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RESULTADOS
TÍTULO DEL PROYECTO:
IDENTIFICACIÓN, CARACTERIZACIÓN Y MANEJO DE AGENTES CAUSALES
DE ENFERMEDADES RADICULARES DEL MANZANO EN LAS PRICIPALES
REGIONES PRODUCTORAS DE CHIHUAHUA.
NÚMERO DE CLAVE: 362
INVESTIGADOR RESPONSABLE: DR. RIOS VELASCO CLAUDIO
RESÚMEN EJECUTIVO
La producción nacional del manzano es inestable debido a factores abióticos (baja
acumulación de horas frío, heladas tardías, granizo, entre otros) y bióticos
(insectos plaga y enfermedades), los cuales limitan su producción ocasionando
pérdidas económicas. Las enfermedades reportadas que atacan a este frutal a
nivel mundial, siguen siendo un gran problema para los fruticultores, dentro de
estas enfermedades destacan las radiculares causadas por diversos patógenos
presentes en el suelo, tales como Phymatotrichopsis omnivora Phytophthora
cactorum, Fusarium spp., Armillaria spp., Rhizoctonia spp., Alternaria spp.,
Rosellinia necatrix, Xylaria mali, Nectria spp., y Pythium spp. entre otros. Cabe
señalar también que en los mismos suelos plantados con manzano, se encuentran
microorganismos antagonistas, tales como bacterias Bacillus spp., hongos
Trichoderma spp. y actinomicetos (Streptomyces spp.), los cuales son una
alternativa viable y económicamente rentable para el manejo de enfermedades. En
la actualidad, la información generada sobre las enfermedades radiculares en
manzano en México, es escasa y no muy reciente en cuanto a agentes causales
asociados, sintomatología, incidencia, severidad, distribución, manejo, entre otros.
Dado lo anterior, el objetivo del estudio fue caracterizar a los hongos causantes de
enfermedades radiculares en manzano y sus antagonistas, en huertos del estado
de Chihuahua. Para lo cual, se estimó la incidencia de enfermedades radiculares
en cinco huertos de cada uno de los cuatro municipios productores de manzano
en el estado de Chihuahua, en los mismos huertos se tomaron muestras de suelo
de la rizosfera de árboles y de tejido vegetal, para el aislamiento de hongos
fitopatógenos y antagonistas. Los hongos fitopatógenos y antagonistas fueron
identificados morfológica y molecularmente. Los hongos antagonistas aislados y
del cepario del CIAD, A.C. fueron confrontados in vitro con los fitopatógenos, para
medir su capacidad antagónica como una alternativa al control químico. Dada la
gran diversidad de especies de hongos entomopatógenos encontrados asociados
a huertos de manzano en el estado, se realizaron pruebas de patogenicidad
(postulados de Koch), bajo condiciones de invernadero en 12 portainjertos de
manzano, en la cual se contemplaron 15 patógenos que en estudios previos en
otros países han sido reportados como agentes causales.
Mediante las características morfológicas macro y microscópicas, se identificaron
a los siguientes hongos fitopatógenos: Pythium spp., Phytophthora cactorum,
Fusarium oxysporum, F. sacchari, F. tricinctum, F. solani, Alternatia alternata, A.
brassicae, Bionectria ochroleuca, Gibberella intermedia y a los antagonistas
Trichoderma harzianum, T. asperelum, T. gamsii, T. atroviridae, entre otros. Estos
microorganismos al igual que las bacterias antagónicas Bacillus amyloliquefaciens
y B. methylotrophicus, fueron confirmados mediante la secuenciación de los
productos de PCR, de acuerdo con las secuencias de la base de datos del Banco
de Genes (NCBI), mediante el algoritmo de BLAST. Se caracterizó micro y
macroscópicamente a los aislados de hongos y bacterias antagonistas. Se estimó
una incidencia de árboles de manzano, con problemas sintomatología de
enfermedades radiculares en los huertos muestreados que fluctúo del 1 al 32 %.
El promedio de incidencia para el estado de Chihuahua, obtenido de los diferentes
huertos muestreados en Cuauhtémoc, Guerrero, Namiquipa, Bachíniva, fue del 17
%. De los hongos fitopatógenos aislados de huertos de manzano en diferentes
municipios del estado de Chihuahua, Fusarium oxysporum fue el más
frecuentemente encontrado con un 32.6 %, seguido por Bionectria ochroleuca. De
igual manera, se encontraron a los oomicetos Phytophthora cactorum y Pythium
spp. con una frecuencia del 1.4 y 0.7 % respectivamente. El género Fusarium fue
el más frecuente en los cuatro municipios muestreados. Así mismo, se aislaron
hongos antagonistas del género Trichoderma, siendo T. gamsii el más frecuente
con un 72.5 %.
Las especies del hongo antagonista Trichoderma spp. mostró un porcentaje de
inhibición del crecimiento radial (PICR) en especies de Pythium, mientras que en
P. cactorum, PICR estuvo por arriba del 80% al día ocho. Sin embargo, cabe
mencionar que todas las especies de Trichoderma a los días 10-12 invadieron por
completo a los patógenos Pythium spp. y P. cactorum. Los antagonistas
bacterianos B. amyloliquefaciens y B. methylotrophicus, fueron efectivas en la
reducción del PICR de P. cactorum y Pythium spp. y mostraron un halo de
inhibición en el crecimiento micelial de los patógenos Oomicetos evaluados in
vitro.
De los 12 portainjertos evaluados, el más susceptible a la mayoría de los
patógenos evaluado fueron G30 y G202, ambos susceptibles a Pythium sp. 2 y P.
cactorum a3 y Bionectria ochroleuca. G30 además fue susceptible al ataque de P.
cactorum a1 y Fusarium sacchari, mientras que G202 mostró susceptibilidad a P.
cactorum a4 y Alternaria alternata. G935 fue susceptible a Pythium sp. 2 y P.
cactorum a1, BUD 118 a P. cactorum a1 y P. cactorum a3. El resto de los
portainjertos también fueron susceptibles al menos a un patógeno de los 12
evaluados, con excepción de G222, M111 y Standart que fueron tolerantes o
resistentes al ataque de todos los patógenos.
Derivado de lo anterior, se elaboró un boletín técnico dirigido a los productores, un
tríptico, se realizaron dos cursos de capacitación y un día de laboratorio y uno de
campo, donde se dieron a conocer los resultados encontrados, a fin de fortalecer
los programas de manejo de enfermedades en manzano en el estado, impactando
tanto económica como socialmente, debido a que con estos resultados se reducirá
el uso de fungicidas químicos y se evitará la mortandad de árboles al ser
manejados biorracionalmente.
Se encontró una incidencia alta de árboles sintomáticos de enfermedades
radiculares en los huertos de manzano evaluados del estado de Chihuahua por
arriba del 17 %; se encontraron nueve géneros de hongos fitopatógenos, en
árboles de manzano sintomáticos de enfermedades radiculares, siendo el más
frecuente Fusarium oxysporum; Phytophthora cactorum a2, y F. sacchari son los
posibles agentes causales de la muerte del 100 % de al menos 3 de los
portainjertos; los portainjertos M111, mostraron resistencia al 80 % de los hongos
fitopatógenos evaluados; los antagonistas encontrados pertenecen al género
Trichoderma, siendo T. gamsii el más frecuente; las cuatro especies de
Trichoderma, detuvieron el crecimiento de Pythium spp. y P. cactorum; B.
amyloliquefaciens y B. methylotrophicus inhibieron el desarrollo de P. cactorum
con más del 90 %, bajo condiciones in vitro.
El diagnóstico visual de síntomas es insuficiente para determinar la naturaleza del
agente causal, por lo que un análisis de laboratorio es esencial para identificar al
agente causal, requisito indispensable para implementar medidas de control de la
enfermedad; una vez realizado el diagnóstico, se pueden usar fungicidas
sistémicos en forma preventiva tanto en árboles dañados como en aquellos que
están alrededor. Sin embargo, también es recomendable aplicar Trichoderma spp.
al inicio del período de crecimiento de los árboles, como preventivos; evitar la
diseminación de este tipo de enfermedades, que se puede dar mediante cualquier
movilización del suelo y raíces contaminadas, arrastre por corrientes de agua, en
implementos agrícolas, maquinaria y sobre todo en árboles contaminados y que se
usan para plantar nuevos huertos o replantar en huertos ya establecidas.
RESULTADOS DEL PROYECTO
Se cumplieron al 100% las metas y objetivos; se estimó la incidencia de
enfermedades radiculares de enfermedades radiculares en árboles de huertos de
cuatro municipios del estado de Chihuahua, se identificaron y caracterizaron
morfológica y molecularmente los agentes causales de enfermedades radiculares
en manzano, además de aislar hongos antagonistas del género Trichoderma spp.,
se realizaron las pruebas de patogenicidad (postulados de Koch) en portainjertos
de árboles de manzano de un edad, bajo condiciones de invernadero, se realizaron
pruebas de antagonismo in vitro de hongos y bacterias entomopatógenas contra los
hongos fitopatógenos asociados al manzano.
