extracción de lignanos de carbón leonarditico por los metodos sosa

EXTRACCIÓN DE LIGNANOS DE CARBÓN LEONARDITICO POR LOS
METODOS SOSA- CLORURO DE SODIO Y RUN-CANG SUN Y
DETERMINACIÓN DE SU ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE
KELLY JOHANNA REINOSO
JUAN FERNANDO VELASCO
Trabajo de grado para optar por el titulo de Químico
UNIVERSIDAD DE CIENCIAS APLICADAS Y AMBIENTALES ´´U.D.C.A´´
FACULTAD DE CIENCIA Y TECNOLOGIA
QUÍMICA
BOGOTÁ D.C
2012
EXTRACCIÓN DE LIGNANOS DE CARBÓN LEONARDITICO POR LOS
METODOS SOSA- CLORURO DE SODIO Y RUN-CANG SUN Y
DETERMINACIÓN DE SU ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE
KELLY JOHANNA REINOSO
JUAN FERNANDO VELASCO
Trabajo de grado para optar por el titulo de Químico
TRABAJO DE GRADO
M.Sc. CAMILO ANDRES MAHECHA
Asesor
UNIVERSIDAD DE CIENCIAS APLICADAS Y AMBIENTALES ´´U.D.C.A´´
FACULTAD DE CIENCIA Y TECNOLOGIA
QUÍMICA
BOGOTÁ D.C
2012
Nota de aceptación
_______________________________
_______________________________
_______________________________
_______________________________
_______________________________
Firma del presidente del jurado
_______________________________
Firma del jurado
_______________________________
TABLA DE TABLAS
Tabla 1. Clasificación de carbones.......................................................................... 3
Tabla 2. Calidad de carbones............................................................................... 7-8
Tabla 3. Composición del carbón de muestra ....................................................... 29
Tabla 4. Solubilidad de extracto Run Cang Sun .................................................... 31
Tabla 5. Solubilidad de extracto Sosa – NaCl ...................................................... 32
Tabla 6. Solubilidad de extracto Run Cang Sun derivatizada .............................. 32
Tabla 7. Solubilidad de extracto Sosa – NaCl derivatizada .................................. 33
Tabla 8. Compuestos identificados por análisis cromatográfico extracto Sosa
Orgánico parcialmente derivatizado ...................................................................... 40
Tabla 9. Compuestos identificados por análisis cromatográfico extracto Run Cang
Sun totalmente derivatizado .................................................................................. 41
Tabla 10. Bandas características de los IR ........................................................... 49
Tabla 11. Datos para la curva de calibración con trólox ...................................... 50
Tabla 12. Datos para la curva de calibración con Vitamina C .............................. 51
Tabla 13. Resultados de actividad antioxidante en términos de inhibición de DPPH
de los extractos ..................................................................................................... 53
Tabla 14. Resultados de actividad antioxidante equivalente a trólox (TEAC) de de
los extractos .......................................................................................................... 54
Tabla 15. Capacidad antioxidante de los extractos expresada en términos de
TEAC .................................................................................................................... 55
TABLA DE FIGURAS
Esquema 1. Clases y usos del carbón .................................................................... 4
Diagrama 1. Cadena del carbón.............................................................................. 5
Figura 1: Lignanos simples ........................................................................................... 11
Figura 2. Ciclolignanos ............................................................................................ 11
Figura 3. Neolignanos .............................................................................................. 12
Figura 4. Lignanos mixtos (estibenolignanos, cumarinolignanos y xantonolignanos) ............... 12
Figura5. Estructura de la lignina ............................................................................ 13
Figura 6: Cubebina ..................................................................................................... 13
Figura 7: lignanos furofuranos y flavona ......................................................................... 13
Diagrama 2. Proceso de extracción por Run Cang Sun ................................................... 22
Diagrama 3. Proceso de extracción por Sosa - NaCl ..................................................... 23
Diagrama 4. Proceso de derivatización parcial ................................................................ 24
Diagrama 5. Proceso de derivatización total .................................................................... 25
Figura 8. Extractos iniciales................................................................................... 33
Figura 9. Extractos derivatizados .......................................................................... 28
Gráfico 1. Espectro UV-Vis Extracto Run Cang Sun antes de derivatizar ............................ 34
Gráfico 2. Espectro UV-Vis Extracto Run Cang Sun despues de derivatizar ........................ 35
Gráfico 3. Espectro UV-Vis Extracto Run Cang Sun Derivatización Total en THF ................ 35
Gráfico 4. Espectro UV-Vis Extracto NaOH - NaCl totalmente derivatizado en Piridina .......... 36
Gráfico 5. Espectro UV-Vis Extracto Run Cang Sun totalmente derivatizado en Piridina ........ 36
Gráfico 6. Espectro UV-Vis Sosa Derivatización parcial en THF ....................................... 37
Gráfico 7. Espectro UV-Vis Run Cang Sun Derivatización Total en THF ............................. 37
Gráfico 8. Espectro UV-Vis Sosa Derivatización Total en THF .......................................... 38
Gráfico 9. Espectro UV-Vis Run Cang Sun Derivatización Parcial en EtOH ......................... 38
Cromatograma 1. Sosa Orgánica parcialmente derivatizada ................................ 39
Cromatograma 2. Run Cang Sun Acuoso totalmente derivatizado ....................... 41
Cromatograma 3. Pico 1 (tetrahidro -2- furanol) .................................................... 42
Esquema 2. Rompimiento de masas (Tetrahidro – 2 – furanol) ........................... 42
Cromatograma 4. Pico 2 (Dimetilsulfoxomonio formilmetiluro) .............................. 43
Esquema 3. Rompimiento de masas (Dimetilsulfoxomonio formilmetiluro) ........... 43
Cromatograma 5. Pico 3 ((S)-(+)-3-Hidroxitetrahidrofurano) ................................. 44
Esquema 4. Rompimiento de masas ((S)-(+)-3-Hidroxitetrahidrofurano) .............. 44
Espectro IR 1. Run Cang Sun Acuoso Totalmente Derivatizado........................... 46
Espectro IR 2. Run Cang Sun Orgánica Totalmente Derivatizado ........................ 47
Espectro IR 3.Sosa - NaCl Acuoso Totalmente Derivatizado ................................ 48
Gráfica 10. Curva de calibración del porcentaje de inhibición Vs concentración
Trólox ................................................................................................................... 51
Gráfica 11. Curva de calibración del porcentaje de inhibición Vs Vitamina C ...... 52
GLOSARIO
Ácido ascórbico: La vitamina C, enantiómero (L) del ácido
antiescorbútica, es un nutriente esencial para los mamíferos.
ascórbico
o
Ácido húmico: molécula orgánica compleja formada por la descomposición de
materia orgánica vegetal.
Ácido fúlvico: molécula orgánica compleja formada por la descomposición de
materia orgánica vegetal, poseen menos carbono mas hidrógeno que los ácidos
húmicos.
Antioxidante: molécula
moléculas.
capaz de retardar o prevenir la oxidación de otras
Fenilpropanoides: estructuras moleculares contienen al menos un grupo fenol,
un anillo aromático unido al menos un grupo funcional
Leonardita: es una forma de ácidos húmicos encontrada exclusivamente en
Dakota del Norte.
Lignina: polímero presente en las paredes celulares de las Plantas y de un tipo
de bacterias conocidas como Dinophytas.
Lignito: carbón que se forma por compresión de la turba, es de estructura frágil y
en él se pueden reconocer algunas estructuras vegetales. Es de color negro o
pardo y frecuentemente presenta una textura similar a la de la madera de la que
procede.
Quelato: Estructura molecular en la que los iones metálicos se hallan unidos a un
compuesto orgánico.
Sosa: El hidróxido de sodio (NaOH) o hidróxido sódico
Radical libre: átomo que tiene un electrón (e-) desapareado en capacidad de
aparearse, por lo que es muy reactivos
Splitless: sistema de inyección para cromatografía de gases masas, se utiliza
para analizar muestras muy pequeñas.
Trolox: Derivado soluble de la vitamina E.
ABREVIATURAS
ABTS•+: (ácido 2,2'–azino–bis–(3–etillbenzotiazolin–6–sulfonico) agente oxidante
de diversos compuestos químicos.
ASTMD: American Society for Testing.
DPPH: Radical 2,2-difenil-1-picrilhidrazil.
GS: Cromatografía de gases masas
HPLC: Cromatografía de alta resolución (por sus siglas en ingles).
IR: Infrarrojo.
KRAFT: (ácido 2,2'–azino–bis–(3–etillbenzotiazolin–6–sulfonico)
MT-CNH2: Tetrametil-silil-diazometano
R2 : coeficiente de correlación estadístico lineal.
RMN: Resonancia Magnética Nuclear
TEAC: Capacidad antioxidante equivalente a trolox (por sus siglas en ingles)
UV: Ultravioleta.
μM: micro molar.
DEDICATORIA
A Dios.
Por darme la fuerza para alcanzar este sueño y por darme salud para lograr
mis objetivos.
A mi madre Luz Daris.
Por su amor, apoyó, consejo, motivación y ejemplo, que han sido mi
fortaleza y refugio en momentos de dificultad.
A mí amado Lucas.
Por estar este tiempo con migo y por su amor y apoyo permanente.
A mis familiares.
A mis hermanas Alejandra y Sharon, por ser mi fuente de inspiración, a mis
hermanos, mis primas y primos por ser ejemplo de tenacidad y valentía
A todos aquellos que participaron directa o indirectamente en la elaboración
de esta tesis.
¡Gracias a ustedes!
A mi maestro.
Lic. Camilo Mahecha Mahecha por su apoyo y motivación para la
culminación de mis estudios profesionales.
Kelly Johanna Reinoso
DEDICATORIA
Dedico la presente trabajo a los seres que más amo en este mundo: mis
padres, Mariluz Forero y Segundo Velasco que día a día se han esforzado
por sacarme a delante, agradezco todo su apoyo y fe en mí; por ser la fuente
de mi inspiración y motivación para superarme cada día más y así poder
luchar para que la vida nos depare un futuro mejor.
Juan Fernando Velasco Forero
AGRADECIMIENTOS
A Dios, a mi madre y a Lucas, fuente de alegría e inspiración para alcanzar
todos mis sueños. Gracias por el amor y la fe que siempre me han
profesado.
