bioelisa bioelisa anti-HBc READ HIGHLIGHTED CHANGES 3000-1102 1 x 96 TESTS ELISA test for the detection of total antibodies to hepatitis B core antigen (anti-HBc) in human serum or plasma. Summary Hepatitis B is a disease produced by a viral infection during which many serological markers appear. One of these markers is the anti-HBc. The hepatitis B core antigen (HBcAg) is an internal component of hepatitis B virus which is antigenically distinct from hepatitis B surface antigen (HBsAg). HBcAg/anti-HBc antigen-antibody system was described by Almeida et al. in 1971.1 Antibodies to HBcAg (anti-HBc) are the first to be developed in the course of an acute hepatitis B infection and may persist for life. Anti-HBc can usually be detected in the blood just after the detection of HBsAg and before the onset of clinically apparent hepatitis. In acute hepatitis B with recovery, anti-HBc is the only serological marker of infection in the period between HBsAg clearance and the appearance of anti-HBs. Blood donations taken at this stage may be infectious and it has been suggested that screening for anti-HBc as well as for HBsAg might further reduce the incidence of post transfusion hepatitis B.4 On the other hand, the screening for anti-HBc should also be performed on any individual before the administration of hepatitis B vaccine to know the immune status in order to vaccinate only the anti-HBc negative individuals. Furthermore several reports have shown a correlation between the presence of anti-HBc in donated blood and the incidence of transfusion associated non-A non-B hepatitis (NANBH or hepatitis C).7,8,9 With the implementation of anti-HBc screening of blood donors, many of these cases could be prevented. Principle bioelisa anti-HBc is a competitive immunoenzymatic method for determination of antibodies to HBcAg in human serum. The assay is based on a competition between human antibodies present in the sample and rabbit IgG antiHBc conjugated to peroxidase (HRP) when they are simultaneously incubated in a well coated with recombinant HBcAg. After incubation and washing to remove unbound material, an enzyme substrate solution containing a chromogen is added. This solution will develop a blue colour if the sample is negative. The blue colour changes to yellow after blocking the reaction with sulphuric acid. The presence of anti-HBc in the sample will reduce the development of colour proportionally to its concentration. Components 1. MCPL MICROPLATE: 12 x 8 wells coated with recombinant HBcAg (E. coli). Individually separable wells. 2. CONJ CONJUGATE: 1 x 6 ml of rabbit IgG anti-HBc conjugated to peroxidase. Contains red dye, stabilisers protein, 0.02% thimerosal and 0.001% gentamicin sulphate. Ready to use. 3. WASH SOLN 10x CONCENTRATE WASHING SOLUTION: 2 x 50 ml of concentrate phosphate buffer (10x) containing 1% Tween 20 and 0.01% thimerosal. To be diluted 1/10 in distilled or deionised water before use. 4. SUBS BUF SUBSTRATE BUFFER: 1 x 14 ml of citrate-acetate buffer containing hydrogen peroxide. 5. SOLN TMB CHROMOGEN: 1 x 1.5 ml of 3,3', 5,5'-Tetramethylbenzidine (TMB) dissolved in dimethylsulphoxide (DMSO). 6. CONTROL + POSITIVE CONTROL: 1 x 2 ml of rabbit IgG anti-HBc diluted in phosphate buffer. Contains stabilisers protein and 0.001% gentamicin sulphate. Ready to use. 7. CONTROL – NEGATIVE CONTROL: 1 x 3.5 ml of human serum negative for all HBV markers containing 0.001% gentamicin sulphate. Ready to use. 8. H2SO4 1N STOPPING SOLUTION: 1 x 12 ml of 1N sulphuric acid. Ready to use. 9. SEALS ADHESIVE SEALS: To cover the microplate during incubations. BIOKIT, S.A. - Can Malé s/n - 08186 Lliçà d’Amunt - Barcelona - SPAIN 1 3000-1102 R13 11.2014 eng.doc 0843 bioelisa 10. BAG RESEALABLE BAG: For storage of unused strips. Precautions bioelisa anti-HBc is intended for IN VITRO diagnostic use. For professional use only. WARNING: POTENTIALLY BIOHAZARDOUS MATERIAL. All human source material used in the preparation of this product was found to be negative for the presence of HIV-1/HIV-2 and HCV antibodies, as well as for the hepatitis B surface antigen, using a commercial licensed method. Nevertheless, because no test method can offer complete assurance of the absence of infectious agents, this product should be handled with caution: - - Avoid contact of reagents with the eyes and skin. If that occurs, wash thoroughly with water. Wear gloves. Do not pipette by mouth. Do not smoke. Dispose all used materials in a suitable biohazardous waste container. Remains of samples, controls, aspirated reagents and pipette tips should be collected in a container for this purpose and autoclaved 1 hour at 121°C or treated with 10% sodium hypochlorite (final concentration) for 30 min before disposal. (Remains containing acid must be neutralised prior addition of sodium hypochlorite). Certain reagents in this kit contain sodium azide as preservative. Sodium azide may react with lead or copper pipes and plumbing creating highly explosive metal azides. Flush drains with water thoroughly after disposing of the remains of reagents. Handling instructions: - Adjust washer to the plate used (flat bottom) in order to wash properly. Do not mix reagents from different lots. Do not use reagents after expiration date. Do not use the reagent if you observed any change in appearance of components included in the kit. Extreme care should be taken to avoid microbial contamination and cross contamination of reagents. Use a new pipette tip for each specimen and each reagent. It is very important to prepare the substrate-TMB solution just 5-10 minutes before use. Keep it in a well-sealed container and avoid light exposure. Soaps and/or oxidising agents remaining in containers used for preparation of substrate-TMB solution can interfere with the reaction. If glass containers are used to prepare the solution, they should be washed with 1N sulphuric or hydrochloric acid, rinsed well with distilled water and dried before use. We recommend using disposable plastic containers. Storage and stability The components will remain stable through the expiration date shown on the label if stored between 2-8°C. The bag containing the microplate should be brought to room temperature before opening to avoid condensation in the wells. Once opened the bag, microplate strips are stable for 3 months at 2-8°C in the plastic bag tightly sealed, with the silicagel. Once diluted, the washing solution is stable for two weeks if stored between 2-8°C. Store the chromogen