INTRODUCCIÓN
El manzano (Malus domestica Borkh.), es el frutal más cultivado en el mundo,
siendo China el principal productor. México ocupa el lugar 20 en producción con
630,533 ton/año aproximadamente (FAOSTAT, 2013). Cabe señalar, que el
estado de Chihuahua aporta el 73% de la producción nacional, equivalente a
462,180 ton/año, siendo el municipio de Cuauhtémoc el líder en cuanto a
superficie plantada y cosechada, seguido por Guerrero, Namiquipa y Bachíniva
(SIAP-SAGARPA, 2013). Sin embargo, la tendencia de la producción nacional del
manzano es inestable debido a factores abióticos (baja acumulación de horas frío,
heladas tardías, granizo, entre otros) y bióticos (insectos plaga y enfermedades),
los cuales limitan su producción ocasionando pérdidas económicas. Las
enfermedades reportadas que atacan a este frutal a nivel mundial, han sido y
siguen siendo un gran problema para los fruticultores, dentro de estas
enfermedades destacan las radiculares causadas por diversos patógenos
presentes en el suelo, tales como Phymatotrichopsis omnivora (SamaniegoGaxiola, 2007), Phytophthora cactorum (Hantula et al., 2000; Jeffers, 2006; Latorre
y Rioja, 2001; Tewoldemedhin et al., 2011a; Tuset et al., 2002; Uthkede y Smith,
1991), Fusarium spp. (Lugo y Sanabria, 2001; Marlatt et al., 1996; Tewoldemedhin
et al., 2011a), Armillaria spp., Rhizoctonia spp. (Tewoldemedhin et al., 2011a),
Alternaria spp. (Serdani et al., 2002), Rosellinia necatrix (Hoopen y Krauss, 2006),
Xylaria mali (Whalley, 1996), Nectria spp., y Pythium spp. (MostowfizadehGhalamfarsa y Banihashemi, 2005; Tewoldemedhin et al., 2011a; Uthkede y
Smith, 1991), entre otros. Dichos patógenos, causan graves daños en los árboles
susceptibles, al bloquear los vasos vasculares (xilema y floema) reduciendo la
absorción de nutrientes y agua, e inclusive ocasionando la completa destrucción
del sistema radical y por ende su muerte inmediata. Cabe señalar también que en
los suelos plantados con manzano, se encuentran microorganismos antagonistas,
tales como bacterias Bacillus spp. (Vega, 2001), hongos Trichoderma spp. (Anees
et al., 2010; Bell et al., 1982; García et al., 2005) y actinomicetos (Streptomyces
spp.) (Ezziyyani et al., 2004), los cuales pueden inhibir el crecimiento de los
patógenos antes mencionados de forma natural.
En la actualidad, la información generada sobre las enfermedades radiculares en
manzano en México, es escasa y no muy reciente en cuanto a agentes causales
asociados, sintomatología, incidencia, severidad, distribución, manejo, entre otros.
Por lo cual, es necesario actuar de manera inmediata para evitar la mortandad de
árboles y así, proteger la producción en las regiones manzaneras del Estado y del
país. Dado lo anterior, el objetivo del estudio fue caracterizar a los hongos
causantes de enfermedades radiculares en manzano y sus antagonistas, en
huertos del estado de Chihuahua.
OBJETIVOS:
1. Identificar y caracterizar los principales agentes productores de enfermedades
radiculares en manzano.
2. Estimar la incidencia de los agentes causales de enfermedades radiculares.
3. Describir la sintomatología característica de cada agente causal
4. Manejar biorracionalmente las enfermedades radiculares mediante la integración
de antagonistas.
MATERIALES Y MÉTODOS
El trabajo experimental, se llevó a cabo en los municipios de Cuauhtémoc,
Guerrero, Namiquipa y Bachíniva, principales productores de manzano del estado
de Chihuahua, México (SIAP-SAGARPA, 2011) (Fig. 3). En cada uno de los
municipios, se contemplaron cinco huertos para la recolección de muestras y
toma de datos (Cuadro 2).
Estimación de incidencia de enfermedades radiculares
La incidencia se estimó en cinco huertos de cada uno de los cuatro municipios
productores de manzano en el estado de Chihuahua (Cuadro 1), en los cuales se
evaluaron 500 árboles, distribuidos en 10 hileras a todo lo ancho del huerto,
evaluando 50 árboles por cada una de ellas, dejando de 5 árboles en la periferia
del huerto evaluado (Fig. 1). Para lo cual, se registró el número de árboles que
presentaron síntomas característicos de enfermedades radiculares causados por
hongos, para lo cual se usó una escala visual arbitraria (Fig. 2) (Carisse y Jobin,
2012).
Figura 1. Esquema de la estimación de la incidencia de enfermedades radiculares
en huertos de manzano del estado de Chihuahua.
a
b
Figura. 2. Escala visual arbitraria para la estimación de incidencia en huertos de
manzano en los principales municipios productores del estado de Chihuahua. a)
árbol sano, b) árbol con síntomas de enfermedades radiculares.
Recolección de muestras
Para la obtención de los hongos fitopatógenos asociados a enfermedades
radiculares, se realizaron muestreos dirigidos tomando partes vegetales (raíz y
cuello) de 10-20 cm de la zona de transición (tejido muerto y tejido vivo), así como
10 muestras de rizosfera de 500-600 g con de 10 árboles con apariencia enferma
(Fig. 2, 3, 4) y de cinco árboles con apariencia sana, en cada huerto para la
obtención de antagonistas (MacHardy et al., 1999). Las muestras fueron llevadas
al Centro de Investigación en Alimentación y Desarrollo, A.C., Unidad Cuauhtémoc
(CIAD), para su almacenamiento a 0 ºC hasta su procesamiento.
Cuadro 1. Ubicación de los huertos donde se llevaron a cabo los muestreos y la
estimación de incidencia de enfermedades radiculares
Bachíniva
Guerrero
Namiquipa
Cuauhtémoc
Municipio
Huerto
Coordenadas
Picacho Lote 7
28º29'28" N; 106º40'08" W; 2020 msnm
Picacho Lote 6
28º29'31" N; 106º39'45” W; 2017 msnm
Picacho Lote 1A
28º29'23" N; 106º39'07" W; 2025 msnm
Campo 2A (2 abajo)
28º26'40" N; 106º59'18" W; 2130 msnm
Campana (Campo 4)
28º33'49" N; 106º54'24" W; 1995 msnm
Carlos Márquez
29º11'2.6" N; 107º 25' 14" W; 1877 msnm
Manuel Rivera
29º08'53" N; 107º 23'34" W; 1868 msnm
Reyes Nevarez 1
29º10' 31" N; 107º 22' 27" W; 1900 msnm
Reyes Nevarez 2
29º 09' 32" N; 107º 23' 10" W; 1873 msnm
Reyes Nevarez 3
29º 08' 59.4" N; 107º 23' 30" W; 1889
msnm
El Encino
28º 33' 23" N; 107º 27' 21" W; 2084 msnm
El Tanque
28º 33' 36" N; 107º 27' 23" W; 2082 msnm
Tres Compadres
28º 32' 5.9" N; 107º 27' 10" W; 2099 msnm
Ing. Gameros
28º 31' 58" N; 107º 26' 57" W; 2096 msnm
Las Margaritas
28º 33' 31" N; 107º 29' 37" W; 2012 msnm
San Joaquín
28º51'58" N; 107º15'57" W; 1991 msnm
Rosy
28º51'45" N; 107º16'08" W; 1984 msnm
Bety
28º51'29" N; 107º16'17" W; 1977 msnm
Manuel
28º51'107" N; 107º15'39" W; 1979 msnm
La Ciénega
28º46'52" N; 107º15'21" W; 2009 msnm
Aislamiento de hongos fitopatógenos y antagonistas
Los posibles hongos fitopatógenos asociados con las enfermedades radiculares
del manzano tales como Phytophthora spp., Fusarium spp., Alternaria spp.,
Rhizoctonia spp., Pythium spp., Xylaria spp., Gibberella spp. y Bionectria spp., así
como especies de Trichoderma, fueron aislados y purificados en medios de cultivo
artificiales semi-selectivos para cada uno de ellos. Para Phytophthora spp., las
partes vegetales enfermas (tejido de transición), se lavaron con agua potable para
eliminar el exceso de suelo. Posteriormente, se realizaron cortes de 3-5 mm
aproximadamente y fueron esterilizados por 5 min en hipoclorito de sodio (NaClO)
al 0.5 %, se enjuagaron con agua destilada estéril y se dejaron secar en una
campana de flujo laminar (Envirco Corporation), en seguida se colocaron en
cámaras húmedas (cajas de Petri con algodón humedecido con agua destilada
estéril en una incubadora) e incubadas en una cámara de crecimiento ambiental
(Precision Scientific, Modelo 31534), por 5 d a 26 ºC. Los hongos fueron
purificados en medio V8-agar más tres antibióticos (piramicina, rifampicina y
oxitetraciclina), y un fungicida (carbendazim), e incubados a 26 ºC por 48 h
(Latorre y Rioja, 2001; Tewoldemedhin et al., 2011a; Tumwine et al., 2000; Tuset
et al., 2002; Uthkede y Smith, 1991).
a
b
c
d
Figura 3 a-d. Recolecta de muestras vegetales a partir de árboles de manzano con
sintomatología de enfermedades radiculares y suelo de la rizosfera.
