Estabilidad de dos variantes genotípicas del nucleopoliedrovirus de
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Estabilidad de dos variantes genotípicas del nucleopoliedrovirus de Spodoptera frugiperda a través de ciclos sucesivos de infección en larva Astrid Lucero Malagón Rodríguez Universidad Nacional de Colombia Postgrado Interfacultades en Microbiología Ciudad, Colombia 2014 Estabilidad de dos variantes genotípicas del nucleopoliedrovirus de Spodoptera frugiperda a través de ciclos sucesivos de infección en larva Astrid Lucero Malagón Rodríguez Tesis presentada como requisito parcial para optar al título de: Magister en Ciencias Microbiología Directora: Ph. D., M Sc., Bact. Gloria Patricia Barrera Codirector: Ph. D., M Sc., Q.F. Fabio Aristizabal Línea de Investigación: Biología Molecular – Control Biológico Universidad Nacional de Colombia Postgrado Interfacultades en Microbiología Ciudad, Colombia 2014 Dedicatoria A mi Madre y Hermano quienes siempre han estado a mi lado dándome todo su apoyo para alcanzar mis metas, A Mi Novio Fernando por su amor, su compañía y apoyo incondicional en todo este proceso, A mi Padre por darme el impulso necesario para iniciar este camino, si hoy estuvieras acá conmigo se que con un gran abrazo me dirías lo logramos….. Agradecimientos Quiero agradecer a Corpoica y la Universidad Nacional por darme la oportunidad de desarrollar este trabajo. A la Dra. Gloria Patricia Barrera por ser mi directora y amiga, por todas sus enseñanzas recibidas y por todos sus concejos para mi vida profesional y personal, al Profe Fabio Aristizabal por su apoyo incondicional y estar siempre ahí para brindarme su ayuda, a la Dra. Laura Villamizar por sus aportes conceptuales para el desarrollo del trabajo. Quiero agradecer también a la Dra. Carolina González por todo su apoyo, al Dr. Fernando Rodríguez, Dr. Jaime Cardozo y Dr. Hugo Jiménez del grupo de Microbiología molecular de Corpoica por permitirme conocerlos y aprender de sus experiencias. Al grupo de Control biológico por su disposición y colaboración en este trabajo. Agradezco también a mis amigos y compañeros de laboratorio Edwin, Yorguin, Lorena, Cristian, Juan Camilo y Rochi por su compañía y colaboración en este proceso. Por último agradezco a mis compañeras de maestría Vanessa, Liliana, Carolina, Diana, quienes aprecio mucho por todos los momentos gratos y también los difíciles que vivimos a lo largo de la maestría , por encontrar en el camino más que compañeros, grandes amigos. También quiero agradecer de manera especial a La Profe Martha Fontanilla por ser más que una maestra una amiga una concejera y un ejemplo a seguir y a Socorrito por estar siempre dispuesta a solucionarnos todo. Para todos y para quienes no mencione infinitas gracias!! Resumen El nucleopoliedrovirus de Spodoptera frugiperda (SfMNPV) se caracteriza por presentar una mezcla de diferentes genotipos con actividad insecticida variable. Estas diferencias pueden ser utilizadas como estrategia para la búsqueda de genotipos puros o mezclas de los mismos, cuya actividad insecticida sea óptima para el desarrollo de un bioplaguicida, para el control del gusano cogollero del maíz. En el presente trabajo se aislaron dos variantes genotípicas mediante clonación in vitro a partir del aislamiento nativo colombiano del SfMNPV (NPV003). La variante genotípica Sf-C1 presentó un perfil de restricción (REN) similar al aislamiento silvestre, mientras que la variante Sf-C2 presentó una deleción en parte de su genoma. El objetivo del presente trabajo fue estudiar la estabilidad de las variantes genotípicas Sf-C1 y Sf-C2 a través de pases sucesivos en larvas de S. frugiperda. A partir de las variantes individuales recuperadas de la línea celular Sf9, se realizaron cinco pases sucesivos de multiplicación en larvas de tercer estadio. A los cuerpos de inclusión (CIs) de cada pase de multiplicación, se les determinó la patogenicidad mediante ensayos de concentración letal media (CL 50) y la virulencia mediante ensayos de tiempo medio de mortalidad (TMM). La patogenicidad inicial de Sf-C1 fue 2,5 veces superior al aislamiento silvestre NPV003, lo cual le otorga potencial para ser utilizado como principio activo de un bioinsumo, mientras que la patogenicidad de Sf-C2 fue 10 veces menor. Mediante electroforesis de campo pulsado de un fragmento variable entre genotipos de SfMNPV, se observó que a partir del tercer pase sucesivo in vivo de la variante Sf-C1, aparecieron genotipos con deleción, lo cual se correlacionó con una disminución de su patogenicidad. Los resultados obtenidos contribuirán a establecer una metodología adecuada para la propagación viral que asegure la calidad del bioplaguicida. Palabras clave Baculovirus, gusano cogollero, Spodoptera frugiperda, control biológico Abstract Spodoptera frugiperda (SfMNPV) is characterized by a mixture of different genotypes with varying insecticidal activity. These differences may be used to generate a strategy to find pure genotypes or mixtures with optimal insecticidal activity that allow the development of a biopesticide for control of the fall armyworm. In the present work two genotypic variants were cloned in vitro from the native Colombian SfMNPV isolate (NPV003). The genotypic variant Sf-C1 showed a molecular restriction pattern (REN) similar to the wild type isolate while Sf-C2 presented a genomic deletion. The aim of this work was to study the genotypic variant stability through successive passes of viral amplification in vivo, by using S. frugiperda larvae. From genotypic variants recovered from Sf-9 cells, five successive passes were done using third instar larvae. The occlusion bodies (OBs) of each amplification passage was evaluated by testing the pathogenicity by the median lethal concentration (LC50) and the virulence was studied by median time to death (MTD). The original pathogenicity of Sf-C1 was 2.5 times fold higher than the wild type isolate NPV003, which made this viral isolate a potential ingredient to be used in development of a biopesticide, while the pathogenicity of Sf.C2 .result 10 time less than the wild type. Through Pulse field Gel Electrophoresis (PFEG) of a genomic variable region present among SfMNPV genotypes was observed genomic deletions in the Sf-C1 variant during the third larvae pass. This deletion was correlated with a decrease in the viral pathogenecity. The results obtained would contribute to establish a methodology to follow (or to monitor) the quality control of the biopesticide production. Key words: Baculovirus, fall armyworm, Spodoptera frugiperda, biological control. Contenido Resumen .............................................................................................................................. VI Abstract ............................................................................................................................... VII Lista de figuras ...................................................................................................................... X Lista de tablas ...................................................................................................................... XI Lista de símbolos y abreviaturas ........................................................................................ XII Introducción......................................................................................................................... 13 1. 2. Objetivos ...................................................................................................................... 15 1.1. Objetivo general ................................................................................................... 15 1.2. Objetivos específicos ........................................................................................... 15 MARCO TEORICO ...................................................................................................... 16 2.1. 2.1.1. Morfología y taxonomía .................................................................................... 17 2.1.2. Ciclo de infección ............................................................................................. 20 2.1.3. Expresión Genómica y regulación de los Baculovirus ..................................... 22 2.1.4. Diversidad y variabilidad de los Baculovirus .................................................... 25 2.2. Nucleopoliedrovirus de Spodoptera frugiperda SfMNPV .................................... 28 2.3. Pases sucesivos in vivo e in vitro ........................................................................ 30 2.4. Cultivo Celular usado en Clonación de Baculovirus............................................ 33 2.5. Spodoptera frugiperda (Lepidoptera: Noctuidae) ................................................ 34 2.5.1. Ciclo de vida ..................................................................................................... 35 2.5.2. Daño causado a la planta................................................................................. 37 2.6. 3. Baculovirus ........................................................................................................... 16 Control Biológico .................................................................................................. 38 MATERIALES Y METODOS ....................................................................................... 40 3.1. Insectos ................................................................................................................ 40 3.2. Aislamento viral y multiplicación .......................................................................... 40 3.3. Obtención de variantes genotípicas .................................................................... 40 3.4. Purificación de Cuerpos de Inclusión, extracción de ADN viral y análisis de restricción ........................................................................................................................ 43 3.5. Caracterización biológica de variantes genotípicas ............................................ 44 3.6. Pases de multiplicación viral ................................................................................ 45 3.7. Determinación de infecciones encubiertas de SfMNPV en cría de insectos ...... 45 3.8. Caracterización morfológica de los cuerpos de inclusión. .................................. 46 3.9. Análisis de restricción de los cuerpos de inclusión de pases sucesivos. ........... 47 3.10. Análisis de la región variable entre variables genotípicas de SfMNPV mediante electroforesis de campo pulsado. ................................................................... 47 3.11. 4. Caracterización biológica de los pases sucesivos de variantes genotípicas .. 48 RESULTADOS Y DISCUSIÓN ................................................................................... 49 4.1. Obtención de variantes genotípicas y multiplicación .......................................... 49 4.2. Perfiles de restricción de variantes genotípicas .................................................. 50 4.3. Caracterización biológica de las variantes genotípicas. ..................................... 51 4.4. Determinación de infecciones encubiertas de SfMNPV en la cría de insectos .. 53 4.5. Caracterización morfológica de los cuerpos de inclusión ................................... 54 4.6. Perfiles de restricción REN de los pases sucesivos ........................................... 55 4.7. Análisis de la región variable entre variantes genotípicas de SfMNPV mediante electroforesis de campo pulsado .................................................................................... 58 4.8. 5. Caracterización biológica de los pases sucesivos .............................................. 60 CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES.............................................................. 66 5.1. Conclusiones ........................................................................................................ 66 5.2. Recomendaciones ............................................................................................... 68 BIBLIOGRAFIA ................................................................................................................... 69 Lista de figuras Figura 2-1: Estructura de los dos fenotipos virales: .......................................................... 18 Figura 2-2: El ciclo de infección del Baculovirus. ............................................................ 21 Figura 2-3 Morfología de nucleopoliedrovirus SfMNPV ................................................... 29 Figura 2-4 : Células línea celular Sf9 infectadas con Baculovirus. .................................... 33 Figura 2-5 :Huevos de Spodoptera frugiperda. ................................................................. 35 Figura 2-6 : Larva Spodoptera frugiperda en diferentes estadios. .................................. 36 Figura 2-7 : Pupa y Adulto de Spodoptera frugiperda. .................................................... 36 Figura 2-8 Daño causado en la planta, ............................................................................. 37 Figura 3-1 : Crecimiento cultivo celular línea Sf9. ............................................................ 41 Figura 3-2 : Extracción de Hemolinfa de larvas infectadas. ............................................. 41 Figura 3-3 : Placa de 6 pozos con células Sf9 para infección .......................................... 42 Figura 3-4 : Inyección intrahemocélica en larva. .............................................................. 42 Figura 3-5 : Infección viral de larvas por método de la gota. ............................................ 44 Figura 3-6 : Unidades experimentales de bioensayos. ..................................................... 45 Figura 4-1 : Infección viral en cultivo celular línea Sf9 de variantes genotípicas ............. 50 Figura 4-2 : Perfil de restricción de ADN genómico .......................................................... 50 Figura 4-3 1 Fotografía cuerpos de inclusión microscopia de luz, 2. Fotografía cuerpos de inclusión microscopio electrónico de barrido ................................................................ 54 Figura 4-4 Perfil de restricción de pases sucesivos 1 a 5 de Sf-C1 ................................. 55 Figura 4-5 . Perfil de restricción de pases sucesivos 1 a 5 de Sf-C2 ............................... 56 Figura 4-6 Electroforesis de campo pulsado de pases sucesivos.................................... 58 Lista de tablas Tabla 3-1 Condiciones de amplificación de Q-PCR:.......................................................... 46 Tabla 3-2 Condiciones de amplificación de la PCR. ......................................................... 48 Tabla 4-1 Valores obtenidos de concentración letal media CL 50 y TMM de las variantes genotípicas Sf-C1 y Sf-C2 .................................................................................................. 