LABORATORIO No 4 EXTRACCION DE ARN

BIOLOGIA CELULAR Y MOLECULAR
LABORATORIO No 4: EXTRACCIÓN DE ARN
1. INTRODUCCIÓN
En los organismos celulares el ARN es la molécula encargada de dirigir la síntesis
de proteínas, pues aunque el ADN es el que contiene la información que
determina la estructura de estas, no puede actuar solo y se vale del ARN para
traducir esta información y producir las proteínas necesarias para el desarrollo y
actividades de la célula.
La mayor dificultad en la extracción del ARN es evitar la contaminación con
RNAsas, enzimas muy estables que no requieren cofactores para su función. Por
lo tanto, se deben tratar las soluciones y los materiales con Dietil-piro carbonato
(DEPC), el cual inactiva las ribonucleasas por modificación covalente
2. OBJETIVOS
•
•
•
Identificar las etapas y fundamentos indispensables para la extracción de
ARN
Adquirir conocimiento básico para el manejo y cuidado de ARN extraído
Realizar un procedimiento comercial y accesible para la obtención de ARN
3. MARCO TEORICO
La mayoría de protocolos para extracción de ARN están basados en el método
descrito por Chomezynski y Sacchi (1), el cual se basa en el aislamiento de este
ácido nucleico empleando fenol-cloroformo e isotiocianato de guanidina. Durante
el procedimiento debe realizarse una etapa de homogenización de la muestra con
el (los) reactivo (s) que contengan la solución fenol-isotiocianato, donde este
último se encarga de conservar la integridad del ARN, mientras rompe las células
y disuelve sus componentes, la adición posterior de cloroformo separa la solución
en fase acuosa y orgánica, donde la primera de estas contiene el ARN, esta fase
acuosa es posteriormente tratada con isopropanol para recuperar por precipitación
el ARN.
La metodología que se va a utilizar en esta práctica, permite recuperar el ARN de
la fase acuosa como ya se mencionó, igualmente el ADN y las proteínas pueden
ser recuperados de la fase orgánica por precipitación secuencia, así con etanol se
logra precipitar el ADN de la interfase y con una precipitación adicional pueden
recuperarse las proteínas de la fase orgánica.
Esta técnica permite obtener ARN a partir de pequeñas cantidades de tejido y
células en cultivo o suspensión de origen humano, vegetal, animal o bacteriano.
Así mismo el ARN obtenido si se realiza el procedimiento con precaución está libre
de contaminación con ADN y proteínas y finalmente puede ser utilizado en
diferentes procedimientos como Northern blot, Dot blot, Transcripción reversa,
ensayos de protección de RNAsas PCR y clonaje molecular
4. PRE-LABORATORIO
1. Durante la extracción de ARN se emplea sales de guanidinium. ¿Cuál es su
función y que tipo de sales son las más utilizadas?
2. ¿Cuál es la función del dietilpirocarbonato (DEPC) durante la extracción del
ARN?
3. ¿Mediante el método de TRIzol se puede aislar simultáneamente ADN, ARN y
proteínas?
4. ¿Se obtiene la misma cantidad de ARN que de ADN en la extracción con
TRIzol?
5. ¿Qué tipo de ARN se obtiene en este tipo de extracción?
6. Porque se requiere agua milliQ, ultrapura o tipo I en este procedimiento?
5. PRECAUCIONES
Las RNAsas (enzimas que rompen ARN) pueden ser introducidas accidentalmente
durante el procedimiento de manipulación del ARN para obtener la segunda
cadena o cadena complementaria, por lo cual deben tenerse en cuenta los
siguientes aspectos cuando se trabaja con ARN:
- Siempre deben utilizarse guantes de látex, ya que la piel contiene algunas
bacterias que poseen estas enzimas y contaminan el ARN a extraer.
- Utilizar pipetas y micro pipetas estériles, reservadas para trabajo de ARN,
evitando así contaminaciones cruzadas.
- Utilizar material tratado con inhibidores de RNAsas (libre de RNAsas)
-El reactivo bromuro de etidio es altamente peligroso por lo que siempre deben
utilizarse elementos de protección como guantes y gafas, evitando completamente
el contacto con piel y ropa, así como evitando inhalar el reactivo o los vapores de
este.
Otras precauciones son:
- Utilizar siempre tubos de polipropileno
-
Utilizar material resistente al cloroformo y altas velocidades de
centrifugación
Equilibrar los tubos previos a la centrifugación
Tapar o sellar correctamente los tubos durante la centrifugación y durante la
incubación para evitar la evaporación.