Zona de transición
10-20 cm
Suelo cercano
a la rizosfera
500-600g
Figura 4. Esquematización de la toma de muestras de tejido vegetal y rizosfera de
árboles de manzano con sintomatología de enfermedades radiculares.
Para el resto de los patógenos y antagonistas, los cortes vegetales se lavaron con
agua potable para remover el excedente de suelo, se trataron con NaClO 0.5 %
por 5 min, se enjuagaron con agua destilada estéril y se dejaron secar en una
campana de flujo laminar. Los segmentos de raíz (de 3-5 mm), previamente
tratados, fueron sembrados en agar-agua, PDA y V8-agar que contenían los
antibióticos antes mencionados (Ikeda et al., 2005; Tewoldemedhin et al., 2011a;
Uppalapati et al., 2010; Uthkede y Smith, 1991). Los aislados de hongos, se
incubaron a 26 ºC por 48 h y fueron purificados mediante las técnicas de cultivos
monospóricos y punta de hifa (Fig. 5) (Cañedo y Ames, 2004).
Figura 5. Aislamiento y clasificación de hongos de acuerdo a sus características
macroscópicas
Identificación morfológica
Los patógenos y antagonistas aislados fueron cultivados en medios semiselectivos (Jeffers, 2006; Leslie y Summerell, 2006; Páez et al., 1993;
Tewoldemedhin et al., 2011a), para su identificación morfológica de acuerdo a sus
características macro y microscópicas propias de cada género y clasificándolos en
grupos, con la ayuda de un microscopio compuesto Carl Zeiss y claves
taxonómicas de diversos autores (Barnett y Hunter 1972; Dugan 2006; Watanabe
2010).
Caracterización molecular
Las muestras obtenidas, fueron caracterizadas molecularmente tomando un
explante de la colonia del microorganismo purificado, el cual se colocó en cajas de
Petri con PDA cubierto con un celofán estéril y se incubó por 7 d a 28 ºC. El
micelio fue cosechado con la ayuda de una espátula de acero inoxidable y se
colocó en un mortero de porcelana al cual se le adicionó un buffer de extracción
de DNA de hongos filamentosos a 70 ºC (200 mM Tris-HCl (pH = 8), 250 mM
NaCl, 25 mM EDTA, 0.5 % SDS) y se maceró para la extracción del DNA
siguiendo el protocolo descrito por Raeder y Broda (1985) y Martínez y Soto
(1993). El DNA total obtenido fue examinado mediante electroforesis en geles de
agarosa al 1%, el cual se utilizó para amplificar el espaciador de transcrito interno
(ITS) del 18s del rDNA utilizando los iniciadores universales ITS5 (5'GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3') e ITS4 (5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3')
donde el fragmento esperado fue de 710 a 850 pb, dependiendo de la especie de
hongo (White et al., 1990). Las condiciones de amplificación se dividieron en cinco
etapas; una primera de desnaturalización a 94 ºC por 5 min,
la segunda
igualmente de desnaturalización a 94 ºC por 30 s, una tercera de alineamiento a
60 ºC por 30 s, una cuarta de extensión a 72 ºC por 45 s, con un número de 30
ciclos y una extensión final a 72 ºC por 10 min. Los productos de amplificación
fueron examinados mediante geles de agarosa 1 % y posteriormente purificados
utilizando un kit de extracción de DNA (DNA Clean & Concentrator, Zymo
Research) siguiendo el protocolo del fabricante. Dichos amplicones se enviaron a
la empresa Macrogen (Maryland, EUA) donde fueron secuenciados siguiendo el
método de Sanger et al. (1977). Las secuencias obtenidas se compararon contra
la base de datos del banco de genes (NCBI) usando el algoritmo de BLAST
(Altschul et al., 1990).
Pruebas de antagonismo in vitro
El uso de microorganismos es una alternativa al control químico que de forma
natural tienen la capacidad de controlar fitopatógenos (Sandoval et al., 2011). Sin
embargo, es importante seleccionar hongos y bacterias antagonistas con un alto
potencial para inhibir el desarrollo del patógeno. Es por ello que se evaluó el
efecto antagonista in vitro de los microorganismos aislados de la rizosfera de
huertos de manzano (aislados de Trichoderma spp.) y del cepario del CIAD
Unidad Cuauhtémoc (cepas de Bacillus spp.), contra los hongos fitopatógenos
causantes de las enfermedades radiculares para lo cual, se realizaron
confrontaciones (antagonista vs patógeno), empleando la técnica de cultivo dual
en cajas de Petri con PDA, colocando en un extremo de la caja un papel filtro, de
aproximadamente 4 mm de diámetro, impregnado con micelio y/o conidias del
patógeno y en el extremo opuesto otro papel filtro impregnado con micelio y/o
conidias del antagonista. Los testigos (antagonistas y patógenos), se sembraron
individualmente, e incubaron a 25 ºC por 10 d, realizando mediciones del
crecimiento radial de las colonias de hongos cada 24 h. El antagonismo fue
evaluado registrando las siguientes variables: radio de crecimiento antagonista
(RCA), radio de crecimiento de patógeno (RCP), micoparasitismo (MICMO) y
porcentaje de inhibición de crecimiento radial (PICR). La competencia de
nutrientes y espacio, se evaluó comparando la velocidad de crecimiento de los
patógenos
(RCP)
y
antagonistas
(RCA)
(Fernández
y
Suárez,
2009).
Conjuntamente, se evaluó el PICR empleando la fórmula de Ezziyyani et al.
(2004), PICR = (R1 – R2) / R1 x 100, donde R1 es el radio del patógeno control y
R2 es el radio del patógeno en la confrontación. Para indicar el micoparasitismo
como posible mecanismo de acción, se realizaron evaluaciones microscópicas de
los cultivos duales, tomando como índice la invasión del antagonista sobre la
superficie del micelio del patógeno, utilizando la escala empleada por Bell et al.
(1982) (Cuadro 2).
Cuadro 2. Evaluación de la capacidad antagónica in vitro de aislados de
Trichoderma spp. de acuerdo con la escala reportada por Bell et al. (1982).
Escala
Capacidad antagónica
1
El antagonista sobrecrece completamente al patógeno y cubre la
superficie completa del medio.
2
El antagonista sobrecrece al menos 2/3 partes de la superficie del
medio.
3
El antagonista y el patógeno crecen aproximadamente a la mitad de
la superficie del medio (más de 1/3 y menos de 2/3) y ninguno
organismo parece dominar sobre el otro.
4
El patógeno crece al menos 2/3 partes del medio y parece resistirse
a la invasión del antagonista.
5
El patógeno sobrecrece completamente al antagonista y cubre la
superficie completa del medio.
Pruebas de patogenicidad (postulados de Koch)
Las pruebas de patogenicidad, se realizaron bajo condiciones de invernadero en
las instalaciones del CIAD, Unidad Cuauhtémoc, para cada uno de los hongos
fitopatógenos encontrados en los huertos (Phytophthora spp., Pythium spp.,
Fusarium spp., Alternaria spp., Gibberella sp., Bionectria sp.), asociados a
enfermedades radiculares, para lo cual fueron inoculados cinco árboles de 12
portainjertos más comúnmente plantados en el estado de Chihuahua (MM.106,
M.25, MM.111, M.7, G.30, G.41, G.222, G.202, G.935, Bud 9, Bud 118 y Franco)
de 1 año de edad, que fueron replantados en bolsas negras de polietileno, así
mismo se dejaron cinco árboles por cada portainjerto como testigos (sin inóculo).
5 árboles de cada portainjerto de 1
año edad por patógeno
Bud.9
G.41
G.935
G.222
G.202
M.7 MM.106 MM.111
G.30
Bud.118
Aislamiento
Purificación
Identificación
Sustrato
Inoculación
Franco (Std)
M25
Inóculo
Sintomatología
Incubar en invernadero
Figura 6. Esquematización de las pruebas de patogenicidad o postulados de Koch
de fitopatógenos en portainjertos de manzano de un año de edad.
El sustrato utilizado (1:1:1, mezcla de suelo franco: peat moss: vermilita) fue
esterilizado y posteriormente infectado con una mezcla de inóculo de 14 d de edad
contenido en caldo de verduras: hojuelas avena (96:4 v/v) a 23 °C (Fig. 6). Los
árboles se incubaron por 2 meses en el invernadero y se mantuvieron húmedos
(Latorre y Rioja, 2001; Tuset et al., 2002; Uthkede y Quamme, 1988; Uthkede y
Smith, 1991). Posterior a esto, se observaron los síntomas característicos
causados por los hongos fitopatógenos en evaluación y se tomó una muestra del
patógeno para su re-aislamiento, purificación e identificación, para cumplir con los
postulados de Koch.
RESULTADOS
Identificación de los microorganismos
Mediante las características morfológicas macro y microscópicas (Figs. 7, 8, 10), y
la ayuda de claves taxonómicas (Barnett y Hunter, 1972; Dugan, 2006; Leslie and
Summerell, 2006; Watanabe, 2010), se identificaron a los siguientes hongos
fitopatógenos: Pythium spp., Phytophthora cactorum, Fusarium oxysporum, F.
sacchari, F. tricinctum, F. solani, Alternatia alternata, A. brassicae, Bionectria
ochroleuca, Gibberella intermedia y a los antagonistas Trichoderma harzianum, T.
asperelum, T. gamsii, T. atroviridae. Estos microorganismos al igual que las
bacterias antagónicas Bacillus amyloliquefaciens y B. methylotrophicus, fueron
confirmados mediante la secuenciación de los productos de PCR, de acuerdo con
las secuencias de la base de datos del Banco de Genes (NCBI), mediante el
algoritmo de BLAST (Fig. 9) (Altschul et al., 1990).
