Columnas Agilent AdvanceBio SEC para el análisis de agregados

Columnas Agilent AdvanceBio
SEC para el análisis de agregados:
compatibilidad de instrumentos
Resumen técnico
Introducción
Las columnas Agilent AdvanceBio SEC son una nueva familia de columnas de
cromatografía de exclusión por tamaño (SEC) rellenas con partículas de 2,7 µm de una
exclusiva fase estacionaria de sílice con recubrimiento polimérico y capacidad ligante
baja. Esta tecnología minimiza las interacciones no específicas y mejora la forma de
pico para el análisis de moléculas bioterapéuticas, como anticuerpos monoclonales
y conjugados anticuerpo-fármaco (ADC).
Aunque se recomienda usar las columnas AdvanceBio SEC con un sistema LC bioinerte
Agilent 1260 Infinity, la elevada uniformidad de las partículas de 2,7 µm consigue
una excelente eficiencia de la columna y maximiza la recuperación de proteínas con
presiones operativas que permiten su funcionamiento en cualquier sistema HPLC:
desde instrumentos antiguos de 400 bar hasta instrumentos de cromatografía líquida de
ultraalto rendimiento (UHPLC) de 1.200 bar. Las columnas AdvanceBio SEC 300 Å se han
diseñado específicamente para el análisis de agregados de anticuerpos monoclonales
y ofrecen un rendimiento óptimo para el aspecto más importante: la resolución de
monómeros y dímeros. Las columnas AdvanceBio SEC 130 Å presentan un volumen
de poro alto similar, pero abarcan proteínas y polipéptidos más pequeños.
La amplia variedad de tamaños de las columnas da respuesta a las necesidades de todo tipo
de aplicaciones: existen desde columnas convencionales de 7,8 mm de d.i. hasta otras de
4,6 mm de d.i., que aportan una mayor sensibilidad o pueden utilizarse si la disponibilidad
de la muestra es limitada. Hay columnas de 30 cm de longitud, para separaciones
convencionales de alta resolución, y de 15 cm, que permiten lograr una mayor velocidad de
análisis cuando es necesario analizar un gran número de muestras. También hay disponibles
precolumnas de 5 cm.
Tipo de instrumento
Cromatograma de ejemplo
Norm.
Instrumento HPLC
Agilent 1100
(400 bar)
200
175
150
125
100
75
50
25
0
0
Sistema cuaternario
bioinerte
Agilent 1260 Infinity
(600 bar)
2
4
6
8
10
12
14 min
2
4
6
8
10
12
14 min
2
4
6
8
10
12
14 min
Norm.
200
175
150
125
100
75
50
25
0
Norm.
Sistema LC binario
Agilent 1290 Infinity
(1.200 bar)
175
150
125
100
75
50
25
0
Figura 1. Ejemplos ilustrativos de separaciones de proteínas con distintos instrumentos HPLC (línea azul:
mezcla de patrón de proteínas BioRad; línea roja: γ-globulina). Nota: Se utilizaron distintos lotes de proteínas
que se analizaron en diferentes laboratorios.
