Inoculación de Embriones de Pollo con Líquido Céfalo

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INOCULACIÓN DE EMBRIONES DE POLLO CON LÍQUIDO CÉFALO-RAQUÍDEO DE PACIENTES
ESQUIZOFRÉNICOS. ESTUDIO INMUNO-ELECTROMICROSCÓPICO.
S Mesa-Castillo
Hospital Psiquiátrico de La Habana. Ciudad de la Habana, Cuba.
Correspondencia: Dr. Segundo Mesa Castillo. Calle 9, No. 13305. Aldabó,
Ciudad de la Habana, Cuba. E-mail: [email protected]
2
INOCULATION
OF
CHICKEN
EMBRYOS
WITH
CEREBROSPINAL
FLUID
FROM
SCHIZOPHRENIC PATIENTS. IMMUNO-ELECTRON MICROSCOPE STUDY.
Segundo Mesa Castillo
Psychiatric Hospital of Havana
e-mail: [email protected]
SUMMARY. Introduction. The viral hypothesis of schizophrenia has been considered among the possible
etiologies of the disease. Objectives. Different intents of experimental transmission in laboratory animals
and in tissue culture using inocules from samples of patient has been reported since the beginig of the
last century. Patient and methods. The results obtained of the immuno-electronmicroscopic studies in
brain samples from chicken embryos inoculated with cerebrospinal fluid from a female hebephrenic
schizophrenic patient are presented. Results. The obtained results are similar to those observed in
previous studies of brains from adults’ dead schizophrenic patients and in the brain of aborted fetuses
from schizophrenic mothers. These results are related to the presence of particles and a phenomenon of
abnormal replication of membranes. Conclusion. The presence of herpes simplex hominis type I virus
(HSV-1) antigen in particles and membrane structures in the observed samples constitute an element in
favour of the slow viral hypothesis considered for this disease by this virus. The obtained results are
compared with those obtained by other authors using the same inoculation techniques.
Key words. Cerebrospinal fluid. Chicken embryos. Electron microscopy. Fetuses. Herpes virus.
Inoculation. Schizophrenia.
INOCULACIÓN DE EMBRIONES DE POLLO CON LÍQUIDO CÉFALO-RAQUÍDEO DE
PACIENTES ESQUIZOFRÉNICOS. ESTUDIO INMUNO-ELECTROMICROSCÓPICO.
Segundo Mesa Castillo
Hospital Psiquiátrico de la Habana, Cuba
Correo electrónico: [email protected]
RESUMEN. Introducción. La hipótesis viral de la esquizofrenia se ha considerado entre las posibles
etiologías de la enfermedad. Objetivos. Diferentes intentos de transmisión experimental en animales de
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laboratorio y en cultivos de tejido usando inóculos procedentes de muestras de pacientes se han
reportado desde principios el siglo pasado. Pacientes y métodos. En el presente trabajo se presentan los
resultados obtenidos del estudio inmuno-electromicroscópico en muestras de cerebros de embriones de
pollo inoculados con líquido cefalorraquídeo de una paciente esquizofrénica hebefrénica. Resultados. Los
resultados obtenidos son similares a los observados por nosotros en estudios previos en cerebros de
esquizofrénicos adultos fallecidos y en cerebros abortados de fetos de madres esquizofrénicas. Estos
resultados se relacionan con la presencia de partículas y con un fenómeno de replicación anormal de
membranas en el sistema nervioso de los embriones inoculados. Conclusiones. La presencia de antígeno
del virus herpes simplex hominis tipo I (HSV-1) en partículas y en estructuras de membrana en las
muestras observadas constituyen un elemento a favor de la hipótesis viral lenta planteada para la
enfermedad por este virus. Se comparan los resultados obtenidos con los de otros autores usando la
mismas técnicas de inoculación.
Palabras claves. Embriones de pollo. Esquizofrenia. Fetos. Inoculación. Líquido céfalo-raquídeo.
Microscopía electrónica. Virus herpes.