6. MATERIALES Y REACTIVOS
Tubos Vacutainer con EDTA, heparina o citrato
Reactivo TRIzol (Gibco)
Eppendorf estériles de 1.5 mL
Micro pipetas
Puntas estériles
Centrífuga y micro centrífuga
Guantes
Agua desionizada estéril
Cloroformo
Agua libre de ARNasas
Isopropanol
Etanol al 75% en agua libre se RNAsas
7. PREPARACIÓN DE REACTIVOS
NaCl al 0.9%
-Agua libre de RNAsas
1mL de Dietil-pirocarbonato (DEPC)
1L de agua destilada estéril
Mezclar en una botella con magneto hasta homogenizar completamente el DEPC
con el agua (durante 12 horas aproximadamente). Esto debe hacerse en cabina
de extracción y con todas las medidas de bioseguridad conocidas.
Autoclavar 2 veces y almacenar a temperatura ambiente
- Etanol al 75%
100mL de agua libre de RNAsas
Etanol grado biología molecular
Mezclar cuidadosamente 75mL de etanol con 15mL de agua libre de RNAsas en
un frasco estéril hasta homogenizar completamente
No autoclavar y almacenar a temperatura ambiente.
8. PROCEDIMIENTO
Esta práctica se realizará en dos clases. En la primera se recolectara la muestra a
partir de sangre total se obtendrán Células Mononucleares de Sangre Periférica
(CMSP), mediante gradientes de centrifugación Ficoll Hypaque y se dejara hasta
el paso de homogenización.
TECNICA DE TRIzol PARA EXTRACCIÓN DE ARN
I. HOMOGENIZACIÓN
1. En un tubo Eppendorf de 1.5 mL, homogenizar el pellet de CMSP (obtenidas
previo sometimiento de sangre total a gradiente de Ficoll-Hypaque) con 1 mL de
reactivo TRIzol. Se deja incubando a -70 0C, hasta la próxima práctica.
2. Mezclar suavemente con micro pipeta.
II. FASE DE SEPARACIÓN
3. Incubar la muestra homogenizada
durante 15 minutos a temperatura
ambiente, permitiendo así la completa
disociación de los complejos de
nucleoproteínas.
4. Adicional 200ul de cloroformo, tapar
perfectamente el tubo
5. Agitar fuertemente durante 15
segundos
6. Incubar por 2 a 3 minutos a
temperatura ambiente y en posición
vertical
7. Centrifugar las muestras a 14000rpm
por 10 minutos preferiblemente a
temperatura de 4 a 8°C
8. Luego de centrifugar, la mezcla se
separa en una fase inferior roja, fase de
fenol cloroformo, en una interfase y en
una fase incolora superior, la cual
contiene exclusivamente el ARN
III. FASE DE PRECIPITACIÓN
9.
Transferir
la
fase
acuosa
cuidadosamente a un tubo Eppendorf
nuevo
(aquí
puede
separarse
igualmente la fase orgánica para
posterior purificación de ADN o
proteínas)
10. Adicional 0.5 mL de isopropanol
Homogenizar pellet de células blancas
con TRIzol
Mezclar e incubar
Adicionar cloroformo
Agitar e incubar
Separación de fases
Tomar la fase acuosa y
Adicionar isopropanol
Descartar el sobrenadante
Adicionar etanol al 75% al pellet.
Mezclar
Eliminar el
sobrenadante
Dejar secar a T° ambiente
Adicionar agua libre de RNAsas y
homogenizar
para precipitar el ARN de la fase acuosa
11. Incubar el tubo por 10 minutos a temperatura ambiente y en posición vertical
12. Centrifugar a 10000rpm (o 12000g) por 10 minutos, preferiblemente a
temperatura de 2 a 8°C
13. El ARN debe verse precipitado antes de la centrifugación como un pellet
parecido a un gel.
IV. FASE DE LAVADO
14. Remover el sobrenadante cuidadosamente y eliminarlo
15. Adicionar 1 mL de etanol al 75% al pellet para lavarlo
16. Mezclar por agitación
17. Centrifugar a 6000rpm por 5 minutos preferiblemente a 2- 8 °C
18. Eliminar cuidadosamente el sobrenadante
V. FASE DE DISOLUCIÓN
19. Secar a temperatura ambiente, colocando el Eppendorf con el ARN sobre una
toalla de papel estéril
20. Adicionar 30ul de agua libre de ARNasas
21. Disolver el ARN por pipeteo suave, opcionalmente puede incubarse 10
minutos a 55-60°C para lograr una completa disolución
9. POST-LABORATORIO
1. ¿A qué factores puede deberse la obtención de baja cantidad o pérdida total del
ARN extraído con esta metodología?
2. ¿Qué otras técnicas comerciales existen para extraer ARN?
3. ¿El ARN obtenido aquí puede utilizarse directamente para realizar una
determinación específica a través de PCR? ¿Por qué?
4. A partir de que otras muestras puede realizarse la extracción de ARN y con qué
objetivo se realiza en estas muestras la extracción?