Condiciones
Parámetro
Valor
Eluyente
Tampón fosfato sódico 150 mM, pH 7,0
Flujo
1,0 ml/min (columnas de 7,8 mm) o 0,35 ml/min (columnas de 4,6 mm)
Temperatura
Ambiente
Muestra
Proteína con una concentración de 1 mg/ml
Instrumento
Instrumento HPLC Agilent 1100 (antiguo, 400 bar)
Sistema cuaternario bioinerte Agilent 1260 Infinity (600 bar)
Sistema LC binario Agilent 1290 Infinity con detector DAD (G1315D) y celda de flujo
bioinerte (1.200 bar)
Longitud de onda 220 nm
2
Elección del diámetro de
columna adecuado
Para poder utilizar columnas con
diferentes diámetros interiores es
necesario ajustar el flujo (para mantener
la misma velocidad lineal) y el volumen
de muestra. El flujo operativo habitual
para las columnas de 7,8 mm es de
1,0 ml/min; por lo tanto, el flujo correcto
para las columnas de 4,6 mm es de
0,35 ml/min. El volumen de inyección
debe disminuir en una proporción similar
para obtener una respuesta comparable
en el detector; en consecuencia, una
inyección de 6 µl en una columna de
7,8 mm se debe reducir hasta 2 µl en
una columna de 4,6 mm. Pueden existir
pequeñas diferencias en el tiempo de
retención observado debido al volumen
extracolumna del instrumento. De manera
similar, la retropresión observada en un
instrumento con un flujo de 1,0 ml/min
será algo superior a la observada en
ese mismo instrumento con un flujo de
0,35ml/min, en particular si se usan
capilares de bajo volumen muerto. En la
Figura 2 se muestran las separaciones
realizadas con fase estacionaria de un
mismo lote empaquetada en columnas
de 30 cm de longitud y 7,8 y 4,6 mm de
d.i.; ambos análisis se realizaron con el
mismo instrumento cuaternario bioinerte
Agilent 1260 Infinity.
Esto ilustra con claridad la enorme
similitud de las columnas en cuanto
al rendimiento. La posibilidad de usar
menores volúmenes de inyección en las
columnas de 4,6 mm resulta ideal si la
disponibilidad de la muestra es limitada;
estas columnas son idóneas para los
instrumentos modernos de bajo volumen
muerto. En aquellas aplicaciones que
requieren el uso de detectores menos
mAU
200
175
150
125
100
75
50
25
0
mAU
175
150
125
100
75
50
25
0
sensibles (como detectores de dispersión
de luz o de índice de refracción) o de
detectores UV de mayor longitud de onda
(por ejemplo, si se utilizan eluyentes
de fase móvil con un elevado ruido de
fondo a menores longitudes de onda),
las columnas de 7,8 mm ofrecen la
capacidad de inyectar volúmenes de
muestra mucho mayores.
1. Agregados de tiroglobulina
2. Monómero de tiroglobulina
3. Dímero de γ-globulina
4. Monómero de γ-globulina
5. Dímero de ovoalbúmina
6. Ovoalbúmina
7. Mioglobina
8. Vitamina B12
6
A
Agilent AdvanceBio SEC 300 Å
7,8 × 300 mm
1,0 ml/min
1
2
4
4
2
7
8
3
5
6
8
10
12
14
min
6
8
10
12
14
min
B
Agilent AdvanceBio SEC 300 Å
4,6 × 300 mm
0,35 ml/min
2
4
Figura 2. Comparación de la separación de un patrón de proteínas con columnas de 7,8 mm y 4,6 mm.
3
Por estos motivos, el instrumento
elegido es el sistema cuaternario
bioinerte Agilent 1260 Infinity.
mAU
Inyección
1
400
800
1.200
70
60
50
40
Inyección n.º 1.200
30
Inyección n.º 800
20
Inyección n.º 400
10
Inyección n.º 1
0
0
2
4
6
8
10
12
14
16
min
Figura 3. Experimento de vida útil con una columna Agilent AdvanceBio SEC 300 Å de 7,8 × 300 mm,
en la que se realizaron 1.200 inyecciones a lo largo de 12 días.
Cómo garantizar una fiabilidad
continua
Cambio de muestra
100
Monómero (%)
Agregados (%)
Dímero (%)
30
95
25
90
% área monómero
La monitorización del rendimiento de
la columna es un aspecto importante
para conseguir una cromatografía
de exclusión por tamaño robusta.
Es sabido que los tampones fosfato
deterioran las fases estacionarias con
sílice. Las columnas AdvanceBio SEC
poseen una capa polimérica hidrofílica
patentada que ayuda a minimizar las
interacciones no específicas. En todas
las comprobaciones rutinarias realizadas,
estas columnas han demostrado que
ofrecen una vida útil extensa incluso con
tampones concentrados de fosfato sódico
(consulte las Figuras 3 y 4). La vida útil de
la columna puede reducirse si se trabaja
a temperaturas elevadas o con flujos altos.
