FITOQUÍMICOS

FITOQUÍMICOS
Tema 1. Introducción. Definiciones. Procedimientos generales de aislamiento y caracterización de fitoquímicos.
Tema 2. Polisacáridos.
Tema 3. Terpenos y esteroides.
Tema 4. Fenoles simples.
Tema 5. Polifenoles.
Tema 6. Curcuminoides.
Tema 7. Taninos.
Tema 8. Lignanos y antraquinonas. Tema 9. Alcaloides
T. Girbes y P. Jiménez Tema 1. Introducción. Definiciones. Procedimientos generales de aislamiento y caracterización de fitoquímicos.
1. Métodos de separación (cromatográficos).
2. Métodos de elucidación estructural (espectrofotométricos, electroforéticos, etc.).
3. Métodos farmacológicos (actividad microbiana, insecticida, parasiticida, antitumoral, antiviral, inmunoestimulante, etc.; Planta
bench‐top assays).
Extracto
OPERACIONES PRELIMINARES
Separación grosera
Identificación botánica del material (muchas variedades)
Separación fina
Selección de la parte del vegetal a extraer (parte útil)
Caracterización Inactivación de los sistemas enzimáticos del vegetal si se trabaja con material fresco
Propiedades Desecación de los vegetales bajo condiciones controladas para evitar transformaciones químicas de los componentes
T. Girbes y P. Jiménez Farmacológicas y/o saludables
Compuestos químicos
estroma
Planta molturación para destruir el estroma FACILITAR la liberación de los principios Extracción de los principios activos
T. Girbes y P. Jiménez Compuestos químicos
estroma
Planta molturación para destruir el estroma FACILITAR la liberación de los principios Extracción de los principios activos
T. Girbes y P. Jiménez Cultivo de callos vegetales de una planta seleccionada (ej. libre de virus)
Cultivo de plantitas derivadas de callos vegetales de una planta seleccionada (ej. libre de virus)
T. Girbes y P. Jiménez ADN
RTasa
mRNA
Fragmentos de ADN cADN
Inserción en plásmidos
(ej. fago lambda
(Agrobacterium spp.)
T. Girbes y P. Jiménez paclitaxel
T. Girbes y P. Jiménez EXTRACCIÓN Tratamiento de la planta con disolventes para facilitar la interacción fitoquímico‐disolvente.
‐Extracción simple o maceración (en caliente se denomina infusión) ‐Extracción continua o percolación (se utiliza para la extracción de perfumes muy valiosos) T. Girbes y P. Jiménez EXTRACCIÓN Tratamiento de la planta con disolventes para facilitar la interacción fitoquímico‐disolvente.
‐Extracción simple o maceración
‐Extracción continua o percolación
‐Extracción en continuo a reflujo (Soxhlet) (prácticas de ATA)
T. Girbes y P. Jiménez T. Girbes y P. Jiménez EXTRACCIÓN Tratamiento de la planta con disolventes para facilitar la interacción fitoquímico‐disolvente.
‐Extracción simple o maceración
‐Extracción continua o percolación
‐Extracción en continuo a reflujo (Soxhlet)
‐Extracción con fluidos supercríticos (EFS)
Con CO2 supercrítico: aceites esenciales de plantas aromáticas, lúpulo, aromas y sabores, café y té sin cafeína.
T. Girbes y P. Jiménez Extracción con fluidos supercríticos (EFS) Con CO2 supercrítico: aceites esenciales de plantas aromáticas, lúpulo, aromas y sabores, café y té sin cafeína.
Estado intermedio entre gas y líquido.
Gran aumento de la capacidad disolvente. Presión Pc
Fluido supercrítico
sólido
líquido
Punto crítico
gas
Temperatura
Variación de la capacidad disolvente por variación de P y T ambos por encima del punto crítico.
La viscosidad es mucho más baja que la de los líquidos.
