AMINAS HETEROCÍCLICAS EN ALIMENTOS COCINADOS.

V Congreso Internacional
Alimentación, nutrición y dietética
Conferencias Sección A: Nutrición y Dietética
AMINAS HETEROCÍCLICAS
EN ALIMENTOS COCINADOS.
Mª Teresa Galceran
Departament de Química Analítica. Facultat de
Química. Universitat de Barcelona
Introducción
Diversos estudios epidemiológicos han puesto de manifiesto que existe una estrecha relación entre el tipo
de vida y la incidencia del cáncer en los seres humanos [1,2].Así, más de un 30% de los cánceres,
especialmente de pulmón se han asociado con el consumo de tabaco [3]. Sin embargo, es la dieta el
factor que contribuye en una mayor proporción al desarrollo de tumores y de hecho, entre un 35% y un
45% de los cánceres se asocian a este factor. Hora bien, el efecto de la dieta varía en función del tipo de
alimento, del modo de cocción, de su valor nutricional y de su composición. Por lo que hace referencia a
los mutágenos presentes en los alimentos hay que indicar que pueden provenir de distintas fuentes; así,
pueden ser de origen natural como por ejemplo, las micotoxinas, las hidracinas y algunos alcaloides y
flavonoides o bien pueden encontrarse en los alimentos como resultado de una contaminación de los
mismos como es el caso de los pesticidas, herbicidas o disolventes. Existe además, una tercera
categoría de compuestos genotóxicos entre los que se pueden citar las nitrosaminas, las nitrosoamidas,
los hidrocarburos aromáticos policíclicos y las aminas heterocíclicas y que son productos que se generan
durante el procesado y cocción de los alimentos. Los compuestos pertenecientes a esta tercera categoría
presentan una característica especial que los diferencia de otros contaminantes alimentarios y que hay
que tener en cuenta en la evaluación de la seguridad de los alimentos. Esta característica se refiere a
que para minimizar el riesgo de ingesta de los mismos puede ser necesario modificar algunos de los
hábitos culinarios de la población o bien los procedimientos de preparación industrial de algunos
alimentos.
Las aminas heterocíclicas: formación e importancia
Los primeros compuestos cancerígenos que se detectaron en alimentos procesados térmicamente fueron
los hidrocarburos aromáticos policíclicos. Sin embargo, a finales de los años 70 Sugimura y
colaboradores [4] descubrieron que en determinadas condiciones, el humo procedente de la cocción de
alimentos ricos en proteínas contenía cantidades apreciables de sustancias mutágenas. Estudios
posteriores pusieron de manifiesto que las partes más tostadas de carnes y pescados asados
presentaban un actividad mutágena notable debida a la presencia de unas substancias básicas.
Actualmente se han identificado 23 de estas substancias, todos ellas pertenecientes al grupo genérico de
las aminas heterocíclicas (HAs). Dependiendo del mecanismo de generación y de los precursores, las
HAs se pueden clasificar en dos grandes grupos, las carbolinas y los aminoimidazoazarenos. En la
Figura 1 se muestran las estructuras de algunas de las aminas más importantes. Las carbolinas también
conocidas como aminas pirolíticas, se forman a temperaturas superiores a los 300ºC por pirólisis de
aminoácidos o proteínas vía reacciones radicalarias. Estas aminas contienen en su estructura grupos
piridoindol (Trp-P-1, Trp-P-2, A C, MeA C, harman, norharman) o piridoimidazol (Glu-P-1, Glu-P-2). El
segundo gran grupo, los aminoimidazoazarenos (AIA), recibe el nombre genérico de aminas térmicas ya
que se forman al cocinar alimentos ricos en proteínas, como la carne o el pescado, a temperaturas
inferiores a los 300ºC. Todas ellas contienen en su estructura el grupo 2-aminoimidazo y una quinolina
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(IQ, MeIQ), una quinoxalina (MeIQx, DiMeIQx) o un anillo de piridina (PhIP, DMIP). En general, los
imidoazoazarenos son compuestos algo más polares que las carbolinas, característica que se utiliza para
la agrupación de las aminas heterocíclicas en dos familias. Desde el punto de vista de su actividad
mutagénica, y por tanto de su potencial cancerígeno, se ha establecido, utilizando el test de Ames, que
algunas de las aminas presentan un índice de mutagenicidad más de 1000 veces superior al del
benzo(a)pireno lo que pone de manifiesto su elevada toxicidad potencial. De hecho, existen datos que
demuestran que estos compuestos son cancerígenos en ratones, ratas y primates en los que se han
detectado tumores en diversos órganos como por ejemplo el hígado, los intestinos, el estómago, el
pulmón, la piel y las glándulas mamarias [5].