in the dark. As the substrate-TMB solution is not stable once prepared, instructions for its use should be closely followed. Material required not provided Distilled or deionised water. Multichannel pipettes and micropipettes (50 µl, 100 µl) and disposable tips. Incubator at 37°C ± 1°C. Timer. Microplate reader with a 450 nm filter. Reference filter of 620 or 630 nm is advisable. Manual or automated wash system. Sample collection Use fresh serum or plasma (citrate/EDTA). Other anticoagulants should be evaluated before use. Samples can be stored at 2-8°C for 3 days. For longer periods, samples should be frozen (-20°C). Avoid repeated freezing and thawing. Samples showing visible particulate matter should be clarified by centrifugation. Serum or plasma samples should not be heat inactivated, since that may cause incorrect results. Samples should not contain sodium azide. BIOKIT, S.A. - Can Malé s/n - 08186 Lliçà d’Amunt - Barcelona - SPAIN 2 3000-1102 R13 11.2014 eng.doc 0843 bioelisa Automatic processing Automated or semi-automated assay may be used with different instruments. It is very important to validate any automated system to demonstrate that results obtained for samples are equivalent to the ones obtained using manual assay. It is recommended that the user validate periodically the instrument. If there is any difficulty in the setting of Biokit automatic processors, please contact your distributor. PROCEDURE (See procedural flow chart) Previous operations Allow all the reagents to reach room temperature (20-25°C) before running the assay. Gently mix all liquid reagents before use. Dilute the concentrate washing solution 1/10 with distilled or deionised water. For one plate, mix 50 ml of the concentrate solution with 450 ml of water. If less than a whole plate is used, prepare the proportional volume of solution. Assay procedure 1. Use only the number of strips required for the test. Reserve 7 wells for blank and controls. Transfer 50 µl of negative control to 4 wells and 50 µl of positive control to 2 wells. Leave a well empty for the substrate blank. 2. Transfer 50 µl of each sample to be tested into the appropriate wells. 3. Add 50 µl of conjugate solution into each well, except the one reserved for substrate blank. 4. Cover the plate with the adhesive seal, mix gently and incubate for 1 hour at 37°C. 5. During the last 5-10 minutes of this incubation prepare the substrate-chromogen solution. If the entire plate is used add 280 µl of chromogen (TMB) to the bottle containing the substrate buffer (14 ml) and mix well. If the entire plate is not used, follow table 1. The final solution should be colourless; discard if it becomes blue. TABLE 1 Strips required Substrate buffer ml Chromogen (TMB) µl 1 1.0 20 2 2.0 40 4 4.0 80 6 6.0 120 8 8.0 160 10 10.0 200 12 12.0 240 NOTE: The TMB is dissolved in DMSO. As the melting point of the DMSO is 18°C, the chromogen solution should be allowed to reach a temperature of 20-25°C, and be well mixed before use. A yellowish colour is normal for the chromogen solution. 6. Remove and discard the adhesive seal. Aspirate the contents of the wells and fill them completely (approximately 350 µl) with the diluted washing solution. Repeat the process of aspiration and washing 3 more times. Ensure that each column of wells soaks for at least 15 seconds before the next aspiration cycle. After the last washing blot the microplate on absorbent tissue to remove any excess liquid from the wells. 7. Add 100 µl of substrate-TMB solution to each well, including the blank. 8. Incubate for 30 minutes at room temperature (20-25°C). 9. Stop the reaction by adding 100 µl of stopping solution in the same sequence and time intervals as for the substrate-TMB. 10. Blank the reader at 450 nm with the blank well and read the absorbance of each well, within 30 minutes. It is recommended to read in bichromatic mode using a 620 - 630 nm reference filter. Quality control Results of an assay are valid if the following criteria are accomplished: 1. Substrate blank: absorbance value must be less than or equal to 0.100. 2. Negative control: each of the individual absorbance values must not differ more than 20% of the mean of the four values. The mean absorbance must be equal to or higher than 0.600 after subtracting the blank. 3. Positive control: the mean absorbance value must equal to or less than 0.100 after subtracting the blank. BIOKIT, S.A. - Can Malé s/n - 08186 Lliçà d’Amunt - Barcelona - SPAIN 3 3000-1102 R13 11.2014 eng.doc 0843 bioelisa Results 1. Calculate the cut-off value by adding the mean absorbance of the negative control to the mean absorbance of the positive control and multiplying this result by 0.4. Cut-off = (NCx + PCx) x 0.4 2. Divide the sample absorbance by the cut-off value. Positive: Negative: Equivocal: ratio absorbance/cut-off ≤ 1.0 ratio absorbance/cut-off > 1.1 ratio absorbance/cut-off > 1.0 ≤ 1.1 Interpretation of the results A positive result for anti-HBc means that the individual has been infected by the hepatitis B virus. It is not a marker of immunity. A negative result indicates that the sample evaluated doesn’t contain anti-HBc or contains it in a concentration lower than the analytical sensitivity of the kit. To evaluate the general state of a patient concerning hepatitis B, additional tests to other serological markers should be performed. Limitations of the procedure As with other serological tests, the results obtained with bioelisa anti-HBc serve only as an aid to diagnosis and should be interpreted taking into consideration the patients’ clinical history. Optimal assay performance requires strict adherence to the assay procedure described. Deviation from the procedure may lead to aberrant results. Specimens with an anti-HBc concentration lower than 1.5 U/ml (PEI or WHO standard) may not be detected. Any positive or equivocal sample should be retested and should be investigated for other serological markers of HBV. Expected results Anti-HBc antibody is the most frequent marker of hepatitis B virus infection and is found in acute, chronic or resolved infection. The prevalence of anti-HBc and other markers of Hepatitis B infection vary widely in the world, from high (70-90%, Africa, Asia and Western Pacific) to intermediate (20-55%, Southern and Eastern Europe) and low (4-6%, Western Europe, North America and parts of South America). Different studies reported a prevalence ranging from 0.53% to 2.16% on blood donors from United Kingdom.2,5,6 Performance characteristics Analytical sensitivity The limit of detection of the bioelisa anti-HBc kit is 1.5 units/ml using the anti-HBc reference serum from Paul Ehrlich Institute (PEI), Germany. According to internal studies 1.0 PEI-U/ml is equivalent to approximately 1.0 IU/ml of the WHO First International Standard for anti-HBc (NIBSC code 95/522). Evaluations The performance of bioelisa anti-HBc was evaluated in comparative studies with other commercial assays. - In an internal evaluation, 233 samples that were anti-HBc positive with another commercial assay (76 of which were also positive for HBsAg) were tested with the bioelisa anti-HBc. 227 gave positive result (including the 76 HBsAg positive) and 6 were negative. The 6 discrepant samples were tested with a third commercial assay and results were also negative. - In an external evaluation in comparison with other commercial assay, 175 samples were tested. 