Figura 7. Características macroscópicas de hongos fitopatógenos asociados a
enfermedades radiculares en manzano: a) Bionectria ochroleuca, b) Alternaria
alternata, c) A. brassicae, d) Fusarium sacchari, e) F. tricinctum, f) F. solani, g)
Gibberella intermedia,
h) F. oxysporum, i) Phytophthora sp.1, j) Phytophthora
sp.2, k) Phytophthora sp.3, l) Phytophthora sp.4, m) Pythium sp.1, n) Pythium sp.2,
o) Pythium sp.3.
Características morfológicas microscópicas
Bionectria ochroleuca es de un color blanco a amarillo pálido característico o
ascomata blanco, con dos células y ascosporas hialinas. Las conidias ligeramente
curveadas y ampliamente redondeadas (Fig. 8 a) (Chandra-Paul et al. 2013).
Alternaria spp., tiene micelio septado y ramificado, tornándose oscuro conforme
madura, los conidióforos que emergen en el tejido enfermo del hospedero son
cortos, simples, erectos y oscuros, que portan cadenas simples o ramificadas de
conidios. Los conidióforos formados en cultivos puros son picudos y muciformes,
formándose individualmente o en cadenas de dos, miden de 17-200 µm de
longitud (Castro-Quijano et al., 2002). Las conidias son grandes, alargadas,
claviformes en forma de pera y con septos transversales y longitudinales que
terminan en picos bien definidos, elipsoidales o redondas sin pico (Fig. 8 b y c).
Alternaria alternata, presenta conidióforos marrón claros, simples o ramificados,
con conidias catenuladas en el ápice y partes apicales fértiles, conidias
catenuladas, principalmente en cadenas de hasta nueve, frecuentemente
ramificado, acropetalmente desarrollado, marrón oscuro, fusiforme o cilíndrico,
frecuentemente con picos cilíndricos, compuesta de 3-4 líneas transversales y de
1-2 logitudinales. A. brassicae, presenta conidias alargadas y piriformes con un
pico largo, son de color dorado o marrón. Fusarium spp., con conidias lunuladas
con una célula base, algunos forman microconidias y otras no, las micronidias son
septadas, algunos forman clamidosporas. Fusarium oxysporum tiene el conidióforo
hialino, simple y corto con masas de esporas en los vértices, sus conidias son
hialinas de dos tipos: macro-conidias en forma de barco, con células apicales
ligeramente reducidas y células basales enganchadas, con cuatro células, microconidias elipsoidales unicelulares, clamidosporas marrón, globosas y usualmente
solitarias (Watanabe, 2010). Fusarium solani, su teleomorfo es Nectria
haematococca, presenta conidióforos hialinos, simples y masas de esporas en los
vértices, con conidias hialinas de dos tipos: macro-conidias con células apicales
ligeramente curveadas, dos células centrales cilíndricas, ligeramente curveadas en
un lado y células basales enganchadas, usualmente consta de 3-5 células, microconidias cilíndricas de una a dos células, clamidosporas marrón, globosas y
usualmente solitarias (Watanabe, 2010). Fusarium sacchari, su etapa sexual o
teleoformo es Gibberella sacchari, presenta células apicales curveadas y células
basales pobremente desarrolladas, macro-conidias usualmente con tres septos,
las micro-conidias/meso-conidias son ovales y sin septos, aunque pueden
presentar meso-conidias con 1 o 2 septos, micelio aéreo presente, células
conidiogenas (mono y poli-fiálides), no presenta clamidosporas (Leslie and
Summerell, 2006). Fusarium tricinctum su estado sexual es Gibberella tricincta,
presenta macroconidias, relativamente delgadas, desde encorvadas a casi
lunuladas, con células apicales curveadas
y estrechas, y basales bien
desarrolladas, predominantemente con tres septos, pero ocasionalmente pueden
presentar hasta cuatro o cinco. Sus micro-conidias son napiformes, ovales,
piriformes,
ocasionalmente citriformes, sin septos y ocasionalmente pueden
presentar uno. Algunas micro-conidias pueden tener papilas en la base de las
mismas, presentan micelio aéreo con pequeños microconidios que pueden estar
agrupados o aparecen como racimos de uvas, son monofialides, algunas cepas
forman clamidosporas globosas (con pared exterior lisa, que se tornan color
marrón al madurar), en las hifas ya sean individualmente o en cadenas (Leslie and
Summerell, 2006). Phytophthora spp., presenta oogonios típicamente ampiginos
(patrones sexuales de inserción del oogonio a través del anteridio), esporangios
globosos, zoosporas diferenciados dentro de los esporangios (Watanabe, 2010).
La morfología de los esporangios Phytophthora cactorum varían ampliamente
(pueden ser elipsoidales obpiriformes, ovoides o esféricos), una característica
distintiva de este patógeno en comparación con otras especies de Phytophthora,
es que sus es esporangios terminan con pedicelos de menos de 40 µm. Los
esporangios son a menudo, agrupados y los esporangióforos normalmente
simples. Cada esporangio puede contener más de 50 zoosporas. En general, las
clamidosporas son terminales, pero en ocasiones pueden ser intercaladas. Todos
los anteridios son pleurógenos (formados lateralmente) y son generalmente
esféricos. Los oogonios suelen ser hialinos, con paredes lisas.
Las especies de Pythium presentan cuerpos vegetativos filamentosos (micelio)
ligeramente amarillento y ramificado apicalmente en ángulo recto formando hifas
de 5-7µm de ancho en la mayoría de los casos (Fig. 8 m, n y o). Pythium spp.
pueden producir apresorios (hifas de adhesión) que permiten penetrar a su
hospedero (Rusagara et al., 2012). Para la identificación de especies de este
género, se incluyen las siguientes estructuras morfológicas: presencia de
estructuras reproductivas, morfología de esporangios, pared oogonial, oosporas y
características de los anteridios (Fig. 8, m, n y o) (Rusagara et al., 2012;
Hernández-Sarmiento y Plasencia-Maldonado, 2013). Cabe señalar que estos
aislados fueron identificados y corroborados molecularmente (Fig. 9).
a
b
c
d
e
f
g
h
i
j
k
l
m
n
o
Figura 8. Características microscópicas de fitopatógenos tomadas en 1000 X:
a) Bionectria ochroleuca, b) Alternaria alternata, c) A. brassicae, d) Fusarium
sacchari, e) F. tricinctum, f) F. solani, g) Gibberella intermedia, h) F. oxysporum, i)
Phytophthora cactorum a1, j) P. cactorum a2, k) P. cactorum a3, l) P. cactorum a4,
m) Pythium sp. 1, n) Pythium sp. 2, o) Pythium sp. 3.
a
b
1
2
800 pb
600 pb
3
4 5 6 7
8 9 10 11 12
800 pb
600 pb
1
2
3
4 5
6 7 8
9 10
100 pb
100 pb
Figura 9. Geles de agarosa al 1 % con productos de PCR obtenidos de la
amplificación del ITS 4 e ITS 5 de hongos fitopatógenos aislados de árboles de
manzano en el municipio de Cuauhtémoc, Chih.
Morfología macroscópica de los antagonistas
Las colonias de Trichoderma, en medios nutritivos artificiales al inicio son de color
blanco que se tornan verde oscuro o amarillento, con la esporulación densa (Fig.
10) (Infante et al., 2009), esta coloración se debe a la pigmentación de las
fialosporas y esporas producidas (Qinche, 2009). El micelio es ralo en su mayoría,
y visto al microscopio es fino, está constituido por hifas que pueden medir de 3 a
12 µm de diámetro, son septadas, con paredes lisas (Osorio-Hernandéz et al.,
2009), terminan en fiálides donde se forman las esporas asexuales o conidias
(Infante et al., 2009). También, se pueden encontrar clamidiosporas globosas y
elipsoidales en las partes terminales de las ramificaciones laterales de la hifa
(Castro, 2007).
Las fiálides son células en forma de botella, reducidas en su base, hinchadas en la
parte media y angostas en el ápice, éstas producen conidias verdes y se disponen
en grupos irregulares de hasta 5 en el extremo de las fiálides , en los extremos de
las ramificaciones (Ulloa y Hanlin, 2006). Las conidias aseguran las generaciones
del hongo durante gran parte del período vegetativo de las plantas, son haploides
y su pared está compuesta por quitina y glucanos, los conidióforos son ramificados
(Infante et al., 2009) y pueden ser lisas, de pared rugosa, hialinas, verdes,
ovoides, elípticas u oblongas (Quinche, 2009).
Los conidióforos tienen ramas estrechas, curveadas (con un eje principal de 6 μm
de ancho); las fiálides en su mayoría están en verticilios de 2-3(-5), sus conidios
son verdes. Las especies en la sección de Trichoderma tienen conidióforos
estrechos y curveados, con ramas y fiálides libres, emparejados con frecuencia y
rara vez los verticilios tienen más de 3 (Kubicek y Harman, 2002).