52 Tabla 4-2 Valores obtenidos de concentración letal media CL 50 y TMM de la variante genotípicas Sf-C1 a través de 5 pases sucesivos ............................................................. 61 Tabla 4-3 Valores obtenidos de concentración letal media CL 50 y TMM de la variante genotípica Sf-C2 a través de 5 pases sucesivos. ............................................................ 63 Lista de símbolos y abreviaturas Símbolos Símbolo HR µl µm µg µM V/cm Abreviaturas Abreviatura Término Humedad Relativa microlitro micrómetro microgramos microMolar Voltios por centímetro Término CORPOICA Corporación Colombiana de Investigación Agropecuaria CIs Cuerpos de inclusión ODV Viriones derivados de cuerpos de inclusión BV Viriones brotados CIs/ml Cuerpos de inclusión por mililitro NPV Nucleopoliedrovirus GV Granulovirus Introducción Spodoptera frugiperda (J.E. Smith, 1797) (Lepidoptera: Noctuidae) conocido también como “gusano cogollero del maíz” o “palomilla del maíz” es una de las plagas más importantes del cultivo de maíz en América (King y Saunder, 1984), donde genera pérdidas superiores al 40% (Fernández, 2002). En Colombia las pérdidas ocasionadas por esta plaga pueden llegar a ser del 60%. (ICA, 2008; Quintero et al., 2004). El uso de plaguicidas químicos para la reducción de la plaga genera riesgos para la salud humana y animal debido a su alta toxicidad (European Commission, 2006) además de su impacto ecológico negativo (Morillo y Notz, 2001). Por tales circunstancias se ha despertado un creciente interés por desarrollar alternativas sostenibles y ecológicas para el manejo de esta plaga. Los baculovirus, son los agentes entomopatógenos de mayor prevalencia entre los insectos lepidópteros, con características relevantes para ser desarrollados como bioplaguicidas, las cuales incluyen alta especificidad, alta virulencia y alta patogenicidad (Caballero et al., 2001). Estos virus se encuentran en la naturaleza en forma de cuerpos de inclusión (CIs) los cuales contienen en su interior viriones denominados Occluded derived virions (ODV), encargados de la transmisión horizontal entre hospederos susceptibles, mientras que otro morfotipo de virion denominado Budded virion (BV) es el encargado de la infección entre células dentro del insecto (Slack y Arif, 2007). Además los virus de la familia Baculoviridae se caracterizan por presentar cuerpos de inclusión en forma de gránulos (granulovirus) ó en forma de poliedros (nucleopoliedrovirus) (Rorhmann, 2011) Los baculovirus específicos de Spodoptera frugiperda (SfMNPV) son nucleopoliedrovirus compuestos por mezclas de variantes genotípicas, las cuales se pueden aislar mediante métodos in vitro, utilizando líneas celulares del insecto (Simón et al., 2005; Harrison et al., 2008). Las diferencias entre las variantes genotípicas presentes en un mismo aislamiento pueden ser fácilmente observables mediante el análisis de los perfiles generados por la digestión de su ADN genómico con endonucleasas de restricción (Simón et al., 2004). Esta heterogeneidad genética entre variantes, en algunas ocasiones generan diferencias en la actividad biológica, lo cual puede ser utilizado como estrategia para el desarrollo de un bioplaguicida, mediante la selección del ingrediente activo con mejores características insecticidas (Murillo et al., 2006). Estudios previos han demostrado el potencial de un aislamiento nativo de SfMNPV para el desarrollo de un bioplaguicida en Colombia. El aislamiento seleccionado (NPV003) fue formulado mediante microencapsulación con excelentes resultados en pruebas de campo, sin embargo su costo de aplicación en campo es superior en 40% comparado con un pesticida químico (Gómez et al., 2013). La purificación de variantes genotípicas a partir de NPV003 que puedan presentar características insecticidas superiores al aislamiento silvestre, puede ser utilizada como una estrategia de potenciación biológica como principio activo en el desarrollo del bioplaguicida con la consecuente disminución de costos de producción para el control de la plaga en Colombia. En el proceso de desarrollo de un bioplaguicida después de la selección del ingrediente activo, es necesaria su producción masiva mediante métodos in vitro ó in vivo. La producción in vivo implica la multiplicación del virus a través de pases sucesivos en larvas. Se ha descrito que la actividad biológica de los nucleopoliedrovirus puede verse afectada durante este proceso, disminuyendo la patogenicidad del virus en algunos casos (Ignoffo et al., 1971). El objetivo del presente trabajo fue evaluar la estabilidad fenotípica y genética de dos variantes genotípicas obtenidas a partir del aislamiento NPV003 en pases sucesivos de multiplicación en larvas de Spodoptera frugiperda de tercer estadio. 14 1. Objetivos 1.1. Objetivo general Determinar la estabilidad de dos variantes genotípicas del nucleopoliedrovirus de Spodoptera frugiperda (SfMNPV) a través de ciclos sucesivos de infección en larva. 1.2. Objetivos específicos Determinar la estabilidad genética de las variantes Sf-C1 (variante completa) y Sf-C2 (variante delecionada) del SfMNPV durante ciclos sucesivos de infección en larva. Establecer el efecto de los ciclos sucesivos de infección en larva sobre la actividad biológica (patogenicidad y virulencia) de las variantes Sf-C1 (variante completa) y SfC2 (variante delecionada) del SfMNPV. 15 2. MARCO TEORICO 2.1. Baculovirus Los primeros estudios de infecciones virales en insectos específicamente en baculovirus se remontan al siglo XI, donde el comercio de la industria de la seda estaba en auge y era de gran importancia en la China (Rohrmann, 2011). Gracias al intercambio comercial, el gusano de seda empezó a transportarse por toda Asia, en el siglo XII llegó a extenderse hasta Europa y ya para el siglo XVI su comercialización se extendió a otros continentes llegando a América, específicamente a México. (Benz, 1987; Rohrmann, 2011). Enfermedades que empezaron a aparecer en los gusanos causaban interés debido a las pérdidas económicas que ocasionaban, lo que motivó al estudio de sus agentes causales. Fue solo a mediados del Siglo XIX gracias a la aparición y uso de métodos como la microscopia de luz, que se determinó a través de la observación directa que una de las enfermedades que atacaba a las larvas presentaba una característica común, la presencia de cuerpos de inclusión refringentes con una estructura particular en forma de poliedro. Las enfermedades en las que estaban presentes los poliedros se les dió inicialmente el nombre de poliedrosis. Para finales de los años 40 y gracias a metodologías avanzadas como la microscopia electrónica se pudo visualizar de manera detallada que esta estructura contenía en su interior estructuras en forma de bastones llamadas viriones. (Bergold, 1947). El nombre de Baculovirus fue propuesto por Mauro Martignoni, quien sugirió dicho nombre derivado del latín baculum por la forma de bastón o varilla que presentaban los viriones. Para los años 70 y gracias a las investigaciones llevadas a cabo acerca del virus, se estableció unificar la nomenclatura bajo la familia Baculoviridae (Vago, 1974). La familia Baculoviridae son virus que tienen alta infectividad en los invertebrados. El material genético está constituido por una única molécula circular de ADN de doble cadena que puede variar en tamaño y contenido génico entre diferentes baculovirus, con tamaños que oscilan entre 80 a 180 kb, que codifican entre 90 y 180 genes (Blissard et al., 2000). 16 Se han identificado 37 genes presentes en todos los genomas de baculovirus (Miele et al., 2011), los cuales se han agrupado en 5 diferentes categorías funcionales que son: Transcripción de RNA, proteínas estructurales, replicación de ADN, proteínas auxiliares, y proteínas de función desconocida. (Miele et al., 2011). Adicionalmente, estos genomas también contienen regiones repetidas homólogas (hrs). Algunos estudios indican que las hrs pueden actuar como potenciadores transcripcionales y orígenes de replicación del ADN para algunos baculovirus (Van Oers y Vlak,2007;Rohrmann, 2011) 2.1.1. Morfología y taxonomía En la actualidad más de 600 tipos de Baculovirus han sido descritos produciendo infección en diferentes especies de insectos de los ordenes Diptera, Himenóptera, Lepidoptera, sin embargo la mayoría de los baculovirus provienen de especies del orden Lepidoptera (ICTV,2012; Jehle et al, 2006). Nucleocápsides El genoma de los baculovirus se encuentra empaquetado en una nucleocápside de naturaleza proteica en forma de bastoncillo, que mide entre 30 y 60nm de longitud, y entre 250 y 300nm de ancho. Luego de ser sintetizada en el núcleo, la nucleocápside puede dar lugar a dos diferentes fenotipos de viriones derivados de cuerpos de inclusión ODV (ODV: occlusion derived virus) o viriones brotados BV (BV: budded virus) (Federici, 1986). Viriones Los ODV se encuentran ocluidos en una matriz proteica cristalina conocida como cuerpo de inclusión que mide aproximadamente 0.15-15µm. Los ODV puede a su vez estar conformados por una o múltiples nucleocápsides presentes en una envoltura de proteínas virales dando lugar a dos tipos morfológicamente diferentes, los ODV simples y ODV múltiples. Los BV contienen una sola nucleocápside dentro de una envoltura que se caracteriza por ser derivada de la membrana plasmática del hospedero con presencia de proteínas P64 y P67 esenciales en la infección de otras células en el hospedero (Monsma et al., 1996). 17 Las características descritas de estos dos fenotipos (ODV y BV) (Figura 2-1) juegan un papel fundamental al momento de la transmisión de la infección por el virus ya sea de célula a célula (BV) o de insecto a insecto (ODV) (Cory y Myers, 2003). Figura 2-1: Estructura de los dos fenotipos virales: Virión brotado (BV) con envoltura compuesta mayoritariamente por glicoproteína gp64, y virión derivado de cuerpo de inclusión (ODV) en el centro la composición de las nucleocápsides, gracias a estas los ODV pueden ser simples con una sola nucleocápside o múltiples con varias nucleocápsides, estos se empaquetan en una matriz proteica de poliedrina formando los cuerpos de inclusión CI http://viralzone.expasy.org/all_by_species/539.html (Adaptado Slack y Arif, 2007). Cuerpos de Inclusión Al final del proceso es común que todos los baculovirus sinteticen grandes cantidades de una proteína conocida como poliedrina ó granulina la cual se cristaliza y da lugar al cuerpo de inclusión (CI) el cual encapsula uno o varios ODVs. (Caballero et al., 2001). La familia Baculoviridae se caracteriza por la presencia de cuerpos de inclusión en forma de poliedros en el caso de los NPVs y gránulos o cápsulas en los GVs. Los poliedros tienen un tamaño de 0.6-2 µm de diámetro, mientras que los gránulos presentan una forma ovalada con un diámetro de 0.2-0.4 µm (Akermann y Smirnoff, 1983). Los cuerpos de inclusión se caracterizan por ser estables y resistir las condiciones ambientales adversas, permitiendo que los viriones permanezcan de manera latente para infectar un 18 huésped cuando se presenta la oportunidad. Estudios sugieren que los CIs son capaces de resistir su paso a través del tracto digestivo de aves lo que ayuda en la dispersión del virus. (Entwistle et al., 1978; Hostetter y Bell, 1985). Taxonomía La familia Baculoviridae ha presentado varios cambios en su taxonomía desde el año 1960, sin embargo en la actualidad se han definido 4 géneros (Jehle et al. 2006; ICTV, 2012): Alphabaculovirus, que incluye a los nucleopoiliedrovirus (NPVs) específicos del orden Lepidoptera; con viriones múltiples o simples por cuerpo de inclusión. Betabaculovirus, granulovirus (GVs) específicos del orden Lepidoptera. La mayoría contienen un único virión por cuerpo de inclusión. Gammabaculovirus, nucleopoliedrovirus (NPVs) específicos del orden Hymenoptera Deltabaculovirus, nucleopoliedrovirus (NPVs) específicos del orden Diptera. El género de los Alphabaculovirus esta subdividido en Grupo I y Grupo II basado en el uso de la GP64 como proteína de fusión en BV (Grupo I) o ausencia de GP64 y uso de la proteína F (Grupo II) (Westenberg et al., 2007). Los Baculovirus se caracterizan por la especificidad de sus diferentes hospederos, posiblemente debido a la presión de selección desarrollada a lo largo de su evolución, lo que le ha permitido ser especifico de un grupo particular de insectos como lepidópteros, himenópteros o dípteros (Herniou et al., 2003). Para nombrar los Baculovirus, se tiene en cuenta el hospedero de donde fue aislado, por lo que es posible encontrar que un mismo virus reciba nombres diferentes por el huésped al que esta infectando ejemplo de ellos es Anagrafa falcifera NPV y Rachiplusia ou NPV son el mismo virus pero infectando a dos especies de insecto diferente Anagrafa falcifera (Lepidoptera:Noctuidae) y Rachiplusia ou (Lepidoptera:Noctuidae) (Bonnig y Hammock, 1999). 