Aminoimidazoazaarenos (AIAs)
NH2
NH2
N
N
N
IQ
N
MeIQ
N
N
N CH3 C H 3
N CH3
N
N
N
MeIQx
CH 3
4,8-DiMeIQx
NH2
C H3
N C H3 C H
3
N
N
7,8-DiMeIQx
C H3
N
PhIP
N
NH2
N
N
H
MeAα
αC
C H3
N
N
H
Harman
N H2
N
TriMeIQx
N
DMIP
N
N
H
Norharman
CH3
CH 3
N
N
N CH 3
N
N
NH2
H
CH 3
Trp-P-1
CH3
CH 3
N
NH2
N
N
CH3
N
N
NH 2
N
C H3
N
H
Aα
αC
CH3
NH 2
NH2
N
C H3
N CH3
N CH3
CH3
Carbolinas
NH2
N
N
NH 2
N
C H3 Glu-P-1
N
H
Trp-P-2
N
N H2
N
NH 2
N
Glu-P-2
Figura 1.- Estructuras de las aminas heterocíclicas más importantes
La formación de las aminas heterocíclicas durante el procesado industrial y/o culinario de los alimentos
cárnicos puede estar influida por algunos factores composicionales como la creatina presente en el tejido
muscular, la grasa o el agua así como los azúcares y los aminoácidos. Así, diversos estudios han puesto
de manifiesto que la creatina es necesaria para la formación de los aminoimidazoazarenos y que existe
una relación directa entre la cantidad de aminoacidos o péptidos de cadena corta y la actividad
mutagénica resultante. En cuanto a los azúcares, se ha demostrado que su presencia es necesaria para
la formación de las aminas aunque algunos autores han puesto de manifiesto que la adición de glucosa o
lactosa a la carne inhibe en parte la formación de aminas y en consecuencia, disminuye la actividad
mutagénica generada por la cocción. En la Tabla 1 se indican los precursores de algunas de las aminas
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heterocíclicas más frecuentemente estudiadas. El agua y los lípidos que contienen los alimentos parece
que también tienen importancia en la generación de compuestos mutagénicos dado que durante el
proceso de cocción los precursores solubles en agua migran junto con ésta a la superficie de los
alimentos donde son expuestos a temperaturas relativamente altas que favorecen la reacción de
formación de dichos compuestos. Esto explica que el nivel de actividad mutagénica de la superficie de la
carne frita sea superior a la de la zona central, donde la temperatura es normalmente más baja. El papel
desempeñado por los lípidos no está tan claro dado que algunos estudios sugieren que las grasas
pueden hacer aumentar la formación de las aminas heterocíclicas al favorecer la transmisión del calor
mientras que otros indican que la posible dilución de los precursores en las grasas puede hacer disminuir
la producción de estos compuestos. Los antioxidantes tanto naturales como sintéticos, como por ejemplo
el butilhidroxianisol, parece que hacen disminuir la actividad mutagénica de la carne frita.