Kelly Johanna Reinoso
Primero y antes que nada, dar gracias a mi mamá Mariluz Forero, por estar
conmigo, por fortalecer mi vida y brindarme todo su apoyo; al profesor y
amigo el M.Sc. CamiloAndres Mahecha porque sin él no habría sido posible
la realización de este trabajo ya que su apoyo y dedicación fueron un pilar
fundamental en esta investigación, nuevamente gracias por todo lo que hizo
por nosotros este trabajo no es solo un logro de los autores sino también de
nuestro asesor.
Gracias a mi amiga y colega Vanessa Penagos que durante toda esta
carrera a sido mi compañera de estudios y de trabajo gracias por toda su
colaboración.
Doy gracias a mi tía Soraya Forero a la cual le debo mi ingreso a la
educación superior ya que sin su apoyo y cariño no hubiese comenzado este
camino de vida.
En general quisiera agradecer a todas y cada una de las personas que han
vivido conmigo la realización de esta carrera, no necesito nómbralas porque
tanto ellas como yo sabemos que desde los más profundo de mi corazón les
agradezco el haberme brindado todo el apoyo, colaboración, ánimo y sobre
todo su cariño y amistad.
Juan Fernando Velasco Forero
INTRODUCCIÓN
El carbón ha proporcionado a la civilización importantes beneficios tanto el
campo energético como en el económico, fue descubierto en la prehistoria. En la
antigüedad se manufacturaba por medio de la combustión incompleta de
materiales orgánicos. Lavoisier 1772 demostró que en la reacción de combustión
del diamante se producía CO2.
Los primeros compuestos de carbono se identificaron en la materia viva a
principios del siglo XIX, y por ello el estudio de los compuestos de carbono se
llamó química orgánica.
En la actualidad se sabe que del carbón se obtienen sustancias húmicas, como
ácidos húmicos, ácidos fúlvicos o lignanos. Estas fracciones se definen
basándose estrictamente en su solubilidad ya sea en ácido o álcali. Todas ellas
son parte de un sistema supramolecular extremadamente heterogéneo y las
diferencias entre estas subdivisiones son debido a variaciones en la acidez, grado
de hidrofobicidad, o a la autoasociación de moléculas por efectos entrópicos.
Sin embargo y pese a que el carbón ha sido ampliamente estudiado, aun falta
descubrir y explotar muchas cualidades de este producto que es abundante en
Colombia y que contiene dentro de su matriz grandes secretos que pueden ser
utilizados para beneficio de la humanidad.
Este trabajo busca extraer de dicha matriz ácidos húmicos por el método de Run
Cang Sun, y el método de sosa – cloruro de sodio, una vez extraídos,
fragmentarlos y solubilizarlos para determinar su poder antioxidante.
Ya que es conocido que una vez fragmentado los ácidos húmicos se obtienen
lignanos y estos poseen grandes cualidades que prestan beneficio a la salud
humana. En el presente estudio se hace una breve descripción del estado del arte,
sobre los ácidos húmicos, la descripción de las características del carbón objeto
de estudio; finalizando con una descripción de la metodología empleada para el
desarrollo del estudio, los resultados obtenidos y las conclusiones a las que se
llegó.
1. OBJETIVOS
1.1
1.2
Objetivo general:
Extraer sustancias húmicas de un carbón leonarditico por los métodos de sosa
– cloruro de sodio y Run-Cang Sun, derivatización y determinación de actividad
antioxidante por el método de DPPH• comparando con Trolox.
Objetivos específicos:
1.2.1 Extraer ´´lignina - ácidos húmicos´´ de carbón leonarditico por los
métodos de sosa- cloruro de sodio y Run-cang Sun.
1.2.2 Derivatizar los extractos de sustancias húmicas para la obtención de
lignanos.
1.2.3 Realizar pruebas físicas y químicas que permitan corroborar la
presencia de lignina, Ácidos húmicos, lignanos.
1.2.4 Determinar si las fracciones obtenidas de la extracción y separación
poseen actividad antioxidante.
1
2. JUSTIFICACIÓN
Los antioxidantes son moléculas capaces de prevenir o retardar la oxidación de
otras moléculas, capturando radicales libres u oxidándose ellos mismos. Por lo
general estos antioxidantes se encuentran en las plantas ya sea como aceites o
metabolítos secundarios. Estas moléculas han empezado a tomar importancia en
el sector de la salud ya que ya pueden anular los efectos perjudiciales de los
radicales libres en las células previniendo enfermedades.
En el proceso de formación del carbón estas moléculas se van degradando por
vía microbiana y/o metamórfica, la duración de estos proceso son los que dan la
variedad de carbones existentes, siendo los de mayor tiempo los carbones
antracita y los de menor tiempo la turba (lignito o leonardita).
Colombia es un país que posee grandes reservas de carbón de alto y bajo rango,
sin embargo han sido los carbones de alto rango como sub-bituminosos y
bituminosos , los que han cobrado mayor importancia por su uso en la industria
como fuente para obtención de energía, convirtiéndose en un producto importante
de exportación para nuestro país generando un amplio índice de regalías y
beneficios para el mismo1; los carbones de bajo rango como el lignito aunque
también son empleados en la industria energética, tienen un uso más frecuente
en la agronomía, en donde son utilizados como fertilizantes directamente o a
través de sus extractos dependiendo del nivel de oxidación de la muestra y
aunque su incursión en esta industria ha sido bueno, es importante conocer los
componentes que hacen parte de este tipo de carbones, extraerlos y estudiarlos
de manera adecuada con el fin de darles un uso distinto al agrícola que permita
diversificar su empleo y aprovechar todas las propiedades químicas y físicas que
poseen.
Una propiedad importante que se ha determinado para algunos lignanos extraidos
de plantas es su capacidad antioxidante2; por tanto es necesario determinar si un
carbón de bajo rango posee este tipo de moléculas y por ende verificar su
capacidad antioxidante empleando la técnica de decoloración del DPPH• y
comparando contra Trolox.
2
3. ESTADO DEL ARTE
3.1
Mineral: Sustancia natural homogénea, de origen inorgánico, con
composición química definida y en general con estructura cristalina, excluyendo a
esta definición las sustancias generadas por la transformación de materia orgánica
en ambientes reductores como carbón, petróleo y resinas fósiles. Varios autores a
clasifican estos materiales como hidrocarburos como minerales; sin embargo,
resulta más adecuado referirse a éstos como materiales energéticos.3
3.2
Carbón: Compuesto principalmente por carbono, hidrógeno, nitrógeno,
oxígeno y azufre, se origina en transformaciones físicas y químicas de grandes
acumulaciones vegetales depositadas en ambientes palustres (pantanos),
lagunares o deltaicos.
Una de las clasificaciones más utilizadas es la de American Society for Testing
and Materials (ASTMD-388-777), mostrada en la Tabla 1, que lo divide en cuatro
clases según las propiedades referidas a la composición de los vegetales y las
condiciones de presión y temperatura (grado de metamorfismo) a que fueron
sometidos durante su formación.3
Tipo
Carbono
Fijo (%)
Material
Volátil (%)
Antracita
Bituminoso
86 - 98
45 - 86
1
32
Contenido
Humedad
(%)
< 15
15 - 20
Sub
bituminoso
Lignito
y
Turba
35 - 45
50
20 - 30
25 - 35
96
> 30
Poder
Calorífico
(Btu/lb)
>14.000
10.50014.000
7.800
10.500
4.000
7.800
Poder
Calorífico
(MJ/Kg)
>32.6
24.5 - 32.6
18.2 - 24.5
9.3 – 18.2
Poder
Calorífico
Kcal/Kg
>7.780
5.8007.780
4.3007.780
2.200
–
4.300
Tabla 1.
Clasificación de carbones
Fuente: American Society for Testing and Materials (ASTMD-388-777)
Tomado de: Unidad de Planeación Minero Energética. Cadena del carbón. [en línea]. [Consultado
12 de marzo de 2012]. Disponible en: < http://www.upme.gov.co/Docs/Cadena_carbon.pdf>
3
Aumenta
poder
calorífico
Aumenta
material
volátil
Antracita
• Carbón duro, con alto contenido de carbono (86% al 98%), bajo
contenido de materia volátil y poder calorífico superior a 32.6
MJ/Kg. Usado como combustible en generación de calor o vapor
en la industria térmica y siderúrgica, también se usa en la
fabricación de goma sintética, colorantes y purificación de agua
para consumo humano (filtros).
Hulla
Bituminosa
• Carbón posee un menor contenido de carbono y menor poder
calorífico que los carbones antracíticos. Por su forma de uso se
conocen como carbones coquizables, usados en procesos de
obtención del acero, y carbones térmicos, usados en la
producción de vapor para generación de energía.
Hulla Subbituminosa
• Carbón un menor poder calorífico que los carbones
bituminosos, su composición en carbono está entre 35% y
45%, tiene un elevado contenido de material volátil, algunos con
poder coquizable. Es empleado en la generación de energía
eléctrica y en procesos industriales.
Lignito y turba
• Carbones con alta humedad y alto contenido de ceniza y de
material volátil, lo cual hace que posean un bajo poder calorífico.
Es
empleado
para
la
generación
de
calórica
(calefacción), energía eléctrica, para algunos procesos
industriales en donde se requiere generar vapor y más
recientemente se han fabricado briquetas de turba y lignito para
quemarlas en hornos.
Esquema 1.
Clases y usos del carbón
Fuente: Unidad de Planeación Minero Energética
Tomado, modificado y creado de: Unidad de Planeación Minero Energética. Cadena del carbón.
[en línea]. [Consultado 12 de marzo de 2012]. Disponible en:
< http://www.upme.gov.co/Docs/Cadena_carbon.pdf>
Reservas carboníferas: Colombia cuenta con carbón de excelente calidad, siendo
participe del mercado mundial por largo tiempo. Las reservas medidas son de
7.063,6 Mt, ubicadas principalmente en la Costa Atlántica, donde se encuentra el
90% del carbón térmico que a su vez corresponde al 98% del carbón nacional.
El 95% de las reservas se ubica en los departamentos de La Guajira, Cesar,
Córdoba, Norte de Santander, Cundinamarca, Boyacá, Antioquia, Valle del Cauca
y Cauca.3
4
Diagrama 1.
Cadena del carbón
Fuente: Unidad de Planeación Minero Energética
Tomado de: Unidad de Planeación Minero Energética. Cadena del carbón. [en línea]. [Consultado
12 de marzo de 2012]. Disponible en: < http://www.upme.gov.co/Docs/Cadena_carbon.pdf>
Calidades del Carbón Colombiano: La calidad de los carbones está referida a las
propiedades físicas y químicas, que son las que finalmente determinarán el uso
final del material.