19 2.1.2. Ciclo de infección La transmisión por baculovirus ocurre por la ingesta de los cuerpos de inclusión (CIs) existentes en el ambiente por parte de los insectos susceptibles. Además se ha descrito una forma alterna de transmisión vertical donde el virus pasaría de insectos adultos a sus crías (Cory y Myers, 2003). La transmisión vertical de la infección puede ser debida a la contaminación de la superficie de los huevos, o incluso por la transmisión de infecciones latentes, donde se ha observado que el nivel de infección puede alcanzar entre el 40 y el 50% de la progenie, cuando los adultos fueron expuestos al virus en estadio de larva. La transmisión horizontal es la forma más común de transmisión viral, la cual depende de la interacción entre individuos infectados y susceptibles (Fuxa et al., 2002). La infección de los baculovirus ocurre exclusivamente en el estadio larval, donde estas consumen los cuerpos de inclusión de planta o suelo contaminado. Los CI se disuelven debido al pH alcalino presente en el intestino medio de la larva (pH 10-11) y los ODV se liberan en el lumen del intestino (Figura 2-2). La membrana peritrófica (MP) es la primera barrera que protege las células intestinales que debe ser atravesada por los ODV. Los ODVs pasan la MP a través de lesiones o por un incremento en la permeabilidad debido a factores denominados enhancinas (Rohmann, 2011; Slack y Arif, 2007) La infección de las células columnares del intestino medio ocurre por la fusión de la bicapa lipídica de los ODVs con las membranas celulares del intestino, lo cual produce la liberación de las nucleocápsides en el citoplasma. Esta fusión es mediada por un complejo formado de diferentes proteínas estructurales de la superficie de los ODVs, que incluyen los factores denominados pif (per os infectivity factors) (Peng et al., 2010) Las nucleocápsides viajan al núcleo ayudadas por estructuras microtubulares de la célula e ingresan a través de poros nucleares (Granados y Williams, 1986) y allí ocurre la replicación del ADN viral. Las nucleocápsides recién formadas son transportadas del núcleo al citoplasma, de donde son liberadas al espacio extracelular. El establecimiento de la infección secundaria (infección de diversos tipos celulares de la larva) ocurre vía hemolinfa o sistema traqueal (Engelhard et al., 1994). Los Alphabaculovirus poseen un amplio tropismo celular sin embargo los Betabaculovirus se dividen en tres grupos de acuerdo a su tropismo. El primer grupo invade el hospedero 20 a través de las células intestinales y luego infecta únicamente tejido graso. El segundo grupo infecta diferentes tipos celulares como los Alphabaculovirus y el tercer grupo únicamente infecta células del epitelio intestinal. Este último tipo de infección se encuentra en los Gammabaculovirus y Deltabaculovirus y en un único miembro de los Betabaculovirus (Moser et al., 2001; Rohrmann, 2011) Figura 2-2: El ciclo de infección del Baculovirus. Los Cuerpos de inclusión son ingeridos por el insecto y se disuelven en el intestino los ODV son liberados e infectan las células epiteliales. Los BV viriones brotados salen fuera de la célula en dirección basal e inician una infección sistémica. Al inicio de la infección sistémica se producen BV que propagan la infección a través de los insectos. A finales de la infección se producen viriones ocluidos, y luego, la célula muere liberando los cuerpos de inclusión CI. (http://www.microbiologybites.com/virology/Kalmakoff/baculo/baculo.html. Luego de la infección sistémica ocurre la producción de ODVs que son incluidos en la matriz proteica para formar CIs. En este punto todas las células son infectadas e inevitablemente ocurre la muerte del hospedero, siendo característica la licuefacción y liberación de grandes cantidades de cuerpos de inclusión que caen y contaminan el follaje permitiendo la transmisión a otras larvas susceptibles. Este sistema de transmisión de célula a célula esta dado por los BV, mientras que la transmisión de hospedero a hospedero se lleva a cabo por los ODV (Cory y Myers, 2003). Por último los insectos se 21 observan pálidos, flácidos y tienden a subir a las partes altas de la planta donde mueren (Castillejos et al., 2002). Al morir, los insectos liberan grandes cantidades de cuerpos de inclusión al medio ambiente y al suelo, los cuales se convierten en reservorios del virus. Estos cuerpos de inclusión pueden permanecer por periodos prolongados incluso años, en suelos ácidos o neutros, luego por efecto de las gotas de lluvia, por corrientes de aire o por artrópodos, son transportados de nuevo a la superficie de la planta. Sin embargo, se ha demostrado que algunos grupos de Baculovirus, gracias a genotipos específicos pueden adaptarse mejor a sobrevivir en el suelo que otros. La supervivencia de los cuerpos de inclusión en el suelo se ve afectada por condiciones que son adversas para ellos, como la radiación ultravioleta del sol y los suelos demasiado alcalinos (Murillo et al., 2006). Para el desarrollo de la infección por Baculovirus también son importantes otros factores que se ha sugerido puedan actuar como desencadenantes de la infección, entre ellos están cambios en la humedad relativa, cambios en la dieta, cambios de temperatura, estrés químico, infección persistente por un segundo virus y que pueden generar cambios en las características del virus en su patogenicidad y virulencia entre otros. (Hodgson et al., 2004). 2.1.3. Expresión Genómica y regulación de los Baculovirus La expresión génica de los Baculovirus y su regulación es similar a la de otros virus ADN de animales, como el de la viruela o el herpes. Esta expresión se caracteriza por realizarse en forma de cascada en la que la activación de cada grupo de genes se basa en la síntesis de proteínas a partir de grupo de genes anteriores, por lo tanto esta regulación permite dividir la expresión génica en tres etapas secuenciales temprana, tardía y muy tardía. (Friesen y Miller, 2001). Etapa Temprana En la literatura se sugiere la división de los genes de esta etapa en dos, genes inmediatos tempranos (EI) y genes inmediatos tardíos (RT), donde algunas de las proteínas de los primeros se requiere para la expresión de los segundos. Los genes tempranos no requieren ninguna proteína viral para su activación y se transcriben aproximadamente 4 horas después de la infección con ayuda de la ARN polimerasa II de 22 la célula, esto se logra gracias al reconocimiento de promotores TATA lo cual origina la codificación de factores EI0, EI1, EI2. Estas proteínas cumplen varias funciones reguladoras esenciales para la transcripción de un segundo grupo de genes (tardíos y muy tardíos) y para la replicación del ADN vírico. Por otra parte los genes inmediatos tardíos se encuentran involucrados en la alteración de la progresión del ciclo celular, provocando cambios morfológicos en la célula, conduciendo a la acumulación de células infectadas en fase G2/M (Ikeda y Kobayashi, 1999). Junto con la alteración del ciclo celular en esta etapa, se da lugar a la producción de proteína codificada por el gen p53 que tiene como fin inhibir el proceso de apoptosis celular, lo que da una ventaja al virus para seguir usando la célula en la replicación viral y dar continuidad al ciclo infeccioso como tal. Etapa Tardía Esta etapa ocurre 12 a 24 horas luego de iniciarse la infección, como resultado de los factores sintetizados en la fase temprana. En esta etapa se produce la replicación del ADN viral mediada por la acción de la ADN polimerasa conformada por subunidades que han sido codificadas por los genes lef4, lef8, lef9 y p47. La transcripción de los genes en esta etapa esta mediada por la acción de una ARN polimerasa II resistente a la αamanitina, la cual reconoce secuencias consenso TAAG actuando como promotores. También se da la producción de las proteínas estructurales de las nucleocápsides para la formación de los viriones BV y ODV (Braunagel et al., 2003). Etapa Muy tardía Esta etapa ocurre de las 18 a 76 horas post-infección, donde los promotores son reconocidos por la ADN polimerasa por su alto contenido de A-T. Se genera la sobreexpresión de genes tardíos como poliedrina y p10 para la producción de proteínas esenciales en formación y encapsulación de los cuerpos de inclusión, reorganización del citoesqueleto por interacción con la tubulina y modificación de los microtubulos y de otras proteínas como GP64 de envoltura, indispensables en la fusión con la membrana de la célula huésped para dar inicio a la infección (Braunagel et al., 2003). Ya en este punto se lleva a cabo una reorganización masiva de los cuerpos de inclusión al interior de la célula lo que hace que se expandan a tal punto que ocupan la mayor parte del volumen de la célula, dando como resultado la lisis de la célula en la fase final de la etapa. 23 Poliedrina Constituye uno de los principales componentes proteicos de los poliedros (CIs). Es una proteína de un peso molecular aproximado a los 29 KDa. La poliedrina es codificada por un gen altamente conservado entre los alphabaculovirus (Van Oers y Vlak, 2007). Se ha demostrado que esta proteína ejerce funciones importantes en los Baculovirus relacionadas con la formación de su estructura y los procesos de transmisión, lo que otorga al virus ventajas en condiciones adversas en el medio ambiente. (Rohrmann, 2011). Se ha demostrado también que el gen de la poliedrina no es necesario en los procesos de multiplicación en cultivo celular puesto que este proceso infectivo de las células es dado por el fenotipo BV sin necesidad de presencia del fenotipo ODV. Como se describió anteriormente la síntesis de poliedrina se lleva a cabo de forma masiva en la etapa tardía de la infección viral, incluso el porcentaje de su producción es significativamente más alto que el de otras proteínas en las células infectadas por baculovirus. Alguna de las hipótesis que podrían explicar esta sobreexpresion están relacionadas con su promotor que contiene una secuencia altamente conservada TAAGTATT ubicada en el punto de inicio de la trascripción, también gracias a una región homologa hr1 situada 3,7 kb aguas arriba del promotor del gen (Habib et al., 1996) Regiones homologas repetidas (hrs) Las regiones homologas repetidas (hrs) son ricas en regiones AT, compuestas de secuencias repetidas con un palindrome imperfecto en las proximidades de su parte central. Se ha reportado que las hrs están implicadas en funciones tales como origen de la replicación de ADN y mejora de la transcripción en la expresión de genes tempranos (Pearson y Rohrmann, 1995). También han sido encontradas cerca de regiones variables en genomas de baculovirus (Li et al., 2002) y se ha sugerido que las hrs constituyen factores de flexibilidad del genoma como mediadores de eventos de recombinación intra e inter moleculares durante la evolución de los baculovirus (Van Oers y Vlak, 2007) 24 2.1.4. Diversidad y variabilidad de los Baculovirus Diversidad interespecífica La familia Baculoviridae se caracteriza por un alto grado de diversidad inter e intraespecífica. La diversidad interespecífica está representada en el gran número de especies de insectos que son infectados por estos virus, la mayoría de los cuales se encuentran en los órdenes Lepidoptera, Diptera y Hymenoptera (Martignoni e Iwai, 1986). Los procesos de especiación de los virus están asociados con su hospedero en coevolución, lo cual se ve reflejado en los principales linajes de agrupación que coincide con el hospedero que infectan (Rohrmann, 2011). Esto esta soportado en el hecho de que la filogenia de los baculovirus sigue la filogenia de los diferentes huéspedes, lo cual refleja un patrón de familias de insectos. Así los baculovirus han evolucionado desde virus no ocluidos que infectan el tejido intestinal, y tejido graso, hasta virus que solo se limitan a infectar células intestinales (Gamma y Deltabaculovirus) y finalmente a virus ocluidos con la habilidad de extender la infección a diversos tejidos (Alphabaculovirus y Betabaculovirus) (Herniou y Jehle 2007). La clasificación actual de los baculovirus está basada en características moleculares propuestas en el 9° reporte de ICTV (international committee on taxonomy of viruses) (Jehle, et al., 2006) y aprobadas por el ICTV en 2008, incluye 33 especies de Alphabaculovirus (NPVs de Lepidóptera), 14 especies en Betabaculovirus (GVs de Lepidóptera), 2 especies en Gammabaculovirus (NPVs de Hymenoptera) y solo una especie en Deltabaculovirus (NPVs de Díptera) (ICTV, 2012). Basados en el estudio de las secuencias de los baculovirus que han sido descritas se sugirió un parámetro como criterio para discriminar las diferentes especies. Jehle y colaboradores (2006) propusieron que la distancia genética entre dos secuencias medida por el método de kimora-2 como en los genes (polh, lef-8, lef-9) es mayor de 0,050, dos o más virus son lo suficientemente distantes para ser considerados como de diferente especie, sin embargo cuando la distancia es menor de 0,015 son considerados de la misma especie. Para valores comprendidos entre 0,015 y 0,05 es necesario contar con información adicional de los virus como características biológicas y huésped para poder discriminar la especie entre ellos (Jehle et al., 2006). De acuerdo con este criterio, 8 nuevas especies fueron propuestas y aceptadas recientemente (ICTV, 2012) 25 El primer genoma de baculovirus completamente secuenciado fue el de Autographa califórnica (Lepidoptera:Noctuidae) AcMNPV cepa C6 (Ayres et al., 1994). A la fecha más de 60 secuencias de genoma de baculovirus han sido determinadas, incluyendo secuenciación de aislamientos geográficos de una misma especie o incluso variantes genotípicas de un aislamiento. Diversidad intraespecífica La heterogeneidad intraespecífica está presente entre aislamientos que pertenecen a la misma especie provenientes de regiones geográficas distantes (diversidad interpoblacional) (Escribano et al., 1999; Muñoz y Caballero, 2000; Rowley et al., 2011) o incluso entre un solo aislamiento, en el que existen mezclas de genotipos (diversidad intrapoblacional) que difieren en su contenido genético (Cory et al., 2005; Figueiredo et al., 2009; Hodgson et al., 2002; Muñoz et al., 2000; Simón et al., 2004). Los diferentes genotipos presentes en un aislamiento natural han sido separados por técnicas de clonación in vivo (Cory et al., 2005; Muñoz et al., 1999) e in vitro (Kikhno et al., 2002; Ogembo et al., 2007; Simón et al., 2004). Las variaciones entre variantes genotípicas y aislamientos geográficos han sido evaluadas utilizando perfiles de restricción de ADN con endonucleasas (Barrera et al., 2011; Escribano et al., 1999; Simón et al., 2004) y las variaciones de secuencias de ADN por medio de PCR (polymerase chain reaction) (Rowley et al., 2011) Variantes genotípicas de nucleopoliedrovirus pueden ser co-ocluidas en un solo cuerpo de inclusión, incluso dentro del mismo virión (Clavijo et al., 2010). Se ha estimado que los ODV de nucleopoliedrovirus múltiples pueden contener hasta 29 genomas (Bull et al., 2001) lo cual es favorable para la infección de larvas en estadios tardíos y en hospederos menos permisivos (Zwart et al., 2009). La diversidad genotípica puede ser el resultado de recombinación natural (Hajós et al., 2000) y de presencia de elementos transponibles (Jehle et al., 1998) luego de infecciones simultaneas de múltiples genotipos. La recombinación ocurre in vivo con alta frecuencia (hasta 50%) entre genotipos de virus estrechamente relacionados. La variación genética ha sido observada en regiones hipervariables del genoma más que estar dispersa al azar (Cory et al., 2005; Harrison et al, 2008; Muñoz et al., 1999; Stiles y Himmerich, 1998) y algunas de las regiones variables incluyen regiones homologas y 26 genes bro, indicando la presencia de puntos calientes de recombinación (Erlandson, 2009) La alta diversidad intraespecífica en los baculovirus ha sido demostrada en varias especies de nucleopoliedrovirus. Por técnicas de clonación in vivo se demostró que el nucleopoliedrovirus de Pannolis flammea (Lepidoptera:Noctuidae) está compuesto de 24 genotipos (Cory et al., 2005), el NPV de S. exempta (Lepidoptera:Noctuidae) por 17 genotipos (Redman et al., 2010) y el NPV de S. exigua (Lepidoptera:Noctuidae) por 7 genotipos (Muñoz et al., 1999). Adicionalmente la técnica de clonación in vitro en células de insecto ha sido usada para recuperar 7 variantes genotípicas de NPV de Autographa califórnica (Stiles y Himmerich, 1998) y 25 variantes genotípicas de NPV de Helicoverpa armígera (Lepidoptera:Noctuidae) (Ogembo et al., 2007). La misma técnica ha sido usada para separar genotipos de Spodoptera frugiperda MNPV (SfMNPV) de aislamientos de campo provenientes de Nicaragua y Estados Unidos (Harrison et al., 2008; Simón et al., 2004). La diversidad intrapoblacional es una fuente para la selección natural, ya que la variabilidad genómica tiene un efecto importante en la actividad insecticida de los baculovirus, en parámetros relacionados con patogenicidad, virulencia y producción de