TABLA 1.- PRINCIPALES PRECURSORES DE LA AMINAS
HETEROCÍCLICAS
Acrónimo
IQ
MeIQ
MeIQx
4,8-DiMeIQx
7,8-DiMeIQx
PhIP
Trp-P-1
Trp-P-2
Glu-P-1
Glu-P-2
A C
MeA C
Precursores
creatina, glicina, fenilalanina, serina, prolina,
fructosa, glucosa
creatina, lanina, fructosa
creatina, glicina, alanina, treonina, lisina, fructosa,
glucosa, ribosa
creatina, alanina, treosina, lisina, fructosa, glucosa,
ribosa
creatina, glicina, glucosa
creatina, fenilalanina, glucosa
triptófano
triptófano
ácido glutámico
ácido glutámico
globulina de semillas de soja
globulina de semillas de soja
Diversos estudios llevados a cabo con modelos fisico-químicos han puesto de manifiesto que la creatina
y los productos de la reacción de Maillard, originados a partir de la glucosa y algunos aminoácidos tienen
un papel importante en la formación de los aminoimidazoazarenos. En la Figura 2 se muestra el proceso
de formación de estos compuestos propuesto por Jägerstad [6] donde se sugiere que la parte
aminoimidazólica de la amina es aportada por la creatinina originada por ciclación de la creatina mientras
que el resto de la molécula proviene de la condensación aldólica de una piridina o una piracina con un
aldehído, ambos generados a partir de la degradación de Strecker de una hexosa y un aminoácido.
Además de los factores composicionales, la aparición de estos contaminantes en el tratamiento térmico
de los alimentos proteicos está influida por otros factores como por ejemplo el material en el que se lleva
a cabo el tratamiento, el tiempo, la temperatura y el tipo de cocción. Se ha observado que las aminas
heterocíclicas se empiezan a formar a los 100ºC y que la actividad mutagénica aumenta con la
o
temperatura hasta los 170 C - 200ºC. Así en general, los tipos de cocción que implican temperaturas
alrededor de los 100ºC como hervir en agua, hacer al vapor o estofar generan pocos agentes
mutagénicos. Sin embargo, los tratamientos térmicos que implican un calentamiento mediante procesos
conductivos como freír o asar conducen a un aumento de la actividad mutagénica.
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OR
C 6 H 12 O 6
NH 2
HN
N CH 3
HOOC
O
+NH
3
hexosa
creatina
aminoácido
- H 2O
Degradación de Strecker
Y
X
Z
N
H
CH 3
+
N
+
O C R
O
piridina o pirazina
aldehído
N
N H2
N CH 3
creatinina
NH 2
Y
Z
N CH 3
R, X e Y pueden ser H o CH 3
X
N
R
Z puede ser CH o N
aminoimidazoazaareno
Figura 2.- Formación de los aminoimidazoazarenos (AIA)
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Métodos de determinación de las aminas heterocíclicas
Para evaluar el riesgo que supone la presencia de aminas heterocíclicas en los alimentos es
imprescindible disponer de metodologías analíticas capaces de identificar y determinar estos compuestos
a niveles de concentración muy bajos, del orden de los ppb. Pero no es suficiente que la metodología
analítica utilizada sea sensible, también debe ser lo más selectiva posible ya que los alimentos contienen
una elevada cantidad de compuestos interferentes. Además, la complejidad de las muestras requiere
frecuentemente la utilización de etapas de preconcentración y purificación laboriosas que hacen
aumentar el tiempo de análisis y disminuir la reproducibilidad de los resultados. Por ello, es necesario
establecer métodos de análisis que además de ser selectivos y sensibles, sean rápidos, robustos e
independientes de la matriz de la muestra.
