INMOVILIZACIÓN DE ENZIMAS

INMOVILIZACIÓN DE
ENZIMAS
Prof. J.M.Sánchez-Montero
Grupo de Biotransformaciones
Departamento de Química Orgánica y Farmacéutica. Fac. Farmacia
INMOVILIZACIÓN DE ENZIMAS
DEFINICIÓN:
•CONFINAMIENTO FÍSICO DE UNA ENZIMA O CÉLULA EN
UNA DETERMINADA REGIÓN DEL ESPACIO, DE MANERA
QUE SU ACTIVIDAD CATALITICA SE RETENGA, Y PUEDA
SER REUTILIZADA.
•1971, 1er Enzyme Engineering Conference, Henniker, New
Hampshire, USA.
POSTERIOR
SIMPLIFICACIÓN
DEL
TÉRMINO:
BIOCATALIZADORES INMOVILIZADOS
•ENZIMAS, CÉLULAS ENTERAS U ORGÁNULOS CELULARES
(O BIEN COMBINACIONES DE ELLOS) QUE SE ENCUENTRAN
EN UN ESTADO TAL QUE SE PERMITE SU REUTILIZACIÓN
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PARA
UNIFICAR
CRITERIOS
A
LA
HORA
DE
CARACTERIZAR UN CATALIZADOR INMOVILIZADO, EL
WORKING
PARTY
ON
APPLIED
BIOCATALYSIS,
ENCUADRADO DENTRO DE LA FEDERACIÓN EUROPEA DE
BIOTECNOLOGÍA DEFINIÓ UNAS LÍNEAS MAESTRAS
(GUIDELINES) CON OBJETO DE RESPONDER A PREGUNTAS
TIPO:
•¿ QUÉ CANTIDAD DE ENZIMA LIBRE SE NECESITA PARA
PREPARAR UN BIOCATALIZADOR INMOVILIZADO ACTIVO?
•¿ QUÉ PARÁMETROS GOBIERNAN UNA REACCIÓN
BIOCATA LIZA DA ?
•¿ QUE RENDIMIENTO COMPARADO PRESENTA UNA
REACCION BIOCATALIZADA POR ENZIMAS O CÉLULAS
LIBRES FRENTE A SISTEMAS INMOVILIZADOS?
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REQUISITOS MÍNIMOS PARA PODER CARACTERIZAR UN
BIOCATALIZADOR INMOVILIZADO
90.- DESCRIPCIÓN GENERAL.
90.1.- ESQUEMA DE REACCIÓN
90.2.- ENZIMA Y MICROORGANISMO
90.3.- TIPO DE SOPORTE
90.4.- MÉTODO EMPLEADO PARA LA INMOVILIZACIÓN
91.- PREPARACIÓN DEL CATALIZADOR INMOVILIZADO.
91.1.- MÉTODO DE INMOVILIZACIÓN, CONDICIONES DE
REACCIÓN.
91.2.- RENDIMIENTO POR PESO SECO, ACTIVIDAD DEL
SOBRENADANTE.
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92.- CARACTERIZACION FISICO- QUIMICA.
9
9
9
9
9
9
2.1.-FORMA DEL BIOCATALIZADOR
2.2.-DIÁMETRO MEDIO DE PARTÍCULA HÚMEDA
2.3.-CAPACIDAD DE HINCHAMIENTO
2.4.-COMPORTAMIENTO EN COLUMNAS
(COMPRESIBILIDAD)
2.5.-ABRASIÓN EN REACTORES AGITADOS
2.5.-ABRASIÓN EN REACTORES DE LECHO
FLUIDIZADO.
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93.-CINETICA DEL BIOCATALIZADOR INMOVILIZADO.
93. 1.-ESTUDIO DE LA VARIACIÓN DE LA VELOCIDAD INICIAL
DE REACCIÓN FRENTE A LA VARIACIÓN DE LAS
CONCENTRACIONES DE ENZIMA Y DE SUSTRATO.
