Diapositiva 1

Introducción a los Cultivos Celulares
100 años de Cultivos Celulares
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Un poco de historia
• 1880-1910: Primeros ensayos de sobrevida de células
fuera de organismos enteros (Roux, Haberlandt, etc.)
• 1912: Burrows y Carrel establecen las primeras líneas
celulares. Desarrollan técnicas asépticas de trabajo y
material específico
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Un poco de historia
•
•
1920-1940: Se establecen líneas celulares de diversos órganos animales
1940-1955:
– Se replican virus sobre células cultivadas
– Se producen las primeras vacunas virales en cultivos celulares
– Se definen las condiciones para congelar células en nitrógeno líquido (Alan
Parks, 1949)
– Se establece la línea HeLa (1ª de origen humano, 1952)
– Se desarrollan los primeros medios de cultivo químicamente definidos
– Se cultivan las primeras células de insectos
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Un poco de historia
•
•
1960’s: Se desarrollan las técnicas de hibridización en cultivos
1970’s:
– Los cultivos celulares se incorporan a la ingeniería genética
– Desarrollo de grandes reactores de cultivos en suspensión
•
Reciente:
– Modificación genética controlada de células
– Desarrollo de medios de cultivo libres de suero
– Desarrollo de medios de cultivo libres de componentes animales
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Cultivos celulares
• Propagación de células fuera del organismo de
origen
• Pueden ser de origen vegetal o animal, y dentro
de éstas, pueden provenir de distintos tejidos de
vertebrados o invertebrados
• Los cultivos celulares producen clones, por lo
que todas las células de un cultivo poseen el
mismo genotipo, excepto que se produzcan
mutaciones durante el proceso
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¿Para qué cultivar células in vitro ?
• Investigación
– Comprender la fisiología celular
– Toxicología, virología, etc.
• Ingeniería de tejidos
– Piel, hígado
– Hueso y cartílago
• Producción de biológicos
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–
–
–
Anticuerpos monoclonales
Hormonas (FSH)
Enzimas
Vacunas virales (polio, aftosa, parvo, moquillo, etc.)
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Ventajas
• Un solo tipo bien definido de células en cada cultivo
• Fácil de manipular, condiciones controladas
• Establecimiento de líneas internacionales de fácil
acceso
• Alternativa al uso de animales
– Sistema para estudiar principios fisiológicos
– Chequeo posterior en un número reducido de animales
• Pueden obtenerse grandes cantidades de células
• Permite trabajar en pequeña, media y gran escala
• Las células pueden mantenerse congeladas por
largos períodos de tiempo con mínima pérdida de
viabilidad
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Sin embargo...
• Cuidado que no son animales enteros
– Las células no están organizados en verdaderos
tejidos
– No hay interrelación con otros tejidos
– El comportamiento es distinto a la organización
tridimensional
• El entorno es distinto
• Las condiciones de crecimiento son distintas
• Las conclusiones de los ensayos deben ser
debidamente acotadas
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Componentes de un cultivo
CÉLULAS
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Tipos de cultivo
• Cultivo primario: células, tejidos u órganos tomados
directamente de un animal.
• Cultivo de órganos, explantes: mantenimiento de
órganos o parte de órganos in vitro.
• Cultivo de tejidos: mantenimiento de tejidos in vitro.
• Cultivo de células: mantenimiento de células dispersas.
• Líneas celulares: células mantenidas por subcultivos
sucesivos comenzando por un cultivo primario.
• Cultivos continuos: células que han logrado sobrevivir a
muchos subcultivos. Expectativa de vida “infinita”.
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Líneas celulares continuas: algunos ejemplos
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BHK: Fibroblastos de riñón de hamster sirio dorado
CrFK: Fibroblastos de riñón de gato doméstico
MDCK: Epitelio de riñón canino (Cocker Spaniel)
CHO: Epitelio de ovario de hamster chino
VERO: Fibroblastos de riñón de mono verde africano
HeLa: Epitelio tumoral de cuello uterino humano
MDBK: Epitelio de riñón de bovino adulto
HUVEC: Endotelio de vena umbilical humana
FHBE: Endotelio de corazón fetal bovino
Etc., etc., etc.
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Colecciones internacionales más importantes
Sigla
Nombre u organismo
Ciudad, país
Nº de
cultivos
ATCC
American Type Culture
Collection
Minassas, USA
≈800
DSMZ
Human and Animal Cell
Cultures
Braunschweig,
Alemania
≈500
ECACC
European Collection of Cell Salisbury,
Cultures
Wiltshire, UK
≈1000
GEIMM
Istituto Giannina Gaslini
≈2300
Genova, Italia
Fuente: www.biotech.ist.unige.it/cldb/indexes.html
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Banco de células español
• El Banco Nacional de Líneas Celulares se configura
como una estructura en red con varios nodos
coordinados por un central, que tendrá como objetivo
garantizar en todo el territorio nacional la disponibilidad
de líneas de células troncales humanas embrionarias y
adultas para la investigación biomédica.
• El Banco de Líneas Celulares está adscrito a la
Subdirección General de Investigación en Terapia
Celular y Medicina Regenerativa del Instituto de Salud
Carlos III,
• Link a la Web del Banco Nacional de Células:
– http://www.cultek.com/link/link.asp?link=http://www.isciii.es/htdoc
s/terapia/terapia_bancocelular.jsp
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Componentes de un cultivo
SOPORTE
CELULAS
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Soporte
• Líquido: Células en suspensión
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Bioreactores
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Soporte
• Sólido: Células adheridas a superficies
plásticas, membranas, polímeros, vidrio etc.