Las estrategias para conseguir una buena preconcentración de las aminas heterocíclicas y una adecuada
limpieza de la muestra han sido ampliamente estudiadas en los últimos años [7] y el resultado ha sido el
establecimiento de complejas metodologías analíticas que incluyen varias etapas generales. En la
primera de ellas se procede a una homogeneización y dispersión de la muestra utilizando disolventes
orgánicos o bien disoluciones acuosas ácidas, básicas o neutras. El siguiente paso consiste en la
separación de las proteinas mediante centrifugación, filtración o adsorción y a continuación, las aminas
heterocíclicas se extraen con disolventes orgánicos y el extracto se somete a una limpieza más
exhaustiva utilizando varias etapas de partición ácido-base o bien sorbentes suficientemente específicos,
como por ejemplo adsorbentes poliméricos, resinas de intercambio iónico, fases de otadecilsilano sobre
sílice, inmunoadsorbentes y más recientemente polímeros de huella molecular (imprinted polymers).
Finalmente, se debe concentrar el extracto a fin de conseguir un nivel de concentración de los analitos
adecuado a la técnica de determinación a utilizar.
De todos los métodos de tratamiento de muestra propuestos en la bibliografía, el de más amplia
aceptación es el que propuso Gian Gross [8] el año 1990 y que utiliza una serie de columnas en tándem
que permiten llevar a cabo las distintas etapas del proceso de tratamiento de la muestra con una cierta
rapidez y seguridad. En la primera columna se coloca la muestra que se ha dispersado en hidróxido de
sodio y mezclado con tierra de diatomeas. Al eluir con diclorometano los analítos quedan retenidos en
una segunda columna que contiene propilsulfonato sódico (PRS). Posteriormente se activa el
intercambior iónico, se conecta la columna con una de octadecilsilano (C18), y se eluyen las aminas
heterocíclicas con acetato de amonio. En el extracto obtenido se encuentran los aminoimidazoazarenos.
En la bibliografía se encuentran numerosas variantes de este método de entre las cuales la más utilizada
es la propuesta por G. Gross y A. Grüter en 1992 [9] que ha sido modificada por nuestro grupo de trabajo
[10] y que es la que se indica en la Figura 3. En este método se recogen los lavados procedentes de la
columna de PRS y se procede a su tratamiento en una columna de C18 lo que permite recoger la fracción
denominada de las aminas apolares que contiene las carbolinas. Así, además de las ventajas aportadas
por el tándem original, este método permite el análisis de las dos familias de aminas heterocíclicas.
Otra variante introducida por nuestro grupo de investigación en el método original consiste en la
activación del intercambior iónico previamente a la retención de los analitos [11], de manera que se
preconcentran todas las aminas heterocíclicas en una única fracción. Esta propuesta supone una
reducción tanto de material utilizado como del tiempo de análisis aunque hay que señalar que el extracto
es menos limpio que el obtenido utilizando el procedimiento comentado previamente. Algunos autores
[12] recomiendan utilizar una etapa adicional de clean-up con resinas de intercambio iónico que aunque
consigue una mayor limpieza de los extractos también provoca un aumento del tiempo de análisis y una
disminución en las recuperaciones ya de por sí bastante bajas, entre el 40 y el 100% dependiendo del
compuesto y del procedimiento.
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Extracto de carne
12 ml NaOH 1 M
Extracción con Extrelut-20
Elución con 75 ml DCM
Extracción con PRS , 500 mg
1ª elución:
a) 6 ml HCl 0,01 M
b) 15 ml MeOH:HCl 0,1 M
(60:40)
c) 2 ml H 2 O
Neutr. con 500µl NH 3
Adic. 25 ml H 2 O
Preconc. con C18, 500 mg
Lavado con 2 ml H 2 O
Elución: 1,4 ml MeOH:NH 3
(9:1)
2ª elución:
20 ml AcONH 4 0,5 M
pH=8
Preconc. con C18 , 100 mg
Lavado con 5 ml H2 O
Elución: 0,8 ml MeOH:NH 3
(9:1)
Cambio de disolvente,
50µl MeOH
Cambio de disolvente,
50µl MeOH
HPLC
Aminas Polares
HPLC
Aminas Apolares
Figura 3.- Esquema del procedimiento de clean-up.