INTRODUCCIÓN. La inoculación de animales de experimentación en el estudio de las enfermedades
humanas ha sido una herramienta útil para investigar la posible etiología infecciosa. La utilización de
este método de investigación en la esquizofrenia tiene sus primeros antecedentes en los trabajos de
inoculación de cerebros de conejos con líquido cefalorraquídeo (LCR) y secreciones faríngeas que
siguieron a la pandemia de encefalitis por el virus de la influenza a principios del siglo pasado al pensarse
en una posible etiología infecciosa en la esquizofrenia por observarse cuadros de psicosis indiferenciables
clínicamente de esta enfermedad durante esta pandemia [1-3]. En la década del 50 dos grupos de
investigadores, unos de origen soviético y otros italianos, realizaron pruebas de aislamiento de virus en
embriones de pollo, reportando resultados contradictorios al utilizar LCR de pacientes esquizofrénicos
como inóculo [4-6]. La falta de un desarrollo adecuado de la virología y la inmunología en estas primeras
observaciones determinó aparentemente un estancamiento en el avance de las investigaciones virológicas
de la enfermedad. La trasmisión exitosa en dos formas de demencia a primates en la década del 60 [7,8]
influyó posiblemente en nuevos intentos de aislamiento de virus en la esquizofrenia, en los trabajos de
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investigadores ingleses en la década del 70, ahora con técnicas más desarrolladas en cultivos de tejidos,
comprobándose que los LCR de la tercera parte de los pacientes esquizofrénicos estudiados, eran capaces
de producir efectos citopáticos en cultivos de fibroblastos de embriones humanos. Sin embargo, este
efecto no podía trasmitirse a otros cultivos v no se inhibía por inhibidores del ácido nucleico ni de la
síntesis proteica, era relativamente termoestable y parecía a estar asociado con partículas de 30 a 60 nm
de diámetro.
En animales inoculados con este LCR en su descendencia se encontraron algunos con anomalías
congénitas que incluían anomalías del sistema nervioso central. Se consideró la posibilidad de una forma
viral no replicable. En los estudios realizados en nuestro país en cerebros de fetos procedentes de madres
esquizofrénicas, con técnicas inmuno-electromicroscópicas, se encontraron partículas y cuerpos de
inclusión dentro de las neuronas que reaccionaban en forma positiva con el antisuero antiherpes simplex
hominis tipo I y que morfológica e inmunológicamente eran similares a las partículas e inclusiones encontradas en estudios anteriores en cerebros de pacientes esquizofrénicos adultos [9,10]. Con estos resultados
y considerando los primeros trabajos ya referidos, se utilizó LCR que por razones médicas había sido
necesario analizar de una paciente esquizofrénica hebefrénica -cuyo feto había sido estudiado con
técnicas de inmuno-electromieroscopía- inoculándose este LCR en embriones de pollo, aplicándose las
mismas técnicas inmunoelectromicroscópicas. Los resultados de esta investigación son los que se exponen
a continuación comparándose los mismos con estudios realizados por otros autores con técnicas de
inoculación de LCR de pacientes esquizofrénicos en animales de experimentación y en cultivos de tejidos.
MATERIAL Y METODO
Se inocularon con LCR de la paciente L.M.S. con
criterio diagnóstico para la investigación de
esquizofrenia hebefrénica [11], diez huevos de un día de incubación. La inoculación se realizó en la
cámara de aire con una décima de cc de LCR, continuándose el proceso normal de incubación. Dos días
después se pusieron a incubar cinco huevos controles inoculados con una décima de cc de agua destilada.