5. ¿Qué inhibidores de nucleasas existen y en que procedimientos deben
utilizarse?
10. BIBLIOGRAFIA
Revista Nature Protocolos Años 2009-2013
- Almonacid, C Pinilla G. Introducción al análisis Bioquímico y a sus
métodos de separación. Universidad Colegio Mayor de
Cundinamarca . 2008
- Chomczynski P. and Sacchi. 1987. Anal Biochem. 162:156
- Chomczynski P. and Sacchi. 1993. Biotechniques. 15:532
- Sambrook, J. et al. 1989 Molecular Cloning: a Laboratory Manual. 2
nd edition, Cold Spring. Laboratory, Cold Spring Harbor, New York
- David, L.G. dibner, M.D.& Battery, J.F. Bassin methods in molecular
biology. Elsiever Science Publishing Co. Ind. NY. 1986
-
Catálogos de TRIzol casa comercial GIBCO.
11. AUTOEVALUACION.
NUMERO DE
LA PRACTICA
LOGRO
(Objetivos
cumplidos)
SI
NO
FORTALEZAS
DEBILIDADES
SUGERENCIAS
A
CADA
DEBILIDAD
ANEXO COMPLEMENTARIO AL LABORATORIO No. 4
OBTENCION DE ADNc
1. INTRODUCCIÓN
Cuando el ARN mensajero es obtenido, se puede llevar a cabo una amplia
variedad de aplicaciones: elusión del ARNm, cuantificación del ARNm y síntesis
de ADNc (ADN complementario) el cual puede ser utilizado para: amplificación,
detección de la expresión de genes específicos o almacenaje de ADNc.
Para obtener el ADNc se utiliza una técnica denominada RT-PCR (Reverse
Transcription - Polymerase Chain Reaction; Transcripción Reversa - Reacción en
Cadena de la Polimerasa), que nos permite la amplificación de una cantidad
pequeña de moléculas de ARN (tanto ARNm como RNA total) con gran
especificidad, mediante la Transcripción reversa del RNA a ADNc, que es
posteriormente amplificado.
2. OBJETIVOS
•
•
•
Identificar los reactivos, funcionamiento y orden de adición de los reactivos
necesarios en la obtención de ADNc in Vitro.
Adquirir conocimiento básico para el manejo y funcionamiento de la
obtención de cadenas complementarias de ADN
Realizar un procedimiento comercial y accesible para la obtención de ADNc
3. MARCO TEORICO
Esta técnica permite obtener ADNc a partir de pequeñas cantidades de ARN de
origen humano, vegetal, animal o bacteriano. Así mismo el ADNc obtenido por
este método, si se realiza el procedimiento con precaución, está libre de
contaminación con DNAsas y proteínas. Además el ADN contaminante, tanto en
las muestras, como en los reactivos, debe ser evitado con el fin de impedir la
aparición de productos inespecíficos
Hay dos partes bien diferenciadas en cualquier RT-PCR: la transcripción reversa y
la amplificación. La transcripción reversa, utilizando RNA total como ARNm, es la
etapa clave en una RT-PCR. Existen varios factores que influencian la eficiencia
del proceso, tales como: la enzima que va a llevar a cabo esta reacción, la
presencia de estructuras secundarias en el ARN, etc.
Las reverso transcriptasas virales, tales como M-MLV y AMV, han sido las
enzimas de elección durante muchos años. Estas enzimas, sin embargo, son
termolábiles, y no pueden llevar a cabo la transcripción reversa cuando existen
estructuras secundarias en el ARN. En este caso, se suelen utilizar transcriptasas
reversas termoestables, que pueden llevar a cabo la reacción a 55-70ºC,
permitiendo la desnaturalización de las estructuras secundarias, y aumentando la
eficiencia global de la reacción.
4. PRECAUCIONES
Las RNAsas (enzimas que rompen ARN) pueden ser introducidas accidentalmente
durante el procedimiento de manipulación del ARN para obtener la segunda
cadena o cadena complementaria, por lo cual debe utilizarse durante todo el
procedimiento guantes de látex, ya que la piel contiene algunas bacterias que
poseen estas enzimas y contaminan el ARN a extraer; utilizar todo el material
necesario para el trabajo de ARN (pipetas, micro pipetas, entre otros) estéril y con
inhibidores de RNAsas evitando así contaminaciones cruzadas. Se deben tener en
cuenta otras precauciones enunciadas en la práctica de extracción de ARN
5. PRE- LABORATORIO
Dependiendo las condiciones experimentales puede darse la necesidad de usar
ADNc, para lo cual se realiza primero la extracción de ARN que más tarde será
sintetizado a ADNc. Para ello, la ciencia se ha valido de un truco viral: los virus
que no poseen ADN propio tienen que transformar su ARN a ADN dentro la célula
huésped y para ello están equipados con una ADN polimerasa especial, al igual
que otras polimerasas es dependiente de ARN, está se denomina transcriptasa
reversa. La más conocida comercialmente es la MMLV (Molones Murine Leucemia
Virus) que añade nucleótidos al poli nucleótido naciente en dirección 5' → 3'.