Figura 10. Características macroscópicas de cepas de Trichoderma spp.
asociadas a huertos de manzano, utilizadas en las pruebas de antagonismo: a) T.
gamsii, b) T. harzianum, c) T. atroviride, d) T. asperellum.
Las colonias de Trichoderma, usualmente crecen rápido, inicialmente el micelio
está sumergido en un inicio, con el tiempo varía en forma flocosa, enmarañada,
lanosa o aracnoide con micelio aéreo y hialino, dependiendo de la cepa y el medio
de cultivo. La coloración puede variar desde el descolorido al amarillo, ambar,
rojizo opaco o amarillo-verdoso. Su olor es característico del género, sobretodo
pronunciado o débil, muy parecido al coco o alcanfor. La formación de conidias es
diseminada o acolchada o formada en pústulas compactas; normalmente en tonos
verdes o con menos frecuencia blancos, gris o café. Los conidióforos están en la
mayoría de las especies con eje principal amplio y ramificado a intervalos
regulares, por lo general con ramas sucesivas apicalmente y ramas más o menos
divergentes, solitarios, emparejados o en verticilios; verticilios repetitivos, la
ramificación puede resultar en una estructura piramidal muy ramificada; en otras
especies de ramificación es menos regular con ramas solitarias o pareadas y no
ampliamente reramificadas (Kubicek y Harman, 2002).
Las colonias tienen crecimiento lento o rápido denepdiento de la especie, el
micelio aéreo está usualmente limitado, flocoso a aracnoide; las coloraciones del
reverso de la caja de Petri van del incoloro a amarillo opaco. Algunos aislados
tienen un distintivo olor aromático, parecido al coco. La formación de conidias es
variablemente y dispersa, forma pústulas compactas; son color blanco al inicio y
eventualmente verdes (rara vez café). Las clamidosporas presentes en la mayoría
de los aislados, son frecuentemente abuntantes. Los conidióforos generalmente
son estrechos y flexivos, con ramas primarias los cuales surgen a intervalos
regulares, usualmente pareadas en verticilios de tres, por lo general cortos y no
ampliamente re-ramificados. Las fiálides se encuentran en su mayoría en
verticilios de 2 a 3, aunque en algunas cepas pueden llegar hasta 5 verticiladas,
langiformes a subuladas. Los conidios son color verde (rara vez café), de paredes
lisas, claramente verrugosas, de forma subglobosa a obovoide o elipsoide
(Kubicek y Harman, 2002).
Trichoderma harzianum Rifai, su teleomorfo es Hypocrea lixii, sus conidióforos
consisten de muchas estructuras ramificadas, con un estipe (estructura de
soporte) de las ramas, con formas piramidales, en cada rama presentan fiálides
irregulares o ampuliformes con conidias individuales, no en cadenas, a menudo se
adhieren en pequeños grupos, esferoidales, sub-esferoidales o a veces
ampliamente elipsoidales. Distintivamente produce conidióforos ramificados
compactos en forma piramidal, la base es muy ramificada y el ápice tiene una
fiálide, las conidias son de paredes lisas, casi esférica y menos de 3.5 µm de
longitud (Pitt y Hocking, 2009). Las colonias de Trichoderma harzianum crecen
rápidamente (la mayoría de los aislados crecen de 7-9 cm). La formación de
conidias son predominantemente dispersas, que aparecen en forma de gránulos o
polvosas, debido a la densa formación; se tornan rápidamente verde-amarillosas a
verde oscuro o producen manojos o pústulas en franjas por micelio blanco estéril.
El color en el reverso va del amarillo opaco al marrón o gris. Su olor es indistinto o
ligeramente a tierra. Los conidióforos tienden a ser regulares, verticiliados, los
cuales forman una estructura piramidal. Las fiálides tienen forma de ámpula a
lageniforme, usualmente 3-4 verticilios, ocasionalmente pareadas, comúnmente de
3.5-7.5 x 2.5-3.8 μm, las fiálides terminales miden arriba de 10 μm de largo. Las
conidias son subglobosas a obovoides, en su mayoría miden (2.5-)2.7-3.5 x 2.12.6(-3.0) μm, son de pared lisa, subhialina a verde pálido (Kubicek y Harman,
2002).
Las colonias de Trichoderma atroviride, crecen rápidamente (5-8 cm). La
formación de conidias aparece en forma de gránulos o costrosa con la edad;
inicialmente gris-azulado o verde, tornándose rápidamente a verde oscuro. El color
se invierte generalmente del incoloro a amarillo o gris con la edad. Su olor es
aromático y agradable que se asemeja al del coco. Los conidióforos son
característicos en cada sección. Las fiálides son individuales o de 2-4 verticiladas,
más o menos langeniforme, a menudo curveada de 6-12 x 2.4-3.0 μm. Los
conidios son de color verde oscuro, liso, subglobosos en la madurez, miden
aproximadamente de 2.6-3.8(-4.2) x 2.2-3.4(-3.8) μm.
Trichoderma asperellum, se propaga usando esporas aéreas, las cuales son
producidas en medio sólido, los cuales son inadecuados para la producción a gran
escala debido a que es difícil mantener las culturas en las condiciones óptimas de
temperatura y de flujo de aire (Watanabe et al., 2006). Algunas cepas de esta
especie, son utilizadas como control biológico de un amplio espectro de
microorganismos fitopatógenos, incluyendo los straminopilas tal como algunas
especies de Phytophthora, hongos y nematodos. Se ha encontrado que tiene
actividad antibacterial a través de la producción de tricotoxinas peptaibólicas
(Watanabe et al., 2006). Puede inhibir su crecimiento o parasitárlos, además se ha
encontrado que promueve el crecimiento vegetal y la inmunidad. T. asperellum ha
demostrado tener un comportamiento endofítico parecido a las micorrizas por lo
que las plantas absorben mejor los nutrientes y elevan su niveles de ácidos
jasmónico, salicílico y peroxidasas con lo que son más resistentes al ataque de
enfermedades fúngicas y bacterianas (Dou et al., 2014). Las conidias son
subglobosas o ovoidales, spinuloso en los extremos (a menudo aparece liso en la
luz del microscópio, mide aproximadamente (2.8–) 3.4–3.6(–7.0) × (2.4–)3–4(–6)
µm, L/W 1.0–1.7. Las colonias carecen de olor similar al del coco; aunque rara vez
tienen ese olor (Walter et al., 2006). Su coloración va de verde claro a verde
oscuro, conforme va avanzando en edad.
Las conidias de Trichoderma gamsii al entrar en contacto con el suelo y detectar la
presencia del hongo fitopatógeno, genera hifas o hilos que crecen paralelamente a
la hifa del hongo dañino, después de reconocerlo se adhieren y lo penetran
enrollándolo hasta estrangularlo, consumiéndolo (parasitismo) y compitiendo con
él por el espacio, energía y luz. La producción de antibióticos por parte de
Trichoderma hace que el área donde se desarrolla este hongo esté libre de otros
hongos dañinos al cultivo. Se encontró la especie en los más diversos contextos;
algunos ejemplos de actividades incluyen organoclorados degradación como un
hongo del suelo, el control biológico de las enfermedades de plantas inducidas por
hongos. Se dice para efectuar la germinación de semillas de plantas con flores y
mejorar la absorción de fósforo por las plantas. Su coloración es blanco a crema.
Produce enzimas, degrada los residuos agrícolas, coloniza la hojarasca y es un
habitante normal de los suelos. Sus conidias son suaves y elipsoidales y poseen la
más larga relación que hemos visto en Trichoderma (Walter et al., 2006).
Incidencia de enfermedades radiculares en árboles de manzano
La incidencia de árboles sintomáticos en los huertos muestreados en el municipio
de Cuauhtémoc, Chihuahua, fluctuó de 1-32 %, que en promedio fue de 16 %
(Cuadro 3). Esto pudo deberse al grado de tecnificación en cada uno de los
huertos, que fue muy variable. Cabe señalar que en el huerto “La Campana”
(Campo 4), la mayoría de los árboles tienen más de 40 años de edad y un grado
de tecnificación medio, mientras que el huerto “Picacho Lote 6”, tiene un nivel de
tecnificación alto.
Cuadro 3. Incidencia de árboles de manzano sintomáticos de enfermedades
radiculares en el municipio de Cuauhtémoc. 2013.
Huerto
Picacho
ha
plantadas
30
Árboles/ha
1,098
Total de
Árboles
Incidencia
árboles
enfermos
(%)
32,940
1,153
4
Lote 7
Picacho
43
800
34,400
344
1
45
350
15,750
2,237
14
10
666
6,660
1,838
28
12
444
5,328
1,694
32
28
672
19,016
1,453
16
Lote 6
Picacho
Lote 1A
2 abajo (campo 2A)
Campana
4)
Promedio
(campo
La incidencia de enfermedades radiculares en los huertos de manzano
muestreados del municipio de Namiquipa, fluctuó de 4 a 28 % que en promedio
fue 16 % (Cuadro 4). Los huertos contemplados en este municipio tienen diferente
grado de tecnificación, así como también diferentes tipos de portainjertos, además
de la edad de los árboles. Dado que la susceptibilidad o resistencia de los árboles
dependerá de estos aspectos.
Cuadro 4. Incidencia de árboles de manzano sintomáticos de enfermedades
radiculares en el municipio de Namiquipa. 2013.
