentos realizados a 50°C la reducción que se produce con
respecto a la pasta inicial con el mediador CAFAC al 1.5% (86%) es mayor que la producida con el HBT
(82%). Al 3% de concentración el mejor de los mediadores naturales es el GALAC con una reducción del
75% de índice kappa.
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(a)
Expe
rime
ntos
a
30°C
(b) Experimentos a 50°C
Figura 1: número Kappa para experimentos realizados a 30°C y 50°C con
concentraciones de mediador de 1.5% y 3% sobre pasta de lino con kappa 6.25.
(a)
Experi
mento
s
a
30°C
(b) Experimentos a 50°C
Figura 2: Blancura ISO para experimentos realizados a 30°C y 50°C con
concentraciones de mediador de 1.5% y 3% sobre pasta de lino con kappa 6.25.
En la figura 2(a) se presentan los resultados de blancura obtenidos en los tratamientos realizados a 30°C.
En la etapa L todos los mediadores a excepción del HBT al 3% (que produce un aumento de blancura del
2%) producen una disminución de la blancura de entre el 7% (HBAC al 3%) y el 44% (CAFAC al 1.5%). En
la secuencia LP ninguno de los mediadores naturales supera al HBT (77 de blancura ISO) siendo el HBAC
al 3% el que obtiene un mejor resultado de 67 de blancura ISO.
En los experimentos realizados a 50°C (figura 2(b) )en la etapa L el HBT es el único que tiene un ligero
aumento de blancura (2%), mientras que los mediadores naturales disminuyen la blancura entre un 9%
(HBAC al 1.5%) y el 74% (CAFAC al 1.5%). En la secuencia LP el mayor incremento se produce con el HBT
(46% al 1.5% y 44% al 3%) y con el GALAC al 3% (44% de aumento).
La figura 3 muestra los parámetros ópticos con tratamientos a 30°C y a 50°C. En esta gráfica se
presenta dos grupos de datos correspondientes a la etapa L y a la etapa P. La dispersión de los datos
obtenidos sobre todo en la coordenada C* sugiere una importante influencia del mediador empleado. Todos
los mediadores naturales excepto el ácido gálico en los experimentos realizados a 50ºC y a 30ºC con
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concentración del 3% incrementa el valor de C*. El valor de L disminuye excepto en los experimentos con
HBT y HABAC en los experimentos realizados a 50ºC y el realizado a 30ºC y concentración del 3%.
Después de la etapa P el valor de C* en los experimentos realizados a 30 ºC disminuye con respecto al
control con GALAC y con HBT al 3% siendo los valores de L similares para todos los mediadores. En los
experimentos realizados a 50ºC tanto con GALAC como con HBT disminuye el valor de C*.
(a)
Exper
iment
os a
30°C
(b)
Exper
iment
os a
50°C
Figure 3: Parámetros ópticos de los experimentos realizados sobre pasta de lino con
kappa 6.25.
DISCUSIÓN
En el presente trabajo se evalúa la eficiencia en términos de Kappa, blancura y propiedades ópticas de
varios mediadores naturales comparada con el mediador sintético HBT. La lacasa Trametes villose en
presencia del mediador HBT presenta buenos grados de deslignificación como ya había sido probado (3,4).
La eficiencia del mediador sintético HBT comparada con la de los mediadores naturales es en todos los
casos mayor, tanto en la etapa L como en la P, datos que están en concordancia con los obtenidos
previamente por otros autores (5). En la etapa L el efecto que se consigue con todos los mediadores
naturales ensayados es el contrario que el obtenido con HBT, produciéndose un aumento del numero kappa
en todos los experimentos realizados y un descenso de la blancura en la mayoría de los casos. Estos
resultados concuerdan con los obtenidos en los estudios de Moldes et al. (6) con pasta de eucalipto y
sugieren la unión de los mediadores naturales a la pasta. Aunque el
Para la consecución de una deslignificación significativa los tratamientos con lacasa-mediador deben de ir
seguidos de un tratamiento alcalino (7). En este caso usando una etapa P como etapa de blanqueo se
obtienen buenos resultados de Kappa y de blancura. El mediador sintético tiene una eficacia mayor que los
mediadores naturales, siendo el GALAC el mediador natural que mejores valores de blancura y
deslignificación obtiene, usado al 3% en experimentos a 50 ºC.
AGRADECIMIENTOS
Los autores agradecen a la Unión Europea el soporte financiero de este trabajo, dentro del proyecto de
investigación ``White biotechnology for added value products from renewable plant polymers: Desing o
ftailor-made biocatalysts and new industrial bioprocesses'' (BIORENEW), NMP2-CT-2006-026456.
Agradecer tambien a las empresas CELESA y Novozymes por suministrar la pasta de lino y las enzimas
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necesarias. El doctor Carlos Vila agradece al ministerio español de ciencia y educación por el contrato
“Juan de la Cierva”.
BIBLIOGRAFÍA
(1) Akin, D. E.; Gamble, G. R.; Morrison Jr, W. H.; Rigsby, L. L.; Dodd, R. B. (1996) Chemical and
structural analysis of fibre and core tissues from flax. Journal of the Science of Food and Agriculture,
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