31 were positive and 141 were negative with both assays. An overall agreement of 98.3% (172/175) was obtained. Eliminating 2 equivocal samples from calculations, relative sensitivity was 100% (31/31) and relative specificity was 99.2%. - In another external evaluation, 251 HBsAg positive samples were tested. 247 (98.4%) were reactive with the bioelisa anti-HBc, from which 245 were also reactive with the alternative routine anti-HBc test. 4 samples were anti-HBc negative with the bioelisa and with the routine test and 2 were positive only with the bioelisa. Therefore, the relative sensitivity of bioelisa was 100% (245/245) and the overall agreement between both methods was 99.2% (249/251). BIOKIT, S.A. - Can Malé s/n - 08186 Lliçà d’Amunt - Barcelona - SPAIN 4 3000-1102 R13 11.2014 eng.doc 0843 bioelisa - In another external evaluation, 5058 samples from consecutive routine blood donors were tested in parallel with the bioelisa and the routine method. From these samples, 6 were reactive with both the bioelisa and the routine test, 5 of which were confirmed as past infection after further tests for other HBV markers while 1 was positive for anti-HBc only. Other 3 samples were repeatedly positive with the bioelisa and negative with the routine test, 2 of which were considered as false positives and 1 was inconclusive after additional tests. Considering as true positives only the samples confirmed as being of past infection, the specificity found was 99.92% (5049/5053). - Another external evaluation concerning end-point sensitivity and performance comparing to other commercial assays is in Bibliography.3 Precision Intra-assay reproducibility: The coefficient of variation obtained for the absorbance values of a negative sample assayed in 48 replicates were 4.34%, 4.19% and 3.66% in three lots studied. Inter-assay reproducibility: Three negative samples were tested in 3 different assays. The coefficients of variation obtained for the ratios absorbance/cut-off of the 3 samples were 4.9%, 7.0% and 8.2% respectively. Interferences To study possible interferences, samples with potential risk of producing cross reaction were tested, including sera positive for Rheumatoid Factor (RF), anti-nuclear antibodies (ANA), heterophiles antibodies, anti-HAV IgM, anti-E. coli and from pregnant women. No evidences of interference were observed. BIOKIT, S.A. - Can Malé s/n - 08186 Lliçà d’Amunt - Barcelona - SPAIN 5 3000-1102 R13 11.2014 eng.doc 0843 bioelisa bioelisa: Troubleshooting guide Problem Possible causes Solution 1. Controls out of validation. 1a. Incorrect temperature, incubation or pipetting. 1b. Improper preparation of reagents, error of dilution, reagents not well mixed. 1c. Cross-contamination of controls. Check procedure. Repeat assay. Check procedure. Repeat assay. 1d. 1e. 1f. 1g. 2. No colour or only a light colour developed at the end of the assay. 2a. 2b. 2c. 2d. Pipette carefully. Do not interchange caps. Repeat assay. Incorrect reading filter. Check that the wavelength of the filter used is 450 nm. If no reference filter of 620-630 nm is used, absorbance increases approximately 0.050. Interference in the optical Check the reader. Clean or pathway. dry the bottom of wells. Check for air bubbles. Repeat reading. Used components from Do not use components from different lots. different lots as they are adjusted for each batch released. Expired reagents. Check the kit expiration date. Use a non-expired kit. One or more reagents not Check procedure. Repeat added or added in wrong assay. sequence. Inactive conjugate: Check for contamination. improper conservation. Check procedure. Repeat assay. Inactive microplate: Always keep unused strips in improper conservation. the bag very well closed, with the desiccant inside. Repeat assay. Inactive substrate: Always use a freshly prepared improper conservation or dilution of TMB in substrate dilution, the container used buffer. Use disposable affects substrate stability, containers or wash with acid cross-contamination with or ethanol and rinse with the stopping solution. deionised water before re-use. Recheck procedure. Repeat assay. BIOKIT, S.A. - Can Malé s/n - 08186 Lliçà d’Amunt - Barcelona - SPAIN 6 3000-1102 R13 11.2014 eng.doc 0843 bioelisa bioelisa: Troubleshooting guide Problem Possible causes Solution 3. Too much colour in all microplate wells. 3a. Contaminated, oxidised or improperly prepared substrate. Check that substrate is colourless, discard if blue. Make sure that TMB is completely liquid before using. Make sure that TMB is well mixed in the substrate buffer. Use acid or ethanol washed or disposable vials or containers. Repeat assay. Check for contamination: turbid aspect. Check dilutions. Repeat assay. Check the quality of distilled or deionised water used for dilution. Repeat assay. Check the washer. Fill wells with washing solution close to the top, aspirate completely. Increase the number of wash cycles. After washing, blot the inverted microplate on tissue paper. Repeat assay. 3b. Contaminated or improperly prepared reagents. 3c. Contaminated washing solution (1x). 4. Poor reproducibility or high number of non-repeatable reactive samples. 3d. Insufficient washing or washing not consistent: filling volume and/or aspiration insufficient or not uniform. Insufficient number of washing cycles, contaminated washer. 3e. Using of a washing solution from other manufacturer. 4a. Washing problems. 4b. Uncalibrated pipettes or tips not well fitted. Improper pipetting. 