Humedad: Se presenta como humedad total, inherente o de equilibrio, superficial,
agua de hidratación o agua de descomposición. Su importancia es contratos de
compraventa, en evaluación, control de procesos industriales, en manejo y
pulverización del carbón.
Cenizas (Cz): Residuo no combustible de origen orgánico e inorgánico.
5
Materias volátiles (Mv): Se determina los rendimientos del coque y sus productos;
es criterio de selección del carbón para gasificación y licuefacción.
Carbono fijo (CF): Es la medida del material combustible sólido y permite clasificar
los carbones y definir los procesos de combustión y carbonización.
Azufre total (St): Parámetro para definir gases tóxicos de los procesos de
gasificación y licuefacción.
Poder Calorífico (PC): Representa la energía de combustión del carbono e
hidrógeno y del azufre. Es el más importante en la definición de los contratos de
compraventa de carbones térmicos y en la clasificación de los carbones por
rango.3
En la Tabla 2 se presenta la calidad de los carbones colombianos discriminada por
regiones.
De acuerdo con los estudios de caracterización adelantados en las zonas
carboníferas del país, en la cordillera Oriental se encuentran los mejores carbones
bituminosos para uso térmico y metalúrgico junto con carbones antracíticos, tanto
para el consumo interno como de exportación; en la cordillera Occidental se hallan
carbones bituminosos y sub-bituminosos en Córdoba, norte de Antioquia, Valle del
Cauca y Cauca; en la cordillera Central existen carbones bituminosos en las zonas
carboníferas de Antioquia y Antiguo Caldas y, menos conocidos, en Huila y
Tolima.3
6
Tabla 2 Calidad de carbones en Colombia:
Continúa en la siguiente página
7
Tabla 2.
Calidad de carbones
Fuente: Ingeominas (2004)
Tomado de: Unidad de Planeación Minero Energética. Cadena del carbón. [en línea]. [Consultado
12 de marzo de 2012]. Disponible en: < http://www.upme.gov.co/Docs/Cadena_carbon.pdf>
8
3.3
Leonardita: Forma de ácidos húmicos encontrada por primera vez en
Dakota del Norte. Es llamada así en homenaje al Dr. A.G. Leonard, el cual fue
primer director del Servicio Geológico del Estado de Dakota del Norte y científico
que estudió sus propiedades.
La leonardita se forma en la era carbonífera del Paleozoico, cerca de 280 millones
de años atrás. La amplia vegetación existente entonces en lo que es hoy Dakota
del Norte fue destruida y carbonizada, pero en ese proceso fueron exprimidos los
ricos jugos orgánicos formando originalmente lagunas de poca profundidad que
también se carbonizaron dando origen a la leonardita. La masa fibrosa se
transformó en carbón encima del cual se formó la delgada capa de leonardita. A
través de los millones de años de su formación, la leonardita ha estado sujeta a
toda clase de acciones físicas y químicas, como también microbiológicas, para
llegar a su forma actual.
La leonardita es una forma de ácidos húmicos. Lo que todos los ácidos húmicos
tienen en común es que son el producto final de la descomposición de materias
orgánicas (principalmente vegetales). Pero, lógicamente, el material de origen ha
sido diferente en cada caso. También ha sido diferente el proceso de formación y
su duración. En contraste se citan los ácidos húmicos encontrados en La Florida
que provienen de una muy reciente (máximo 50.000 años) formación de turba.
Aunque tratándose en ambos casos de “ácidos húmicos”, hay una gran diferencia
en su estructura molecular y sobre todo en sus propiedades biológicas.4
3.4
Lignanos: Grupo de metabolitos secundarios muy difundidos entre las
plantas, tanto entre las Gimnospermas como entre las Angiospermas, aunque son
más frecuentes en las Pináceas, Podofiláceas, Rutáceas y Lauráceas. Se
presentan hasta en un 6,4% de los aceites extraídos de las raíces de las plantas,
como Sesamum angolense (Pelalacieae), y alrededor del 35% de los aceites
esenciales de las semillas de algunos cultivares del falso hinojo indio, Anethum
sowe. Son menos abundantes en las Asteráceas, los lignanos son suficientemente
frecuentes para poder utilizarlos con fines taxonómicos.5
Comprenden una clase de productos naturales de plantas que se derivan de
derivados de ácido cinámico y que están relacionadas bioquímicamente a la
fenilalanina.
9
3.4.1 Tipos de lignanos:
Los lignanos se pueden dividir en 4 grandes grupos:
a) Lignanos simples: Presentan únicamente una unión carbono carbono en las
posiciones β y β’ de sus cadenas laterales. En función de si el oxígeno es o
no incorporado a la cadena lateral y del modo en que lo hace, se
establecen 4 subtipos (Figura 1)6:
•
•
•
•
Derivados del dibencilbutano
Derivados de la dibencilbutirolactona (lignanólidos)
Derivados del tetrahidrofurano (epoxilignanos)
Derivados del furofurano (bisepoxilignanos)
b) Ciclolignanos: Son el resultado de la formación de otro enlace adicional
carbono – carbono, dando lugar a un nuevo anillo; dando como resultado 4
subtipos (Figura 2)6:
•
•
•
•
Ariltetrahidronaftalenos
Arildhidronaftalenos
Arilnaftalenos
Dibencilciclooctadienos
c) Neolignanos: Son dímeros de unidades C6C3que no poseen enlace β y β´
(Figura 4).6
d) Dímeros mixtos: Son heterodímeros mixtos resultantes del acoplamiento de
lignanos o neolignanos con otras sustancias como flavonoides, cumarinas,
xantonas, etc., formándose de esta manera los denominados
flavonolignanos, cumarinolignanos, estilbenolignanos, xantonolignanos, etc.
(Figura 5).6
10
Figura 1: Lignanos simples
Tomado de: Fitoterapia.net, Revista de fitorterapia [en línea]. [Consultado 05 de abril de 2012].
Disponible en: < http://www.fitoterapia.net/revista/pdf/55-68%20RDF%205.1%20LIGNANOS.pdf>
Figura 2: Ciclolignanos
Tomado de: Fitoterapia.net, Revista de fitorterapia [en línea]. [Consultado 05 de abril de 2012].
Disponible en: < http://www.fitoterapia.net/revista/pdf/55-68%20RDF%205.1%20LIGNANOS.pdf>
11
Figura 3: Neolignanos
Tomado de: Fitoterapia.net, Revista de fitorterapia [en línea]. [Consultado 05 de abril de 2012].
Disponible en: < http://www.fitoterapia.net/revista/pdf/55-68%20RDF%205.1%20LIGNANOS.pdf>
Figura 5: Lignanos mixtos (estibenolignanos, cumarinolignanos y xantonolignanos)
Tomado de: Fitoterapia.net, Revista de fitorterapia [en línea]. [Consultado 05 de abril de 2012].
Disponible en: < http://www.fitoterapia.net/revista/pdf/55-68%20RDF%205.1%20LIGNANOS.pdf>
12
Muchos lignanos muestran una actividad fisiológica, como las podofilotoxinas que
son inhibidores tumorales. Esta actividad específica conduce a la interferencia con
la división celular por dos mecanismos diferentes en animales, incluyendo seres
humanos.
Por otra parte se han realizado estudios que muestran que algunos lignanos son
activos en la supresión del sistema nervioso central y la inhibición de la
fosfodiesterasa de AMP cíclico; además se utilizan para el tratamiento de la
hepatitis viral y la protección del hígado.7
3.5
Lignina: Es un polímero complejo, tridimensional, globular, irregular,
insoluble y de alto peso molecular (>10000g/mol), formado por unidades de
fenilpropano cuyos enlaces son relativamente fáciles de hidrolizar vía química o
enzimática. Ésta molécula tiene diferentes tipos de uniones aromáticas de
fenilpropano.
Figura 6: Estructura de la Lignina
Tomado de: e-limbo.org. Lignina, EAU de biblioteca [en línea]. [Consultado 12 de marzo de 2012].
Disponible en: < http://www.e-limbo.org/articulo.php/Art/3290>
13
En las planta, la lignina se encuentra químicamente unidad a la hemicelulosa y
rodeando a las fibras compuestas por celulosa. Es responsable de la rigidez de las
plantas y sus mecanismos de resistencia al estrés y a ataques microbianos. Es
especialmente abundante (20-30 % del peso de la pared) en células conductoras
(vasos xilemáticos) y estructurales (fibras) con engrosamiento secundario.
En cuanto a su biosíntesis, se sabe que los precursores de la lignina se forman
por conducto de la ruta correspondiente al ácido shiquímico. Este ácido, formado
por una unión del ácido fosfoenolpirúvico y eritrosa-4-fosfato, se convierte en el
principal escalón de la biosíntesis de los aminoácidos L-tirosina y L-fenilalanina,
que están formados por aminación reductiva. Las enzimas desaminantes
convierten a continuación los dos aminoácidos en sus respectivas contrapartes de
ácido de shiquímico.
La hidroxilación en etapas por hidroxilasa, y en su momento la metilación por ometil-transferasas, transforma los ácidos para hidroxi-shinámicos conocidos como
precursores de lignina.8
3.6
Extracción de lignina: Existen otros trabajos relacionados con la lignina,
los más investigados son los procesos para su eliminación en el blanqueo de la
pulpa de madera.
Existen artículos que reportan características de diferentes procesos para la
obtención de un tipo particular de lignina, debido a que la lignina varía según el
método de extracción y separación así como de la materia prima de la cual
proviene.
Según en el trabajo de grado Extracción de lignina proveniente de
residuos agroindustriales para su empleo en procesos de gasificación
dan a conocer los usos de la lignina como materia prima de la
gasificación existen 3 procesos de extracción como subproducto y la
lignina se clasifica según este proceso::
Lignina de sulfito: Proviene del líquido residual sulfitado (solución de
bisulfito y anhídrido sulfuroso) de las fábricas de pulpa, la cantidad de
lignina que se desprende de la pulpa de madera es de 50 –60%.
Lignina alcalina (Kraft): Obtenida del líquido residual (licor negro) de
los procedimientos al sulfato y a la sosa (mezcla de hidróxido de
sodio y sulfuro de sodio) en la fabricación de la pasta para papel. Por
lo general la cantidad de lignina que se obtiene es del 50 – 75% del
contenido en la madera.
14
Lignina comercial: Se obtiene como subproducto de procesos
relacionados con la celulosa u otros productos primarios;
generalmente se nombran de acuerdo al fabricante: Benaloid®,
Binderine®, Furafil®; Glutrin®; Goulac®; Indulin®; Isofil®;
Marasperse®;
Maratan®;
Maratex®;Meadol®;
Silvacon®;
TomLinite®.