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Otros soportes de Cultivo
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Soporte
Titulación de virus en microplacas con tinción final
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Soporte
• Superficies cubiertas con sustancias que
favorecen el crecimiento celular
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Microcarriers
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Extraído de “From Space to the Clinical Bedside”
En Internet: slsd.jsc.nasa.gov/bso/resources/ lectures/npLectureMechCulture.pdf
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Componentes de un cultivo
SOPORTE
FASE GASEOSA
CELULAS
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Fase gaseosa
• La concentración de oxígeno necesaria
depende de los requisitos de las células
• La concentración de dióxido de carbono
depende de la capacidad buffer del medio de
cultivo
• Usualmente el equilibrio dióxido de carbono (en
la fase gaseosa) - bicarbonato (en la fase
líquida) actúa como buffer del cultivo
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Componentes de un cultivo
SOPORTE
FASE GASEOSA
CELULAS
Materiales
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Medios de cultivo celulares
CUALIDADES:
•
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Específico para la célula a cultivar
Nutritivo
pH adecuado
Capacidad buffer
Isotónico
Estéril
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Componentes de los medios de cultivo
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Agua
Sales
Glucosa
Ácidos grasos
Vitaminas
Suero
Péptidos
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•
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•
Micro y oligoelementos
Aminoácidos esenciales
Factores de crecimiento
Otro regulador de pH
Indicador de pH
Antiespumante
¿Antibióticos?
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Organización de un subcultivo
• El objetivo de un subcultivo (pasaje) es mantener las
células en condiciones de replicación normal.
• En el subcultivo se renueva el medio de cultivo y se lleva
la relación células/medio/superficie de soporte, a la
inicial.
• Las células adheridas a soportes sólidos deben ser
primero despegadas de este soporte y separadas
enzimáticamente (tripsina). Luego se resuspenden, se
tiñen con colorante vital (Azul Tripan) y se cuentan en
cámara de Neubauer.
• Si se parte de un cultivo de células en suspensión
directamente se procede a contar las células.
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Organización de un sub-cultivo
• Una vez conocida la concentración de células
en el material de origen, se definen las
condiciones del subcultivo deseado y se
realiza el pasaje.
– Ejemplo
• Material de origen: 2x106 cél/ml
• Destino: tres botellas de 175 cm2 con una concentración
inicial de 35000 cél/cm2
• Necesidad: 3 x 175 x 35000 = 1.8x107 células
• 1.8x107 células / 2x106 cél/ml = 9 ml ( 3 ml / botella )
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Factores críticos
• Suero:
– Ventajas: Gran aporte de nutrientes básicos,
proteínas, factores de crecimiento, hormonas,
promotores de adhesión, inhibidores enzimáticos, etc.
– Desventajas: Composición indefinida, variabilidad
entre lotes, interferente en procesos de purificación
de proteínas, interferente en procesos de
multiplicación viral, vehículo de entrada de
contaminaciones, etc.
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Factores críticos
• Temperatura de cultivo: depende del origen de
las células. Mamíferos: 37ºC, peces e insectos:
18-22ºC, aves: 38.5ºC, etc.
• Contaminaciones: gran complicación en los
laboratorios de cultivos celulares, principalmente
a escala industrial. Pueden ser por levaduras,
hongos miceliares, virus, bacterias,
micoplasmas, otras células, etc.
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Factores críticos no biológicos
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Orden
Limpieza
Higiene personal
Vigilancia microscópica
Estudio adecuado de los problemas
Análisis de problemas potenciales
Trazabilidad de los cultivos
Protocolización exhaustiva
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Equipamiento
• Además del equipamiento usual de cualquier laboratorio,
se requiere:
– Microscopio invertido
– Cámara de conteo de células
– Flujo laminar de características adecuadas al trabajo a
desarrollar
– Sistema de filtración esterilizante de soluciones, líquidos y
medios de cultivo
– Material de soporte estéril
– Espacio frío de 4, -20, -75 y –196ºC
– Estufas de cultivo con o sin atmósfera de CO2
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Componentes de un cultivo
SOPORTE
FASE GASEOSA
CELULAS
Catálogo
Materiales
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Medios de cultivo
• Medios para Cultivo Celular
– Hyclone, pinche aquí
– Biochrom, pinche aquí.
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Agitación
(pinche sobre imagen)
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Cabinas de flujo laminar
(pinche sobre imagen)
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Incubadores de CO2
(pinche sobre imagen)
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Manejo de líquidos
(pinche sobre imagen)
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SOPORTE
FASE GASEOSA
CELULAS
Catálogo
Materiales
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Aplicaciones
actuales
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Hibridomas: producción Anticuerpos Monoclonales
(pinche sobre imagen)
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Celulas Madre (Stem Cells)
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Fertilización In Vitro
(pinche sobre imagen)
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Soporte técnico
(pinche sobre imagen)
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Manuales
Protocolos
Referencias
Guías de ususario
Artículos técnicos
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Nuestras marcas
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Seminarios conmemorativos del Centenario de
las técnicas de Cultivo Celular
Seminarios conmemorativos del
Centenario de Cultivos Celulares
(pinche para ver el programa)
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