Tc
T. Girbes y P. Jiménez Muy baja tensión superficial que permite una alta penetrabilidad a través de sólidos
Mayor difusividad que en líquidos
Propiedades críticas de varios solventes
Solvente Peso molecular Tª crítica Presión crítica Densidad crítica g/mol K atm g/cm3 CO2
44,01 72,8
0,469 H2O 18,02 647,3 218,3
0,348 Etileno 28,05 282,4 49,7
0,215 Propileno
42,08 364,9 45,4
0,232 512,6 79,8
0,272 Etanol
46,07 513,9 60,6
0,276 Acetona
58,08 508,1 46,4
0,278 Metanol 32,04 304,1 T. Girbes y P. Jiménez Propiedades críticas de varios solventes
Solvente Peso molecular Tª crítica Presión crítica Densidad crítica g/mol K atm g/cm3 CO2
44,01 72,8
0,469 H2O 18,02 647,3 218,3
0,348 Etileno 28,05 282,4 49,7
0,215 Propileno
42,08 364,9 45,4
0,232 512,6 79,8
0,272 Etanol
46,07 513,9 60,6
0,276 Acetona
58,08 508,1 46,4
0,278 Metanol 32,04 304,1 T. Girbes y P. Jiménez Ventajas de la extracción con fluidos supercríticos (reducen los riesgos de degradación de principios por la manipulación).
Flexibilidad
Selectividad
Bajo costo
No degradación de los extractos
Fácil acoplamiento a cromatógrafo de gases y a equipo de HPLC
T. Girbes y P. Jiménez Extracción liquido‐liquido en Soxhlet con disolventes de polaridad creciente.
Los distintos disolventes permiten la extracción de compuestos de distinta polaridad sin tener que calentar en exceso. T. Girbes y P. Jiménez Extracción líquido‐liquido.
Es una etapa previa a la extracción con diversos disolventes.
Se utilizan dos disolventes inmiscibles que se agitan con la muestra durante un cierto tiempo. Los compuestos van a cada disolvente según su solubilidad y afinidad. Se denomina también de reparto.
Al final cada uno de los disolventes está enriquecido en determinados solutos y no en otros. Se utilizan frascos de decantación. Se utilizan las propiedades acido‐base de los compuestos, jugando con los pH de los disolventes de extracción.
Este procedimiento se utiliza mucho para el aislamiento de alcaloides. Los alcaloides suelen tener nitrógenos secundarios o terciarios que son los que les confieren las propiedades de alcaloide . En medio ácido forman sales solubles en agua. En medio alcalino forman la base libre insoluble en agua pero soluble en disolventes orgánicos como el etil acetato. T. Girbes y P. Jiménez Fase apolar
Concentración de compuestos apolares Fase polar
Concentración de compuestos polares T. Girbes y P. Jiménez Extracción líquido‐liquido.
Es una etapa previa a la extracción con diversos disolventes.
Se utilizan dos disolventes inmiscibles que se agitan con la muestra durante un cierto tiempo. Los compuestos van a cada disolvente según su solubilidad. Se denomina también de reparto.
Al final cada uno de los disolventes está enriquecido en determinados solutos y no en otros. Se utilizan frascos de decantación. Se utilizan las propiedades acido‐base de los compuestos, jugando con los pH de los disolventes de extracción.
Este procedimiento se utiliza mucho para el aislamiento de alcaloides. Los alcaloides suelen tener nitrógenos secundarios o terciarios que son los que les confieren las propiedades de alcaloide. En medio ácido forman sales solubles en agua. En medio alcalino forman la base libre insoluble en agua T. Girbes y P. Jiménez pero soluble en disolventes orgánicos como el etil
acetato. Fase apolar, más ligera
Fase polar, más pesada
T. Girbes y P. Jiménez Alcaloides base/medio alc.
Carotenos, licopenos
Aceites esenciales
Aromas
Polisacáridos solubles
Polifenoles glucosilados
Vitaminas hidrosolubles
Curcumina
morfina
Fase apolar, más ligera
Fase polar, más pesada
T. Girbes y P. Jiménez Alcaloides base/medio alc.
Carotenos, licopenos
Aceites esenciales
Aromas
(Curcumina)
Polisacáridos solubles
Polifenoles glucosilados
Vitaminas hidrosolubles
(Curcumina)
morfina
acetilo
Alcaloides base/medio alc.