Ha
Árboles/h
Total de
Árboles
plantadas
a
árboles
enfermos
Carlos Márquez
5
560
2,800
487
17
Manuel Rivera
4
375
1,500
231
15
Reyes Nevarez 1
8
500
4,000
528
13
Reyes Nevarez 2
4
1,000
4,000
144
4
Reyes Nevarez 3
3
666
2,000
564
28
Promedio
5
620
2,860
391
16
Huerto
Incidencia (%)
En el municipio de Guerrero, los árboles sintomáticos de enfermedades
radiculares fluctuaron del 12 al 24 % que en promedio fue de 17 % (Cuadro 5). En
el municipio de Bachiniva fluctuó de 2-40 % (Cuadro 6). Cabe señalar que el
huerto “San Joaquín” son árboles viejos y también cuentan con diferente grado de
tecnificación, es por ello de la gran variabilidad en la incidencia. Sin embargo, en
la mayoría de estos huertos tienen tecnificación baja, particularmente en “La
Cienega” y “San Joaquín” o son árboles viejos sin manejo.
Cuadro 5. Incidencia de árboles de manzano sintomáticos de enfermedades
radiculares en el municipio de Guerrero. 2013
Huerto
ha
plantadas
Árboles/ha
Total de
árboles
Árboles
enfermos
Incidencia (%)
El Encino
5
500
2,500
295
12
El Tanque
6
280
1,680
326
19
Tres
Compadres
6
500
3,000
408
14
Ing. Gameros
4
425
1,700
408
24
Las
Margaritas
3
1,000
3,000
558
19
Promedio
5
541
2,376
399
17
Cuadro 6. Incidencia de árboles de manzano sintomáticos de enfermedades
radiculares en el municipio de Bachíniva. 2013
Huerto
ha plantadas Árboles/ha
Total de
Árboles
árboles
enfermos
Incidencia (%)
San Joaquín
17
445
7,565
2,996
40
Rosy (SJ2)
7
500
3,500
231
7
Bety (SJ3)
9
667
6,003
324
5
Manuel (SJ4)
7
667
4,669
103
2
La Ciénega
5
500
2,500
815
33
Promedio
9
556
4,847
894
17
El promedio de incidencia para el estado de Chihuahua, obtenido de los diferentes
huertos muestreados en Cuauhtémoc, Guerrero, Namiquipa, Bachíniva, fue del 17
% (Cuadro 7).
Cuadro 7. Incidencia de árboles de manzano sintomáticos de enfermedades
radiculares en huertos de manzano en el estado de Chihuahua.
Total de
Árboles
Incidencia
enfermos
(%)
672
14,687
16
14,885
620
2,316
16
24
12,984
541
2,270
17
Bachíniva
45
25,011
556
4,322
17
Promedio
233
146,904
597
5,899
17
Municipio
ha sembradas
Cuauhtémoc
140
94,024
Namiquipa
24
Guerrero
árboles
Árboles/ha
De los hongos fitopatógenos aislados de huertos de manzano en diferentes
municipios del estado de Chihuahua, Fusarium oxysporum fue el más
frecuentemente encontrado con un 32.6 %, seguido por Bionectria ochroleuca. De
igual manera, se encontraron a los oomicetos Phytophthora cactorum y Pythium
spp. con una frecuencia del 1.4 y 0.7 % respectivamente. El género Fusarium fue
el más frecuente en los cuatro municipios muestreados (Cuadro 8). Así mismo, se
aislaron hongos antagonistas del género Trichoderma, siendo T. gamsii el más
frecuente con un 72.5 % (Cuadro 9).
Cuadro 8. Frecuencia de hongos fitopatógenos asociados a huertos de manzano
en el estado de Chihuahua.
Frecuencia (%)
Hongo
Cuauhtémoc Namiquipa Guerrero Bachíniva Total
Fusarium oxysporum
15.0
4.4
6.4
6.8
32.6
Bionectria ochroleuca
10.0
1.0
--
1.0
12.0
Gibberella moniliformis
7.0
1.4
0.3
--
8.7
Fusarium solani
8.0
0.3
--
0.7
9.0
Fusarium subglutinans
7.0
1.4
--
--
8.4
Gibberella intermedia
5.0
--
--
1.4
6.4
Fusarium succisae
4.1
1.0
--
--
5.1
Fusarium sacchari
4.0
--
--
3.1
7.1
Fusarium sp.
1.4
--
0.7
--
2.0
Clonostachys sp.
1.4
--
--
--
1.4
Phytophthora cactorum
1.0
0.3
--
--
1.4
Fusarium tricinctum
1.4
--
--
0.7
2.0
Pythium spp.
0.7
--
--
--
0.7
Fusarium fujikoroi
0.7
--
--
--
0.7
Fusarium proliferatum
0.7
--
--
--
0.7
Alternaria brassicae
0.7
--
--
--
0.7
Alternaria sp.
--
--
0.3
--
0.3
Alternaria alternata
--
--
0.3
--
0.3
Xylariaceae sp.
--
--
0.3
--
0.3
Total
68
10
8
14
100
Cuadro 9. Frecuencia de hongos antagonistas aislados de manzano en el estado
de Chihuahua.
Frecuencia (%)
Hongo
Cuauhtémoc Namiquipa Guerrero Bachíniva Total
Trichoderma gamsii
65.0
5.0
0.0
2.5
72.5
Trichoderma hamatum
0.0
2.5
12.5
0.0
15.0
Trichoderma harzianum
5.0
0.0
0.0
2.5
7.5
Trichoderma atroviride
5.0
0.0
0.0
0.0
5.0
Total
75
8
13
5
100
Antagonismo de aislados de Trichoderma spp. contra Oomicetos
Trichoderma asperellum mostró un PICR en las tres especies de Pythium que
fluctuó de 15.51 a 31.44 %, donde el mayor porcentaje se observó en Pythium sp.
1, al día cinco después de la confrontación. Cabe señalar que el T. asperellum
testigo al día tres llenó por completo la caja de Petri. Para P. cactorum el PICR
estuvo por arriba del 84 % al día ocho (Fig. 11). Para el control biológico de
Pythium se han usado los hongos Trichoderma spp. y Gliocladium spp., las
bacterias Enterobacter spp., Erwinia spp., Bacillus spp., Burkholderia spp.,
Stenotrophomonas spp., Rhizobium spp. y Pseudomonas spp. y de actinomicetos
como Streptomyces spp., Actinoplanes spp. y Micromonospora spp. (Rusagara et
al., 2012).
a
a
a
a
90
80
Crecimiento radial (%)
Antagonista 100
Patógeno
Ant. vs Pat.
90
PICR
a
b
70
b
60
50
A
40
a
a
a
a
A
A
A
A
80
b
b
A
30
Crecimiento radial (%)
100
A
20
b
70
b
60
c
c
50
40
30
20
10
10
0
d
d
d
sp. 2
sp. 3
d
0
sp. 1
sp. 2
sp. 3
Pythium spp.
DC = 5
sp. 1
sp. 4
Phytophthora spp.
DC = 8
Figura 11. Antagonismo de Trichoderma asperellum contra aislados de Pythium
spp. y Phytophthora cactorum.
Trichoderma harzianum de igual manera mostró la misma tendencia en el PICR
que T. asperellum, dado que en Pythium spp. fluctuó de 1.6-7.9 % y en P.
cactorum fue de 86.62 a 92.1 % (Fig. 12).
a
a
c
a
b
90
Crecimiento radial (%)
80
Antagonista 100
Patógeno
Ant. vs Pat.
90
PICR
c
70
a
a
a
a
A
AB
AB
B
80
c
d
Crecimiento radial (%)
100
d
60
50
40
30
b
70
60
b
c
c
50
40
30
20
20
A
10
B
B
0
sp. 1
sp. 2
sp. 3
Pythium spp.
10
d
d
d
sp. 2
sp. 3
sp. 4
d
0
sp. 1
Phytophthora spp.
DC = 3
DC = 4
Figura 12. Antagonismo de Trichoderma harzianum contra aislados de Pythium
spp. y Phytophthora cactorum.
Trichoderma gamsii mostró un PICR en Pythium spp. de 15.51 al 29.73 %,
mientras que en P. cactorum fue de más del 81 % (Fig. 13).
a
100
a
Antagonista
100
Patógeno
Ant. vs Pat.
PICR
90
a
a
a
90
a
a
a
A
b
b
Crecimiento radial (%)
Crecimiento radial (%)
A
80
b
70
b
60
50
40
a
A
A
80
b
70
b
c
60
c
50
40
A
A
30
20
30
20
A
10
10
d
d
d
sp. 2
sp. 3
d
0
0
sp. 1
sp. 2
Pythium spp.
DC = 5
sp. 3
sp. 1
sp. 4
Phytophthora spp.
DC = 7
Figura 13. Antagonismo de Trichoderma gamsii contra aislados de Pythium spp. y
Phytophthora cactorum.
Trichoderma atroviride mostró la misma tendencia con un PICR en Pythium spp.
que fluctuó de 11.84 a 26.29 % y por arriba del 88 % en P. cactorum, al día 5 y 6
respectivamente (Fig. 14).
100
a
a
a
Antagonista
Patógeno
Ant. vs Pat.