En el trabajo de grado Extracción de lignina proveniente de residuos
agroindustriales para su empleo en procesos de gasificación dan a
conocer los usos de la lignina como materia prima de la gasificación,
pero no es el único proceso en el que se puede emplear lignina en la
industria de la gomas, en calidad de relleno y antioxidante, y
demostrando que solo la lignina sulfática (Kraft) sirve para este fin.
Otra aplicación es como surfactante, debido su característica lipofilica
de la lignina, mencionan que la lignina es la mejor alternativa para la
elaboración de estos.
Por otra parte en esta misma investigación se describe diversas
metodologías para la extracción de lignina proveniente de maderas,
utilizando una mezcla de solventes tolueno/etanol a una relación
volumétrica de 2:1 y su posterior separación con ácido sulfúrico al
72%. Otro método es Run-Can Sun basado en medio ácido describe
la delignificación de tallos de maíz, mostrando diferentes formas de
caracterizar éste tipo de lignina; donde se realiza la extracción de
lignina proveniente de paja de cebada por métodos alcalinos
caracterizándolo por IR.
Rojas Aguilar describe dentro de su trabajo formas de caracterización
de la lignina que se realiza mediante técnicas como: NMR, HPLC, IR;
de estos análisis se obtienen resultados de tipo cuantitativo y
cualitativo aportando información útil por la cual se reconocen
especies a nivel atómico o molecular, deduciendo características
estructurales y/o reconociendo en la muestra la presencia de
determinados grupos funcionales como en el caso del espectro UV
concluye que la lignina posee una longitud de onda característica
situada a los 280nm.9
15
3.7
Ácidos Húmicos: Polímeros complejos de alto peso molecular con núcleos
periféricos (grupos radicales) que permiten capturar iones del medio circundante o
una mayor polimerización. Hay dos tipos: pardos y grises. 10
3.7.1 Ácidos húmicos pardos: Provienen de la oxidación de la lignina. Son poco
estables, pobres en nitrógeno en forma amínica (-NH2) y floculan poco en
presencia de calcio. 10
3.7.2 Ácidos húmicos grises: Se forman por acción de microorganismos del suelo.
Tiene mayor contenido de nitrógeno, floculan rápidamente en presencia de calcio
y forman complejos órgano-minerales (arcillas-humus) muy estables.10
3.8
Antioxidante: Es toda sustancia que retrasa o previene el deterioro, daño o
destrucción provocados por una oxidación. Durante muchos años, los químicos
han tenido conocimiento de que la acción oxidante de los radicales libres puede
ser controlada, o incluso prevenida por una serie de sustancias antioxidantes.11
3.9
Radical libre: Es una molécula con uno o más electrones no ligados en su
órbita externa. Los electrones libres, o no ligados, proveen una mayor carga
energética.
Tal molécula es inestable y tiende a reaccionar activamente con otras moléculas
para ligar los electrones libres y generar moléculas estables. Es precisamente esta
marcada reactividad y su tendencia a iniciar reacciones redox en cadena lo que
constituye un papel citotóxico central en la casualidad de lesiones de células y
tejidos.12
16
4. ANTECEDENTES
4.1
Estudios de actividades biológicas y antioxidantes de ácidos húmicos:
En estudios realizados sobre ácidos húmicos se ha determinado que inducen la
apoptosis en células HL-60 (relacionadas con la leucemia), deteniendo su
proliferación y crecimiento, en concentraciones de 50-400 µg / mL13, de igual
modo se ha comprobado su efecto antitumoral, también por vía apoptosis, en
combinación con As2O3, sobre Adenocarcinoma cervical humano, en líneas
celulares HeLa y SiLa, generando una reducción en la CL50 obteniendo
resultados de 57,62% a 73,52% (300 µg HA / mL) y 79,03% a 83,67%
(500 g de HA / mL), respectivamente.14
También se ha logrado probar su activad antimutagenica en células de ovario de
hámster chino en combinación con mutágenos como la mitomicina C y La
Hidrazida maleica.15
Se han realizado estudios in vitro en líneas celulares de cáncer de las
mitocondrias del hígado, probando ácidos húmicos de una fuente seleccionada en
Eslovaquia; los resultados obtenidos mostraron un potencial prometedor de este
tipo de sustancias como agentes para mejorar la inmunidad.16
En otros estudios se ha comprobado que al generar complejos con otras
sustancias permiten un mejor transporte de las mismas a través de distintos
tejidos, mejorando su efecto, como sucede con el complejo Carbamazepina- Acido
húmico (1:2), que mejora la permeabilidad y acceso de la sustancia en el cerebro,
potencializando su efecto anticonvulsivo.17
En cuanto a la actividad antioxidante se ha determinado esta propiedad a través
de la técnica ABTS, en términos de TEAC, para dos muestras de sustancias
húmicas, dando como resultado 57,130 ± 0,091 y 22,212 ± 0,059 µmoles de trolox
por gramo de peso seco ± la desviación estándar para ambas respectivamente,
comparando con 5,671 ± 0,032 µmoles de trolox por gramo de acido ascórbico
que fue empleado como sustancia de referencia.18
17
4.2
Estudios de actividades biológicas y antioxidantes de los lignanos:
Los lignanos deben sus características una gama amplia de estructuras dando asi
una gran diversidad de actividades biológicas. Los lignanos son moléculas muy
estudiadas y se conocen algunos con propiedades anti-tumoral, antimitótica,
antiviral y pueden inhibir específicamente ciertas enzimas, además de ser toxicas
para hongos e insectos.19
Estas sustancias húmicas son constituyentes de alimentos unidos a estrógeno
y con actividad anti-estrógeno, lo que contribuye a la prevención de cánceres
hormono-dependientes, osteoporosis, enfermedad cardiovascular y síntomas de la
menopausia. Esta actividad anti-estrogena a sido evaluda en mamiferos,
examinado si
lignanos
naturales
y semi-sintéticos
poseen
estas
caracteristicassiendo los lignanos vegetales los de mayor actividad; mientras que
los norlignanos semi-sintéticos eran moderadamente activos lo que apoya la idea
de lignanos vegetales que tienen función fitoestrógeno.20
Existen varias explicaciones posibles para las bioactividades observados,
incluyendo la participación en el metabolismo hormonal o disponibilidad, la antiangiogénesis, anti-oxidación y la supresión de un gen. Por otra parte, las
concentraciones fisiológicamente relevantes del enterolignano se ha demostrado
que conducir a la "in vitro" e "in vivo" la activación de los receptores estrogénicos.
La Lychnophora ericoides es una planta brasileña que
está disponible
comercialmente como un agente analgésico y antiinflamatorio. El extracto de las
raíces, produjo 10 lignanos, que mostraron actividad analgésica en el test de
contorsiones del ratón. El lignano cubebina(Figura 7), fue uno de los más activos,
mostro capacidad anti-inflamatoria y antipirética. Además de dos derivados
metilo previamente desconocidas.
Figura 7: Cubebina
Tomado de: Medycyna dawna i współczesna. Lignany w ziołach i ich znaczenie [en línea].
[Consultado 7 de abril de 2012]. Disponible en: < http://rozanski.li/?p=1737>
18
Los lignanos vegetales son convertidos en lignanos mamíferos al ser absorbidos
por él organismos y en ocasiones estan presentes en el suero y la orina. Se ha
investigado que algunos lingnanos vegetales poseen actividad antitumoral y
endocrino modulador de lignanos vegetales, con el fin de aclarar las relaciones
estructura-actividad. Como en el estudio de la 7-hidroximatairesinol (HMR) que se
convierte en el ENL, y ambos HMR y ENL pueden inhibir el crecimiento de7,12dimetil[a] antraceno (DMBA) inducida por cáncer mamario. Otras investigaciones
sobre el papel de los lignanos como los enterolignanos, lariciresinol, pinoresinol,
medioresinol, syringaresinol, arctigenina y sesamina consumidos en la dieta
inhibiendo o mostrando efectos beneficiosos en el cáncer de mama, colon y
próstata. .
Estudios recientes muestran que diversos lignanos mostraron inhibir la Vit C
/ NADPH inducida por la peroxidación lipídica (la formación de malondialdehído
(MDA)) de los microsomas de hígado de rata. Estos compuestos,
schisanhenol (Sal),
S (-) schizandrin C (S (-) sen C) y S (-)schizandrin B
(S (-)
sen B)
muestran
ser
más potente
que
la
vitamina E
en
la misma concentración. El Sal y (S (-) sen B) fueron capaces de inhibir la
gosipol inducida por la generación de anión superóxido en microsomas de
hígado de rata. Además, la administración oral de Sal y (S (-) sen B) reduce
notablemente la formación de MDA hígado inducida por etanol, 15 mL/kg
en ratones, y aumento de la superóxido dismutasa y las actividades de catalasa en
el citosol de hígado de rata. Este trabajo concluye que algunos lignanos,
como Sal, tienen una fuerte actividad antioxidante.19, 20
Otrs estudios en el cual después del aislamiento y la identificación de seis
conocidos lignanos furofuranos: eudesmin(1), magnolin(2), epimagnolin A(3),
aschantin(4),
kobusin(5),
sesamina(6)
y una flavona artemetina(7). Se
evaluaron in vitro para su citotoxicidad en un panel de selección que consta
de varias líneas de células tumorales de mamíferos, por su actividad contra la
malaria resistente a la cloroquina contra el Plasmodium falciparum (FcB1 cepa) y
para su citotoxicidad contra células murinas normales (CFU-GM). Si bien no hay
una citotoxicidad prometedora contra las células tumorales humanas se notó,
potencia marginal y la selectividad se encontró para los compuestos 1-5 contra el
colon murino . Además, los compuestos 2-7 mostró leves actividad antiplasmodial,
6
y 7 son
los
compuestos
más
activos (IC50 3,37 y 3,50 g
/
mL,
21
respectivamente).
19
Figura 8: lignanos furofuranos y flavona
Tomado de: Journal Ethonopharmacology. Furfuranlignans and a flavone from Artemisia gorgonum
Webb and their in vitro activity against Plasmodium falciparum, ScienceDirect [en línea].
[Consultado 7 de abril de 2012]. Disponible en:
< http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0378874111007100>
20
5. METODOLOGÍA
Esta investigación se abordó desde 2 aspectos; el químico el cual consistió en la
extracción de sustancias húmicas del carbón leonarditico por los métodos de Run
Cang Sun y Sosa – Cloruro de sodio y su posterior derivatización para la
obtención de lignanos. El segundo aspecto abordado en esta investigación es la
biológica la cual consistió en la determinación de la actividad antioxidante de los
extractos obtenidos con la técnica de DPPH• dando a conocer esta capacidad
antioxidante en equivalentes a trolox.