4c. Reagents and sera not at room temperature or not well mixed before using. Use only biokit washing solution. See 3c, 3d, 3e. Use only calibrated pipettes, with well fitted tips and pipette carefully, without bubbles and splashing. Repeat assay. Equilibrate reagents and samples to room temperature and mix thoroughly before using. Keep the microplate protected from air currents. 4d. Air currents over the microplate during incubations. 4e. Too long time for addition Develop consistent and of samples and/or uniform technique. reagents. Inconsistency in time intervals. Air bubbles. 4f. Interference in the optical See 1e. pathway. BIOKIT, S.A. - Can Malé s/n - 08186 Lliçà d’Amunt - Barcelona - SPAIN 7 3000-1102 R13 11.2014 eng.doc 0843 bioelisa LEER CAMBIOS SOMBREADOS bioelisa anti-HBc 3000-1102 1 x 96 TESTS Test de ELISA para la detección de anticuerpos totales contra el antígeno core de la hepatitis B (anti-HBc) en suero o plasma humano. Sumario La hepatitis B es una enfermedad causada por una infección vírica. A lo largo de la infección aparecen varios marcadores serológicos entre los cuales está el anti-HBc. El antígeno "core" de la hepatitis B (HBcAg) es un componente interno del virus de la hepatitis B antigénicamente distinto al antígeno de superficie (HBsAg). Este sistema antígeno-anticuerpo HBcAg/anti-HBc fue descrito por Almeida y col. en 1971.1 El anti-HBc es el primer anticuerpo detectable en el curso de una hepatitis B aguda y puede persistir durante toda la vida. El anti-HBc suele detectarse en sangre inmediatamente después de la detección de HBsAg y justo antes de la aparición de las manifestaciones clínicas de la enfermedad. En casos de hepatitis B aguda con recuperación, el anti-HBc es el único marcador de la infección detectable en el período entre la desaparición de HBsAg y la aparición de anti-HBs. La sangre extraída de un individuo durante este período puede ser infectiva y se ha sugerido que el cribado para anti-HBc además del cribado para HBsAg en donantes, permitiría reducir la incidencia de hepatitis B postransfusionales.4 Por otra parte, la detección de anti-HBc es útil en exámenes prevacunales ya que sólo es necesario que se vacunen contra la hepatitis B aquellos individuos negativos para anti-HBc. Varios estudios han demostrado una correlación entre la presencia de anti-HBc en donaciones sanguíneas con la aparición de hepatitis no A no B (NANBH o hepatitis C) postransfusional.7,8,9 La implementación del cribado para anti-HBc en donantes de sangre podría prevenir muchos de estos casos. Principio bioelisa anti-HBc es un método inmunoenzimático competitivo para la determinación de anticuerpos contra el HBcAg en suero humano. El ensayo está basado en la competencia entre anticuerpos humanos presentes en la muestra y anticuerpos IgG de conejo anti-HBc conjugados con peroxidasa cuando se incuban simultáneamente en los pocillos de una microplaca recubierta con HBcAg recombinante. Después de la incubación se efectúa un lavado para eliminar el material no fijado y a continuación se añade una solución de sustrato enzimático y cromógeno. Esta solución desarrollará un color azul cuando la muestra sea negativa. El color azul cambia a amarillo después de parar la reacción con ácido sulfúrico La presencia de anti-HBc en la muestra reduce el desarrollo de color de forma proporcional a su concentración. Componentes 1. MCPL MICROPLACA: 12 x 8 pocillos recubiertos con antígeno recombinante HBcAg (E. coli). Pocillos separables individualmente. 2. CONJ CONJUGADO: 1 x 6 ml de anticuerpos IgG de conejo anti-HBc conjugados con peroxidasa. Contiene colorante rojo, proteínas estabilizadoras, mertiolato sódico al 0,02% y sulfato de gentamicina al 0,001%. Listo para usar. 3. WASH SOLN 10x SOLUCIÓN DE LAVADO CONCENTRADA: 2 x 50 ml de tampón fosfato concentrado (10x) que contiene Tween 20 al 1% y mertiolato sódico al 0,01%. A diluir 1/10 con agua destilada o desionizada antes de utilizarse. 4. SUBS BUF TAMPÓN SUSTRATO: 1 x 14 ml de tampón citrato-acetato que contiene peróxido de hidrógeno. 5. SOLN TMB CROMÓGENO: 1 x 1,5 ml de 3,3', 5,5'-Tetrametilbenzidina (TMB) disuelta en dimetilsulfóxido (DMSO). 6. CONTROL + CONTROL POSITIVO: 1 x 2 ml de anticuerpos IgG de conejo anti-HBc diluidos en tampón fosfato. Contiene proteínas estabilizadoras y sulfato de gentamicina al 0,001%. Listo para usar. 7. CONTROL – CONTROL NEGATIVO: 1 x 3,5 ml de suero humano negativo para todos los marcadores de la hepatitis B. Contiene sulfato de gentamicina al 0,001%. Listo para usar. 8. H2SO4 1N SOLUCIÓN DE PARADA: 1 x 12 ml de ácido sulfúrico 1N. Listo para usar. BIOKIT, S.A. - Can Malé s/n - 08186 Lliçà d’Amunt - Barcelona - SPAIN 8 3000-1102 R13 11.2014 spa.doc 0843 bioelisa 9. SEALS LÁMINAS ADHESIVAS: Para cubrir la microplaca durante las incubaciones. 10. BAG BOLSA DE PLÁSTICO: Para guardar las tiras sin usar. Precauciones bioelisa anti-HBc es para el diagnóstico IN VITRO. Para uso exclusivo por profesionales. ATENCIÓN: MATERIAL DE RIESGO BIOLÓGICO. Todo el material de origen humano utilizado en la preparación de este producto ha sido encontrado negativo a la presencia de anticuerpos de los virus HIV-1/HIV-2 y HCV, así como a la del antígeno de superficie de la hepatitis B, utilizando un método comercial autorizado. Sin embargo, dado que ningún método puede ofrecer la total seguridad de la ausencia de agentes infecciosos, este producto debe manejarse con precaución: - - No permitir que los reactivos entren en contacto con la piel o los ojos; si esto ocurre, lavar con abundante cantidad de agua. Usar guantes. No pipetear ningún reactivo con la boca. No fumar. Depositar todos los materiales usados en recipientes adecuados para material biocontaminante. Los restos de muestras, controles, reactivos aspirados y puntas desechables deben recogerse en un recipiente destinado al efecto y autoclavarse una hora a 121°C, o tratarse con hipoclorito sódico a una concentración final del 10%, durante 30 minutos. (Los restos que contengan ácido deben ser neutralizados antes de añadir el hipoclorito sódico). Algunos reactivos de este kit contienen azida sódica como conservante. La azida sódica puede reaccionar con tuberías y desagües de plomo o cobre dando lugar a azidas metálicas altamente explosivas. Al desechar los restos de reactivos, deje correr agua abundante. Precauciones de manejo: - Ajustar el lavador al tipo de placa utilizado (fondo plano), para realizar un buen lavado. No mezclar reactivos procedentes de diferentes lotes. No usar los reactivos una vez hayan caducado. No utilice el reactivo si