93.2.- EFECTO DEL TIPO DE BUFFER Y DEL pH.
93.3.- LIMITACIONES DIFUSIONALES EN EL SISTEMA (EFECTO
DEL TAMAÑO DE PARTÍCULA Y LA CARGA ENZIMÁTICA)
93.4.- GRADO DE CONVERSIÓN FRENTE A TIEMPO DE
RESIDENCIA.
93.5.- ESTABILIDAD DEL BIOCATALIZADOR EN EL
ALMACENAMIENTO (VELOCIDAD INICIAL RESIDUAL TRAS EL
ALMACENAMIENTO A DIFERENTES TIEMPOS EN DIFERENTES
CONDICIONES.)
93.6.- ESTABILIDAD OPERACIONAL (VELOCIDAD INICIAL
RESIDUAL DESPUÉS DE DIFERENTES CICLOS CATALÍTICOS)..
OBJETIVO: MAYOR REPRODUCIBILIDAD
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VENTAJAS E INCONVENIENTES DE LA INMOVILIZACIÓN
9PUNTO DE VISTA BIOQUÍMICO
9VENTAJAS:
91.- Disminución de problemas de autolisis (proteasas) o de
agregación, al estar limitados los movimientos rotacionales y
translacionales.
92.- Se ralentizan los cambios conformacionales, por lo que se
pueden estudiar las relaciones estructura-función.
93.- Se pueden simular reacciones in vivo.
94.- Se pueden simular sistemas estructuralmente asimétricos (ej.
estudios de membranas).
95.- En sistemas entrecruzados, se pueden fijar interacciones con
fosfolípidos, polisacáridos... para simular orgánulos celulares.
96.- La unión multipuntual a soportes deformables permite
estudiar la deformación de proteínas globulares.
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VENTAJAS E INCONVENIENTES DE LA INMOVILIZACIÓN
9PUNTO DE VISTA BIOQUÍMICO
9DESVENTAJAS:
91.- Generalmente, se disminuye la actividad enzimática al
inmovilizar.
92.- Si la preparación enzimática no es homogénea, se dificulta la
interpretación de los datos.
93.- A veces, se pueden originar contactos proteína-proteína
indeseados.
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VENTAJAS E INCONVENIENTES DE LA INMOVILIZACIÓN
9PUNTO DE VISTA APLICADO
9VENTAJAS:
91.- Se produce un gran aumento de la estabilidad de la enzima o
célula inmovilizada.
92.- Se aumenta de gran manera la productividad enzimática por
la capacidad de reutilización.
93.- Se aumenta la facilidad de recuperación y purificación de los
productos.
94.- Se puede elegir entre una gran variedad de diseños
ingenieriles
95.- Se aumenta la facilidad de operación y control del proceso,
al trabajar en condiciones más suaves.
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VENTAJAS E INCONVENIENTES DE LA INMOVILIZACIÓN
9PUNTO DE VISTA APLICADO
9DESVENTAJAS:
91.- Generalmente, se disminuye la actividad enzimática.
92.- Se aumentan los problemas difusionales.
93.- Se aumenta el costo del proceso.
94.- El intervalo de pH de trabajo puede ser distinto al del
biocatalizador nativo.
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MÉTODOS DE INMOVILIZACIÓN:
Existen varias metodologías.
1.- RETENCIÓN QUÍMICA
1.1.- Enlaces covalentes
1.2.- Enlaces no covalentes. Adsorción.
1.3.- Reticulado (cross-linking)
2.- RETENCIÓN FÍSICA = ATRAPAMIENTO
2.1.- Atrapamiento en matrices.
2.1.1.- En geles o polímeros.
2.1.2.- Micelas reversas.
2.2.- Atrapamiento en membranas.
2.2.1.- En fibras huecas.
2.2.2.- En reactores de membrana.
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1.- RETENCIÓN QUÍMICA
1.1.- Enlaces covalentes
1.2.- Enlaces no covalentes. Adsorción.