5.1
Extracción de la lignina:
5.1.1 Método de Run Cang Sun:
A una muestra de 200 g de carbón leonarditico, se realizó una extracción soxhlet,
con 500 mL de solvente propuesto en el método de Run Cang Sun y
colaboradores (tolueno/etanol en relación 2:1)22, a una temperatura de operación
de 100°C. El tiempo de extracción de 24 Horas, al terminar el proceso de
extracción la mezcla de solventes se recupera en un rotavaporador para así
facilitar la separación de las sustancias húmicas, posteriormente al residuo se le
agregara agua en proporción 4:1, manteniendo en agitación constante por una
hora a 60°C, posteriormente la mezcla se filtra al vacío con papel filtro
Whatman No. 40, lavando el producto con 50 mL de Etanol / Agua 2:1 y secando
por 10 minutos a 70°C en una estufa. Para eliminar el exceso de agua en la
muestra se filtra de nuevo al vacío si es necesario y se calienta a 50° C por 1 hora.
21
A una muestra de 200 g de carbón leonarditico, se
realizara una extracción soxhlet, con 500 mL de solvente
propuesto (tolueno/etanol en relación 2:1) a una
temperatura de operación de 100°C.
El tiempo de extracción de 24 Horas, al terminar el
proceso de extracción la mezcla de solventes se recupera
en un rotavaporador
Posteriormente la mezcla se filtra al vacío lavando el
producto con 50mL de Etanol / Agua, relación 2:1.
Secando por 10 minutos a 70°C en una estufa. Para
eliminar el exceso de agua en la muestra se filtra de
nuevo al vacío si es necesario y se calienta a 50° C por 1
hora.
Diagrama 2. Proceso de extracción por Run Cang Sun.
Fuente: Autores
5.1.2 Método Sosa – Cloruro de sodio:
El lignito seco y molido (400 g) se mezcla con 2L de una solución de NaOH 2M –
1M de NaCl y se agita durante 3 horas, luego la mezcla se pasa por el
ultrasonido, la solución se filtra a través de un filtro de celulosa 60 micrómetros y
el filtrado se acidifica por adición de HCl concentrado a pH 1.
El precipitado se lava varias veces con una mezcla de HCl 0,25 M y agua
destilada hasta que quede libre de cloro y se seca hasta peso constante a 50 °C.
22
Muestra (400 g) en solución de NaOH
2 M- 1 M de NaCl agitar por 3 horas
Se pasa por el ultrasonido, se filtra a través de
un filtro de celulosa 60 µmetros.
Acidificar por adición de HCl concentrado hasta
pH 1.
El precipitado, se lava con una mezcla de HCl 0,25 M
y agua destilada agua hasta que quede libre de cloro
y se seca hasta peso constante a 50 ° C.
Diagrama 3. Proceso de extracción por Sosa - NaCl.
Fuente: Autores
5.2
Derivatización Parcial:
a) La derivatización de la muestra se hará de acuerdo al método realizado por
S. Amir el en 2006.22Al extracto obtenido se le agrega solución Cloruro de
acetilo. La mezcla se mantiene a temperatura ambiente y luego se agita
suavemente durante la noche.
b) Después de eliminar el disolvente por evaporación rotatoria, el residuo se
disuelve en 25 mL de dioxano / ácido acético / agua (05:04:01, v / v / v), se
añade Zn en polvo (500 mg) a la solución agitando bien; se continua la
agitación durante 30 min.
23
Extracto
Adiciona AcCl
Disolver en dioxano/ác.
acético/ agua y adicionar
Zn
Adicionar una sln CH2Cl2
/NH4Cl y separa fase
acuosa y fase orgánica
DERIVATIZACIÓN
PARCIAL
Diagrama 4. Proceso de derivatización parcial.
Fuente: Autores
5.3
Derivatización total:
a) Luego la mezcla se transfiere cuantitativamente a un embudo de
separación con CH2Cl2 (50 mL) y una solución saturada de NH4Cl (50 mL).
b) La solución se mezcla vigorosamente, y las fases orgánica y acuosa se
separan.
c) La fase acuosa se extrae con CH2Cl2 (2/10 mL).
d) La fase orgánica se combina y se seca sobre MgSO4 y, después de
adicionar una cantidad conocida de patrón interno (n-undecano en CH2Cl2),
el disolvente orgánico se evapora a presión reducida.
e) El residuo se acetila durante 40 minutos en 1,5 mL contiene CH2Cl2 0,2 mL
de anhídrido acético y 0,2 mL de piridina.
f) La fase acuosa se acidifica a un pH <3 con HCl. El filtrado se evapora a
presión reducida antes de acetilación y la metilación con
trimetilsilidiazometano (MT-CHN2).Todos los componentes volátiles se
eliminan por completo por evaporación con EtOH a presión reducida.
24
Fase
orgánica
Fase
Acuosa
Sólido
Acetilar con
CH2Cl2/Anhidrido
acético/Piridina
Acidular con HCl
Solubilizar
DMS/Dioxano/Piridi
na
DERIVATIZACIÓN
TOTAL
Acetilar con MTCHN2
DERIVATIZACIÓN
PARCIAL
DERIVATIZACIÓN
TOTAL
Diagrama 5. Proceso de derivatización total.
Fuente: Autores
5.4
Caracterización por Espectrofotometría UV:
Se utilizara un espectrofotómetro UV-VIS marca Jenway modelo 6405 serial
número 4063 para realizar la caracterización de la lignina, verificando la banda
característica 280 a 290 nm.
5.5
Caracterización por Espectroscopía IR:
Los espectros de infrarrojo (IR) son tomados en película de Bromuro de potasio
utilizando un equipo Shimadsu IR Infinity 1.
Estos análisis fueron realizados en el laboratorio de instrumental 2 de la
Universidad Francisco José de Caldas, y son de tipo cualitativo. Para ello se
ajustaron las variables instrumentales como velocidad, ganancia y velocidad del
peine (actividades realizadas por el laboratorista de la universidad)
Para analizar las muestras se utilizo el método de KBr, relación en peso 1:100
muestra /KBr.
25
5.6
Caracterización por Espectrofotometría Gases – Masas (GM-MS):
El análisis se llevó a cabo en un cromatógrafo de gases Shimadzu GC 2010plus
equipado con un puerto de inyección splitess.
Se utilizó una columna capilar de dimetilpolisiloxano, (Restek Rxi GC Columns
EE.UU.) de 30 m x 0,25 mm (d.i.) x 0,25 μm (df), con fase estacionaria 5% fenilo.
La programación de temperatura del horno fue de 50 ºC (2 min) @ 15 ºC/min,
hasta 200 ºC (2 min) @ 10 ºC/min, hasta 300°C (10 min).
Los espectros de masas se obtuvieron por impacto de electrones (EI) de energía
de 70 eV. Las temperaturas de la cámara de ionización y de la línea de
transferencia fueron de 230 y 325 ºC, respectivamente. El gas de arrastre utilizado
fue helio (99,995%, Aga Fano, S.A, grado 5), con flujo constante de 1,2 mL/min.
Los espectros de masas y corrientes iónicas reconstruidas (TIC) fueron adquiridos
usando un analizador cuadrupolar, por medio de barrido automático de frecuencia
(full scan), a 4,75 scan s-1, en el rango de masas m/z 40-400.
DETERMINACIÓN DE ACTIVIDADES BIOLÓGICAS
A los ácidos Húmicos, lignina, lignanos obtenidos por aislamiento y extracción se
les determinara su actividad antioxidante.
5.7
Actividad antioxidante:
La capacidad de las muestras para captar radicales libres se midió con el método
DPPH• modificado.23 A 2,0 mL de una solución metanólica de DPPH•, ajustada
hasta tener una absorbancia de 0,9 se le añaden 1,0 mL del extracto acuoso u
orgánico de la muestra. Se midió la absorbancia a 517 nm hasta que la reacción
se estabilizó aproximadamente 15 min.
La actividad se midió en un espectrofotómetro jenway modelo 6405 serial N. 4063,
usando cubetas de cuarzo.
26
La metodología desarrollada fue la siguiente:
5.7.1 Preparación de soluciones:
•
Preparación del radical DPPH•: Se peso 3.9 mg de DPPH• en un matraz
aforado previamente tarado y se disolvió en 100 mL de metanol, el matraz
se cubrió con papel aluminio como protección contra luz.
•
Preparación de Trolox: Se preparó una solución stock 800 µM disolviendo
2 mg de acido 6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametilcromo-2- carboxílico 97% (Trolox)
de Aldrich Chemical Co,
en 10 mL de metanol, luego se prepararon
diluciones con rangos de concentración entre 100 µM y 700 µM, con el fin
de realizar la curva de calibración. Como blanco de calibración del equipo
se empleó metanol.
•
Preparación del Acido Ascórbico: Se preparo un solución stock 0,1 µg/mL
disolviendo 5µg de acido ascorbico en 50 mL de metanol, luego se
prepararon diluciones con rangos de concentración entre 0,005 y 0,06
µg/mL, como blanco del equipo se preparo metanol.
5.7.1.1
Preparación de la curva de calibración: A 2,0 mL DPPH•· se le
adicionaron 0,1 mL de cada una de las diluciones de Trolox; la medición se
realizó a 517 nm, y el porcentaje de inhibición se calculó con base en la siguiente
ecuación 1:
% 𝑑𝑑𝑑𝑑 𝑖𝑖𝑖𝑖ℎ𝑖𝑖𝑖𝑖𝑖𝑖𝑖𝑖𝑖𝑖ó𝑛𝑛 =
A inicial − A final
𝑋𝑋100
A inicial
Ecuación 1.
El porcentaje de inhibición representa la pérdida del color violeta del radical
DPPH•, cuando le es agregado un compuesto antioxidante, disminuyendo así la
absorbancia de la solución, que es medida a 517 nm; la absorbancia inicial se
toma en el minuto cero sin adición de trolox, la absorbancia final se toma 8
minutos después de agregar el trolox .
5.7.1.2
Medición de la inhibición generada por el patrón: A 2,0 mL DPPH•· se
le adicionaron 0,1 mL de cada una de las diluciones de Ácido ascorbico; la
medición se realizó a 517 nm, y el porcentaje de inhibición se calculó con la
misma ecuación empleada para realizar la curva de calibración.