cuerpos de inclusión. Muchas de las variantes aisladas desde aislamientos nativos muestran diferencias en virulencia y patogenicidad (Cory et al., 2005; Harrison et al., 2008; Kikhno et al., 2002; Muñoz et al., 1999; Simón et al., 2004). Mantenimiento de la diversidad Los mecanismos para mantener la diversidad genética pueden estar relacionadas con el patógeno, incluyendo un equilibrio entre sus características insecticidas, interacciones entre genotipos y selección diferencial por genotipos (Hodgson et al., 2003), además puede esto relacionarse con la ecología del huésped. En los baculovirus dos propiedades insecticidas importantes que generan equilibrio son: la duración de la infección y la producción de cuerpos de inclusión, de tal manera que entre más tiempo le lleve al virus producir la muerte del hospedero, mas cuerpos de inclusión serán producidos (Hodgson et al, 2003). En cuanto a la selección diferencial ocurre cuando genotipos particulares presentan mejor desempeño en diferentes condiciones ecológicas, por ejemplo cuando 27 se produce la infección en un huésped alternativo, lo que sugiere es una opción para la generación de diversidad (Cory, 2010; Hitchman et al., 2007) La ecología de los hospederos puede ser un factor de selección de las variantes genotípicas, promoviendo la persistencia o selección de genotipos (Cory, 2010). Las interacciones entre planta, insecto y genotipos virales pueden favorecer la selección diferencial de las variantes. Diferencias en la patogenicidad fueron observadas cuando dos variantes de P. flammea fueron usadas para infectar larvas de P. flammea criadas en dos especies de pino (Hodgson et al., 2002) indicando que la adaptación a diferentes plantas huésped puede incrementar su transmisibilidad (Cory, 2010). La influencia de las plantas huésped en las interacciones con el virus podría deberse a muchos factores entre ellos la arquitectura de la planta que afecta la persistencia del virus, la palatabilidad que modifica la adquisición y permanencia del virus, la química vegetal que modula la infección en el intestino y contenido de nutrientes que determinan la supervivencia en el huésped (Cory y Myers, 2003). Además factores ambientales que afectan el rendimiento y la selección del virus, como la sensibilidad a la irradiación ultravioleta (UV) y temperatura en el periodo de vida del huésped (Cory, 2010) 2.2. Nucleopoliedrovirus de Spodoptera frugiperda SfMNPV El nucleopoliedrovirus múltiple de Spodoptera frugiperda (SfMNPV) se encuentra clasificado dentro de la familia Baculoviridae, específicamente dentro de los Alphabaculovirus del grupo II (ICTV, 2012; Jehle et al., 2006). SfMNPV ha sido estudiado intensivamente desde el primer reporte a comienzos de la década de los 70 (Summers y Anderson, 1973). Inicialmente fueron descritas la morfología, estructura, propiedades físicas y serológicas de la partícula viral (Bud y Kelly, 1980) (Figura 2-3). 28 Figura 2-3 Morfología de nucleopoliedrovirus SfMNPV A. Fotografía de microscopia electrónica de barrido donde se observa la estructura poliedral de los cuerpos de inclusión. B. Fotografía de microscopia electrónica de transmisión donde se observa que los viriones dentro de los cuerpos de inclusión pueden contener una o varias nucleocápsides al interior (Flecha negra) Diferentes aislamientos de SfMNPV obtenidos a partir de larvas recolectadas en varias regiones de Norte, Centro y Sur América han sido identificados (Barreto et al., 2005; Escribano et al., 1999; Maruniak et al 1984) a la fecha parecen ser variantes de la misma especie de virus. Debido al especial interés en la capacidad del virus como agente de control biológico varios estudios han sido enfocados en la diversidad interespecífica (Barreto et al., 2005, Escribano et al., 1999; Rowley et al., 2010) y la diversidad intrapoblacional (Harrison et al., 2008, Simón et al., 2004), así como en estudios de la ecología de los NPV, donde han sido utilizados como virus modelo de SfMNPV (Simón et al., 2005). La variación genética entre aislamientos de SfMNPV ha sido estudiada por análisis de restricción con endonucleasas de digestión. Inicialmente el genoma completo de SfMNPV fue estimado por construcción de mapas físicos (Simón et al., 2005). Varias variantes genotípicas han sido recuperadas de asilamientos de campo usando técnicas de clonación in vitro en células de insecto (Harrison et al., 2008; Maruniak et al., 1984; Simón et al., 2004). La característica general en estas variantes es la presencia de genotipos con deleción en una región hipervariable específica (1.4 a 16.2 Kb) alrededor del gen egt involucrado en la inactivación hormonal del insecto modificando el desarrollo y aumentando el tiempo de infección y progenie. Harrison y colaboradores (2008) 29 purificaron diferentes variantes genotípicas de un aislamiento de Missouri Estados Unidos, el genotipo puro SfMNPV-3Ap2 mostró un aumento en la velocidad para matar, correlacionado con una deleción que eliminó partes del gen que codifica ecdysteroide UDP-glucosiltransferasa (egt). Deleciones similares fueron observadas en ocho de nueve genotipos clonados de un aislamiento de campo de Nicaragua (SfNIC), algunos de los cuales no fueron infectivos por vía oral (per os) con deleciones que afectaron genes tales como pif-1 y pif-2 (Simón et al., 2004, 2005). Los genotipos individuales ya sean completos o delecionados presentaron baja patogenicidad con respecto al aislamiento nativo o mezclas experimentales de genotipos (López-Ferber et al., 2003; Simón et al., 2005; 2008) sugiriendo que las interacciones entre genotipos incrementan la transmisibilidad de la población de aislamiento nativo. Los primeros análisis de secuencia de SfMNPV se realizaron de regiones parciales de SfMNPV (Maruniak et al., 1999; Simón et al, 2005). Posteriormente se realizó la secuencia del genoma completo de un aislamiento de campo de SfMNPV de Brasil (Wolff et al., 2008) y genomas completos de variantes genotípicas de SfMNPV fueron publicadas. La comparación del genoma de estos SfMNPV mostró alta similitud entre ellos (Harrison et al., 2008; Simón et al., 2012; Wolff et al., 2008). El aislamiento de campo SfMNPV de Nicaragua ha sido evaluado como un potencial biopesticida para el control del gusano cogollero del maíz (Armenta et al., 2003; Cisneros et al., 2002; Moscardi, 1999; Williams et al., 1999). Aplicaciones del virus causan altos niveles de mortalidad en larvas en cultivos de maíz sin afectar poblaciones de enemigos naturales de la plaga (Armenta et al., 2003; Gómez et al., 2013; Williams et al., 1999) y se ha observado que estos aislamientos tienen diferente eficacia hacia poblaciones de S. frugiperda siendo más susceptible a aislamientos nativos (Escribano et al., 1999). 2.3. Pases sucesivos in vivo e in vitro Los pases sucesivos de virus in vivo es una práctica de producción que se ha venido desarrollando de muchos años atrás y en algunos casos se ha estudiado el comportamiento de un virus en un huésped diferente. Los pases sucesivos de un aislamiento de baculovirus en huéspedes alternativos pueden dar como resultado el cambio en su estructura genotípica y por ende cambios en su actividad biológica. En 1985 se realizaron pases sucesivos de Orgya pseudotsugata (Lepidoptera: Lymantriidae) 30 múltiple nucleopoliedrovirus (OpMNPV) en larvas de T. ni (Lepidoptera:Noctuidae) (Martignoni e Iwai, 1986). Inicialmente se observaron síntomas de flacidez o daños en la epidermis de la larva (primero al quinto pase), sin embargo en el sexto pase se observaron lesiones diseminadas, y sólo en el séptimo se observó la presencia de lesiones características de infección por nucleopoliedrovirus como resultado de la adaptación in vivo del virus en un huésped diferente. Al realizar la infección inversa, es decir del virus OpMNPV adaptado a T. ni de nuevo en larvas de O. pseudotsugata, éste conservó sus características de alta virulencia. T. ni ha sido usado como huésped alternativo para otros virus en pases sucesivos. En un trabajo similar, se observó un incremento significativo de la virulencia del nucleopoliedrovirus de Choristoneura fumiferana (CfNPV) cuando se realizaron pases sucesivos en larvas de T. ni, sin embargo, cuando se realizó la infección inversa, en su huésped original de C. fumiferana fue menos virulento (Stairs et al., 1981). En contraste, cuando el nucleopoliedrovirus de A. califórnica (AcMNPV) y el nucleopoliedrovirus de T. ni (TniNPV) fueron sometidos a pases sucesivos en larvas de S. exigua, mostraron un aumento en la virulencia y mayor número de viriones por cuerpo de inclusión (Tompkins et al., 1981). Lo anterior, representa una alternativa para mejorar la virulencia de un inoculo inicial. En pases sucesivos de un virus de AcMNPV en larvas de Plutella xylostella (Lepidoptera: Plutellidae), se encontró que la infectividad del virus hacia P. xylostella aumento 15 veces, además se evidenció un aumento de viriones por cuerpos de inclusión y se observaron cambios en los perfiles de restricción REN (Kolodny-Hirsch, 1997). Este tipo de cambios también se han presentado en pases sucesivos del NPV de H. zea en larvas de H. zea y H. virescens, donde se evidenció mediante perfiles de restricción de ADN genómico, un incremento de bandas submolares en comparación con el aislamiento que no provenía de pases sucesivos, además de pérdida de fragmentos de restricción presentes en el inóculo original (McIntosh e Ignoffo, 1981). Los cambios genotípicos y fenotípicos generados a través de pases sucesivos de virus in vivo, tanto en hospedero original como en otro diferente, sugiere un papel importante del hospedero en el mecanismo para mantener la diversidad genética. El resultado de la multiplicación de pases sucesivos en larva es dependiente de la naturaleza del huésped, considerando condiciones como la presencia de infecciones subletales o persistentes, o de otros agentes infecciosos como parásitos. Escribano y colaboradores (2001) demostraron el efecto de los pases sucesivos de un aislamiento de SfMNPV en larvas 31 libres de agentes infecciosos y parasitadas de Spodoptera frugiperda. La patogenicidad del SfMNPV se redujo en los pases sucesivos de larvas no parasitadas, mientras que en las larvas parasitadas se observó un aumento en la infectividad y la virulencia, posiblemente debido a la competencia intraespecífica, donde el patógeno con tasa de replicación más alta logra una ventaja selectiva sobre las cepas del competidor. Sin embargo, las características fenotípicas y genotípicas a través de pases sucesivos en larva no siempre se presentan de la misma manera. Pases sucesivos en larva de un NPV de A. gemmatalis (AgMNPV) generaron un incremento de la heterogeneidad genética viral (Maruniak et al, 1999), mientras que después de 20 pases sucesivos de un NPV Helicoverpa zea, se observó una alta estabilidad en rasgos fenotípicos (McIntosh e Ignoffo, 1986). Una de las mayores limitantes del uso de la multiplicación de virus in vitro es la aparición de mutantes a través de los pases sucesivos en el cultivo celular, los cuales alteran las características insecticidas del virus. La aparición del fenotipo FP (Few polyhedra) se caracteriza por la disminución de células productoras de cuerpos de inclusión por ende disminución en la producción, disminución del número de viriones ocluidos en los cuerpos de inclusión y aumento en el número de cuerpos de inclusión anormales disminuyendo la virulencia (Slavicek et al, 1992), La multiplicación de un aislamiento de SfMNPV en cultivo celular produjo la aparición de FP a partir del segundo pase realizado (Da Silva et al., 2004), las alteraciones se caracterizaron por cuerpos de inclusión con muy pocos viriones o en algunos casos carecían de ellos. Estas alteraciones se han reportado en AcMNPV, en donde a través de pases sucesivos en cultivo celular aparecen FP y otro fenotipo anómalo DIP (Partículas defectuosas interferentes) que se caracterizan por carecer de genes implicados en la expresión tardía. Además, se ha observado que las deleciones en el genoma en DIP ocurren con mayor frecuencia en regiones con presencia de hr (homologous regions) lo cual sugiere que estos sitios juegan un papel importante en las alteraciones genéticas producidas a través de los pases sucesivos. (Pijlman et al, 2001; Potter et al., 1978). Las alteraciones genéticas que se presentan en los baculovirus después de los pases sucesivos in vitro incluyen deleciones de fragmentos del genoma, inserciones y mutaciones puntuales (Krell, 1996). Las alteraciones genómicas y fenotípicas generadas a través de los pases sucesivos han sido evidenciadas a través de metodologías como microscopia electrónica y electroforesis de campo pulsado PFGE (Giri, et al., 2012) 32 2.4. Cultivo Celular usado en Clonación de Baculovirus Las líneas celulares de insectos han sido usadas con éxito hace más de cuatro décadas, inicialmente se utilizaron células de ovarios inmaduros de Antherea eucalypti (Grace, 1958). Este avance logró establecer las primeras líneas celulares de insectos. A partir de ello Grace logro establecer otras líneas celulares de insectos como lepidópteros, dípteros, ortópteros y coleópteros (Vlak, 2007). Al comienzo se requirió por parte de los investigadores grandes esfuerzos y varias líneas celulares en estudio para elegir las condiciones y las células óptimas para los virus y patógenos de interés. Uno de los mayores avances en esta técnica fue la capacidad de producción de virus recombinantes para la producción de proteínas de interés (Vasconcelos, 2001). Sin embargo, es importante tener en cuenta que la selección de una línea celular para la obtención ya sea de genotipos puros clonados de un virus de interés, así como de proteínas recombinantes, requieren de una línea celular susceptible a los procesos infecciosos virales, tener en cuenta la capacidad de producción de poliedros, así como la capacidad de propagación de virus en las células en el cultivo seleccionado. La replicación de SfMNPV ha sido estudiada en varias líneas presentando resultados satisfactorios en las células Sf9 y Sf21 (Figura 2-4), todo esto teniendo en cuenta los requerimientos básicos del cultivo celular de esta línea entre los que se destaca los requerimientos de nutrientes, la temperatura la producción de desechos tóxicos, entre otros (Elias et al., 2000) Figura 2-4 : Células línea celular Sf9 infectadas con Baculovirus. http://www2.bioc.cam.ac.uk/baculovirus/pics/web.gif 33 Entre las líneas celulares de insectos para el cultivo de baculovirus se encuentran Sf9 derivada de las células IPLB-Sf21-AE provenientes de tejido ovárico de Spodoptera frugiperda. Las células Sf9 se adaptan al cultivo tanto en monocapa como en suspensión y son ampliamente utilizadas para la expresión transitoria o mantenida de proteína recombinante. Su tiempo de duplicación es de 18-30 h. Se mantienen en cultivo en suspensión para la propagación de baculovirus y producción de proteínas recombinantes o cultivo en monocapa para cotransfección o ensayos en placa para la purificación de baculovirus. Estas células pueden ser criopreservadas para posteriores usos. (Dong et al., 2010). Otra línea celular ampliamente utilizada es T. ni células High Five (BTI-TN5B1-4) derivadas de la línea celular de Trichoplusia ni. Estas células son utilizadas para la obtención de proteínas recombinantes cuando se usa el sistema de expresión basado en baculovirus, además, al igual que las Sf9, pueden crecer en medio en cultivos en monocapa, y aunque menos eficientes también en suspensión. 