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En cuanto a las técnicas utilizadas para el análisis de los extractos purificados, es de destacar el uso de
la cromatografía de líquidos (LC) con detección espectrofotométrica (UV), fluorimétrica o electroquímica y
más recientemente su acoplamiento a la espectrometría de masas [13]. De todos estos sistemas de
detección el que se ha utilizado tradicionalmente es la espectrofotometría UV con instrumentos de series
de diodos que permiten obtener información de los compuestos analizados [14]. Sin embargo, la
selectividad y sensibilidad de los espectrofotómetros es baja y por esta razón con frecuencia, se utilizan
simultáneamente con un detector fluorimétrico que proporciona una mayor selectividad y sensibilidad
para las aminas fluorescentes que son algunas carbolinas (Glu-P-1, Glu-P-2, Trp-P-1, Trp-P-2) y la PhIP
[15]. Dado que las aminas heterocíclicas pueden ser fácilmente oxidadas, la deteccion electroquímica es
también una buena opción para la determinación de estos compuestos [16] aunque hay que señalar que
con este tipo de detección no se puede obtener fácilmente información adicional que ayude a la
identificación. Sin embargo, la sensibilidad es elevada como puede observarse en la tabla 2 donde se
dan los límites de detección obtenidos con un detector amperométrico y uno espectrofotométrico (UV).
Tabla 2 - Límites de detección obtenidos con distintos detectores (pg
inyectados).
Compuesto
LC-EC
LC-UV
LC-MS (ESI-IT)
DMIP
IQ
MeIQx
MeIQ
4,8-DiMeIQx
Trp-P-2
Trp-P-1
PhIP
Aα
αC
MeAα
αC
16
40
44
65
41
5
54
11
22
33
1300
1400
200
1300
200
200
200
1500
800
1000
67
22
9
8
5
7
4
13
27
15
Durante los últimos años y a raíz del desarrollo de las técnicas de ionización a presión atmosférica (API),
el acoplamiento de la cromatografía de líquidos a la espectrometría de masas (LC-MS) ha pasado a ser
la técnica más recomendada para la determinación de aminas heterocíclicas en alimentos [17,18]. La
ventaja más importante del acoplamiento LC-MS es que permite la identificación inequívoca de los
analítos a partir del espectro de masas pero es que además, los límites de detección son muy buenos y
similares o incluso mejores que los que pueden obtenerse por ejemplo con detección electroquímica
como puede observarse en los valores recogidos el la tabla 2 que se han obtenido utilizando una fuente
de ionización de electrospray y un ion-trap como analizador. Aunque la espectrometría de masas es una
técnica de elevada selectividad, cuando las concentraciones son muy bajas y las muestras son complejas
puede resultar difícil cuantificar los analítos y en estos casos, resulta ventajoso trabajar con
espectrometría de masas en tándem (LC-MS/MS) aunque este modo de trabajo requiere la utilización de
instrumentos más complejos que los espectrómetros de masas convencionales de un único cuadrupolo.
Niveles de aminas heterocíclicas en alimentos cocinados
Las aminas heterocíclicas se han detectado en carnes de distinto origen (bovino, ovino, porcino y aves de
corral) y en pescados fritos, a la plancha o a la parrilla y procedentes tanto de restaurantes como de
casas particulares así como en productos precocinados, en extractos de carne, en aromatizantes
comerciales y en los residuos que quedan en las sartenes o las planchas después de la cocción.