observa algún cambio de apariencia en cualquier componente incluido en el kit. Deben extremarse las precauciones para evitar contaminaciones microbianas y contaminación cruzada entre los reactivos. Utilizar una nueva punta desechable para pipetear cada muestra o reactivo. Es muy importante preparar la solución de sustrato-TMB justo 5-10 minutos antes de ser empleada. Mantenerla en un recipiente bien tapado y al abrigo de la luz. Restos de jabones y/o agentes oxidantes en los recipientes utilizados para la preparación de la solución sustrato-TMB, pueden interferir en la reacción. En caso de que se utilicen recipientes de vidrio, es conveniente lavarlos con ácido sulfúrico o clorhídrico 1N, enjuagarlos bien con agua destilada y secarlos antes de usarlos. Usar preferiblemente material plástico desechable. Conservación y estabilidad Los componentes permanecerán inalterados hasta la fecha de caducidad indicada en la etiqueta, si se conservan entre 2-8°C. La bolsa que contiene la microplaca debe llevarse a temperatura ambiente antes de abrirla para evitar condensación en los pocillos. Una vez abierta la bolsa, la microplaca es estable por 3 meses guardada a 2-8°C en la bolsa de plástico bien cerrada, con la bolsita de silicagel. La solución de lavado, una vez diluida, es estable durante dos semanas si se conserva entre 2-8°C. Guardar el cromógeno al abrigo de la luz. La solución sustratoTMB una vez preparada no es estable, por lo que se deben seguir estrictamente las indicaciones para su utilización. Material necesario no incluido Agua destilada o desionizada. Pipetas multicanal y micropipetas (50 µl, 100 µl) y puntas desechables. Incubador a 37°C ± 1°C. Cronómetro. Lector de microplacas con filtro de 450 nm. Recomendable filtro de referencia de 620 o 630 nm. Sistema de lavado manual o automático. BIOKIT, S.A. - Can Malé s/n - 08186 Lliçà d’Amunt - Barcelona - SPAIN 9 3000-1102 R13 11.2014 spa.doc 0843 bioelisa Recolección de la muestra Usar suero fresco o plasma (citrato/EDTA). Otros anticoagulantes deben ser comprobados antes de utilizarse. Las muestras pueden ser conservadas durante 3 días entre 2-8°C. Si es por un período de tiempo más largo las muestras deben ser congeladas (-20°C). Debe evitarse congelar y descongelar las muestras repetidamente. Partículas en suspensión deben eliminarse por centrifugación. Los sueros o plasmas no deben ser inactivados por calor, ya que puede conducir a resultados incorrectos. No utilizar muestras que contengan azida sódica. Procesamiento automático Esta prueba permite su uso de modo automático o semi-automático en diferentes instrumentos. Es muy importante validar cualquier sistema automático para demostrar que los resultados obtenidos para las muestras son equivalentes a los obtenidos empleándose el ensayo manual. Se recomienda que el usuario valide periódicamente el instrumento. Si encuentra cualquier dificultad en la programación y ajuste de los procesadores automáticos de Biokit, por favor contacte con su distribuidor. PROCEDIMIENTO (Ver esquema del procedimiento) Operaciones previas Todos los reactivos deben estar a temperatura ambiente (20-25°C) antes de empezar el ensayo. Los reactivos líquidos deben homogeneizarse suavemente antes de usarlos. Diluir la solución de lavado concentrada 1/10 con agua destilada o desionizada. Para una placa mezclar 50 ml de solución de lavado concentrada con 450 ml de agua. En caso de no utilizar una placa completa preparar el volumen proporcional de solución. Realización de la prueba 1. Utilizar solamente el número de tiras necesario para el test. Reservar 7 pocillos para blanco y controles. Transferir 50 µl de control negativo a 4 pocillos y 50 µl de control positivo a 2 pocillos. Dejar vacío un pocillo para el blanco de sustrato. 2. Transferir 50 µl de cada una de las muestras a analizar a los pocillos correspondientes. 3. Añadir 50 µl de conjugado a cada pocillo, a excepción del pocillo para el blanco de sustrato. 4. Cubrir la placa con una lámina adhesiva, agitarla suavemente e incubar durante 1 hora a 37°C. 5. Durante los últimos 5-10 minutos de esta incubación, preparar la solución de sustrato-cromógeno. Para una placa añadir 280 µl de la solución de cromógeno (TMB) a un vial de tampón sustrato (14 ml) y mezclar bien. Si no se utiliza toda la placa, preparar la cantidad necesaria según indica la tabla 1. La solución final debe ser incolora, descartar en caso de que se vuelva azul. TABLA 1 Tiras requeridas Tampón sustrato ml Cromógeno (TMB) µl 1 1,0 20 2 2,0 40 4 4,0 80 6 6,0 120 8 8,0 160 10 10,0 200 12 12,0 240 NOTA: El TMB está disuelto en DMSO. Dado que la temperatura de fusión del DMSO es de 18°C, el cromógeno debe alcanzar una temperatura de 20-25°C y agitarse bien antes de usarlo. Es normal que el cromógeno presente un color amarillento. 6. Desechar la lámina adhesiva. Aspirar el contenido de los pocillos y llenarlos completamente (aproximadamente 350 µl) con solución de lavado diluida. Repetir el proceso de aspiración lavado 3 veces más. Asegurarse de que cada columna de pocillos esté en remojo al menos 15 segundos antes del nuevo ciclo de aspiración. Después del último lavado golpear la placa invertida sobre un papel absorbente para eliminar cualquier exceso de líquido en los pocillos. 7. Añadir 100 µl de sustrato-TMB a todos los pocillos, incluso el blanco. 8. Incubar durante 30 minutos a temperatura ambiente (20-25°C). 9. Añadir 100 µl de solución de parada a cada pocillo, guardando la misma secuencia y con los mismos intervalos observados en la adición del sustrato-TMB. BIOKIT, S.A. - Can Malé s/n - 08186 Lliçà d’Amunt - Barcelona - SPAIN 10 3000-1102 R13 11.2014 spa.doc 0843 bioelisa 10. Ajustar el cero del lector con el pocillo del blanco a 450 nm y leer la absorbancia de cada uno de los pocillos en el plazo máximo de 30 minutos. Se recomienda hacer lectura bicromática utilizando filtro de referencia de 620 - 630 nm. Control de calidad Los resultados de un ensayo son válidos si se cumplen los siguientes criterios: 1. Blanco del sustrato: el valor de absorbancia debe ser inferior o igual a 0,100. 2. Control negativo: cada uno de los valores individuales de absorbancia no debe variar más del 20% de la media de los cuatro valores. La media de las absorbancias deber ser igual o mayor que 0,600 después de restar el blanco. 