2.5. Spodoptera frugiperda (Lepidoptera: Noctuidae) Spodoptera frugiperda es una de las principales plagas que ataca cultivos como el maíz, se encuentra distribuido en Norteamerica, México, América central, el Caribe y América del Sur (King y Saunder 1984). En Colombia constituye una de las plagas de mayor importancia económica (García et al., 2002). También conocido como “gusano cogollero del maíz” actúa como un gusano trozador, o tierrero, aunque se ha vinculado frecuentemente al daño de los cultivos de maíz, también puede atacar otros cultivos como sorgo, caña de azúcar, algodón, soya, girasol, entre otros. (Posada, 1989). El maíz es uno de los principales cereales de la alimentación humana y se clasifica como el tercer producto agrícola de importancia a nivel mundial. En nuestro país se estima que existen cerca de 547.290 hectáreas con cultivos de maíz lo que lleva a una producción aproximada anual de 1.2 millones de toneladas por año (ICA, 2008). Teniendo en cuenta estas cifras, los daños ocasionados por el ataque de la Spodoptera frugiperda a estos cultivos se estiman en pérdidas importantes, que pueden llegar a una reducción del 34% aproximadamente y específicamente en Colombia las pérdidas pueden llegar a ser incluso de un 60% en este cultivo (ICA, 2008). 34 Dadas estas cifras significativas se hace indispensable un seguimiento constante de los cultivos, ya que el insecto puede pasar de un cultivo a otro. El estadio dañino de S. frugiperda es la larva. El insecto es holometábolo, es decir que su ciclo de vida pasa por metamorfosis completa incluyendo estadio de huevos, larvas (gusano), pupa y estado adulto. (Negrete, 2003). 2.5.1. Ciclo de vida Huevos y postura Se caracterizan por ser de forma globosa con estrías radiales, son de color rosa pálido que cambia a gris a medida que se acerca la eclosión (Figura 2-5). Usualmente las hembras depositan los huevos durante las primeras horas al anochecer y son colocados tanto en el haz como en el envés de las hojas. Estos son colocados en varios grupos y son cubiertos por segregaciones bucales y escamas para protegerlos del medio ambiente (Negrete, 2003). Figura 2-5 :Huevos de Spodoptera frugiperda. http://www.agromonitoreo.com/plagas.html. Larvas Las larvas (gusano) al nacer se alimentan del corion. Es importante esta etapa ya que las larvas tienden a pasar a otras partes de la planta o a plantas vecinas, para evitar la competencia por el alimento. 35 El color de la larva puede variar de acuerdo al alimento sin embargo, en general es de color oscuro con rayas pálidas. Como característica principal tiene en la cabeza una raya blanca en forma de Y invertida. Las larvas pasan por aproximadamente 6 a 7 estadios o mudas (Figura 2-6), sin embargo, son los primeros estadios los de mayor importancia ya que es donde producen mayor daño a la planta por lo tanto las medidas de control son más efectivas cuando se realizan en estos estadios (Negrete, 2003; Pérez, 1999). Figura 2-6 : Larva Spodoptera frugiperda en diferentes estadios. http://extension.entm.purdue.edu/fieldcropsipm/insects/fall-armyworm.php Pupas Esta fase ocurre en el suelo, el insecto se encuentra en reposo y pueden pasar de 8 a 10 días, son de color café, pasado este tiempo, emerge la polilla (Figura 2-7). Ya adultas son capaces de permanecer entre la hojarasca o incluso desplazarse varios kilómetros ayudadas por vientos fuertes. Las hembras oviposicionan después de 4 a 5 días de vida (Negrete, 2003). Figura 2-7 : Pupa y Adulto de Spodoptera frugiperda. http://www.programamri.com/notas/16/Claves-para-un-buen-manejo-del-Maíz. 36 2.5.2. Daño causado a la planta. En su estadio de larva la Spodoptera frugiperda puede realizar diferentes tipos de daño a la planta (Figura 2-8) como son: Esquelitización de las hojas: Este daño lo realiza en los dos primeros estadios, se caracteriza por realizar un raspado de la hoja solo por un lado de la misma y dejando manchas de color blanco y semitransparente (Aponte y Morillo, 1987) Daño como cortador Aproximadamente 15 días después de emerger las larvas producen un efecto de corte en el tallo de la planta y en las hojas (Aponte y Morillo, 1987). Daño como cogollero Usualmente las larvas viven protegidas dentro del cogollo alimentándose del tejido tierno, lo que causa destrozos en el caso del maíz en la mazorca, ocasionando agujeros de tamaño y forma irregular en las hojas y reduciendo así su área fotosintética. Figura 2-8 Daño causado en la planta, http://extension.entm.purdue.edu/fieldcropsipm/insects/fall-armyworm.php 37 2.6. Control Biológico El control biológico es una alternativa ecológica. En la actualidad se conocen diferentes microorganismos con características potenciales para ser usados como biopesticidas, entre ellos se encuentra varias especies de hongos, protozoarios, nematodos y virus dentro de los que se encuentran los baculovirus. Muchos de estos entomopatógenos tienen su mayor eficacia cuando son aplicados en los estadios tempranos de la larva. (Caballero et al. 2009). Los baculovirus juegan un rol importante en los ecosistemas actuando como agente supresor sobre una gran variedad de insectos por ejemplo sobre la polilla gitana en Norte América donde es considerado uno de los principales controladores de densas poblaciones de esta polilla. También se encuentran naturalmente controlando insectos plagas de cultivos de importancia agrícola para el hombre. Por tanto una vez conocido el papel de estos virus en el control de poblaciones naturales de insectos, han tomado gran importancia para ser considerados como biocontroladores de insectos, particularmente de plagas que atacan cultivos de importancia agrícola (Podgwaite, 1981) Otra ventaja de los baculovirus usados como agentes biocontroladores es que los cuerpos de inclusión generados en cada ciclo infectivo, pueden durar en el ambiente por años sin ser afectados, aunque su viabilidad puede variar ante algunas condiciones del medio como lo son la humedad, la temperatura del ambiente, el pH. En la actualidad un factor muy estudiado que afecta en alta proporción los cuerpos de inclusión en el ambiente son los rayos UV, por lo que se están utilizando agentes fotoprotectores para la formulación de baculovirus entre los que se encuentran abrillantadores ópticos, dióxido de titanio, entre otros. Otra de las ventajas de los baculovirus en el control biológico es que no afectan a otras especies que se encuentren en el medio donde se aplica, son especie- específicos por lo que se ha demostrado que no ejercen algún peligro para otras especies como aves, abejas, peces, incluso enemigos naturales de las larvas infectadas como depredadores (Szewczyk, 2006) El uso excesivo de los insecticidas químicos de amplio espectro y en dosis que duplican la recomendada, muchos de ellos en categorías toxicológicas I y II, han hecho que se evalúe el impacto ambiental y en la salud humana, además de generar resistencia en los insectos en los que se aplica. (Corpoica, 2011). 38 Los biopesticidas en estudio buscan sustitutos y nuevas alternativas al uso de los insecticidas químicos, para disminuir al máximo los problemas que se presentan como resistencia y acumulación de residuos tóxicos en el medio ambiente. Estos biopesticidas deben cumplir con características como ser de precio accesible, efectividad en campo y de fácil producción a gran escala. Algunos productos a base de SfMNPV han sido desarrollados para control del gusano cogollero del maíz. Una formulación de polvo mojable fue evaluada en condiciones de campo con alta mortalidad de larvas en Brasil (Valicente y Da Costa, 1995) y una formulación acuosa fue evaluada en cultivos de maíz en Honduras y México (Williams et al, 1999). Recientemente una variante genotípica con alta mortalidad en menor tiempo fue formulada por encapsulación para proveerle protección contra rayos UV y evaluada en campo en cultivos de col, presentando una mejora en la duración de la eficacia (Behle y Popham, 2012) En Colombia se ha estudiado el uso de un aislamiento nativo de SfMNPV (NPV003) proveniente de Córdoba con resultados satisfactorios en campo con una eficacia superior al 80% (Gomez et al., 2013). Además una variante genotípica de este aislamiento colombiano ha mostrado características superiores de patogenicidad con respecto al aislamiento nativo, lo que la convierte en una opción promisoria para el desarrollo de un bioplaguicida (Barrera et al., 2013). Sin embargo, los costos de producción en campo superan en un 40% a los de uso de un bioplaguicida químico, por lo que deben ser estudiadas metodologías en producción y en mejores características del virus como principio activo que puedan generar reducción en los costos. Varias aproximaciones se han hecho para el uso de baculovirus de rápida acción tales como el desarrollo de virus recombinantes. Estos virus pueden expresar toxinas específicas (Inceoglu et al., 2001), hormonas (Elvira et al., 2010) o enzimas (Gramkow et al., 2010). Sin embargo la aversión publica a la liberación de organismos genéticamente modificados (Szewczyk et al., 2006) ha focalizado la búsqueda de nuevos aislamientos o genotipos del virus con mejores características fenotípicas. Además se ha estudiado el uso natural de genotipos con características de mortalidad en menor tiempo (Behle y Popham., 2012) 39 3. MATERIALES Y METODOS 3.1. Insectos Se utilizaron larvas de Spodoptera frugiperda provenientes de la cría del Laboratorio de Control Biológico de CORPOICA, la colonia de insectos es refrescada periódicamente con insectos colectados en campo. Esta cría de insectos fue mantenida en condiciones controladas a 25°C y 75% de humedad relativa (HR), con un fotoperiodo de 16 horas luz y 8 horas en la oscuridad. Las larvas se alimentaron con dieta semisintética (Greene et al., 1976). 3.2. Aislamento viral y multiplicación Se utilizó el aislamiento colombiano NPV003 de SfMNPV proveniente de la colección de microorganismos del Laboratorio de Control Biológico de la Corporación Colombiana de Investigación Agropecuaria, CORPOICA. Para la multiplicación del virus se infectaron por vía oral larvas de tercer estadio de S. frugiperda, con una suspensión de cuerpos de inclusión en concentración 1x108 CI/ml (Hughes y Wood, 1981) y recolectando las larvas muertas que presentaran síntomas característicos de infección por el virus, que incluyen baja movilidad, tegumento frágil o coloración parda. Los CI provenientes de las larvas muertas se purificaron de acuerdo con la metodología propuesta por Caballero (1992). El pellet obtenido se suspendió en dos volúmenes de agua milli-Q, se determinó la concentración utilizando Cámara de Neubauer, bajo microscopio óptico (400x). Los cuerpos de inclusión purificados se almacenaron a 4°C. 3.3. Obtención de variantes genotípicas Para la obtención de las variantes genotípicas in vitro se realizó el cultivo de células de la línea Sf9 de Spodoptera frugiperda, las cuales fueron mantenidas a 28°C en medio de 40 cultivo TC100 suplementado con 10% de suero fetal bovino (FSC, Gibco) y antibióticos (Penicilina/Estreptomicina, Gibco).(Figura 3-1) Figura 3-1 : Crecimiento cultivo celular línea Sf9. Laboratorio cultivo celular CORPOICA. Se infectaron larvas de S. frugiperda en estadio L3 por el método de la gota descrita por Hughes y Wood (1981), con una concentración del virus de 1x10 8 CI/ml. Se realizó extracción de hemolinfa y se utilizó para infectar células de la línea Sf9.(Figura 3-2) La infección se realizó en placas de 6 pozos con 7,5x106 células por pozo en medio TC100 suplementado con penicilina/estreptomicina al 1%. Antes de realizar la infección, las células se dejaron por una hora para permitir completa adhesión a la placa. El volumen de hemolinfa extraído de cada grupo de larvas infectadas se filtró por membrana de 0.45µm estéril, y se realizaron diluciones seriadas 1/10 con medio completo (TC100SFB y antibiótico) y se utilizaron 110 µl de cada dilución (3 diluciones) para la infección de cada pozo de células. Figura 3-2 : Extracción de Hemolinfa de larvas infectadas. 41 Después de 1 hora se retiró el inóculo, y se adicionaron 3ml de medio TC100 suplementado con suero fetal bovino 5% (Gibco), agarosa sea plaque 3% y penicilina/estreptomicina al 1% (Figura 3-3). Después de la solidificación de la agarosa, se adicionó 1 ml de medio. Después de 5 días de incubación a 27°C se buscaron células infectadas individuales mediante un microscopio invertido, las cuales fueron recuperadas mediante succión con una pipeta automática. Cada muestra se disolvió en 0,1 ml de PBS (phosphate buffered saline)1X. . Figura 3-3 : Placa de 6 pozos con células Sf9 para infección . Para amplificar los clones obtenidos a partir de células infectadas individualmente, se realizó inyección intrahemocélica de la suspensión de cada clon en 10 larvas de S. frugiperda de tercer estadio (Figura 3-4), Pasados 5 días se recogieron las larvas muertas que presentaran sintomatología característica de infección por el virus, se reunieron en un vial por clon, se maceraron y se realizó purificación de CIs con la metodología descrita por Caballero y colaboradores (1992). Se realizó extracción de ADN a partir de los CIs purificados y se realizó la digestión del ADN genómico con la enzima de restricción PstI (Providencia stuartii I). Figura 3-4 : Inyección intrahemocélica en larva. 