También se ha descrito su presencia en muestras medioambientales y en algunas bebidas alcohólicas
como el vino o la cerveza aunque lo más frecuente es encontrarlas en alimentos proteicos que han sido
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sometidos a tratamientos térmicos a elevadas temperaturas. En la Tabla 3 se dan a modo de ejemplo, los
intervalos de concentración de las aminas heterocíclicas que con más frecuencia se encuentran en
algunos tipos de alimentos, carnes y pescado, sometidos a diferentes procedimientos de cocción [19,
20]. Aunque los niveles de concentración son muy variados, oscilan entre los 0.1 y los 40 ng/g, es de
interés señalar que los valores más elevados corresponden siempre a alimentos tratados a temperaturas
altas y en algunos de estos casos, las concentraciones, especialmente para la PhIP, pueden alcanzar los
400 ng/g. En general, las cantidades de aminas producidas aumentan con la temperatura y el tiempo y se
ha demostrado que para algunos compuestos, por ejemplo la PhIP, su formción está favorecida a
temperaturas elevadas. También es interesante remarcar que las temperaturas relativamente bajas y los
tiempos de cocción relativamente largos, favorecen la presencia de las aminas en los residuos de la
sartén lo que es explicable por el transporte de los precursores de las aminas desde la carne a la sartén
lo que produce como consecuencia una disminución de estos compuestos en la superficie de los
alimentos y un aumento en los residuos. Algunos estudios recientes indican que la concentración de
estos compuestos en la superficie de la carne puede disminuir si se cocina a temperatura relativamente
baja y girando con frecuencia la carne.
Uno de los problemas a remarcar en relación con los datos de la bibliografía es que en la mayor parte de
los trabajos en los que se indican los niveles de estos compuestos en alimentos no se describe con
exactitud el procedimiento de cocción utilizado y además, en algunos casos sobre todo en los trabajos
más antiguos, la temperatura se ha aumentado a fin de favorecer la formación de las aminas y así
poderlas detectar. Cabe destacar también que los métodos de análisis utilizados por los laboratorios que
generan los datos pueden ser distintos y con frecuencia no han sido validados. Por ello, los valores de la
bibliografía son difícilmente comparables entre sí lo que lleva a pensar que pueden resultar poco
representativos de la cantidad real de aminas heterocíclicas que contienen los alimentos y que por tanto,
puede afectar a la población.
Tabla 3.- Contenido (ng/g) de varias HAs en diferentes muestras de alimentos cocinados.
Muestra
IQ
MeIQx
4,8-DiMeIQx
PhIP
Ternera
Frita
n.d.-1.9
n.d.-12.3
n.d.-3.9
n.d.-67.5
A la plancha
n.d-0.2
n.d.-6.0
n.d.-1.2
n.d.-290
a la parrilla
n.d.-1.6
n.d.-4.4
n.d.-2.7
n.d.-38
Extracto
n.d.-15
n.d.-20
n.d.-4.0
n.d.-10
Pollo
Frito
n.d.
n.d.-3.0
n.d.-2.0
n.d.-70
A la plancha
n.d.
n.d.-6.1
n.d.-4.0
n.d.-315
a la parrilla
n.d.
n.d.-9.0
n.d.-3.1
n.d.-390
Cerdo
Frito
n.d.-0.1
n.d.-4.6
n.d.-3.3
n.d.-13.4
A la plancha
n.d.
n.d.-0.6
n.d.-0.2
n.d-6.6
Cordero
Frito
n.d.
n.d.-0.6
n.d.-0.6
n.d.-2.3
A la plancha
n.d.
n.d.-1.6
n.d.-0.7
n.d.-11
Pescado
Frito
n.d.-0.2
n.d.-6.4
n.d.-0.1
n.d.-6.4
A la plancha
n.d.-1.0
n.d.-4.6
n.d.-0.1
n.d.-51
n.d.: no detectado
En España no existen estudios sobre la concentración de estos compuestos en los alimentos y en este
campo incide el trabajo que estamos llevando a cabo en nuestro grupo de trabajo que pretende
establecer y validar metodología analítica para la determinación de las aminas heterocíclicas en
alimentos. Además, también se pretende llevar a cabo una estimación de la ingesta de aminas
heterocíclicas basada en encuestas sobre los platos de carne y pescado más frecuentemente
consumidos por la población y en el análisis de muestras de alimentos cocinados de modo tradicional y
con distintos grados de cocción tanto en domicilios particulares como en restaurantes.
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