Carotenos, licopenos
Fase apolar, Papaver somniferum
Aceites esenciales
más ligera
(adormidera; contiene Aromas
distintos alcaloides
Fase polar, más pesada
T. Girbes y P. Jiménez Polisacáridos solubles
Polifenoles glucosilados
Vitaminas hidrosolubles
Curcumina
metoxi
morfina
acetilo
acetilo
Alcaloides base/medio alc.
Carotenos, licopenos
Fase apolar, Papaver somniferum
Aceites esenciales
más ligera
(adormidera; contiene Aromas
distintos alcaloides
Fase polar, más pesada
Polisacáridos solubles
Polifenoles glucosilados
Vitaminas hidrosolubles
Curcumina
Metoxi‐morfina: codeína
T. Girbes y P. Jiménez Diacetil‐morfina: heroína Morfinano de codeína y morfina
T. Girbes y P. Jiménez CODEÍNA: RESTRICCIONES DE USO COMO ANALGÉSICO EN PEDIATRÍA
Fecha de publicación: 17 de junio de 2013
Tras conocerse casos graves, algunos de ellos mortales, asociados a la administración de codeína en niños para el tratamiento sintomático del dolor, se recomiendan las siguientes restricciones:
La codeína está indicada únicamente para el tratamiento del dolor agudo moderado en niños mayores de 12 años para los que no se considere adecuado el uso de ibuprofeno o paracetamol como único analgésico.
La codeína es un opioide que, entre otras indicaciones, se encuentra autorizado como analgésico, bien como monofármaco o en combinación con otros principios activos (paracetamol, ibuprofeno o ácido acetil salicílico).
El efecto farmacológico de la codeína se debe a su transformación en morfina a través de
la enzima CYP2D6 del citocromo P450. Existen diferencias genéticas en cuanto a la
expresión de esta enzima que determinan el grado de esta metabolización. Así las personas con deficiencia en la enzima CYP2D6 obtendrán un menor efecto analgésico
mientras que aquellas que tengan más de dos copias del gen que la codifica
(metabolizadores ultra‐rápidos) transformarán la codeína en morfina más rápidamente y
por tanto tendrán más posibilidades de presentar reacciones adversas derivadas de la
T. Girbes y P. Jiménez intoxicación por morfina.
ARRASTRE DE VAPOR
Un procedimiento sencillo que permite el aislamiento de substancias volátiles de las planta es el arrastre de vapor.
El vapor de agua extrae las substancias vaporizables que se condensan posteriormente en matraces junto con le agua. Como normalmente son inmiscibles con el agua se forman dos capas fácilmente separables por decantación. Se utiliza para el aislamiento de aceites esenciales y aromas de especias y plantas aromáticas que posteriormente se añaden a los alimentos y los preparados farmacéuticos. T. Girbes y P. Jiménez ARRASTRE DE VAPOR
Un procedimiento sencillo que permite el aislamiento de substancias volátiles de las planta es el arrastre de vapor.
El vapor de agua extrae las substancias vaporizables que se condensan posteriormente en matraces junto con le agua. Como normalmente son inmiscibles con el agua se forman dos capas fácilmente separables por decantación. Se utiliza para el aislamiento de aceites esenciales y aromas de especias y plantas aromáticas que posteriormente se añaden a los alimentos y los preparados farmacéuticos. T. Girbes y P. Jiménez METODOS GENERALES DE SEPARACIÓN.