42 3.4. Purificación de Cuerpos de Inclusión, extracción de ADN viral y análisis de restricción La purificación de los CIs se llevó a cabo a partir de las larvas muertas obtenidas tras la infección por inyección intrahemocélica con cada clon. Las larvas muertas se maceraron, y filtraron a través de muselina para eliminar los restos de tegumento de las mismas. Los CIs se lavaron dos veces con SDS (sodium dodecil sulfate) 0,1% y dos veces con agua milli-Q. Finalmente los CIs se suspendieron en agua ultrapura para su almacenamiento a 4ºC. La extracción de ADN a partir de los CIs se realizó utilizando la metodología descrita por Barrera y colaboradores (2011). Para disolver la matriz proteica de los CIs se mezclaron 100 µl de la suspensión purificada de cada virus con 100 µl de Na 2CO3 0,5 M, 50 µl de SDS 10% en un volumen final de 500 µl se incubó la mezcla 10 minutos a 60ºC. Tras este paso se centrifugó la preparación a 8.000 rpm durante 5 minutos para separar así los CIs sin disolver. Finalmente se recuperó el sobrenadante con los viriones. El sobrenadante se incubó con 25 µl del proteinasa K (20 mg/ml) durante 45 minutos a 50ºC. El ADN viral liberado fue sometido a extracción con dos pases de fenol saturado y con un pase de cloroformo, luego se precipitó con etanol puro frío y acetato de sodio 0,3M y se centrifugó la muestra a 13.000 rpm durante 5 minutos. El ADN precipitado se sometió a un pase último con etanol al 70% y se centrifugó a 8.000 rpm durante 5 minutos. Finalmente, el pellet se suspendió en 50-100µl de buffer TE (Tris-EDTA). La concentración de ADN se estimó por absorbancia espectofotrométrica a 260 nm de longitud de onda (ND1000-Thermo Scientific) Para el análisis del perfil de restricción, 2µg de ADN genómico se digirieron con 1,5 U de la enzima de restricción PstI. La reacción se incubó 6 horas a 37°C. Se realizó electroforesis horizontal utilizando un gel de agarosa 1000 (Invitrogen) al 1% en buffer TAE (0.04M tris acetato, 0.001M EDTA, pH 8.0) a 22V de 18-20 h. Los fragmentos de ADN se tiñeron con bromuro de etidio y se visualizaron en transiluminador U.V. Se realizó observación del gel en documentador Che-midoc BioRad para la observación del patrón de bandas de las variantes genotípicas obtenidas. 43 3.5. Caracterización biológica de variantes genotípicas La actividad insecticida de las variantes genotípicas se comparó con el aislamiento nativo NPV003. Se determinó la patogenicidad por medio de la concentración letal media (CL50) y la virulencia a través del tiempo medio de mortalidad (TMM). Para determinar la concentración letal media (CL50) se infectaron larvas de S. frugiperda de segundo estadio mediante el método de la gota descrita por Hughes y Wood (1981), donde las larvas son infectadas por vía oral. Para ello, previo a la infección, las larvas se dejaron en ayuno por 12 horas a 26ºC en envases individuales, posteriormente se les suministró una gota de suspensión viral que contenía 10% de sacarosa, 0.001% de Fluorella Blue y CIs de cada una de las variantes genotípicas en las concentraciones 1.2x106, 2,4x105, 4,8x104, 9,6x103 y 1,9x103 CI/ml. Este rango de concentraciones fue determinado previamente por causar la mortalidad entre el 5 y el 95% de la población (Barrera et al., 2011). Las larvas que habían ingerido el virus adquirieron una coloración azul debido a la presencia de Fluorella blue (Figura 3-5). Figura 3-5 : Infección viral de larvas por método de la gota. Las larvas infectadas se trasladaron a envases individuales que contenían dieta semisintética, los cuales se dispusieron en cajas de plástico en grupos de 24 larvas por cada concentración viral (Figura 3-6). Cada ensayo se montó por triplicado y contó con un grupo control de 24 larvas que ingirieron la solución acuosa sin virus. Las larvas se mantuvieron bajo condiciones controladas de laboratorio a 25°C y 75% de HR. La mortalidad se registró cada 7 días hasta el estadio de pupa. Los datos obtenidos fueron sometidos a un análisis probit utilizando el programa Polo plus (Leora-Software, 1987). 44 Figura 3-6 : Unidades experimentales de bioensayos. Para la evaluación de la virulencia en términos de TMM se infectaron larvas de segundo estadio usando la misma metodología descrita anteriormente, con una concentración única (CL90) determinada en el ensayo de concentración letal media, la cual causa la mortalidad del 90% de la población. La mortalidad se registró cada 8 horas hasta el estadio de pupa. Los datos de mortalidad se sometieron a un análisis de supervivencia Weibull con el programa estadístico GLIM (Crawley, 1993). 3.6. Pases de multiplicación viral Las variantes genotípicas denominadas Sf-C1 y Sf-C2 obtenidas después de su multiplicación por vía oral en larvas de tercer estadio de S. frugiperda a partir de NPV003 se consideraron como pase 0 (P0). A partir de los CIs de los P0 se realizó la multiplicación infectando aproximadamente 150 larvas de tercer estadio con una concentración de 1x107 CIs/ml por el método descrito por Hughes y Wood (1981), el cual fue considerado como pase 1 (P1). El procedimiento se repitió hasta el pase 5 (P5). 3.7. Determinación de infecciones encubiertas de SfMNPV en cría de insectos Para asegurar que las larvas utilizadas en la multiplicación de pases sucesivos de las variantes genotípicas no tenían una infección previa por nucleopoliedrovirus de S. frugiperda, se realizó la detección de SfMNPV mediante la técnica de PCR en tiempo real o PCR cuantitativa (Q-PCR) descrita por Barrera y colaboradores (2012). Se utilizó una 45 sonda de hibridación específica para el gen de poliedrina marcada con HEX (Sonda Taqman) y una pareja de cebadores diseñados sobre el mismo gen (Barrera et al., 2012). De la población de larvas utilizadas para la multiplicación de cada pase de las variantes genotípicas, se tomaron 6 larvas al azar, las cuales se maceraron en un tubo de 15 ml, con 200 µl de agua ultrapura estéril. Posteriormente, cada muestra se centrifugó a 3.500 rpm por 5 minutos, se recuperó el sobrenadante y se sometió a un proceso de denaturación a 98°C por 5 minutos. La reacción de PCR se realizó a un volumen final de 25 µl así: 2U de Taq polimerasa, dNTPs 200 µM, 0,5 µM de cebadores, MgCl2 2.0 µM, Buffer 10X, sonda HEX 0,35 µM y 5 µl de la suspensión del sobrenadante obtenido de las larvas maceradas. Cada reacción se montó dos veces, utilizando como control ADN del aislamiento NPV003.Cada corrida se realizó utilizando una curva patrón desarrollada por Barrera y colaboradores (2012), la cual se diseñó con 6 concentraciones de ADN plasmídico con un inserto del gen de poliedrina. Las condiciones de amplificación fueron las siguientes:. Tabla 3-1 Condiciones de amplificación de Q-PCR:. Paso Temperatura (°C) Tiempo Ciclos Denaturalización inicial Denaturalización 95 95 3 min 10 seg 1 Anillamiento Extensión 56 72 45 seg 30 seg 35 Paso final 8 1 min 1 3.8. Caracterización morfológica de los cuerpos de inclusión. Para el análisis morfológico de los CIs de las variantes genotípicas Sf-C1 y Sf-C2, se realizaron suspensiones de los virus a una concentración de 1x10 6 CI/ml. Se colocaron 10 µl de cada suspensión viral en lámina portaobjeto cubierta con laminilla para su observación en microscopio de luz. Mediante el programa NIS-elements (Nikon, versión 4.0) se midió el diámetro de 200 CI de cada variante genotípica. Adicionalmente, los CIs de cada variante se analizaron mediante microscopia electrónica de barrido, para lo cual los CIs se fijaron con una solución de Glutaraldehido al 3%, se recuperaron en 46 membrana de filtración de 0.22µm y se recubrieron con oro. Las muestras se observaron en un microscopio electrónico de barrido (Philips SEM 515). 3.9. Análisis de restricción de los cuerpos de inclusión de pases sucesivos. A partir de los CIs obtenidos de cada pase de multiplicación en larva de las variantes genotípicas Sf-C1 y Sf-C2 se realizó la extracción de ADN como se describió anteriormente. Se digirieron 2 µg de ADN genómico con la enzima de restricción PstI a 37°C por 6 horas. Las restricciones se compararon con la digestión del ADN genómico del aislamiento silvestre NPV003, mediante geles de agarosa 1000 (Invitrogen) al 1%, corridos a 24V por 12 horas. La visualización se realizó utilizando bromuro de etidio y luz ultravioleta. 3.10. Análisis de la región variable entre variables genotípicas de SfMNPV mediante electroforesis de campo pulsado. Teniendo en cuenta que la región variable entre variantes genotípicas y entre aislamientos silvestres de SfMNPV ha sido previamente descrita entre los marcos abiertos de lectura (ORF Open Reading Frames) sf20 y sf31 (Barrera et al., 2011; 2013; Harrison et al., 2008; Simón et al, 2005), se diseñaron una pareja de cebadores en esta región. El cebador directo se diseñó sobre la secuencia del gen de catepsina (CathF: 5´CGCCAGTTCGTTAATCATACCG -3´) y el cebador reverse se diseñó sobre la secuencia del gen pkip-1 (PkipR: 5´-CCAACAAGGCAACGTTTTCG-3). La reacción de PCR se realizó como sigue: 2U de Taq polimerasa platinum (Invitrogen), Buffer de reacción 1X, dNTPs 200µM, cebadores 0,5 µM, MgSO4 2 mM y 50-100ng de ADN genómico en un volumen final de 15 µl. 47 Las condiciones de amplificación fueron las siguientes: Tabla 3-2 Condiciones de amplificación de la PCR. Paso Temperatura (°C) Tiempo Ciclos Denaturalización inicial Denaturalización Anillamiento Extensión Extensión final 94 92 58 68 68 4 min 10 seg 15 seg 13 min 10 min 1 35 1 Los amplimeros se visualizaron en gel de agarosa al 0,8% y se corrieron a 80V por 4 horas. Los productos de amplificación de la región variable de cada pase de las variantes genotípicas Sf-C1 y Sf-C2, fueron corridos en electroforesis de campo pulsado (PFGE) para obtener una mayor resolución y separación de fragmentos de gran tamaño (aproximadamente 12000pb). Se determinó la concentración de los amplimeros obtenidos en el nanodrop (ND1000Thermo Scientific). La electroforesis se corrió en un gel de Agarosa SeaKem Gold SKG al 1% en buffer TBE (Tris, borato y EDTA) 0,5X. Las condiciones de corrido incluyeron un voltaje 6V/cm, un pulso inicial 2 segundos, un pulso final 10 segundos, ángulo de corrida 120°, con un tiempo de corrida de 5 horas. Una vez terminado el tiempo de corrida de la electroforesis se realizó la tinción del gel por inmersión en una solución de bromuro de etidio al 10%, durante 1 hora. Luego se procedió a realizar la captura de la imagen en documentador Che-midoc BioRad 3.11. Caracterización biológica de los pases sucesivos de variantes genotípicas Los CIs obtenidos de cada pase se evaluaron mediante ensayos de actividad biológica para determinar concentración letal media y tiempo medio de mortalidad como se describió anteriormente 48 4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 4.1. Obtención de variantes genotípicas y multiplicación El cultivo de células de insectos lepidópteros se implementó hace más de 3 décadas y es una herramienta de gran utilidad para el estudio de los Baculovirus. (Miller y Friesen, 1996; Hink, 1979). En el presente trabajo, células Sf9 (clon de línea IPLB-Sf21-AE de ovario de Spodoptera frugiperda) fueron infectadas con un aislamiento colombiano del nucleopoliedrovirus de Spodoptera frugiperda (NPV003) (Gómez et al., 2010). A partir del cultivo se recuperaron 52 células individuales con infección, las cuales fueron consideradas como clones de genotipos (Figura 4-1). Después de la inyección vía intrahemocélica en larvas de tercer estadio de S. frugiperda, 38 clones se multiplicaron satisfactoriamente, sin embargo 14 no causaron infección en las larvas. Lo anterior posiblemente debido a que la concentración de partículas infectivas no fue suficiente para instaurar una infección en una larva de tercer estadio, donde la susceptibilidad de las larvas a la infección disminuye en estadios avanzados (Williams y Cisneros, 2001). Adicionalmente, el genoma de algunas variantes genotípicas se caracteriza por la presencia de deleciones, las cuales pueden localizarse en regiones que pueden afectar genes necesarios para la infección en el insecto y que en el cultivo celular no afecten su replicación (Barrera et al., 2013; Simón et al., 2004), por lo tanto se conto con 24 clones. Autores como Dai y colaboradores (2001) hacen referencia a que los baculovirus obtenidos por medio de procesos in vitro se adaptan rápidamente al cultivo celular y pierden genes necesarios para su supervivencia en el medio ambiente, por lo que los CIs pueden presentar perdida en su patogenicidad. Sin embargo se ha descrito que esta condición sucede en baja proporción en la obtención inicial del clon y aumenta a través de pases sucesivos del virus en cultivo celular (Krell, 1996; Rhodes, 1996). 49 Figura 4-1 : Infección viral en cultivo celular línea Sf9 de variantes genotípicas 4.2. Perfiles de restricción de variantes genotípicas Mediante el análisis de los perfiles de restricción del ADN genómico de los 24 clones con la endonucleasa PstI, se seleccionaron dos variantes genotípicas, las cuales se denominaron Sf-C1 presente en 12 clones y Sf-C2 presente en 7 clones, 5 de los clones presentaron perfiles con bandas submolares lo que sugería mezclas de variantes. La variante Sf-C1 presentó un perfil de restricción igual al aislamiento nativo NPV003, mientras que Sf-C2 (Figura 4-2) presentó diferencias en número y tamaño de bandas generadas en su perfil, con ausencia de 2 bandas presentes en Sf-C1, una de aproximadamente 3.500 pb y otra de 2.900 pb. Por otra parte, la variante Sf-C2 presentó una banda adicional de aproximadamente 9.000 pb Figura 4-2 : Perfil de restricción de ADN genómico Carril 1 Marcador de Peso Molecular 1 Kb plus, Carril 2 Control Aislamiento Nativo NPV003, Carril 3 variante genotípica Sf-C1 Carril 4 variante genotípica Sf-C2.(La estrella roja indica las bandas ausentes, la flecha verde la banda adicional) 50 La estimación del tamaño de las variantes se realizó teniendo en cuenta el tamaño de las bandas generadas en la restricción con PstI, donde el tamaño estimado del genoma de la variante Sf-C2 fue menor que el de la variante Sf-C1, lo cual sugiere que Sf-C2 es una variante que presenta una deleción de su genoma (aproximadamente de 10 Kb) dentro del aislamiento silvestre. Estudios similares, realizados con variantes genotípicas recuperadas de aislamientos silvestres del nucleopoliedrovirus de S. frugiperda provenientes de diferentes regiones, muestran la presencia de variantes con deleciones de diferentes tamaños (Barrera et al., 2013; Harrison et al., 2008; Simón et al., 2005). Además, en variantes genotípicas de SfMNPV de Nicaragua y Colombia se encontraron variantes con perfil de restricción idéntico al aislado silvestre. Estos trabajos demostraron mediante análisis de PCR cuantitativo que las variantes con perfil similar al aislamiento silvestre de origen son las de mayor proporción en el mismo (Barrera et al., 2013; Simón et al., 2005). Simón y colaboradores comprobaron que la variante B con un perfil similar al aislamiento silvestre es la variante genotípica mayoritaria en SfNIC (Simón et al., 2005) y de manera similar, Barrera y colaboradores demostraron que la variante SfCOL-A con perfil similar al aislamiento silvestre SfCOL fue la de mayor proporción (Barrera et al., 2013). El perfil de restricción de Sf-C1 sugiere que esta variante se encuentra en mayor proporción en la mezcla natural de NPV003, por lo cual representa el perfil dominante en el aislamiento silvestre. 