Al terminar el proceso de incubación se sacrificaron los pollos recién nacidos (inoculados y controles)
haciéndose trepanación del cráneo y obteniendo en todos los casos el hemisferio cerebral izquierdo,
estudiándose para técnicas de microscopía electrónica e inmuno-electromicroscopía 6 pollos inoculados
con LCR y 3 controles inoculados con agua destilada, procediéndose a su fijación inmediata en
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glutaraldehído-paraformaldehído al 1% durante una hora. Se realizaron dos lavados en buffer fosfato de
cinco minutos cada uno. Se procedió posteriormente al bloqueo de la peroxidosa endógena con metanol
más peróxido de hidrógeno durante treinta minutos a temperatura ambiente. Posteriormente se lavó con
varios volúmenes de PBS durante 15 minutos. Se lavó con TRIS, tres volúmenes por cinco minutos cada
vez. Se usó suero normal de chivo diluido al 1:5. Se añadió después el antisuero durante 24 horas,
procediéndose posteriormente al lavado con TRIS (tres volúmenes cinco minutos cada uno). DAB, ocho
minutos, a temperatura ambiente y lavado con TRIS, post-fijación con tetróxido de osmio al uno por
ciento durante treinta minutos, lavado con buffer fosfato (3 X 15 minutos), etanol al treinta por ciento
durante cinco minutos, al cincuenta por ciento durante cinco minutos, al setenta por ciento durante diez
minutos y etanol absoluto (3 X 20 minutos). Oxido de propileno (3 X 15 minutos): procediéndose a la
inclusión en Epón I durante sesenta minutos, Epón II durante toda la noche, terminándose la inclusión
definitiva Se hicieron inclusiones para bloques con diluciones del antisuero al 1/10 y al 1/20, bloques
controles de cada dilución, bloques de los controles más control de los bloques controles en cada dilución
y técnica general. Se procesaron un total de 87 muestras en los laboratorios de microscopía electrónica
del Centro Nacional de Investigaciones Científicas de Cuba y del Departamento de Patología del Instituto
de Nefrología. Los trabajos de inoculación se realizaron en el Departamento de Embriología del Instituto
de Ciencias Médicas de Cuba. Los pollos inoculados estudiados fueron enumerados del 1 al 6 y los
controles 7, 8 y 9.
Análisis digital de imágenes. Las imágenes obtenidas en los negativos de inmuno-electromicroscopía en
las que no se pudo definir una morfología viral mediante el análisis visual directo de las mismas, fueron
procesadas con un analizador de imágenes diseñado por EICISUFI que utiliza el programa IMPROSOR.
Previamente las imágenes a analizar fueron captadas en un monitor dé video de 512 X 512 pixels,
mediante una cámara de video AVC-3250. Se utilizó también una microcomputadora NEC-XA de propósito general y un digitalizador de imágenes ED-1182. Las imágenes así obtenidas fueron digitalizadas y
filtradas en el programa, mejorándose el contraste de las mismas, lo que permitió poner en evidencia
mediante un tratamiento de seudocolor, los diferentes niveles de grises de las partículas estudiadas.
Todas estas experiencias se realizaron previo consentimiento familiar y de la paciente de la que se
obtuvo el líquido céfalo-raquídeo con la aprobación del Comité de Ética del Hospital Psiquiátrico de la
Habana.
6
RESULTADOS
Los pollos inoculados presentaron las siguientes alteraciones:
No. 1. Parálisis de alas y patas (figura l).
No. 2. Paraparesia y anomalía congénita de los dedos de las dos patas.
No. 3. Paraparesia y anomalía congénita de los dedos de una pata.
No. 4. Falta de desarrollo trófico y motor.
No. 5. Pollo de aspecto normal.
No. 6. Pollo dentro del huevo con atrofia del hemisferio cerebral izquierdo (sin desarrollo y sin
vitalidad).
Dos huevos no desarrollaron embrión. Otros dos huevos con muy poco desarrollo del embrión. De los
10 huevos inoculados entre no nacidos (falta de desarrollo del embrión) y nacidos con problemas: 9 para
un 90%. De los pollos controles de 5 huevos, 2 con embriones muertos dentro de los huevos, un pollo que
hubo que ayudarlo a salir del huevo. Todos sin anomalías congénitas. En dos huevos no se formó
embrión. Los hemisferios cerebrales y cerebelo en todos los casos fueron normales. Se estudiaron además
como controles dos pollos nacidos de incubación normal con gallina ninguno presentó anomalía congénita.
El examen al microscopio electrónico mostró las siguientes alteraciones en el cerebro de los pollos
inoculados:
1. Presencia de inclusiones intranucleares en neuronas y células endoteliales similares morfológicamente
a las estructuras laminares descritas en el cerebro de fetos y en adultos esquizofrénicos. Estas inclusiones
reaccionaron en ocasiones en forma positiva con el antisuero antiherpes simplex hominis tipo I.
2. Replicación aumentada de las estructuras laminares que normalmente existen en el tejido nervioso.
En algunas de estas estructuras se observó la misma reacción que en 1.
3. Presencia de puntos de reacción con el antisuero en la cromatina nuclear relacionado con estructuras
de membranas que se encuentran dentro del rango de medida de partículas virales en el núcleo de
neuronas.
4. Presencia del fenómeno de replicación de las estructuras laminares con formación de partículas de
igual constitución de membranas, observada en cerebros de esquizofrénicos adultos y en el feto de
madre esquizofrénica, que reaccionan en ocasiones con el antisuero antiherpes simplex.