1.3.- Reticulado (cross-linking)
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2.- RETENCIÓN FÍSICA = ATRAPAMIENTO
2.1.- Atrapamiento en matrices.
2.1.1.- En geles o polímeros.
2.1.2.- Micelas reversas.
2.2.- Atrapamiento en membranas.
2.2.1.- En fibras huecas.
2.2.2.- En reactores de membrana.
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Métodos físicos
Métodos químicos
E
E
E
E
E
E
E
E
E
E
Enlace covalente
E
E
Entrecruzamiento
Intramolecular
Adsorción
(no covalente) Atrapamiento en
fibras
Atrapamiento en
gel polimérico
E+
E+
- - -
E
E
-
E
E
E
E
Microencapsulación
E
Entrecruzamiento
Intramolecular
Adsorción
iónica
E
Atrapamiento en
liposomas
E
E
E
E
E
E
E
Copolimerización de la
enzima modificada con un
monómero insaturado en
un gel 3D
Atrapamiento en
láminas de un
polímero
semipermeable
E
Atrapamiento en
fibras huecas
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ELECCIÓN DEL MÉTODO DE INMOVILIZACIÓN:
C O M P AR A C IÓ N D E LO S M É TO D O S
M ÉT O D O
IN C L U S IÓ N
M E M B R AN AS
AT R AP A M IEN T O
R ET IC U L AD O
AD SO R C IÓ N
U N IÓ N
C O VAL EN T E
PR EP AR A C IÓ N
IN T ER M ED IA
D IF ÍC IL
IN T ER M ED IA
SEN C IL L A
D IF ÍC IL
F U ER Z A D E L A U N IÓ N
D ÉB IL
M ED IA
D EB IL -M ED IA
M ED IA
F U ER T E
AC T IV ID AD
EN Z IM ÁT IC A
M ED IA-AL T A
B AJ A
B AJ A
M ED IA-AL T A
AL T A
R EG EN ER AC IÓ N
D EL SO PO R T E
PO SIB L E
IM PO S IB L E
IM PO S IB L E
PO SIB L E
D IF ÍC IL
C O ST E
M ED IO -AL T O
M ED IO
M ED IO
B AJO
AL T O
EST AB IL ID AD
M ED IA
AL T A
AL T A
B AJ A
AL T A
VAL ID EZ
G EN ER AL
G EN ER AL
L IM IT AD A
G EN ER AL
L IM IT AD A
R ES IST EN C IA
A
C O N T AM IN A C IÓ N
SI
SI
SI
NO
NO
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REQUISITOS LÓGICOS MÍNIMOS
9La enzima o célula debe ser estable en las condiciones experimentales empleadas.
9Si se emplean agentes entrecruzantes, éstos no deben afectar al centro activo. Si pudieran interferir
con éste, se debe utilizar un agente entrecruzante lo más grande posible.
9Si es posible, se debería proteger el centro activo:
9si existen grupos -SH, éstos deben hacerse reaccionar con cisteína o glutation, para reactivarse
posteriormente tras la inmovilización.
9se puede realizar la inmovilización en presencia de concentraciones saturantes de sustrato.
9El proceso de lavado no debe afectar negativamente a la enzima.
9Coherencia con la posterior biotransformación.
9si soporte = polianión, la conversión de un sustrato aniónico será muy difícil (repulsión)
9enzima atrapada en un gel: si el sustrato presenta un alto peso molecular, el resultado será
malo.
9Gran importancia de las propiedades mecánicas (estabilidad del soporte, forma física del mismo)
9El soporte debe presentar una alta superficie específica, para minimizar los problemas de
transferencia de materia.
9 El soporte debe conferir al derivado inmovilizado una buena resistencia a la contaminación
microbiana.
9El soporte debe permitir que se inmovilice una alta cantidad de biocatalizador (alto "loading").
9El soporte debe ser comercialmente accesible:
9bajo precio
9buena disponibilidad
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