Rs
2,16 (tras 0 días)
2,16 (tras 4 días)
2,20 (tras 8 días)
2,19 (tras 12 días)
20
85
15
80
75
10
70
5
65
60
% área agregados y dímero
Debido a que los tampones usados
para el análisis son más fuertes, existe
riesgo de precipitación o corrosión (si
hay presentes cloruros en la fase móvil).
También existe la posibilidad de que
se produzca crecimiento bacteriano en
tampones acuosos que no contengan
conservantes. Resulta esencial realizar
un mantenimiento preventivo periódico
y lavar siempre los instrumentos, de
modo que no quede tampón en ellos.
Para conseguir un rendimiento fiable
es indispensable usar tampón recién
preparado y filtrado con un filtro de
membrana de 0,2 µm.
0
200
400
600
800
Número de inyecciones
1.000
0
1.200
Figura 4. Cambio mínimo del porcentaje (%) de área del monómero y el dímero durante el experimento de
vida útil realizado con una columna Agilent AdvanceBio SEC 300 Å de 7,8 × 300 mm a lo largo de 12 días.
4
Patrones de proteínas Agilent
AdvanceBio SEC 130 Å
Mezcla de proteínas que consta de cinco
proteínas cuidadosamente seleccionadas
(ovoalbúmina, mioglobina, aprotinina,
neurotensina y angiotensina II), diseñada
para calibrar las columnas de exclusión
por tamaño Agilent AdvanceBio 130 Å.
Este patrón se puede usar periódicamente
para calibrar la columna y asegurar un
rendimiento ideal del sistema en diversas
aplicaciones que implican la purificación
y el análisis de proteínas.
4
2
A
175
Sistema HPLC Agilent serie 1100
150
125
100
1
75
50
25
0
0
2
4
7
mAU
8
3
5
6
8
10
12
14
min
6
8
10
12
14
min
B
175 Sistema cuaternario bioinerte
150 Agilent 1260 Infinity
125
100
75
50
25
0
0
2
4
Figura 5. Comparación de una mezcla de patrón de proteínas analizada en columnas Agilent AdvanceBio
SEC 300 Å de 7,8 × 300 mm, utilizando un instrumento HPLC Agilent serie 1100 y un instrumento
cuaternario bioinerte Agilent 1260 Infinity.
Patrones de proteínas Agilent AdvanceBio SEC
Patrones de proteínas Agilent
AdvanceBio SEC 300 Å
Mezcla de proteínas que consta de cinco
proteínas cuidadosamente seleccionadas
(tiroglobulina, γ-globulina, ovoalbúmina,
mioglobina y angiotensina II), diseñada
para calibrar las columnas de exclusión
por tamaño Agilent AdvanceBio 300 Å.
Este patrón se puede usar periódicamente
para calibrar la columna y asegurar un
rendimiento ideal del sistema en diversas
aplicaciones que implican la purificación
y el análisis de proteínas.
6
Respuesta
Para conseguir una transferencia de
métodos eficaz, resulta esencial garantizar
unos resultados uniformes entre
instrumentos y entre laboratorios. Solo
mediante el uso periódico de una mezcla
patrón de proteínas se puede determinar
si hay que optimizar otros factores
distintos de la columna. En la Figura 5
se muestra la excelente reproducibilidad
conseguida con instrumentos que
funcionan correctamente y utilizados en
condiciones similares.
Descripción
Tamaño
130 Å
Vial de 1,5 ml 5190-9416
300 Å
Vial de 1,5 ml 5190-9417
5
Referencia
Con un sistema de separación isocrático,
las explicaciones más probables sobre
las diferencias en los tiempos de
retención son la imprecisión del flujo
(quizás provocada por un mantenimiento
deficiente de la bomba o por el desgaste
general) o las diferencias en el volumen
muerto extracolumna (cambios en la
longitud o el diámetro del capilar, o en
el tamaño del loop de muestra). Esto es
particularmente importante al transferir
métodos a instrumentos LC de otros
fabricantes (consulte las Figuras 6 y 7).