27
5.7.1.3
Medición de la actividad antioxidante de los extractos: En una celda
de cuarzo se agregó 2,0 mL del radical DPPH• se midió la absorbancia a 517nm,
luego se adicionaron 1 mL de la dilución del extracto y nuevamente se midió la
absorbancia final a la misma longitud de onda 15 minutos después.
5.7.1.4
Determinación de la actividad total equivalente a trolox(TEAC): La
actividad antioxidante total frente al catión radical DPPH• fue calculada mediante
la ecuación 2; el TEAC equivale a decir la concentración de Trolox en µM/mL,
con una capacidad antioxidante equivalente a la de una concentración 1 µM/mL de
la sustancia problema. Para efectos de comparación se calculo el TEAC.24
µM Eq.Trolox/mL muestra=
X
(m ∗ mL muestra ∗ 1000)
Ecuación 2
m: pendiente de la ecuación de la curva de calibración
X: Abs inicial – Abs final
28
6. ANÁLISIS DE RESULTADOS
Esta investigación fue abordada desde dos aspectos, el químico que consistió en
conocer el rendimiento de extracción, que características fisicoquímicas, el análisis
espectrofotométrico y el análisis espectroscópico de las muestras obtenidas; por
otra parte el biológico que consistió en la actividad antioxidante de las muestras
dando las a conocer este resultado en µM equivalentes a trolox.
6.1
Toma de muestra de carbón leonardítico:
La muestra de carbón lignito (leonardita), analizada fue aportada por la empresa
BIOTROPIC LTDA, de una mina de su propiedad que se encuentra en
inmediaciones de la frontera noroccidental entre Boyacá y Santander, la muestra
fue entregada pulverizada, tamaño de partícula de 250 µm (tamiz No.60), lista
para ser analizada, en la tabla No 3 se describen los resultados obtenidos en
cuanto a su composición de la muestra analizada.
Parámetro evaluado
Carbono Fijo
Materia Volátil
Humedad
Nitrógeno
Resultado obtenido
47%
38%
15%
1,2%
Tabla 3. Composición del carbón de muestra
Fuente: Instituto Agustin Codazzi
29
6.2
Análisis Químico:
Este trabajo se realizó dos metodologías diferentes de extracción que consistían
una por solventes orgánicos y otra por medio básico. Dando como resultado los
siguientes resultados:
•
El método de Run Cang Sun obteniéndose un extracto seco de 13,58g y un
rendimiento del 6,79%.
•
El método de NaOH – NaCl el extracto seco fue de 14,78g y su rendimiento
fue de 4,93%.
En la siguiente imagen se muestra como son los extractos sólidos los cuales son
de un color marrón oscuro a negro que se observa en la figura 2.
Extracto inicial Run Cang Sun
Extracto inicial NaOH – NaCl
Figura 2. Extractos iniciales
Fuente: Autores
30
A estos se le realizaron unas pruebas de solubilidad que se muestran en las
siguientes tablas 3 y 4:
6.2.1 Solubilidad de extractos:
Extracto
Run Cang Sun
Solvente
Etanol
Diclorometano
Acetona
Tolueno
Benceno
1,4 Dioxano
Dimetilsulfoxido
Piridina
Diclorometano – 1,4 dioxano
Tetrahidrofurano
Dimetilsulfoxido – piridina
Diclorometano – dimetilsulfoxido
piridina
Diclorometano – dimetilsulfoxido
piridina – 1,4 dioxano
Suspensión
Parcialmente soluble
Insoluble
Insoluble
Insoluble
Parcialmente soluble
Parcialmente soluble
Parcialmente soluble
Parcialmente soluble
Soluble
Parcialmente soluble
– Parcialmente soluble
– Parcialmente soluble
Tabla 4. Solubilidad de extracto Run Cang Sun
Fuente: Autores
Como se aprecia en la Tabla 4 el extracto obtenido por el método de Run Cang
Sun es una mezcla poco soluble en diferentes solventes orgánicos de polaridad
media alta, dificultando los ensayos de propiedad antioxidantes, por esta razón se
realiza una derivatización para mejorar la solubilidad asi reduciendo la complejidad
por ende mejorando su solubilidad.
El extracto total del método de Run Cang Sun es un extracto de baja polaridad lo
hace poco soluble en todos los solventes orgánicos más utilizados.
31
Sosa – NaCl
Extracto
Solvente
Suspensión
Diclorometano
Parcialmente soluble
1,4 Dioxano
Insoluble
Dimetilsulfoxido
Insoluble
Piridina
Insoluble
Etanol
Parcialmente soluble
Tolueno
Piridina – Dimetilsulfoxido – 1,4 Parcialmente soluble
Dioxano
Soluble
Tetrahidrofurano
Tabla 5. Solubilidad de extracto Sosa - NaCl
Fuente: Autores
En la tabla 5 se apreciar que el extracto por el método de Sosa – NaCl también es
un extracto de baja solubilidad como el del método utilizado de solventes
orgánicos esto se debe a que las moléculas extraídas son polímeros orgánicos de
alto peso molecular y de polaridades muy bajas lo que dificulta su solubilidad en
diferentes solventes.
A los extractos derivatizados se les realizo pruebas de solubilidad dando como
resultado las siguientes tablas 5 y 6:
Extracto
Solvente
Etanol
Diclorometano
Acetona
1,4 Dioxano
Piridina
Tetrahidrofurano
Run Cang Sun Derivatizada
Parcialmente Soluble
Insoluble
Insoluble
Soluble
Parcialmente soluble
Soluble
Tabla 6. Solubilidad de extracto Sosa – NaCl derivatizada
Fuente: Autores
32
Extracto
Sosa – NaCl Derivatizada
Solvente
Etanol
Diclorometano
Acetona
1,4 Dioxano
Piridina
Tetrahidrofurano
Parcialmente Soluble
Insoluble
Insoluble
Insoluble
Soluble
Soluble
Tabla 7. Solubilidad de extracto Run Cang Sun derivatizada
Fuente: Autores
Se puede apreciar una mejora en solubilidad de estos extractos derivatizados ya
que es soluble en solventes de polaridad media alta como el THF, la piridina y el
etanol, esto permitió realizar pruebas antioxidantes cuyos resultados se mostraran
más adelante.
Extracto Sosa Acuoso
Totalmente
derivatizado.
Muestra 1
Extracto Run Cang
Sun Acuoso totalmente
derivatizado.
Muestra 2
Extracto Sosa
Orgánico Totalmente
derivatizado.
Muestra 3
Figura 3. Extractos derivatizados
Fuente: Autores
33
Extracto Run Cang
Sun Parcialmente
derivatizado.
Muestra 4
6.2.2 Características espectrales UV-Vis de lignanos:
Una característica espectral de algunas moléculas es que producen rotación
especifica de la luz polarizada, esto se debe a las conjugaciones con los anillos
aromáticos; en un espectro UV generalmente aparecen dos señales de similar
intensidad entre 230 – 240 nm y entre 280 – 290 nm. Una característica
importante de los lignanos, es que todos producen rotación específica de la luz
polarizada. Las insaturaciones conjugadas con los anillos aromáticos originan
desplazamientos de las señales.
A los extractos obtenidos se les realizo este ensayo espectrofotométrico
(gráfica 1 – 9) con el fin de conocer si existían moléculas con estas características
espectrales dando como resultado positivo desde el primer extracto hasta su
correspondiente derivatización viéndose picos de absorbancia en las longitudes de
onda mencionadas anteriormente; conociendo la procedencia del carbón nos
permite asegurar que estos extractos son ricos en moléculas de carácter
polifenólicos es decir lignina, ácidos húmicos y/o fúlvicos.25
Extracto Run Cang Sun antes de derivatizar
3
2
1
0
200
Absorbancia
4
Longitud de onda (nm)
Gráfico 1. Espectro UV-Vis Extracto Run Cang Sun antes de derivatizar
Fuente: Autores
34
Extracto Run Cang Sun despues de derivatizar
3,5
Absorbancia
3
2,5
2
1,5
1
0,5
200
0
Longitud de onda (nm)
Gráfico 2. Espectro UV-Vis Extracto Run Cang Sun despues de derivatizar
Fuente: Autores
Extracto Run Cang Sun Der Total en THF
1
0,6
0,4
0,2
-0,2
500
0
200
Absorbancia
0,8
Longitud de onda (nm)
Gráfico 3. Espectro UV-Vis Extracto Run Cang Sun Derivatización Total en THF
Fuente: Autores
35
Extracto NaOH - NaCl totalmente derivatizado en
Piridina
2
Absorbancia
1,5
1
0,5
-0,5
200
0
Longitud de onda (nm)
Gráfico 4. Espectro UV-Vis Extracto NaOH - NaCl totalmente derivatizado en Piridina
Fuente: Autores
Extracto Run Cang Sun totalmente derivatizado
en Piridina
2
1
0,5
0
-0,5
200
Absorbancia
1,5
Longuitud de onda (nm)
Gráfico 5. Espectro UV-Vis Extracto Run Cang Sun totalmente derivatizado en Piridina
Fuente: Autores
36
500
350
0,9
0,8
0,7
0,6
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0
-0,1
-0,2
200
Absorbancia
Sosa Derivatización parcial en THF
Longitud de onda (nm)
Gráfico 6. Espectro UV-Vis Sosa Derivatización parcial en THF
Fuente: Autores
Run Cang Sun Derivatización Total en THF
3,5
2,5
2
1,5
1
0,5
500
350
0
200
Absorbancia
3
Longitud de onda (nm)
Gráfico 7. Espectro UV-Vis Run Cang Sun Derivatización Total en THF
Fuente: Autores
37
Sosa Derivatización Total en THF
3,5
Absorbancia
3
2,5
2
1,5
1
0,5
500
350
200
0
Longitud de onda (nm)
Gráfico 8. Espectro UV-Vis Sosa Derivatización Total en THF
Fuente: Autores
Run Cang Sun Derivatización Parcial en EtOH
3,5
2,5
2
1,5
1
0,5
500
350
0
200
Absorbancia
3
Longitud de onda (nm)
Gráfico 9. Espectro UV-Vis Run Cang Sun Derivatización Parcial en EtOH
Fuente: Autores
38
6.2.3 Análisis de gases – masas de los extractos obtenidos:
Las sustancias húmicas se extrajeron del carbón leonarditico empleando las
técnicas Run Cang Sun y sosa de acuerdo con la metodología descrita en los
numerales 5.1.1 y 5.1.2: la derivatización se efectuó de acuerdo a lo establecido
en el numeral 5.2.