PICR
a
b
90
b
80
d
Crecimiento radial (%)
Crecimiento radial (%)
a
a
a
A
a
A
A
90
A
80
c
70
100
d
60
50
40
30
A
b
b
70
60
c
c
50
40
30
20
20
B
B
10
10
d
d
d
d
sp. 2
sp. 3
sp. 4
0
0
sp. 1
sp. 2
sp. 3
sp. 1
Phytophthora spp.
Pythium spp.
DC = 6
DC = 5
Figura 14. Antagonismo de Trichoderma atroviride contra aislados de Pythium
spp. y Phytophthora spp.
Cabe
señalar
que
las
cuatro
especies de
Trichoderma
mostraron
un
comportamiento similar de antagonismo en Pythium spp. y P. cactorum, sin
embargo, entre estas el nivel de PICR fue diferente que el Pythium spp. fluctuó de
1.6 a 31.44 % y de 81.38 a 92.1 % en P. cactorum. Es importante resaltar, que en
todos los aislados de ambos patógenos se observó sobrecrecimiento (invasión
total de los patógenos) por parte de las cuatro especies de Trichoderma a los 8 d.
Antagonismo de aislados de Bacillus spp. contra Oomicetos
Bacillus amyloliquefaciens mostró un PICR que fluctuó de 2.38 al 47.63 % en
Pythium spp. y de 85.07 al 93.84% en Phytophthora spp. al día 6 (Fig. 15). B.
methylotrophicus mostró la misma tendencia, con un PICR del 1.35 al 18.75 en
Pythium spp. y por arriba del 85% en Phytophthora spp. (Fig. 16). Cabe señalar
que en Phytophthora spp. no hubo día de contacto, debido a la presencia de un
halo de inhibición. Ambas bacterias fueron efectivas en la reducción del PICR de
Phytophthora spp., esto fue debido a la capacidad de producir antibióticos o
compuestos volátiles que detuvieron el crecimiento del patógeno. Sin embargo, no
fue así para los aislados de Pythium spp.
Los antagonistas bacterianos B. amyloliquefaciens y B. methylotrophicus,
mostraron un halo de inhibición en el crecimiento micelial de los patógenos
Oomicetos evaluados a los 6 d de incubación in vitro (Fig. 15 y 16). Al respecto,
hay estudios realizados en campo por Guillen et al., (2006) donde muestran que el
género Bacillus tuvo un efecto antagónico ante Phytophthora cactorum, además
de inducir el crecimiento de la planta, posiblemente porque le proporcionó
nutrientes, o contribuyó a la fijación de N, P, K, solubilización de fosfatos y otros
nutrientes, entre otros, donde B. amyloliquefaciens fue más eficiente.
Las especies de Pythium fueron de rápido crecimiento, es por ello que el PICR fue
muy bajo en comparación con los aislados de Phytophthora cactorum al ser
confrontadas in vitro contra Bacillus spp.
100
b
90
80
100
c
c
AB
A
B
90
C
80
Crecimiento radial (%)
cd
d
70
Crecimiento radial (%)
Antagonista
Patógeno
Ant. vs Pat.
PICR
a
A
60
50
40
30
a
a
70
b
60
b
50
40
30
20
20
B
c
10
10
e
C
e
c
e
c
c
c
c
c
c
0
0
sp. 1
sp. 2
Pythium spp.
DC = 6
sp. 3
sp. 1
sp. 2
sp. 3
sp. 4
Phytophthora spp.
DC = 6
Figura 15. Antagonismo de Bacillus amyloliquefaciens contra aislados de Pythium
spp. y Phytophthora spp.
100
Antagonista
100
a
Patógeno
b
90
Ant. vs Pat.
PICR
d
a
d
c d
70
60
50
40
30
A
20
10
B
c
B
B
80
Crecimiento radial (%)
Crecimiento radial (%)
80
A
A
90
c
70
60
40
30
20
C
0
b
b
50
10
c
a
c
d
c
d
c
cd
c
d
0
sp. 1
sp. 2
sp. 3
Pythium spp.
DC = 5
sp. 1
sp. 2
sp. 3
sp. 4
Phytophthora spp.
DC = 5
Figura 16. Antagonismo de Bacillus methylotrophicus contra aislados de Pythium
spp. y Phytophthora spp.
De los 12 portainjertos evaluados, el más susceptible a la mayoría de los
patógenos evaluado fueron G30 y G202, ambos susceptibles a Pythium sp. 2 y
Phytophthora cactorum aislado 3 y Bionectria ochroleuca. G30 además fue
susceptible al ataque de Phytophthora cactorum aislado 1 y Fusarium sacchari,
mientras que G202 mostró susceptibilidad a Phytophthora cactorum aislado 4 y
Alternaria alternata (Cuadro 10).
Cuadro 10. Porcentaje de incidencia en portainjertos de manzano
G935 fue susceptible a Pythium sp. 2 y Phytophthora cactorum sp. 1, BUD 118 a
Phytophthora cactorum sp.1 y P. cactorum sp. 3. El resto de los portainjertos
también fueron susceptibles al menos a un patógeno de los 12 evaluados, con
excepción de G222, M111 y Standart que fueron tolerantes o resistentes al ataque
de todos los patógenos (Cuadro 10).
Pruebas de patogenicidad
Figura 17. Portainjerto de manzano G30, de 1 año de edad inoculado con: a)
Fusarium sacchari, b) Alternaria brassicae, c) Bionectria ochroleuca, d) A.
alternata, e) Gibberella intermedia, f) F. solani, g) F. tricinctum, h) Phytophthora
sp.1, i) Phytophthora sp. 2, j) Phytophthora sp. 3, k) Phytophthora sp. 4, l) Pythium
sp. 1, m) Pythium sp. 2, n) Pythium sp. 3, o) Testigo
Figura 18. Portainjertos de manzano de 1 año de edad inoculados con
Phytophthora sp. 3: a) G222, b) M111, c) G935, d) M25, e) Bud 118, f) Bud 9, g)
G30, h) M106, i) G202, j) G41, k) M7, l) Franco.
Los síntomas ocasionados por los diferentes microorganismos responsables de
las pudriciones de raíz en manzano son muy similares. El diagnóstico visual de
síntomas es insuficiente para determinar la naturaleza del agente causal, por lo
que un análisis de laboratorio es esencial para identificar al agente causal, lo cual
es requisito indispensable para implementar medidas de combate de la
enfermedad. Algas y hongos fitopatógenos que ocasionan pudrición de raíz en
manzano, producen estructuras de crecimiento y sobrevivencia que permanecen
en suelo y/o raíces infectadas. La diseminación de este tipo de enfermedades se
da en cualquier forma de movimiento de suelo y raíces contaminadas, arrastre por
corrientes de agua, en implementos agrícolas, maquinaria y sobre todo en
arbolitos contaminados y que se usan para plantar nuevas huertas o replantar en
huertas ya establecidas. El contacto de raíces de árboles enfermos con raíces de
árboles sanos. Exceso de humedad sobre todo en suelos pesados, favorece el
desarrollo de estas enfermedades.
En suelos pesados o con mal drenaje, riegos ligeros deberían preferirse sobre
riegos pesados. Arbolitos para replante o para plantar nuevas huertas debe
asegurarse que provengan de viveros sanos. En huertas con árboles enfermos, se
debe evitar la diseminación de suelo contaminado, dejando al final las labores de
cultivo en estos árboles y los que los rodean, además debe desinfectarse los
implementos de trabajo una vez que se usaron en árboles con síntomas. Arboles
con daño avanzado deben sacarse y eliminarse, dejando solarizar la cepa de 6 a 8
semanas. En huertas con árboles presentando síntomas, debe equilibrase el área
foliar con poda, pues ya poseen pocas raíces sanas. Una vez realizado el
diagnóstico, se puede usar fungicidas sistémicos en forma preventiva tanto en
árboles dañados como en aquellos que están alrededor. La aplicación es
recomendable realizarla al inicio del período de crecimiento de los árboles.
Los síntomas iniciales causados por Fusarium spp., pueden ser visibles
presentando necrosis en hojas y marchitamiento en brotes jóvenes, de modo que
al hacer un corte en el tallo se puede observar que el tejido vascular esta
decolorado y obstruido, pérdida de coloración y brillo, al hacer un corte
longitudinal, se observa el tejido vascular manchado de color marrón, causando la
muerte del brote y posteriormente de la planta (Lubbe, 2008; Acurio y Manosalvas,
2010; y Salazar et al., 2010). Las hojas no se vuelven cloróticas y flácidas, sino
rígidas y secas después de la necrosis, permaneciendo sujetas al tallo por mucho
más tiempo posterior a la muerte de la planta, también presenta lesiones en los
tallos extendiéndose desde la raíz hacia la parte aérea de la planta y lesionando la
planta en el floema y xilema (Obreque, 2004).
Alternaria spp., se caracteriza por dañar las hojas provocando manchas redondas
y de color pardo oscuro, con anillos concéntricos de color amarillento.