3. Control positivo: la media de las absorbancias debe ser igual o menor que 0,100 después de restar el blanco. Resultados 1. Calcular el valor umbral sumando el valor promedio de absorbancias del control negativo y el del control positivo y multiplicando el resultado de esta suma por 0,4. Valor umbral = (CNx + CPx) x 0,4 2. Dividir la absorbancia de la muestra por el valor umbral. Positivo: Negativo: Dudoso: ratio absorbancia/valor umbral ≤ 1,0 ratio absorbancia/valor umbral > 1,1 ratio absorbancia/valor umbral > 1,0 ≤ 1,1 Interpretación de los resultados Un resultado positivo para anti-HBc significa que el paciente ha contraído la hepatitis B alguna vez previamente. No es un marcador de inmunidad. Un resultado negativo significa que la muestra analizada no contiene anti-HBc o lo contiene por debajo del límite de detección del kit. Para evaluar la situación de un paciente respecto a la hepatitis B deben practicarse los tests para los demás marcadores serológicos de la hepatitis B. Limitaciones del procedimiento Como ocurre con otras pruebas serológicas, los resultados obtenidos con el bioelisa anti-HBc sirven solamente como ayuda al diagnóstico y deben interpretarse teniendo en cuenta la historia clínica del paciente. Para el correcto funcionamiento del kit debe seguirse estrictamente las instrucciones descritas. Cualquier desviación puede dar origen a resultados aberrantes. Muestras con una concentración de anticuerpos anti-HBc inferior a 1,5 U/ml (estándar PEI o WHO) pueden no detectarse. Todas las muestras positivas o dudosas se deberían repetir y probarse para otros marcadores serológicos del HBV. Resultados esperados El anticuerpo anti-HBc es el marcador más frecuente de infección por el virus de la hepatitis B y se detecta tanto en la infección aguda como en la crónica y en la infección pasada con recuperación. La prevalencia de anti-HBc y de otros marcadores de la hepatitis B varía ampliamente en el mundo, de alta (70-90%, ej., África, Asia y Pacífico Oeste) a intermediaria (20-55%, ej., sur y este Europeo) y baja (4-6%, ej., Europa occidental, América del Norte y partes de América del Sur). Diferentes estudios han descrito una prevalencia del 0,53 al 2,16% en donantes de 2,5,6 sangre del Reino Unido. Características funcionales Sensibilidad analítica El límite de detección del bioelisa anti-HBc es 1,5 unidad/ml utilizando el suero de referencia anti-HBc del Paul Ehrlich Institute (PEI), Alemania. Según estudios internos, 1,0 PEI-U/mL equivale a aproximadamente 1,0 UI/mL del primer Estándar Internacional de la OMS para anti-HBc (código NIBSC 95/522). BIOKIT, S.A. - Can Malé s/n - 08186 Lliçà d’Amunt - Barcelona - SPAIN 11 3000-1102 R13 11.2014 spa.doc 0843 bioelisa Evaluaciones El funcionamiento del bioelisa anti-HBc se evaluó en estudios comparativos con otros ensayos comerciales. - En una evaluación interna se probaron 233 muestras que eran positivas de anti-HBc con otro ensayo comercial (76 de ellas eran también positivas de HBsAg). 227 presentaron resultado positivo (incluso las 76 positivas de HBsAg) y 6 presentaron resultado negativo. Las 6 muestras discrepantes se probaron con un tercero ensayo comercial y los resultados fueron también negativos. - En una evaluación externa en comparación con otro ensayo comercial, se probaron 175 muestras. 31 fueron positivas y 141 fueron negativas con ambos ensayos. Se obtuvo una concordancia global del 98,3% (172/175). Eliminándose 2 muestras dudosas de los cálculos, la sensibilidad relativa fue del 100% (31/31) y la especificidad relativa fue del 99,2%. - En otra evaluación externa, se probaron 251 muestras positivas de HBsAg. 247 (98,4%) fueron reactivas con el bioelisa anti-HBc, de las cuales 245 fueron reactivas también con el método alternativo utilizado en rutina para anti-HBc. 4 muestras fueron anti-HBc negativas con el bioelisa y con el método en rutina y 2 fueron positivas solamente con el bioelisa. Por tanto, la sensibilidad relativa del bioelisa fue del 100% (245/245) y la concordancia global entre ambos métodos fue del 99,2% (249/251). - En una otra evaluación externa, 5058 muestras consecutivas de donantes de sangre habituales se probaron en paralelo con el bioelisa y con el método en rutina. De estas muestras, 6 fueron reactivas tanto con el bioelisa como con el método en rutina, 5 de las cuales se confirmaron 5 como de infección pasada después de realizarse tests adicionales para otros marcadores de HBV. mientras que 1 era positiva solamente para anti-HBc. Otras 3 muestras fueron repetidamente positivas con el bioelisa y negativas con el test en rutina siendo 2 de ellas consideradas como falsamente positivas y 1 de resultado inconclusivo después de realizar tests adicionales. Considerando como positivas verdaderas solamente las muestras confirmadas como de infección pasada, la especificidad encontrada fue del 99,92% (5049/5053). - Otra evaluación externa de sensibilidad a punto final y funcionamiento comparando con otros ensayos 3 comerciales se encuentra en la bibliografía. Precisión Reproducibilidad intra-ensayo: Los coeficientes de variación obtenidos para los valores de absorbancia de 48 replicados de una muestra negativa fueron del 4,34%, 4,19% e 3,66% en tres lotes estudiados. Reproducibilidad inter-ensayo: Tres muestras negativas se probaron en 3 ensayos diferentes. Los coeficientes de variación obtenidos para los ratios absorbancia/valor umbral de las 3 muestras fueron del 4,9%, 7,0% y 8,2% respectivamente. Interferencias Para estudiar posibles interferencias, se probaron muestras con un riesgo potencial de producir reacciones cruzadas, tales como sueros positivos de factor reumatoide (RF), anticuerpos anti-nucleares (ANA), anticuerpos heterófilos, IgM anti-HAV, anti-E. coli y de mujeres embarazadas. No se observaron evidencias de interferencia. BIOKIT, S.A. - Can Malé s/n - 08186 Lliçà d’Amunt - Barcelona - SPAIN 12 3000-1102 R13 11.2014 spa.doc 0843 bioelisa bioelisa: Guía de problemas Problema Posibles causas Solución 1. Controles fuera de validación. 1a. Temperatura, incubación o pipeteo incorrecto. 1b. Preparación incorrecta de reactivos, error en las diluciones. Reactivos no mezclados correctamente. 1c. Contaminación cruzada entre controles. Comprobar procedimiento. Repetir el ensayo. Comprobar procedimiento. Repetir el ensayo. 1d. 1e. 1f. 1g. 2. Sin color o poco color al final del ensayo. 