AU
0,3
2
A
Agilent AdvanceBio SEC 300 Å 4,6 x 150 mm
en un sistema Waters H-Class (0,35 ml/min)
N.º Tiempo % área
1
2,842
12,2
2
3,253
87,8
0,25
0,2
0,15
0,1
1
0,05
0
0
AU
0,05
1
2
3
4
B
5
min
6
Agilent AdvanceBio SEC 300 Å 7,8 x 300 mm
en un sistema Waters Alliance (1,0 ml/min)
N.º Tiempo % área
1
6,392
12,5
2
7,263
87,5
0,04
0,03
0,02
0,01
0
0
2
4
6
8
10
12
14 min
Figura 6. Comparación de la separación de γ-globulina utilizando diferentes tamaños de columna
y distintos instrumentos.
AU
0,07
3
1. Agregados
2. Dímero
3. Monómero (% área = 86,6 %)
4. Fragmento de bajo PM
5. Conservante
0,06
0,05
0,04
0,03
0,02
2
0,01
5
4
1
0
0
2
4
6
8
10
12
Figura 7. Cuatro inyecciones repetidas de γ-globulina en un sistema HPLC Waters Alliance.
6
14
min
Conclusiones
Las columnas Agilent AdvanceBio
SEC se han desarrollado para ofrecer
un rendimiento óptimo sea cual sea el
instrumento usado. En este resumen
técnico se destacan algunos de los
aspectos que hay que considerar para
obtener resultados comparables en todo
tipo de instrumentos, desde instrumentos
antiguos de 400 bar hasta modernos
sistemas UHPLC, independientemente
de la ubicación o del usuario.
15 °C
167,5 bar
Rs = 1,758
% área monómero = 74,8 %
200
175
150
25 °C
140,6 bar
Rs = 1,825
% área monómero = 73,9 %
125
100
75
50
25
0
4,0
4,5
5,0
5,5
6,0
6,5
7,0
7,5
8,0
8,5
min
Figura 8. Efecto de la temperatura de análisis de γ-globulina.
85
Monómero (%)
Agregados (%)
Dímero (%)
20
83
18
81
16
79
14
77
12
75
10
73
8
71
6
69
4
67
2
65
15 °C
20 °C
25 °C
30 °C
35 °C
40 °C
Número de inyecciones
45 °C
50 °C
55 °C
% área agregados y dímero
Un factor que a menudo se pasa por
alto a la hora de determinar la robustez
de un método es la temperatura
de la separación. Con frecuencia,
las separaciones se llevan a cabo
a temperatura ambiente; no obstante,
la temperatura normal en un entorno
determinado puede fluctuar en función
de la hora del día y de las variaciones
estacionales, así como de la influencia
de la calefacción o el aire acondicionado.
En las separaciones en fase acuosa,
la retropresión varía notablemente con
los cambios de temperatura; asimismo,
algunas proteínas también se ven
afectadas. Cabría esperar una mejora de
la resolución al aumentar la temperatura;
no obstante, eso también podría cambiar
el nivel de agregación (consulte las
Figuras 8 y 9). Por este motivo, se
recomienda encarecidamente realizar las
separaciones con la columna instalada
en un horno con control termostático
y mantener las muestras en un entorno
de temperatura controlada.
mAU
225
% área monómero
Control de la temperatura
0
Figura 9. Efecto de la temperatura de análisis sobre el contenido de monómeros, dímeros y agregados
de γ-globulina.
7
www.agilent.com/chem
Esta información está sujeta a cambios sin previo aviso.
© Agilent Technologies, Inc., 2016
Publicado en EE. UU. el 1 de enero de 2016
5991-6302ES