Sublimación (cafeína)
Destilación (productos volátiles separables por el punto de ebullición; aceites esenciales)
Liberación fraccionada (solubilización acuosa de sales de alcaloides en mezclas complejas insolubles en agua)
Cristalización fraccionada (se aprovecha la solubilidad dependiente de temperatura en diferentes disolventes; ej. sacarosa) Técnicas cromatográficas. Se basan en las propiedades de: adsorción‐desorción (columna y capa fina)
reparto o partición
exclusión molecular (columna)
iónicas (intercambio iónico; columna) afinidad (columna)
Electroforésis
Papel y derivados de celulosa Geles de poliacrilamida (proteínas; analítica)
T. Girbes y P. Jiménez Capilar (analítica y preparativa)
Cromatografía de adsorción‐desorción.
Soporte sólido microporoso (sílice, alúmina, tierra de diatomeas, caolín, carbonato cálcico, etc.) al que se adsorben los compuestos disueltos en un disolvente. Los compuestos adsorbidos se eluyen con el mismo disolvente o con otro diferente. La adsorción depende de factores de carga y de polaridad. Los disolventes juegan un papel importante al provocar la desorción selectiva de cada compuesto. La detección se realiza por Tinción o por visualización con lámpara UV. T. Girbes y P. Jiménez Cromatografía de intercambio iónico Cromatografía de afinidad (afinidad ligando receptor)
Cromatografía de exclusión molecular (masa moleculares relativas)
Cromatografía de papel (aminoácidos y algunos producto naturales) Cromatografía en capa fina versatilidad
adsorbentes de silica gel, celulosa, óxido de aluminio, poliamida, hidróxido cálcico
velocidad
sensibilidad
disolventes más comunes: cloroformo, éter etílico, etil acetato, y sus mezclas Rf: distancia recorrida/distancia del frente; hay que introducir patrones puros como referencias
Detección: se realiza mediante pulverización con reactivos que dan productos coloreados visibles directamente o mediante luz ultravioleta (onda corta 254 nm
y onda larga 365 nm). En algunos casos se puede utilizar también directamente la luz UV.
T. Girbes y P. Jiménez Capa fina preparativa: se aplica la muestra en una línea continua. Cromatografía de intercambio iónico Cromatografía de afinidad (afinidad ligando receptor)
Cromatografía de exclusión molecular (masa moleculares relativas)
Cromatografía de papel (aminoácidos y algunos producto naturales) Cromatografía en capa fina versatilidad
adsorbentes de silica gel, celulosa, óxido de aluminio, poliamida, hidróxido cálcico
velocidad
sensibilidad
disolventes más comunes: cloroformo, éter etílico, etil acetato, y sus mezclas Rf: distancia recorrida/distancia del frente; hay que introducir patrones puros como referencias
Detección: se realiza mediante pulverización con reactivos que dan productos coloreados visibles directamente o mediante luz ultravioleta (onda corta 254 nm
y onda larga 365 nm). En algunos casos se puede utilizar también directamente la luz UV.
T. Girbes y P. Jiménez Capa fina preparativa: se aplica la muestra en una línea continua. T. Girbes y P. Jiménez Cromatografía de gases
T. Girbes y P. Jiménez T. Girbes y P. Jiménez Cromatografía líquida de alta eficacia (HPLC)
T. Girbes y P. Jiménez Cromatografía líquida de alta eficacia (HPLC)
T. Girbes y P. Jiménez T. Girbes y P. Jiménez ESPECTROMETRÍA DE MASAS
Fragmentación y separación de los iones positivos por relación masa/carga.
T. Girbes y P. Jiménez Espectrometría de masas de lectinas de S. ebulus
Jimenez y cols. (2013) Food Chemistry (136:794‐80) SELfd
Lectina del tipo B‐B de frutos del saúco enano (Sambucus ebulus)
Ebulina f
proteína inactivadora de ribosomas del tipo A‐B de frutos del saúco enano (Sambucus ebulus)
T. Girbes y P. Jiménez Espectrometría de masas de lectinas de S. ebulus
Jimenez y cols. (2013) Food Chemistry (en prensa) Péptidos trípticos de SELfd
Péptidos trípticos de ebulina f T. Girbes y P. Jiménez