4.3. Caracterización biológica de las variantes genotípicas. Teniendo en cuenta que las diferencias genéticas entre variantes de un aislado silvestre pueden reflejarse en diferencias en su actividad insecticida, se realizó la evaluación de la patogenicidad y la virulencia de las variantes Sf-C1 y Sf-C2. La patogenicidad de la variante Sf-C1 en términos de concentración letal media fue de 1,1x105, 2,5 veces superior al aislamiento nativo NPV003, mientras que la CL50 de la variante Sf-C2 fue de 1,4x106, significativamente inferior al aislamiento nativo NPV003 (P<0,05) (Tabla 4-1). En cuanto a la virulencia, medida en términos de tiempo medio de mortalidad, la variante Sf-C1 presentó un tiempo medio de mortalidad de 107 horas, 51 mientras que la variante Sf-C2 presentó un TMM de 110 horas, siendo similares al asilamiento NPV003. Tabla 4-1 Valores obtenidos de concentración letal media CL 50 y TMM de las variantes genotípicas Sf-C1 y Sf-C2 Virus CL50 Potencia Límites de confianza TMM Límites de confianza Relativa (95%) (h) (95%) (CIs/ml) Inferior NPV 003 2.8x10 5 5 Sf-C1 1.1x10 Sf-C2 1.4x106 Superior Inferior Superior 1 2,5 5 1.8x10 7.4x104 5 4.9x10 1.7x105 112 107 106 102 1119 113 0.20 6.4x105 4.7x106 110 101 119 Trabajos previos con variantes genotípicas clonadas a partir de aislamientos silvestres de SfMNPV muestran diferencias fenotípicas entre ellas (Simón et al., 2004, 2005, Barrera et al., 2013; Harrison et al., 2008). Las variantes con deleciones genómicas más grandes fueron significativamente menos patogénicas que las demás variantes (Simón et al., 2004, 2005 Barrera et al., 2013). Lo anterior sugiere que la menor patogenicidad de la variante Sf-C2 puede ser debida a la deleción del genoma. Algunas variantes genotípicas de SfMNPV presentan deleciones que incluyen genes que ayudan a instaurar una infección primaria denominados genes pif (Per os infectivity factors), cuando la infección ocurre en el intestino medio de la larva, como es el caso de variantes genotípicas de SfNIC (Simón et al., 2005). La capacidad de infectar larvas por vía oral de las variantes genotípicas Sf-C1 y Sf-C2 quedó demostrada en la realización de los ensayos de actividad biológica, sugiriendo que la deleción presente en Sf-C2 no afecta los genes pif. En trabajos similares, todas las variantes genotípicas recuperadas de aislamientos de SfMNPV fueron infectivas por vía oral (Barrera et al., 2013; Harrison et al., 2008). Sin embargo, las deleciones genómicas en todas las variantes genotípicas de SfMNPV se concentran en la misma región variable, que incluye principalmente genes de función auxiliar como quitinasa, catepsina, gp37 y el gen egt (ecdisteroide UDPglucosiltransferasa) (Barrera et al., 2013; Harrison et al., 2008; Simón et al., 2004, 2005). La deleción de estos genes no impide la replicación viral, sin embargo afecta la actividad biológica del virus y su transmisibilidad en el ambiente (Barrera et al., 2013). La quitinasa y la catepsina actúan conjuntamente para lograr la licuefacción de las larvas cuando la infección está en estados avanzados (Vieira et al., 2012) mientras que el gen gp37 ha 52 sido relacionado con la formación de poros en la membrana peritrófica del intestino medio del insecto, lo cual contribuye en la instauración de la infección primaria (O’Reilly, 1997). Por su parte el gen egt ha sido relacionado con bloqueo de procesos hormonales dentro de la larva que hace que su cambio de estadio sea más lento, por lo tanto el tiempo de infección es mayor aumentando la progenie viral (Simón et al., 2012). 4.4. Determinación de infecciones encubiertas de SfMNPV en la cría de insectos Para verificar que la población de larvas usadas en la multiplicación in vivo de cada variante genotípica se encontraba libre de infección por nucleopoliedrovirus, grupos de 6 larvas se utilizaron para la detección de un fragmento del gen de poliedrina mediante una PCR cuantitativa utilizando un diseño de sonda Taqman. La prueba se validó teniendo en cuenta los valores de concentración conocidas de una curva patrón con 6 muestras de ADN plasmídico con un inserto del gen de poliedrina (Scott, 2006). Las muestras identificadas como P1-C1 al P5-C1 hacen referencia a las muestras de la población de larvas utilizadas para la multiplicación de los pases de la variante genotípica Sf-C1, mientras que las muestras identificadas de P1-C2 a P5-C2 hacen referencia a las muestras de la población de larvas usadas para la multiplicación de los pases de la variante genotípica Sf-C2. No se observó señal de amplificación en ninguna de las poblaciones analizadas, indicando que las poblaciones se encontraban libres de infecciones subletales por nucleopoliedrovirus. Cabodevilla y colaboradores (2011), describieron la presencia de infecciones subletales en una colonia de insectos de S. exigua mediante la amplificación cuantitativa del gen de poliedrina. Larvas de S. exigua con infecciones subletales de nucleopoliedrovirus de S. exigua, fueron 2,3 a 4,4 veces más susceptibles a una nueva infección que las larvas de una cría sana (Cabodevilla et al., 2011). Además, la coinfección de dos aislamientos virales en un mismo hospedero puede producir eventos de recombinación entre ellos (Barrera et al., 2011; Cory y Myers, 2003), lo cual puede afectar la actividad insecticida de los aislamientos después de su multiplicación in vivo. Los resultados obtenidos demuestran que las larvas de S. frugiperda utilizadas en la multiplicación sucesiva de las variantes genotípicas, no presentaron una infección previa por nulcleopoliedrovirus que pudiese modificar el fenotipo obtenido. 53 4.5. Caracterización morfológica de los cuerpos de inclusión El análisis de las partículas virales de las variantes genotípicas Sf-C1 y Sf-C2 mostraron CIs con la morfología característica de poliedro (Figura 4-3). El tamaño de los CIs varió en un rango entre 1,68 y 2,52 para la variante Sf-C1 (N=200) con un valor promedio de 2,0 µm, mientras que la variante genotípica Sf-C2 presentó un tamaño promedio de CI de 1,8 µm con un rango entre 1,56 y 2,46 µm (N=200). No se observaron diferencias significativas entre las dos variantes (P<0.05). 1 2 Figura 4-3 1 Fotografía cuerpos de inclusión microscopia de luz, 2. Fotografía cuerpos de inclusión microscopio electrónico de barrido Las diferencias en los tamaños de partículas de los CIs pueden relacionarse en ocasiones con variantes genotípicas que presentan deleciones. Un estudio reciente con SfMNPV evidenció que el tamaño de los CIs presentaba un aumento de diámetro hasta de un 18% con respecto al virus completo cuando había deleción del gen sf32, se determinó que las alteraciones estaban relacionadas con funciones del gen en el proceso de empaquetamiento o de oclusión del virus, lo que originaba CIs físicamente mas grandes por un aumento significativo de nucleocápsides en cada CI pero una menor producción en el número de CIs dando como resultado una menor tasa de infectividad (Beperet et al., 2013). Tompkins y colaboradores en 1981 encontraron una disminución significativa en el tamaño de los cuerpos de inclusión de AcMNPV luego de ser sometida a pases por larvas de S. exigua, sin embargo el tamaño no varió cuando se realizó el pase en larvas 54 de T.ni, al observar al microscopio electrónico los cuerpos de inclusión se encontró que AcMNPV-Se contenía un número menor de viriones con respecto a los de AcMNPV – Tn. 4.6. Perfiles de restricción REN de los pases sucesivos Los ADNs genómicos de los CIs obtenidos después de cada pase de multiplicación de las variantes genotípicas Sf-C1 y Sf-C2 se sometieron a digestión con la enzima de restricción PstI y se visualizaron en un gel de agarosa (Figuras 4-4, 4-5). El perfil de restricción de los pases sucesivos de Sf-C1 comparados con el aislamiento nativo NPV003, mostró que a través de los pases 1 y 2 no se presentó ningún cambio en el patrón de bandas y fue igual al aislamiento NPV003. A partir del pase 3 se observa la ausencia de una de las bandas cuyo tamaño es cercano a 2900 pb. Esta característica también se observó en los pases 4 y 5. Figura 4-4 Perfil de restricción de pases sucesivos 1 a 5 de Sf-C1 Carril 1 Aislamiento nativo NPV 003, Carril 2 Pase 1, Carril 3 Pase 2, Carril 4 Pase 3, Carril 5 pase 4, Carril 6 pase 5, Carril 7 Marcador de peso molecular 1Kb plus (invitrogen), la estrella roja indica la presencia de banda de 2900 pb en NPV003 y P1 y P2 55 El perfil de restricción de la variante Sf-C2 se mantuvo a través de los pases sucesivos de multiplicación in vivo y presentó diferencias respecto al perfil del aislamiento silvestre NPV003, como se describió anteriormente (Figura 4-5). Figura 4-5 . Perfil de restricción de pases sucesivos 1 a 5 de Sf-C2 Carril 1 Marcador de peso molecular 1Kb plus (invitrogen), Carril 2 Pase 1, Carril 3 Pase 2, Carril 4 Pase 3, Carril 5 pase 4, Carril 6 pase 5, Carril 7 Aislamiento nativo NPV 003. La estrella roja marca las bandas ausentes en Sf-C2, la flecha verde marca la banda adicional en Sf-C2. Simón y colaboradores (2010) encontraron deleción durante los pases sucesivos de SfMNPV de regiones genómicas que no son esenciales, sugiriendo que presumiblemente esto ocurra por que no es una ventaja adaptativa para el virus mantener esas secuencias. Se ha descrito que las variaciones en pases sucesivos en larva tanto fenotípicas como genotípicas pueden tener diferentes orígenes, uno de ellos es la naturaleza del huésped, esto debido a condiciones o infecciones subletales (Fuxa et al., 2002) que pueden alterar la estructura genética del virus a través de los pases sucesivos, sin embargo en este caso al realizar los pases sucesivos de Sf-C1 las larvas no presentaban infecciones subletales por nucleopoliedrovirus lo que fue comprobado por medio de Q-PCR. Otra 56 posibilidad pudo ser la presencia de una infección latente, con otro tipo de virus por ejemplo granulovirus Smith y Summers (1978) obtuvieron luego de clonación y purificación en placa distintas variantes genotípicas de AcMNPV identificadas por medio de pérfiles de restricción. A través de pases sucesivos en T.ni encontraron que sus características genotípicas fueron estables en un número limitado de pases. En cuanto al perfil de restricción de los pases sucesivos de la variante Sf-C2, variante con deleción, no se observaron cambios en los pases obtenidos, algunos autores como Lopez-Ferber (2003), describen que estas variantes delecionadas poseen una ventaja replicativa sobre los de genoma completo, o que se valen de ellos para realizar su proceso de replicación, otros comportamientos descritos para variantes delecionadas muestras como actúan en conjunto con otra variante genotípica completa y dar como resultado aumento en la patogenicidad (Simón et al., 2005). Sin embargo muchos factores como los ya descritos se deben tener en cuenta para el proceso de pases sucesivos ya que variaciones en la temperatura, humedad, concentración del inoculo, mantenimiento durante la replicación, contaminaciones, susceptibilidad del huésped entre otros pueden afectar el proceso directamente y producir variaciones. (Moscardi et al., 1999; Ziemnicka, 2007). 57 4.7. Análisis de la región variable entre variantes genotípicas de SfMNPV mediante electroforesis de campo pulsado Los productos de PCR obtenidos de los pases 1 a 5 de cada una de las variantes Sf-C1 y Sf-C2 se corrieron en un gel de campo pulsado (PFGE) para su análisis. (Figura 4-6) Figura 4-6 Electroforesis de campo pulsado de pases sucesivos. Carril No 1: Marcador de Peso Molecular MP 1Kb plus (Invitrogen) Carril No 2-6: Producto de PCR Sf-C1 Pases P1,P2,P3,P4,P5 Carril No 8: Marcador de Peso Molecular MP 1Kb plus (Invitrogen) Carril No 9-13: Producto de PCR Sf-C2 Pases P1,P2,P3,P4,P5. En los pases P1 y P2 de Sf-C1 se observa una única banda de amplificación de 12000pb, sugiriendo un único genoma con una banda única de amplificación. En los pases P3, P4, P5 se observan diferentes bandas de amplificación con tamaños menores posiblemente generadas por deleciones en la región amplificada. que empiezan a suceder en estos pases. Sin embargo, se conserva la banda de un peso aproximado de 12.000 pb original lo cual sugiere la aparición de mezclas de variantes genotípicas, este tamaño del fragmento amplificado concuerda con la secuencia de la región hipervariable en otros baculovirus (Barrera et al., 2013; Harrison et al., 2008; Simón et al 2005). Esta región incluye genes de función auxiliar, que tienen grandes implicaciones en la transmisibilidad del virus, pero que sin embargo no afectan su replicación (Barrera et al., 58 2013; Harrison et al., 2008). Entre ellos genes como catepsina v-cath y quitinasa chiA actúan para facilitar la liberación de los cuerpos de inclusión de las larvas muertas por infección con el virus logrando la licuefacción de la cutícula, lo cual permite en campo ser fuente de infección para otras larvas. Adicionalmente la región hipervariable de SfMNPV presenta una región homologa hr la cual se ha sugerido está implicada en la variabilidad de los SfMNPV y ha sido descrita en los ORF entre sf20 y sf29. Las hr han sido asociadas a variabilidad en otros baculovirus como el NPV de Bombyx mori y el NPV de Spodoptera exigua (Muñoz ,1999; Erlandson, 2009). Uno de estos genes que ha sido estudiado en detalle es el egt (ecdisteroide UDPglucosiltransferasa), una enzima que conjuga ecdisteroides con UDP-glucosa o galactosa y está relacionado con prolongar el estado larvario al inactivar los ecditeriodes que actúan como hormonas que regulan el proceso de muda del insecto. (O'Reilly &Miller 1989). Otro gen sf29 ubicado en esta región se ha descrito como un posible factor que determina el número de ODVs por cuerpo de inclusión y se cree que está involucrado en el empaquetamiento de los ODVs dentro de los CIs (Simón et al., 2008). Pases sucesivos de AcMNPV a través de cultivo celular fueron analizados por medio de electroforesis de campo pulsado para la detección de genomas defectuosos o partículas interferentes defectuosas, la técnica demostró ser de alta sensibilidad en la observación de las variaciones genéticas. La técnica de electroforesis de campo pulsado ha sido recientemente utilizada para el estudio de la variabilidad genética en nucleopoliedrovirus ya que ha resultado ser más sensible para la detección de estas variaciones que el perfil de restricción (Giri et al., 2012) El hecho de que el análisis por perfiles de restricción sólo puede detectar polimorfismos presentes dentro de los sitios de reconocimiento de enzimas, reduce en gran medida su capacidad de detectar la variación de pares de bases al azar dentro de los genomas de los baculovirus (Baillie y Bouwer, 2011), por lo cual la electroforesis de campo pulsado asociada con PCR y utilizada en este estudio evidenció una mayor resolución y sensibilidad en los resultados obtenidos con respecto a los perfiles de restricción. En cuanto a las bandas obtenidas en Sf-C2 se observa un fragmento de amplificación de aproximadamente 5000 pb, inferior al obtenido en Sf-C1 lo cual confirma una deleción en la región amplificada, la cual se observo en todos los pases. Adicionalmente la presencia de una banda tenue del mismo tamaño de Sf-C1(12000pb) 59 Aunque en el perfil REN no se observan diferencias en los perfiles de los pases de Sf-C2, en el campo pulsado si se observa, ya que se esperaba una única banda de amplificación de 5000pb, lo anterior podría sugerir una contaminación con la variante genotípica Sf-C1 durante los pases sucesivos, además de confirmar la sensibilidad del campo pulsado. Como ya se ha mencionado la variabilidad genética es una característica importante de los NPV, además de ser también documentada a través de los pases sucesivos, técnicas como perfiles de restricción han sido ampliamente usados para evidenciar estos cambios (Miller,1986), sin embargo estudios recientes han mostrado satisfactoriamente el uso de electroforesis de campo pulsado (PFGE) como un método altamente sensible en el estudio de la variabilidad genética en baculovirus como Helicoverpa armígera.