5. Presencia de estructuras laminares en la envoltura de los hematíes en los capilares cerebrales.
7
6. Presencia de antígeno de herpes simplex en estructuras de membranas, dentro del núcleo, en el
citoplasma y en las prolongaciones celulares de neuronas y células del endotelio vascular
fundamentalmente.
7. Un análisis digital mostró la presencia de partículas con un núcleo central y una cápsula periférica en
los sitios de reacción antígeno-anticuerpo (figura 2 y 3).
DISCUSIÓN. Los cuadros de psicosis indiferenciables clínicamente de la esquizofrenia que siguieron a la
pandemia por el virus de la influenza v de la encefalitis de Von Economo a principios del siglo pasado
hicieron pensar en la posibilidad de una relación entre esta enfermedad y la etiología viral 2. Un ejemplo
de ello se expresa en el pensamiento de Karl Menninger en 1922 cuando expresó: "Estoy persuadido que
la demencia precoz (esquizofrenia) es al menos en la mayor parte de los casos una somatopsicosis, la
manifestación psíquica de una encefalitis" [12]. No es hasta la década de los 50 en que se hacen los
primeros intentos serios para aislar un virus del LCR de pacientes esquizofrénicos. Un desarrollo
inadecuado de las técnicas virológicas e inmunológicas en ese momento, parece haber contribuido a la no
continuación de estos trabajos a pesar de haberse reportado efectos citopáticos en embriones de pollo
después de la inoculación. En 1979 se reporta por Tyrrell y colaboradores que el LCR de un 35% de
pacientes esquizofrénicos tenía efectos citopáticos cuando era inoculado en fibroblastos de embrión
humano [13]. Sin embargo este hallazgo no era específico para la esquizofrenia, ya que el LCR de
pacientes con trastornos afectivos producía igual efecto en igual proporción. Se desconoce aún si este
efecto se debía a una toxina o a un virus. La imposibilidad por una parte de trasmitir este efecto
citopático de cultivo a cultivo y su persistencia a pesar del uso de inhibidores de la síntesis proteica y de
DNA o RNA sugería más la posibilidad tóxica que virológica, a menos que se tratara de una forma viral
no convencional.
En 1983 Baker reporta los resultados de la inoculación intracerebral a monos de la América del Sur
con el LCR que había producido efectos citopáticos en cultivos de tejidos [14]. Este autor señala
alteraciones de conducta en una parte de los animales inoculados que se caracterizaba por disminución
de la actividad normal y cambios en la conducta social que semejaban los síntomas del defecto
esquizofrénico, por el contrario, la inyección de LCR que no producía efectos citopáticos, no provocaba
tales alteraciones de conducta. En el estudio de la descendencia de los animales inoculados se reportaron
anomalías congénitas: defecto del cierre del cráneo con encefalocele v cambios de coloración de la cola en
8
algunos de ellos. Libiková en 1983 reporta efectos similares a los descritos por Baker en cultivos SIRC y
HEL con determinación de antígeno HSV-1 por técnicas de inmuno-fluorescencia [15]. Sin embargo,
otros intentos de reproducir los síntomas descritos por Baker mediante la inoculación intracraneal
directa o mediante la utilización de tejido cerebral de pacientes fallecidos fueron infructuosos.
Debido a los resultados obtenidos por investigadores soviéticos en la observación ultraestructural de
cerebros de embriones procedentes de madres esquizofrénicas de un aumento de estructuras de
membrana a las que denominaron “lamelosomas” [16] confirmado por nosotros en esquizofrénicos
adultos, en fetos de madres esquizofrénicas y en animales experimentalmente inoculados con líquido
céfalo-raquídeo [17] , así como la presencia de partículas intranucleares semejantes al virus del herpes
simplex que reaccionaron con el antisuero para este virus [18]. Considerando una posible trasmisión de
tipo vertical en la enfermedad inoculamos embriones de pollo con LCR de la paciente esquizofrénica
hebefrénica cuyo feto se había estudiado por inmuno-electromicroscopía. Aparte de constituir un método
relativamente fácil de investigación, nos permitía observar células embrionarias del sistema nervioso,
susceptibles de infección viral, así como observar el posible desarrollo de anomalías congénitas en los
embriones inoculados. Sin embargo tuvimos en cuenta en nuestros trabajos que el comportamiento
biológico de los virus lentos no es siempre igual ya que mientras se ha logrado la trasmisión exitosa en
animales de laboratorio de las formas virales menos convencionales, no ha sucedido lo mismo con las
formas más convencionales, como es el caso del virus de la leucoencefalopatía multifocal progresiva y el
de la panencefalitis esclerosante subaguda.