2a. 2b. 2c. 2d. Pipetear cuidadosamente. No intercambiar los tapones de los viales. Repetir el ensayo. Filtro de lectura Comprobar que el filtro de incorrecto. lectura sea de 450 nm. Si no se usa filtro de referencia de 620 o 630 nm, las absorbancias aumentan aproximadamente 50 miliunidades. Interferencia en el camino Comprobar el lector. Limpiar o óptico. secar el fondo de los pocillos. Comprobar que no haya burbujas de aire. Repetir la lectura. Se han utilizado No utilizar componentes de componentes de lotes lotes diferentes puesto que diferentes. están ajustados para cada lote en particular. Reactivos caducados. Comprobar la caducidad del kit. No utilizar un kit caducado. Uno o más reactivos no Comprobar el procedimiento. añadidos o añadidos en Repetir el ensayo. secuencia equivocada. Conjugado inactivo: Comprobar si ha habido conservación incorrecta. contaminación, comprobar el procedimiento. Repetir el ensayo. Microplaca inactiva: Mantener siempre las tiras no conservación incorrecta. utilizadas en la bolsa minigrip, bien cerrada, con el desecante dentro. Repetir el ensayo. Sustrato inactivo: Utilizar siempre una dilución conservación o dilución fresca de TMB en tampón incorrecta, el contenedor sustrato. Usar contenedores utilizado afecta la desechables o lavados con estabilidad del sustrato, ácido o etanol y enjuagados contaminación cruzada con agua desionizada. con la solución de Comprobar el procedimiento. parada. Repetir el ensayo. BIOKIT, S.A. - Can Malé s/n - 08186 Lliçà d’Amunt - Barcelona - SPAIN 13 3000-1102 R13 11.2014 spa.doc 0843 bioelisa bioelisa: Guía de problemas Problema Posibles causas Solución 3. Demasiado color en todos los pocillos de la microplaca. 3a. Sustrato contaminado, oxidado o preparado incorrectamente. Comprobar que el sustrato preparado sea incoloro, descártelo si está azul. Asegúrese que el TMB está completamente líquido antes de utilizarlo. Asegurar la correcta mezcla del TMB en el tampón sustrato. Utilizar viales o contenedores desechables o lavados con solución ácida o etanol. Repetir el ensayo. Comprobar contaminación (aspecto turbio). Comprobar diluciones. Repetir el ensayo. Comprobar la calidad del agua destilada/desionizada utilizada para preparar la dilución. Repetir el ensayo. Comprobar el lavador. Llenar los pocillos hasta el tope y aspirar completamente. Incrementar el número de ciclos de lavado. Golpear la placa invertida contra papel absorbente. Repetir el ensayo. Utilizar sólo la solución de lavado de biokit. 3b. Reactivos contaminados o preparados incorrectamente. 3c. Solución de lavado (1x) contaminada. 3d. Lavado insuficiente o no consistente: llenado o aspiración insuficiente o no uniforme, número de ciclos de lavado insuficiente. Lavador contaminado. 3e. Se ha utilizado solución de lavado de otro fabricante. 4. Reproducibilidad pobre o 4a. Problemas de lavado. elevado número de 4b. Pipetas mal calibradas o muestras reactivas que puntas mal encajadas. no se repiten. Técnica de pipeteo incorrecta. 4c. 4d. 4e. 4f. Ver apartados 3c, 3d, 3e. Utilizar pipetas calibradas con puntas bien ajustadas. Pipetear cuidadosamente sin burbujas ni salpicaduras. Repetir el ensayo. Reactivos y muestra no a Atemperar muestras y temperatura ambiente o reactivos y mezclarlos bien no correctamente antes de utilizarlos. mezclados antes de usar. Corrientes de aire sobre Mantener la microplaca la microplaca durante las protegida de las corrientes de incubaciones. aire. Demasiado tiempo en la Desarrollar una técnica adición de muestras y/o uniforme y consistente. reactivos. Inconsistencia en los intervalos de tiempo, burbujas de aire. Interferencia en el camino Ver 1e. óptico. BIOKIT, S.A. - Can Malé s/n - 08186 Lliçà d’Amunt - Barcelona - SPAIN 14 3000-1102 R13 11.2014 spa.doc 0843 bioelisa HERVORGEHOBENE ÄNDERUNGEN LESEN bioelisa anti-HBc 3000-1102 1 x 96 TESTS ELISA-Test zur Bestimmung der Gesamtantikörper gegen das Kernantigen der Hepatitis B (anti-HBc) in Humanserum oder –plasma. Zusammenfassung Die Hepatitis B ist eine Krankheit, die durch eine Virusinfektion verursacht wird. Im Verlauf der Infektion treten verschiedene serologische Marker u.a. der Anti-HBc auf. Das „Kern“-Antigen der Hepatitis B (HBcAg) ist ein interner Bestandteil des Hepatitis B-Virus, das sich unter antigenetischem Gesichtspunkt von dem Oberflächen-Antigen (HBsAg) unterscheidet. Dieses HBcAg/Anti-HBc-Antigen-Antikörper-System wurde 1971 von Almeida und Kol.1 beschrieben. Der Anti-HBc ist der erste im Verlauf einer akuten Hepatitis B nachweisbare Antikörper und kann lebenslang weiterbestehen. Der Anti-HBc-Antikörper lässt sich in der Regel unmittelbar nach dem Nachweis von HBsAg und genau vor dem Auftreten der klinischen Manifestationen der Krankheit im Blut nachweisen. In Fällen akuter Hepatitis B mit Erholung ist der Anti-HBc der einzige im Zeitraum zwischen dem Verschwinden des HBsAg und dem Auftreten des Anti-HBs nachweisbare Infektionsmarker. Das einer Person in diesem Zeitraum abgenommene Blut kann infektiös sein und es ist vorgeschlagen worden, dass die zusätzliche Sichtung auf Anti-HBc neben HBsAg bei Spendern das Vorkommen von posttransfusionaler Hepatitis B senken würde.4 Der Nachweis von Anti-HBc erweist sich zudem bei Untersuchungen vor Impfungen als nützlich, da nur diejenigen Personen geimpft werden müssen, deren Anti-HBc-Befund negativ ausfällt. Verschiedene Studien haben einen Zusammenhang zwischen dem Vorhandensein von Anti-HBc in Blutspenden und dem Auftreten von Hepatitis weder A noch B (NANBH oder Hepatitis C) nach Transfusionen gezeigt.7,8,9 Die Einführung der Sichtung der Anti-HBc bei Blutspendern könnte vielen dieser Fälle vorbeugen. Prinzip bioelisa anti-HBc ist eine kompetitive enzymimmune Methode, um die HBcAg-Antikörper im Humanserum zu bestimmen. Der Versuch basiert auf dem Wettbewerb zwischen in der Probe vorhandenen menschlichen Antikörpern und mit Peroxidase konjugierten IgG-Kaninchenantikörpern Anti-HBc, wenn sie gleichzeitig in den Vertiefungen eines mit rekombinanten HBcAg beschichteten Mikrotiters inkubiert werden. Nach der Inkubation wird ausgewaschen, um das ungebundene Material zu beseitigen und anschließend wird ein Enzymsubstrat, das zu einem Farbumschlag führt, hinzugegeben. Diese Lösung wird sich bei einer negativen Probe blau verfärben. Die blaue Farbe wird gelb, nachdem die Reaktion mit Schwefelsäure gestoppt worden ist. Das Vorhandensein von Anti-HBc in der Probe mindert die Verfärbung direkt proportional zu seiner Konzentration. Bestandteile 1. MCPL MIKROTITERPLATTE: 12 x 8 Vertiefungen, beschichtet mit rekombinantem HBcAg Antigen (E. coli). Einzeln trennbare Vertiefungen. 2. CONJ KONJUGAT: 1 x 6 ml Peroxidase konjugierte IgG- Kaninchen-HBc-Antikörper. Enthält roten Farbstoff, stabilisierende Proteine, Thimerosal 0,02% und 0,001% Gentamicinsulfat. Gebrauchsfertig. 