En la siguiente figura se observa el perfil cromatográfico característico de las
sustancias húmicas obtenidas por la técnica sosa, con derivatización parcial. En
la tabla 8 se encuentran los compuestos identificados por comparación con la
biblioteca NIST 2,0 a través de la base de datos
MSD Chemstation
G1701DAD.03.00611; se reportaron los compuestos que por comparación
presentaban más de un 90% de coincidencia con el espectro de la biblioteca,
también se presentan las concentraciones de cada uno de los componentes del
extracto obtenidos por comparación con el patrón interno.
Cromatrograma 1. Sosa Orgánica parcialmente derivatizada
Fuente: Autores
39
N°
Compuesto
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
Tetrahidro-2-furanol
Dimetilsulfoxamonio formilmetiluro
(S)-(+)-3-Hidroxitetrahidrofurano
1,3-Propanodiol, 2-(hidroximetil)-2-nitro
Nonano
2-Metoxitetrahidrofurano
Ácido - 4-hidroxi butanoico
Undecano (patrón interno)
2-(metoximetil)- tetrahidrofurano
Acido tetrahidro – 2 – furanil metil
Ácido tetrahidro-2-furanil metil butanoico
Anhidrido Butanoico
2-(metoximetil)- tetrahidro Furano
2-(metoximetil)- tetrahidro Furano
Ácido tetrahidro-2-furanil metil butanoico
Ácido tetrahidro-2-furanil metil butanoico
Ácido tetrahidro-2-furanil metil butanoico
Hexatriacontano
Tetratriacontano
Hexatriacontano
Tiempo R
4,103
4,473
4,555
5,021
5,192
5,421
5,543
6,577
8,263
8,359
8,551
8,744
8,945
10,264
11,774
18,118
18,194
19,492
21,264
22,783
Área
111322126
8067876
3571612
2666384
3255648
17882361
5456800
291360529
630245
18848923
4956755
15490493
574392
959183
580012
1580192
1106543
3363107
2608550
1213490
ppm
2109040,9
153468,1
68311,6
51167,1
62327,4
339348,5
104015,9
5518859,2
12603,8
357654,6
94545,3
294047,9
11546,0
18833,7
11652,4
30595,3
21624,6
64362,6
50071,7
23650,2
Tabla 8. Compuestos identificados por análisis cromatográfico extracto Sosa Orgánico
parcialmente derivatizado
El siguiente cromatograma muestra el perfil característico de las sustancias
húmicas obtenidas por la técnica Run Cang Sun, totalmente derivatizado. En la
tabla 9 se encuentran los compuestos identificados por comparación con la
biblioteca NIST 2,0 a través de la base de datos
MSD Chemstation
G1701DAD.03.00611; se reportaron los compuestos que por comparación
presentaban más de un 90% de coincidencia con el espectro de la biblioteca.
También se presentan las concentraciones de cada uno de los componentes del
extracto obtenidos por comparación con el patrón interno.
40
Cromatograma 2. Run Cang Sun Acuoso totalmente derivatizado
Fuente: Autores
N° Compuesto
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
Tiempo R
Tetrahidro – 2 –furanol
Dimetilsulfoxonio formilmetiluro
(S)-(+)-3-Hidroxitetrahidrofurano
1,3-Propanediol, 2-(hidroximetil)-2-nitro
3,7 – Dimetil undecano
2-Metoxitetrahidrofurano
3-Hidroxipropil oxirano
Undecano (patrón interno)
2,10 – Dimetil undecano
2-Etoxitetraidrofurano
Ácido tetrahidro – 2 – furanil metil butanoico
Ácido tetrahidro – 2 – furanil metil butanoico
Anhidro butanoico
Tetrahidro -2 – metoximetil furano
Tetrahidro -2 – metoximetil furano
Área
ppm
4,104 104468207 1979231,91
4,470
8944382 170068,563
4,547
4099833 78315,7405
5,013
2497437 47967,3314
5,192
3243093 62089,6042
5,417
19394498 367987,426
5,535
4775058 91104,0928
6,540 228384621
4326133,7
6,577
67260076 1274532,46
8,263
750139 14874,5663
8,355
20233263 383873,127
8,548
5518583 105186,006
8,741
17309356
328496,1
8,942
753438 14937,0473
10,283
2002490 38593,3352
Tabla 9. Compuestos identificados por análisis cromatográfico extracto Run Cang Sun totalmente
derivatizado
41
En los esquemas 2, 3 y 4, se puede observar las posibles rutas de fragmentación
de tres de los compuestos identificados por la biblioteca; el tetrahidro-2- furanol, el
dimetil sulfoxonio formilmetiluro y el ((S)-(+)-3-Hidroxitetrahidrofurano).
Cromatograma 3.Pico 1(Tetrahidro – 2 – furanol)
Fuente: Autores
Esquema 2. Rompimiento de masas (Tetrahidro – 2 – furanol)
Fuente: Autores
42
Cromatograma 4.Pico 2 (Dimetilsulfoxonio formilmetiluro)
Fuente: Autores
Esquema 3. Rompimiento de masas (Dimetilsulfoxonio formilmetiluro)
Fuente: Autores
43
Cromatograma 5.Pico 3 ((S)-(+)-3-Hidroxitetrahidrofurano)
Fuente: Autores
Esquema 4. Rompimiento de masas ((S)-(+)-3-Hidroxitetrahidrofurano)
Fuente: Autores
La cromatografía de gases y el uso de ionización química en espectrometría de
masas (GC-MS) revelaron patrones de fragmentación diastereoespecíficos que
sirvieron para diferenciarlos.
A pesar de que los resultados de las muestras por infrarrojo, corroboraron la
presencia de grupos funcionales alcohol y acido ligados a anillos aromáticos, el
corrimiento de estas mismas por gases masas no confirmo los datos, esto puede
ser debido a que la columna utilizada era de polaridad media baja y lo ideal era
contar con una columna polar ya que las sustancias allí encontradas tenían estas
características de polaridad alta según las pruebas de solubilidad realizadas en el
laboratorio, además de esto al contar con sustancias tan altamente polares el
44
analista del laboratorio determinó que la forma de análisis adecuada de las
muestras sin poner en peligro la columna era dejar correr el solvente
(tetrahidrofurano) por 4 min antes de empezar la identificación de la muestra,
acción que abre la posibilidad a que moléculas importantes hayan salido unidas al
solvente antes de ser identificadas.
6.2.4 Características espectrales IR de extractos obtenidos:
El análisis de los extractos obtenidos por las técnicas Sosa y Run Cang Sun en el
infrarrojo se realizó de acuerdo al numeral 5.4, en las siguientes graficas se
encuentran los espectro IR obtenidos para los extractos de Run Cang Sun total y
parcialmente derivatizados y de Sosa totalmente derivatizado.
45
Espectro IR 1. Run Cang Sun Acuoso Totalmente Derivatizado
Fuente: Autores
46
Espectro IR 2. Run Cang Sun Orgánica Totalmente Derivatizado
Fuente: Autores
47
Espectro IR 3.Sosa - NaCl Acuoso Totalmente Derivatizado
Fuente: Autores
48
En la tabla 10 se puede observar de manera resumida las principales bandas
identificadas en los anteriores espectros infrarrojos, así como los grupos
funcionales atribuibles a tales bandas
Muestra analizada
Pico
Característico para
Run cang sun acuoso derivatizado
1197
1400
1637
1656
2850
2953
3448
c-o-c,
C(CH3)3
C=C
C=C
Anillo aromatico
C-H
O-H
1002
1172
S=O
Sulfonatos sulfonamidas
C=N, NO2
Anillo aromatico
RCO-O-COR'
Anillo aromatico
O-H
1637
2850
2920
3037
3446
Run cang sun orgánico derivatizado
1095
1139
1400
3035
3138
Sosa acuosa derivatizada
S=O
Sulfonatos sulfonamidas
C=N, NO2
Anillo aromatico
RCO-O-COR'
Tabla 10. Bandas características de los IR.
Fuente: Autores
Al realizar la comparación de las bandas obtenidas en los espectros de las
muestras analizadas, con espectros IR reportados en artículos científicos26 para
lignanos como el matairresinol, arctigenina, pinoriesinol, entre otros, se confirma la
presencia de bandas características, correspondientes a los grupos funcionales
como lactona, sulfona, grupos aromáticos, alcoholes, dobles enlaces entre otros.
49
6.3
Análisis Biológico:
6.3.1 Determinación de la capacidad antioxidante:
La actividad antioxidante se determinó de acuerdo a los parámetros establecidos
en el numeral 5.6.1.
6.3.1.1 Preparación de curvas de calibración y comparación:
Con el fin de expresar los resultados de actividad antioxidante en términos de µM
equivalentes de trolox/mL (ecuación 1), se realizo la curva de calibración con
soluciones de trolox en concentraciones de 100 a 800 µM y se realizó la medición
del porcentaje de inhibición empleando la ecuación 2. Los resultados de la
medición del porcentaje de inhibición se encuentran en la tabla 11 corroborando
una efectividad del trolox entre un 19% y un 79% para las concentraciones
evaluadas.
TROLOX µM
100
200
400
600
800
Absorbancia
inicial (ƛ 517
nm)
0,903
0,910
0,907
0,899
0,907
Absorbancia
Final (ƛ 517
nm)
0,729
0,691
0,522
0,345
0,187
% de
inhibición
19,0
24,0
42,0
62,0
79,0
Tabla 11. Datos para la curva de calibración con trolox
Fuente: Autores
Partiendo de los datos obtenidos de la inhibición de DPPH•, por parte del trolox,
se construyó una curva de calibración (Gráfica 10) que permite verificar la
dependencia lineal del % de inhibición del radical Vs. la concentración del trolox
obteniéndose un R2 de 0,996.
50
Inhibición DPPH (%)
1
y = 0,000x + 0,080
R² = 0,996
Inhibición %
0,8
0,6
0,4
0,2
0
0
200
400
600
TROLOX µM
800
1000
Gráfica 10. Curva de calibración del porcentaje de inhibición Vs concentración Trólox
Fuente: Autores
Se determinó la actividad del ácido ascórbico (vitamina C) en concentraciones de
0,005 a 0,06 µg/mL (tabla 12), para tomarlo como patrón de comparación en
cuanto a porcentaje de inhibición.