MMLV utiliza ARNm como molde, pero requiere de un cebador.
Teniendo en cuenta el enunciado anterior. Responda las siguientes preguntas:
1. ¿Cuál es la diferencia entre ADNc y ADN genómico?
2. ¿Actualmente en el mercado se cuenta con otro tipo de retrotranscriptasas,
mencione alguna de ellas? ¿Cuáles son las diferencias entre cada una de ellas?
3. La retrotranscriptasas utilizan ARNm como molde, pero requiere de un cebador.
Los cebadores más comunes son un oligo dT (TTTTTTTT), primers degenerados
(generalmente hexámeros) específicos anti sentido o sentido. ¿En qué
condiciones se deben emplear cada uno de ellos?
6. MATERIALES REACTIVOS Y EQUIPOS
ARN obtenido con anterioridad
Micro pipetas
Puntas estériles
Vortex
Centrífuga con rotor para tubos de 15ml y Micro centrifuga para viales de 1.5 ml
Guantes
Agua des ionizada estéril
Tris
Acetato
EDTA
SDS
Bromuro de etidio
Agarosa
Reactivos comerciales para transcripción reversa
Cámara de electroforesis
7. PREPARACION DE REACTIVOS
• Agua libre de RNAsas
1mL de Dietil pirocarbonato (DEPC)
1L de agua destilada estéril
Mezclar en una botella con magneto hasta homogenización completa del
DEPC con el agua (durante 12 horas aproximadamente), adicionando el DEPC
en cabina de extracción y con todas las medidas de bioseguridad conocidas.
Autoclavar 2 veces y Almacenar a temperatura ambiente
8. PROCEDIMIENTO
•
TECNICA DE ADNc DE PROMEGA
Luego de la extracción de ARN, cada muestra se procesa para la obtención de
cadena complementaria o ADNc por medio de una reacción la cual contiene la
enzima Transcriptasa Reversa MMLV-RT, buffer para la enzima, dNTPs, RNAsin y
Random Primers u Oligo DT (Promega).
El procedimiento utilizado es:
1.
En un tubo Eppendorf, colocar 10 µl de RNA (200ng aproximadamente)
2. Adicionar 5ul de agua libre de RNAsas 6ul de buffer para RT, 1ul de RNAsin,
1.5ul de dNTP (mezcla de 10mM), 3 µl de Oligo DT o Random Primers y 1.5ul
de enzima MMLV-RT.
3.
Incubar a 37°C durante 1 hora.
4.
El ADNc obtenido se puede guardar a -20°C hasta su futuro uso.
5. Puede observarse la calidad del ADNc visualizándolo en gel de agarosa al 1%
preparado en buffer de corrido TAE (tris-acetato-EDTA) y teñido con bromuro
de etidio.
6.
El corrido se hace a 100V durante 30 minutos aproximadamente
9. POST-LABORATORIO
1. ¿Cómo actúa o funciona la MMLV-RT en la transcripción reversa?
2. ¿Qué otras transcriptasas reversas existen, de que origen y que características
tienen?
3. ¿La enzima para la transcripción reversa en que paso del procedimiento
debería adicionarse y porque?
4. ¿El ADNc obtenido en que procedimiento o para que finalidades puede
utilizarse?
5. ¿Qué inhibidores de RNAsas existen y cómo actúan?
10. BIBLIOGRAFIA
-Revista Nature Protocols años 2009- 2012
1..Catálogos y fichas técnicas 2012 de las casas comerciales: Invitrogene, Promega, Biorad,
Biologend, Bioline, Roche, etc.
2.Chomczynski P and Sacchi. 1987. Anal Biochem. 162: 156.
1. David, L.G. Dibner, M.D. & Battery, J.F. Basic methods in molecular biology. Elsiever Science
publishing Co. Ind. NY. 1986.
2. Sambrook, J. et al. 1989 Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd edition, Cold Spring.
Laboratory, Cold Spring Harbor, New York,
3. Catálogos de PROMEGA para obtencion de caderna complementaria de DNA.
4. Fundamentos moleculares en medicina. Fernando Lizcano Losada.Manual Moderno. Universidad de la
Sabana. 2005.
5. Biología molecular e ingenieria genetica. Texto ilustrado de biología molecular e ingenieria genetica.
Luque jose et l. Primera edicion. 2001.
11. AUTOEVALUACION.
NUMERO DE
LA PRACTICA
LOGRO
(Objetivos
cumplidos)
SI
NO
FORTALEZAS
DEBILIDADES
SUGERENCIAS
A
CADA
DEBILIDAD