Comúnmente, las hojas senescentes de la parte inferior de la planta son las
primeras en ser atacadas, la enfermedad se extiende hacia la parte superior de la
planta y hace que las hojas afectadas se sequen, debiliten y/o desprendan (Agrios,
1991). En el tallo las manchas son negras y ovaladas, trayendo consigo el daño de
debilidad de la rama. Walker (1959) señala que cuando la mancha se encuentra
entre la unión del tallo y una rama lateral, ésta provoca que la rama se quiebre una
vez que los frutos tengan un volumen significativo, o bien por la sobrecarga de
frutos. En ocasiones las lesiones del tallo forman cánceres que pueden
extenderse, cubrir el tallo y matar a la planta, o bien si se forma cerca del suelo
puede originar la pudrición de cuello (Agrios, 1991).
Pythium spp. causa pudriciones de raíz en plantas, los síntomas producidos para
el desarrollo de la enfermedad van desde el mal establecimiento de plántulas y
almácigos,
provocando
crecimiento
irregular,
clorosis,
tallos
colapsados,
defoliación y ahogamiento (Abawi et al., 2006).
En el manzano (Malus domestica), P. cactorum es el principal causante de la
pudrición de raíz y cuello y el síndrome de la muerte regresiva (Hantula et al.,
2000). Los síntomas asociados a este fitopatógeno son la muerte súbita de los
árboles a veces, pero no siempre, precedidos por clorosis de las hojas tiernas,
además del marchitamiento gradual debido a la escasez de agua en los árboles
sobretodo en la época de invierno (Thomidis, 2003). Por otra parte, la temperatura
es uno de los factores más importantes en la influencia del crecimiento y
esporulación de Phytophthora, debido a que la temperatura del suelo en ciertas
épocas del año en los huertos, puede ser inhibitoria a la esporulación y
colonización de las raíces, causadas por este patógeno. El desarrollo de
Phytophthora, también puede ser asociado a lesiones de la corteza causadas por
instrumentos mecánicos u otras causas, ya que los árboles heridos son más
susceptibles a la pudrición de corona causada por dicho patógeno (Thomidis,
2003). La pudrición de corona causada por Phytophthora se puede observar a 76
cm de los troncos del manzano. La infección generalmente ocurre entre la línea
del suelo y el área de la corona de la raíz. La mayoría de las infecciones
comienzan a partir de la unión de una raíz lateral con el tronco. Los cáncros
jóvenes a nivel del suelo, son difíciles de detectar, pero a medida que aumentan
su tamaño, se oscurecen y se reprimen con un margen abrupto o más o menos
ovalado. La corteza infectada se torna café y es a menudo suave y pesada o
viscosa cuando esta mojada. Una decoloración café a café-rojiza de la madera y
un exudado gomoso debajo de la corteza muerta del cáncro, indica la presencia
de Phytophthora (Badadoost, 1988).
Síntomas causados por Gibberella intermedia en manzano (Malus domestica)
Este patógeno causa decadencia en las plántulas y podredumbre de la raíz, lo
cual se ve reflejado en el crecimiento reprimido del árbol, clorosis en las hojas y
malformación en las plantas enfermas (Pavlović et al., 2009).
Las clasificaciones de los Hypocreales han cambiado significativamente en los
últimos años, lo que resulta en la separación de Nectria en su sentido tradicional,
en un gran número de grupos dentro de varias familias. Bionectria como se
entiende que antes se centraba en el grupo de Nectria ochroleuca, con anamorfos
tales como Clonostachys, que una vez se agrupan junto con Gliocladium. La
clasificación de los anamorfos dentro de los Hypocreales es ferozmente compleja,
por lo que el tratamiento monográfico formal, divide en seis subgéneros a
Bionectria, basado en el estroma y morfología del ascoma. Algunos de ellos son
claramente taxas naturales, con caracteres correspondientes de ascosporas y
anamorfos (Schroers, 2001).
Aunque es más común en primavera y otoño, el hongo Nectria puede infectar a las
plantas durante todo el año, siempre y cuando haya suficiente humedad y la
temperatura está por encima de cero. Las plantas que están estresados por, la
sequía, los daños mecánicos resfriado u otra enfermedad son especialmente
susceptibles. Las infecciones pueden ser peores en otoño e invierno, cuando la
planta huésped está inactivo y la recuperación de la herida es más débil que en la
temporada de crecimiento. El primer síntoma de una infección Nectria es un área
descolorida deprimida del corteza cerca de heridas o en la base de ramitas o
ramas muertas. Estos chancros generalmente no se notan hasta que aparezcan
otros síntomas. Las primeras señales fácilmente visibles de Nectria son cancros
pequeños de color blanco cremoso o rojo a rojizo estructuras frutales de naranja y
el desarrollo de tejido de callo. Este tejido de callo se produce como la planta
huésped intenta aislar el hongo. Si el callo no aísla la infección, el hongo seguirá
creciendo en la madera sana y la planta responderá por el crecimiento de otra
cresta de tejido de callo. Esta alternancia de crecimiento de hongos y el reborde
de callo, que puede ocurrir durante muchos años, resulta en una forma de tipo de
destino como redondeada o alargada. La corteza de las cordilleras de mayor edad
puede decaer y el tiempo lejos de exponer las crestas de madera debajo. Esta
enfermedad se desarrolla lentamente y más grandes tallos rara vez están ceñidas,
aunque múltiples lesiones pueden crecer juntos y matar a una sucursal o la planta
entera. Las plantas que están estresados son los más afectados por la
enfermedad. Este hongo también puede afectar a las manzanas haciendo que se
pudra durante el almacenamiento. El hongo penetra las plantas principalmente a
través de las heridas naturales y artificiales. En manzana, sitios de entrada
importantes sobre los brotes y ramas son cicatrices de pecíolos de las hojas y
pedicelos frutales, grietas de crecimiento y superficies de corte expuestos por la
poda; entrada en la fruta es a través de las lenticelas de la piel, lesiones de la
sarna (Venturia inaequalis) y heridas (Xu y Butt, 1996).
Conclusiones

La incidencia de árboles sintomáticos de enfermedades radiculares evaluados
en huertos de manzano del estado de Chihuahua fue de 17 %.

Se encontraron nueve géneros de hongos fitopatógenos, en árboles de
manzano sintomáticos de enfermedades radiculares, siendo el más frecuente
Fusarium oxysporum con 40 %.

Phytophthora cactorum a2, y F. sacchari son los posibles agentes causales de
la muerte del 100 % de 3 de los portainjertos, respectivamente.

Los portainjertos G30 y G202 resultaron ser muy susceptibles al ataque de
más del 90 % de los hongos fitopatógenos evaluados.

Los portainjertos M111, mostraron resistencia al 80 % de los hongos
fitopatógenos evaluados.

Los antagonistas encontrados pertenecen al género Trichoderma, siendo T.
gamsii el más frecuente con el 84 %.

Trichoderma harzianum mostró un crecimiento rápido, deteniendo el
crecimiento de los fitopatógenos evaluados en un promedio de 3 d, mostrando
parasitismo sobre ellos.

Las cuatro especies de Trichoderma, detuvieron el crecimiento de Pythium
spp. y Phytophthora spp.

B. amyloliquefaciens y B. methylotrophicus inhibieron el desarrollo de
Phytophthora spp. con más del 90 %, bajo condiciones in vitro.

B. amyloliquefaciens y B. methylotrophicus mostraron bajos porcentajes de
inhibición, menor al 50 y 20 % respectivamente, al ser enfrentados in vitro con
Pythium spp.
Recomendaciones
1. Seleccione cultivares y portainjertos resistentes pues es la practica más efectiva
de control. Portainjertos susceptibles no deberán plantarse en suelos pesados y
mal drenados. Solo arbolitos procedentes de invernaderos sanos, deben ser
plantados, pues aquellos infectados son un importante surtidor de la enfermedad.
Por otro lado los portainjertos deben seleccionarse adecuadamente para evitar la
pudrición de cuello. M-4 y M-9 se consideran con buena resistencia, M-25, M-26,
Malling-Merton (MM) 103, MM-104, MM-106, MM-107, MM-109, MM-110, MM-111,
MM-113, y MM-115, son completamente susceptibles (University of Illinois).
2.- Evite plantar en suelos muy húmedos, con mal drenaje y con alto contenido de
arcilla, evite la acumulación de agua en la base del tronco cuando se realiza el
riego en huertos con problemas de pudrición de cuello.
3.- No plantar más profundo los arbolitos que como estaban en el vivero, ya que
de lo contrario se incrementa la pudrición y daño a las raíces.
4.- En árboles ya infectados, se recomienda remover el suelo alrededor de la base
del tronco del árbol recientemente infectado para exponer el área con el cáncer,
cortar los tejidos enfermos y eliminarlos, exponiendo el área del tronco para que
se seque y prevenir desarrollo de la enfermedad, a finales de otoño se vuelve a
rellenar el área alrededor del tronco con buen suelo.
5.- Aplicaciones de fungicidas específicos contra Phytophthora pueden tener
efecto en minimizar el daño, pero es recomendable aplicarlos en prevención, es
decir al momento de la plantación, o en primavera antes de que inicie el desarrollo
de los árboles y en otoño al final de la cosecha. Además no se debe usar solo el
control químico, sino que deberá integrarse con buenas prácticas culturales y
materiales resistentes. La aplicación de fungicidas difícilmente recuperará árboles
con daño de moderado a severo.
Cuando se realice control químico, es recomendable aplicar antes de que
aparezcan los síntomas especialmente en huertos donde existen condiciones
favorables a la enfermedad.
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