(Baillie y Bouwer, 2011) 4.8. Caracterización biológica de los pases sucesivos Teniendo en cuenta que las diferencias genéticas pueden afectar el desempeño biológico de las variantes genotípicas, esta característica es de gran interés para el desarrollo del ingrediente activo de un bioplaguicida (Muñoz y Caballero, 2000). La mayor patogenicidad observada en la variante Sf-C1 pone de manifiesto su potencialidad para ser desarrollada como ingrediente activo de un bioplaguicida. Sin embargo, una de las limitantes para su desarrollo se basa en la estabilidad genética y fenotípica cuando se realiza su multiplicación en larva. Para evaluar la estabilidad fenotípica, se realizó la multiplicación de las variantes Sf-C1 y Sf-C2 en larvas de tercer estadio de S. frugiperda durante 5 pases consecutivos (Tabla 42, Tabla 4-3). Con el virus obtenido y purificado de las larvas muertas por infección de cada uno de los pases se realizó la caracterización de la patogenicidad mediante la determinación de la concentración letal media CL50, y de la virulencia mediante ensayo de tiempo medio de mortalidad, comparados con NPV003. 60 Tabla 4-2 Valores obtenidos de concentración letal media CL50 y TMM de la variante genotípicas Sf-C1 a través de 5 pases sucesivos Virus CL50 Potencia Límites de confianza TMM Límites de confianza (CI/ml) Relativa (95%) (h) (95%) Inferior 5 1 2,5 1.8x10 5 7.4x10 4 9.7x10 4 2.4x10 5 NPV 003 2.8x10 Sf-C1P1 1.1x10 5 1.5x10 5 3.9x10 5 Sf-C1P4 4.0x10 5 0,6 2.3x10 5 Sf-C1P5 8.6x10 5 0,3 4.0x10 5 Sf-C1P2 Sf-C1P3 1,9 0,7 Superior Inferior Superior 4.9x10 5 112 106 119 1.7x10 5 107 102 113 2.4x10 5 111 105 118 7.4x10 5 108 102 114 8.7x10 5 110 104 117 2.8x10 6 105 100 111 Los datos obtenidos se sometieron a análisis Probit, usando el programa Polo PC (LeOra Software,1987) en donde los valores de P obtenidos fueron superiores a 0,05 lo que evidencia la correlación lineal entre las dosis administradas y la mortalidad de las larvas. La potencia relativa de cada pase se encuentra dada en comparación con el aislamiento nativo NPV003. La hipótesis de igualdad fue rechazada lo que evidencia diferencia de las muestras entre sí. El aislamiento nativo NPV 003 presentó una concentración letal media de 2.8 x 105 CI/ ml este resultado es similar al reportado por autores como Simón y colaboradores (2005) en un aislamiento nativo de Nicaragua SfNIC , también a lo reportado por otros autores como Gómez (2010) y Barrera (2013) para este mismo aislamiento en Colombia. El pase uno P1 presentó un concentración letal media de 1.1.x 105 CI/ml resultando ser 2,5 veces superior en patogenicidad que el aislamiento nativo NPV003, este comportamiento ha sido reportado por autores como Muñoz y Caballero (2000), donde una variante genotípica de Spodoptera exigua presentó características de patogenicidad superiores al aislamiento nativo. Las concentraciones letales de los pases dos y tres P2 y P3 se encontraron en el rango de 9,7 x 104 y 7,4 x105 ,las cuales no presentan diferencias estadísticas significativas con respecto al aislamiento nativo (P<0,05) 61 Las concentraciones letales de los pases cuatro y cinco P4, P5 se encontraron en el rango de 2,3x105 a 2,8x106 lo que evidencio una disminución en patogenicidad estadísticamente significativa de P5 con respecto al aislamiento nativo NPV003. Así mismo, teniendo en cuenta que la región variable que presentó deleción como se evidencio en la PCR y Campo pulsado para los pases P3, P4, P5, de Sf-C1 y REN, se caracteriza por tener genes auxiliares no estrictamente necesarios para la supervivencia del virus, pero que si pueden alterar las características fenotípicas como es el caso de egt ya descrito o el gen sf29 relacionado con el número de ODVs por OB y por tanto con la patogenicidad del virus (Simón et al., 2008). Podría tratarse de una estrategia de adaptación de la variante genotípica donde genes auxiliares son delecionados obteniendo ventajas en la producción acelerada de progenie, o mayor virulencia entre otros. Los cambios en el perfil de restricción desde el pase 3 en adelante pueden correlacionarse con los ensayos biológicos de CL50 que evidenciaron la disminución de patogenicidad En cuanto a la virulencia, la determinación del Tiempo medio de mortalidad (TMM) por medio de análisis Weibull se encontró entre 105 y 111 horas. No se observan diferencias significativas entre el aislamiento nativo y los pases sucesivos de la variante genotípica Sf-C1. Autores como Harrison (2008) reportaron que las variantes genotípicas con virulencia superior al aislamiento nativo estaban asociadas a la deleción del gen egt el cual se encuentra relacionado con la activación y regulación del proceso de muda. Se ha descrito que en pases sucesivos del virus en cultivo celular, el virus se adapta rápidamente y tiende a perder genes que no sean necesarios para la supervivencia en cultivo (Dai et al., 2000). Los pases sucesivos de Sf-C2 presentaron una concentración letal media significativamente inferior al aislamiento nativo NPV003, esta característica fenotípica de Sf-C2 puede originarse debido a que su genoma presenta una deleción descrita anteriormente donde es posible que genes auxiliares como quitinasa, catepsina, lef 7 se encuentren ausentes. Autores como Harrison y colaboradores (2008) han reportado ausencia de estos genes en otros genotipos de SfMNPV, adicionalmente las variantes con mayores deleciones presentaron una patogenicidad más baja que las variantes genotípicas completas o con deleciones más pequeñas (Simón et al., 2005). Los pases sucesivos de la variante genotípica Sf-C2 no presentaron diferencias significativas entre sí en cuanto a su patogenicidad. En cuanto a la virulencia en Sf-C2, el tiempo medio de 62 mortalidad fue de 110 y 120 horas, lo cual no representa diferencia marcada con respecto al aislamiento nativo NPV003. Tabla 4-3 Valores obtenidos de concentración letal media CL50 y TMM de la variante genotípica Sf-C2 a través de 5 pases sucesivos. Virus CL50 Potencia Límites de confianza TMM (CI/ml) Relativa (95%) (h) Inferior NPV 003 2.8x10 5 1 Superior Superior 4.9x10 5 1.8x10 6.4x10 5 4.7x10 6 112 105 123 110 101 119 6.3x10 6 116 106 126 7.5x10 6 115 106 125 120 111 131 120 111 131 1.4x10 Sf-C2P2 1.6x10 6 0.17 8.1x10 5 Sf-C2P3 1.9x10 6 0.15 8.4x10 5 Sf-C2P4 3.2x10 6 0.09 1.3x10 6 1.8x10 7 Sf-C2P5 3.0x10 6 0.09 1.2x10 6 1.5x10 7 0.20 (95%) Inferior 5 6 Sf-C2P1 Límites de confianza No se observan diferencias significativas de los pases sucesivos obtenidos de Sf-C2 en cuanto a la virulencia con respecto al aislamiento nativo NPV003. Se han observado diferencias en virulencia ya sea aumento o disminución en pases sucesivos de genotipos en huéspedes diferentes (Stairs et al. 1981; Martignoni e Iwai 1986; Shapiro et al. 1982), en este caso no hubo variaciones significativas a través de los pases. Los pases sucesivos de nucleopoliedrovirus tanto en huéspedes naturales como en huéspedes alternos han dado como resultado modificaciones en su actividad biológica, así quedo demostrado cuando un nucleopoliedrovirus de A. califórnica y T. ni fueron sometidos a pases sucesivos en larvas de S. exigua mostrando un aumento en la virulencia y mayor numero de viriones por cuerpo de inclusión, este tipo de comportamientos aumenta la posibilidad de mejorar la virulencia de un inoculo inicial sin embargo cuando el mismo nucleopoliedrovirus de T. ni fue sometido a pases sucesivos en larvas de T. ni y posteriormente en larvas de S. exigua no presentó un aumento de número de viriones por cuerpos de inclusión (Tompkins et al., 1981). En otros estudios en especies diferentes, se encontró que a través de pases sucesivos de HzNPV en larvas de H. zea aumentó su virulencia en un 80% (Shapiro e Ignoffo 1970), lo que evidencia que mecanismos de coevolución son importantes en cada especie por lo que modelos biológicos deben ser estudiados de manera individual. 63 Escribano y Williams (2001) realizaron pases sucesivos con SfMNPV en larvas de S. frugiperda parasitadas y no parasitadas, resultando en la aparición de cuatro distintos aislados genéticos detectados por perfil de restricción REN. Por medio de bioensayos se determinó que las variantes presentaban cambios en su actividad biológica, dos de ellas mostraron aumento en la virulencia y una reducción en la infectividad. En este caso la presencia de deleciones se asoció con la reducción en la actividad insecticida. La variante genotípica Sf-C2 presentó una baja patogenicidad con respecto al aislamiento nativo NPV003. Variantes genotípicas con deleciones importantes también han sido registrados en otros aislamientos de nucleopoliedrovirus como el caso de SeMNPV-US2 de la Florida o SfMNPV-NIC aislamiento de Nicaragua presentando características genotípicas y fenotípicas similares (Serrano et al., 2013; Simón et al., 2005). Estos genotipos delecionados en la mayoría de los casos toman partido de su condición y al encontrarse en la célula se replican más rápido gracias a su genoma más corto (Frank, 1996). En un estudio, variantes defectivas de AcMNPV obtenidas a través de pases en cultivo celular fueron sometidas a multiplicación in vivo, a través de 2 pases sucesivos recuperaron sus características de infectividad y contenido de ODVs, además de una disminución en la frecuencia de regiones non-HR ori (Zwart et al., 2009). Autores como Ignoffo y Couch (1981) y que han sido citados posteriormente por Moscardi (1999) recomiendan una vez hallado el aislamiento nativo o la variante genotípica con mejores características insecticidas para producción masiva realizar un inoculo por multiplicación inicial en cantidades suficientes que sirva para producciones futuras, ya que a través de los pases sucesivos por el hospedero puede verse afectada propiedades como la virulencia o patogenicidad del virus, sin embargo estas recomendaciones fueron dadas específicamente para NPV de Heliothis spp. Estudios anteriores con el aislamiento nativo NPV003 demostraron su efectividad en campo superior al 80%, sin embargo la concentración requerida para lograr esta eficacia es de 1500g por hectárea lo que redunda en altos costos por aplicación, esta concentración es alta teniendo en cuenta que para la obtención del principio activo debe realizarse un proceso in vivo que tiene alta demanda en mano de obra, lo que conlleva a que el control biológico tenga un sobrecosto del 40% con respecto al control químico (Gómez et al., 2013; Barrera et al ., 2013) 64 Por lo anterior el hallazgo demostrado en el presente trabajo, donde la estabilidad genética y fenotípica de la variante Sf-C1, presenta características insecticidas superiores al aislamiento nativo NPV003, conservadas hasta tres pases de replicación sucesiva in vivo, presenta una clara expectativa de su uso como principio activo en un bioplaguicida ya que concentraciones menores del virus son requeridas para su aplicación lo que permitiría bajar los costos de producción y hacerlo competitivo en el mercado. 65 5. CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES 5.1. Conclusiones El estudio de la diversidad intrapoblacional de un aislamiento colombiano de SfMNPV, mediante la clonación de genotipos en cultivo celular permitió la obtención de 2 variantes genotípicas. Al realizar la caracterización genómica se observo que la variante genotípica Sf-C1 presentaba genoma completo similar al aislamiento nativo y la segunda variante Sf-C2 presentaba una deleción. Los bioensayos de caracterización biológica de las variantes obtenidas a partir del cultivo mostraron que la variante genotípica Sf-C1 variante completa demostró ser 2,5 veces superior en patogenicidad al aislamiento nativo NPV003, siendo la variante mayoritaria presente la mezcla natural mientras que la variante Sf-C2 presentó una patogenicidad significativamente menor que el aislamiento nativo. Las dos variantes genotípicas no presentaron diferencias significativas respecto al aislamiento silvestre en cuanto a la virulencia. A partir del tercer pase de multiplicación en larva, la variante Sf-C1 presentó cambios genómicos observados mediante el perfil de restricción. Los cambios se observaron en la región variable comprendida entre los ORFs sf20 y sf31, lo cual se evidenció mediante PFGE. La variante genotípica Sf-C2 no presento cambios genómicos en el perfil de restricción, si se observaron cambios en la región variable mediante PFGE donde se evidencio que no era un clon puro. La caracterización biológica a través de los pases sucesivos demostraron la disminución de la patogenicidad en Sf-C1 con respecto a NPV003 a partir del tercer pase y no se presentó diferencia significativa a través de los pases con respecto a la 66 virulencia. La variante Sf-C2 no se presentaron cambios significativos en su patogenicidad y virulencia a través de los pases La técnica de electroforesis de campo pulsado utilizada para la observación de cambios en la estructura genética de los pases sucesivos presento mayor resolución que los perfiles de restricción REN. Su aplicación permitió concluir que la variante SfC2 no era un clon puro, característica que no fue observada en el perfil de restricción. 67 5.2. Recomendaciones La variante genotípica Sf-C1 es una alternativa para ser usada como principio activo ya que mostro ser 2,5 veces mayor en patogenicidad que el aislamiento nativo NPV003, característica relevante que disminuiría costos de producción en el desarrollo de un bioplaguicida Se recomienda la implementación de la técnica de electroforesis de campo pulsado para el estudio de variaciones genotípicas de baculovirus, ya que demostró un alto poder de resolución sobre otras técnicas usadas comúnmente, como el perfil de restricción. Usar mezclas de genotipos podría resultar en estabilidad en las funciones biológicas del virus, por lo que se recomienda realizar ensayos con mezclas de variantes genotípicas completas y delecionadas para evaluar dicha estabilidad a través de pases sucesivos. Si se utiliza la variante Sf-C1 dadas sus propiedades para el desarrollo de un bioplaguicida, se recomienda tener alícuotas que no superen el tercer pase de multiplicación in vivo. 68 BIBLIOGRAFIA Akermann, H.-W., & Smirnoff, W. (1983). A morphological investigation of 23 baculoviruses. Journal of invertebrate Pathology , 41, 269-280. Aponte, O., & Morillo, F. (1987). Problemática entomológica de maíz en el estado Portuguesa. IX Curso sobre Entomología General y Manejo Integrado de Plagas. Araure. Armenta, R., Martínez, J., Chapman, R., Magallanes, D., Goulson, D., Caballero, P., y otros. (2003). 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