6.3.1.2 Determinación de la actividad antioxidante de Vitamina C frente a DPPH•:
Vitamina C
(µg/mL)
Vitamina C
(ppm)
0,005
0,01
0,02
0,04
0,06
5
10
20
40
60
Absorbancia
Inicial (ƛ 517
nm)
0,902
0,891
0,908
0,910
0,900
Absorbancia
Final (ƛ 517
nm)
0,603
0,527
0,443
0,186
0,016
Tabla 12. Datos para la curva de calibración con Vitamina C
Fuente: Autores
51
Inhibición
DPPH• (%)
33,1
40,9
51,2
79,6
98,2
Teniendo en cuenta los resultados obtenidos de la actividad antioxidante de la
vitamina C se elaboro la gráfica 11, que nos permite corroborar un
comportamiento lineal de la misma.
Inhibición DPPH (%)
120,0
Inhibicón (%)
100,0
80,0
60,0
40,0
20,0
0,0
0
0,01
0,02
0,03
0,04
0,05
0,06
0,07
Vitamina C (µg/ml)
Gráfica 11. Curva de calibración del porcentaje de inhibición Vs Vitamina C
Fuente: Autores
6.3.2 Actividad antioxidante de los extractos:
En la tabla 13 se encuentran los resultados obtenidos de la actividad antioxidante
de los extractos, en ella se describe el tipo de extracto, concentración inicial,
diluciones evaluadas, el cálculo del porcentaje de inhibición obtenido de las dos
replicas para cada dilución, el promedio y la desviación estándar correspondiente.
52
Muestra 1
Muestra 2
Muestra 3
Muestra 4
Concentración
(µg/mL)
% de
inhibición
Concentración
(µg/mL)
% de
inhibición
Concentración
(µg/mL)
% de
inhibición
Concentración
(µg/mL)
% de
inhibición
1200
92,0
1200
99,5
1200
79,1
1200
79,5
90,3
98,7
80,5
80,0
Promedio
91,2
Promedio
99,1
Promedio
79,8
Promedio
79,8
Desviación
estándar
0,9
Desviación
estándar
0,4
Desviación
estándar
0,7
Desviación
estándar
0,3
600
41,0
600
56,2
600
34,8
600
44,2
42,8
54,3
35,9
43,8
Promedio
41,9
Promedio
55,3
Promedio
35,4
Promedio
44,0
Desviación
estándar
0,9
Desviación
estándar
1,0
Desviación
estándar
0,6
Desviación
estándar
0,2
300
27,5
300
34,2
300
19,3
300
24,3
26,0
32,7
17,9
25,0
Promedio
26,8
Promedio
33,5
Promedio
18,6
Promedio
24,7
Desviación
estándar
0,8
Desviación
estándar
0,8
Desviación
estándar
0,7
Desviación
estándar
0,4
150
15,8
150
21,8
150
11,6
150
12,3
14,7
22,6
12,9
12,7
Promedio
15,3
Promedio
22,2
Promedio
12,3
Promedio
12,5
Desviación
estándar
0,6
Desviación
estándar
0,4
Desviación
estándar
0,7
Desviación
estándar
0,2
Tabla 13. Resultados de actividad antioxidante en términos de inhibición de DPPH• de los
extractos.
Fuente: Autores
Nota: Muestra 1. Sosa acuosa derivatizada totalmente, Muestra 2. Run Cang Sun
acuoso totalmente derivatizado, Muestra 3. Sosa orgánica totalmente derivatizada,
Muestra 4. Sosa orgánica parcialmente derivatizada
6.3.2.1 Determinación de la actividad antioxidante equivalente a trolox de los
extractos (TEAC).
La actividad antioxidante total, se calculó de acuerdo al numeral 5.6.1.4, según la
ecuación 2, tomando como base la ecuación de la recta de calibración:
y = 0,0009x + 0,0809, los resultados son plasmados en la tabla 14 y se reportan
en equivalentes trolox/mL de muestra.
53
Muestra 1
Muestra 2
Concentración
(µg/mL)
% de
inhibición
µM equivalente a
trolox/mL
Concentración
(µg/mL)
% de
inhibición
µM equivalente a
trolox/mL
1200
600
300
150
92
41
26
14,7
0,85
0,29
0,16
0,07
1200
600
300
150
98,7
54,3
34,2
21,8
0,96
0,59
0,27
0,15
Muestra 3
Muestra 4
Concentración
(µg/mL)
% de
inhibición
µM equivalente a
trolox/mL
Concentración
(µg/mL)
% de
inhibición
µM equivalente a
trolox/mL
1200
600
300
150
79,1
34,8
19,3
11,6
0,71
0,31
0,08
0,02
1200
600
300
150
79,5
44,2
24,3
12,3
0,71
0,33
0,16
0,03
Tabla 14. Resultados de actividad antioxidante equivalente a trolox (TEAC) de los extractos.
Fuente: Autores
Los valores de Inhibición y TEAC calculados para los extractos obtenidos por
ambas técnicas son similares en todos los puntos evaluados, siendo un poco más
altos los obtenidos para la técnica Run Cang Sun extracto acuoso totalmente
derivatizado (muestra 2).
En la tabla 14 se realiza una comparación del valor calculado de TEAC para la
dilución que presento el mayor porcentaje de inhibición de cada uno de los
extractos, con valores de TEAC reportados en la literatura para flavonoides con
alta capacidad antioxidante como la quercitina27, o ácidos fenólicos de mediana
capacidad antioxidante como el ácido cafeico.28 Se puede deducir que la
capacidad antioxidante de los extractos expresada en términos de TEAC es
media, esto debido a la presencia de derivados de fenilpropanoides, fenoles o
sustancias donadoras de protones en la
composición de los extractos.
Comparando el porcentaje de inhibición logrado por los extractos contra la
inhibición obtenida por el patrón de ácido ascórbico, los resultados obtenidos por
las muestras analizadas fueron un poco bajas, sin embargo se debe tener en
cuenta que el ácido ascórbico es una sustancia con una gran capacidad
antioxidante, y las muestras analizadas no se encontraban en estado puro, es
decir aquellas sustancias que podrían haber tenido capacidad antioxidante,
pueden estar ligadas a otras que pueden interferir con esta propiedad.
54
Extracto
Muestra 1
Muestra 2
Muestra 3
Muestra 4
Quercitina
Ácido Cafeico
TEAC (µM)
0,85
0,96
0,71
0,71
4,70
1,26
Tabla 15. Capacidad antioxidante de los extractos expresada en términos de TEAC
Fuente: Autores
En este trabajo se utilizo el método de decoloración del DPPH• para la
determinación de la actividad antioxidante, la cual es una técnica efectiva para la
búsqueda de nuevas sustancias o mezclas antioxidantes. Sin embargo, la
efectividad de un antioxidante depende de una variedad de factores que, incluyen,
la polaridad, solubilidad y la actividad quelante de metales, entre otros, por esta
razón, es necesario evaluar las posibles sustancias antioxidantes a través de
diferentes metodologías, con el fin de poder descartar una sustancia como
antioxidante de manera definitiva.
55
7. CONCLUSIONES
•
Partiendo de los resultados obtenidos podemos afirmar que el método de
Run Cang Sun es más eficiente que el método Sosa en cuanto a eficiencia,
sin embargo para valorar un resultado hay que tener en cuenta otros
aspectos importantes, como lo son los reactivos empleados en la
extracción, el costo de los mismos; en cuanto estos dos últimos factores el
método de Run Cang Sun es más costoso y peligroso debido a que uno de
los componentes principales de la mezcla extractora es el tolueno
•
Por medio de análisis espectrofotométricos de UV-Vis se identificaron
bandas características reportadas en la literatura para sustancias húmicas
permitiendo corroborar de cierto modo la presencia de las mismas,
permitiendo así continuar con la investigación, cuyo enfoque principal era
la comprobación de la capacidad antioxidante de las mismas.
•
El análisis infrarrojo realizado a los extractos permitió realizar
comparaciones entre las señales identificadas con otras bandas reportadas
en estudios realizados sobre lignanos y derivados fenólicos con
características antioxidantes,
las cuales mostraron gran similitud
reconociendo así la presencia de sustancias con características
antioxidantes, información que pudo ser corroborada luego por los
resultados obtenidos de esta actividad.
•
El proceso de derivatización fue efectivo permitió romper los polímeros
aromáticos aumentando su solubilidad y permitiendo separación de sus
sustancias constituyentes por cromatografía de gases.
•
Las sustancias separadas por cromatografía de gases e identificadas por
masas a través de comparación con biblioteca NIST, no poseen actividad
antioxidante importante esto debido a que las sustancias antioxidantes que
pueden extraerse de la matriz del carbón, (derivados de sustancias
húmicas)
poseen un carácter bastante polar, siendo estos poco
incompatibles con la columna empleada, por tanto se identificaron en el
carbón aquellas sustancias que fueron más compatibles con la columna y
fueron separadas por ella de manera más adecuada.
•
El realizar pruebas como la espectrofotometría de masas, UV-Vis y
espectroscopía IR permitió corroborar varios aspectos importantes como
características estructurales de los compuestos, cuantificación de
moléculas existentes, lo que podría permitir la determinación del
rendimiento la extracción de cada uno de los compuestos y nos permite
afirmar algunas moléculas existentes en los extractos.
56
•
Los 4 extractos obtenidos poseen una actividad antioxidante muy similar
esto puede ser que tanto el método de extracción como su correspondiente
derivatización se realizaron de manera adecuada obteniendo 2
posibilidades la primera es haber obtenido los mismos compuestos por
ambos métodos y la segunda que las sustancias obtenidas tengan actividad
antioxidante muy cercanas. Los extractos obtenidos presentaron una
actividad antioxidante comparada con la que posee el acido caféico, que es
una sustancia antioxidante de mediana capacidad.
•
La muestra N° 2 es la que posee mayor actividad lo que induce a pensar
que es un extracto con un porcentaje mayor de compuestos de tipo fenólico
lo que permite tener obtener este resultado.
57
8. RECOMENDACIONES
•
Para próximas investigaciones se recomienda utilizar el método de NaOH –
NaCl porque es más económico, menos contaminante y su tiempo de
operación es menor que la extracción orgánica. Además el rendimiento del
método inorgánico podría mejorarse realizando ensayos aumentando la
concentración de los reactivos.
•
Debido a que el proceso de derivatización empleado fue efectivo y un
proceso netamente químico, se puede plantear otra metodología en la cual
se utilice reactivos de menor contaminación o un proceso físico como la
termoquimolisis.
•
Es necesario determinar otra metodología para él análisis por CGM ya que
la utilizada no permitió corroborar la presencia de moléculas con
características antioxidantes.
•
Se sugiere realizar otros ensayos que permitan corroborar de manera
definitiva la actividad antioxidante como lo es el método de ABTS.
58
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