La presencia en algunos de los animales estudiados por nosotros de anomalías (parálisis de alas y patas,
deformación de los dedos de las patas, atrofia de un hemisferio cerebral) puede relacionarse con el
hallazgo de los efectos citopáticos ya citados en la década del 50 y los resultados referidos por otros
investigadores en otros animales y en cultivos de tejidos también citados; sin embargo este hallazgo y la
presencia de antígeno de herpes simplex en nuestros trabajos en embriones de pollo, debe hacemos
considerar las siguientes posibilidades:
a) La trasmisión a los embriones se debe a la gran difusión en la naturaleza del herpes virus sin que se
relacione con la esquizofrenia.
b) Una posible reacción no específica del antisuero en el tejido nervioso.
9
c) El LCR pudo actuar como un inductor no específico (toxina) en el desarrollo de las estructuras de
membrana y de las inclusiones intranucleares, así como de las anomalías descritas.
d) El LCR era portador de partículas virales que reprodujeron los efectos encontrados en el feto y en el
cerebro de esquizofrénicos adultos y la reacción con el antisuero fue específica para el herpes simplex
hominis tipo 1.
e) Estos resultados pueden estar relacionados con los descritos en este trabajo por otros investigadores
en el desarrollo de anomalías congénitas en otras especies de animales inoculados con LCR de
pacientes esquizofrénicos y de efectos citopáticos en cultivos de tejidos.
f) La multiplicación del virus (HSV-1) puede estar relacionada con los trastornos inmunológicos que se
observan en la enfermedad y no necesariamente se relacionan con su etiología.
Se ha reportado por otros autores la posible relación del HSV-1 y la esquizofrenia en diferentes
experiencias como son el aumento del título de anticuerpos contra este virus, la presencia de antígeno o
del genoma viral utilizando diferentes técnicas de investigación [19-30]. La etiología viral de la
esquizofrenia continúa considerándose entre las hipótesis que tratan de explicar el origen de la
enfermedad. Una teoría que se maneja hoy con frecuencia es la que relaciona la enfermedad con un
trastorno del neurodesarrollo en las primeras etapas de la vida intrauterina. La acción de un virus
actuando en esta primera etapa del desarrollo también se ha incluido dentro de los posibles factores
ambientales, interactuando con factores de tipo genético. El virus herpes simplex hominis tipo I por sus
características de permanecer latente en el sistema nervioso central, de evolucionar en forma de crisis y
remisiones en sus manifestaciones clínicas, de afectar el lóbulo temporal, asiento del sistema límbico y
sustrato anatómico de la esquizofrenia y de replicarse entre otros factores por la acción de situaciones
estresantes
como
ocurre
también
en
esta
enfermedad
se le ha considerado como un posible candidato entre los agentes virales a considerar. De todos los
elementos señalados, se deriva la necesidad de continuar y ampliar el marco de esta investigación en
mayor número de experiencias y con técnicas inmunológicas más específicas. Estos resultados pueden
contribuir a la demostración de la posible trasmisión de tipo vertical planteada en la enfermedad, así
como al estudio de los mecanismos que influyen en la posible trasmisión horizontal y en el desarrollo de
una prueba biológica diagnóstica. La inoculación asociada a medicamentos antivirales (acyclovir,
interferón) puede contribuir al estudio de la susceptibilidad del herpes virus de estar este agente relacionado con la etiología de la esquizofrenia.
10
AGRADECIMIENTOS
Agradecemos la valiosa colaboración técnica y profesional de los Centros: Hospital Psiquiátrico de la
Habana, Dpto. de Embriología del Instituto de Ciencias Médicas de Cuba, Instituto de Hematología e
Inmunología y Laboratorios de Microscopía Electrónica del Hospital “Hermanos Ameijeiras”, del
Instituto de Nefrología y del Centro Nacional de Investigaciones Científicas de Cuba
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