3. WASH SOLN 10x KONZENTRIERTE WASCHLÖSUNG: 2 x 50 ml konzentrierter Phosphatpuffer (10x), der 1% Tween 20 und 0,01% Thimerosal enthält. Vor Gebrauch mit destilliertem oder deionisiertem Wasser 1/10 verdünnen. 4. SUBS BUF SUBSTRATPUFFER: 1 x 14 ml Zitrat/Azetat-Puffer mit Wasserstoffperoxid. 5. SOLN TMB CHROMOGEN: 1 x 1,5 ml 3,3', 5,5'-Tetramethylbenzidin (TMB), gelöst in Dimethylsulfoxid (DMSO). Enthält roten Farbstoff. 6. CONTROL + POSITIVE KONTROLLE: 1 x 2 ml in Phosphatpuffer gelöste IgG-Kaninchen-HBc-Antikörper. Enthält stabilisierende Proteine und 0,001% Gentamicinsulfat. Gebrauchsfertig. 7. CONTROL – NEGATIVE KONTROLLE: 1 x 3,5 ml für alle Hepatitis-B-Marker negatives Humanserum. Enthält 0,001% Gentamicinsulfat. Gebrauchsfertig. 8. H2SO4 1N STOPPLÖSUNG: 1 x 12 ml 1N Schwefelsäure. Gebrauchsfertig. BIOKIT, S.A. - Can Malé s/n - 08186 Lliçà d’Amunt - Barcelona - SPAIN 15 3000-1102 R13 11.2014 ger.doc 0843 bioelisa 9. SEALS HAFTFOLIE: Zum Abdecken der Mikrotiterplatte während der Inkubationsphasen. 10. BAG FOLIENBEUTEL: Zur Aufbewahrung der nicht verwendeten Streifen. Vorsichtsmassnahmen bioelisa anti-HBc ist ausschliesslich für die IN VITRO-Diagnostik bestimmt. Für den ausschließlichen Gebrauch durch Fachpersonal. ACHTUNG: BIOLOGISCH GEFÄHRLICHES MATERIAL. Das gesamte zur Herstellung dieses Produkts verwendete Humanmaterial ist unter Verwendung eines zugelassenen kommerziellen Verfahrens auf die Anwesenheit von HBsAg, HIV-1/HIV-2 und HCV Antikörpern getestet und für negativ befunden worden. Da kein Nachweisverfahren die Abwesenheit von infektiösen Agenzien garantieren kann, ist dieses Produkt mit entsprechenden Vorsichtsmassnahmen zu handhaben: - - Eine Berührung der Reagenzien mit Haut oder Augen vermeiden; bei Berührung mit reichlich Wasser auswaschen. Handschuhe verwenden. Die Reagenzien nicht mit dem Mund pipettieren. Nicht rauchen. Alle benutzten Materialien sind separat in Behältern für biologische Abfälle zu entsorgen. Die Reste von Proben, Kontrollen, aspirierte Reagenzien und Pipettenspitzen müssen in einem dafür vorgesehenen Behälter gesammelt werden und eine Stunde bei 121°C autoklaviert werden oder mit Natriumhypochlorit in einer Endkonzentration von 10% 30 Minuten lang behandelt werden. (Die Reste, die Säure enthalten können, müssen vor Zugabe des Natriumhypochlorit neutralisiert werden). Einige Reagenzien in diesem Kit enthalten Natriumazid als Konservierungsmittel. Natriumazid kann auf Blei- oder Kupfer-Rohrleitungen und –Abflüsse reagieren und zu hochexplosiven Metallaziden führen. Beim Entfernen der Reagenzreste muss mit genügend Wasser nachgespült werden. Hinweise für die Handhabung: - Für sachgemäßes Auswaschen den Wascher auf den Mikrotiterplattentyp einstellen (flacher Grund). Reagenzien aus unterschiedlichen Chargen nicht mischen. Die Reagenzien nicht über das Verfallsdatum hinaus verwenden. Verwenden Sie das Reagenz nicht, wenn Sie an irgendeinem zu dem Kit gehörenden Bestandteil irgendeine Änderung des Erscheinungsbilds beobachten. Es ist besondere Sorgfalt aufzuwenden, um eine Kontamination mit Bakterien und eine Kreuzkontamination zwischen den Reagenzien zu vermeiden. Zur Pipettierung jeder Probe und jedes Reagenz ist eine neue Einweg-Pipettenspitze zu verwenden. Reste von Seifen und/oder Oxidationsmitteln, die in den zur Herstellung der TMB-Substratlösung verwendeten Gefässe zurückgeblieben sind, können die Reaktion beeinflussen. Bei Verwendung von Glasgefäßen sollten diese darum mit 1N Schwefelsäure oder Salzsäure ausgewaschen, mit reichlich destilliertem Wasser ausgespült und vor Gebrauch getrocknet werden. Vorzugsweise sind Einweggefäße aus Kunststoff zu verwenden. Lagerung und Stabilität Bei einer Lagerungstemperatur von 2-8°C bleiben die Bestandteile bis zum auf dem Etikett angegebenen Verfallsdatum haltbar. Der Beutel mit der Mikrotiterplatte muss vor dem Öffnen auf Raumtemperatur gebracht werden, um eine Kondensationsbildung in den Vertiefungen zu vermeiden. Nach dem Öffnen des Beutels ist die Mikrotiterplatte bei Lagerung zwischen 2 und 8°C im gut verschlossenen Kunststoffbeutel mit dem Silicagelbeutel 3 Monate haltbar. Die Waschlösung bleibt nach Verdünnung zwei Wochen haltbar, wenn sie bei 2-8°C gelagert wird. Das Chromogen vor direktem Licht schützen. Die TMB-Substratlösung ist nach Zubereitung nicht stabil, deshalb sind die Gebrauchsanweisungen sorgfältig zu befolgen. Erforderliches, nicht mitgeliefertes Material Destilliertes oder deionisiertes Wasser. Mehrkanalpipetten und Mikropipetten (50 µl, 100 µl) und Einwegspitzen. Inkubator bei 37°C ± 1°C. Stoppuhr. Mikrotiterplattenmessgerät mit Filter 450 nm. Empfohlen wird ein Referenzfilter 620 oder 630 nm. Manuelles oder automatisiertes Waschsystem. BIOKIT, S.A. - Can Malé s/n - 08186 Lliçà d’Amunt - Barcelona - SPAIN 16 3000-1102 R13 11.2014 ger.doc 0843 bioelisa Probenmaterial Frisches Serum oder Plasma (Zitrat/EDTA) benutzen. Andere Antikoagulantien müssen zuvor evaluiert werden. Die Proben können 3 Tage lang bei 2-8°C gelagert werden. Bei längerer Lagerung müssen die Proben eingefroren werden (-20°C). Mehrmaliges Einfrieren und Auftauen der Proben ist zu vermeiden. Sichtbare suspendierte Partikel sind durch Zentrifugieren zu entfernen. Die Seren oder Plasmen dürfen nicht hitzinaktiviert werden, da es sonst zu falschen Ergebnissen kommen kann. Keine Proben verwenden, die Natriumazid enthalten. Automatische Verarbeitung Dieser Test kann in seiner automatischen oder halbautomatischen Modalität in unterschiedlichen Instrumenten eingesetzt werden. Beim Einsatz automatischer Systeme muss jedoch unbedingt geprüft werden, ob die erhaltenen Probenergebnisse mit den Ergebnissen des manuellen Tests übereinstimmen. Der Anwender sollte das Instrument in regelmäßigen Abständen validieren. Falls Sie Probleme bei der Programmierung und Einstellung der automatischen Prozessoren von Biokit feststellen sollten, setzen Sie sich bitte mit Ihrem Händler in Verbindung. DURCHFÜHRUNG (Siehe schematischer Ablauf) Vorbereitung Alle Reagenzien müssen vor Beginn des Tests auf Raumtemperatur gebracht worden sein (20-25°C). Flüssige Reagenzien müssen vor Gebrauch vorsichtig gemischt werden. Die konzentrierte Waschlösung ist mit destilliertem oder deionisiertem Wasser auf 1/10 zu verdünnen. Für eine Platte 50 ml konzentrierte Waschlösung mit 450 ml Wasser mischen. Wird nicht die ganze Platte gebraucht, dann eine proportional entsprechende Menge der Lösung herstellen. Versuchsprotokoll 1. Nur die für den Test erforderliche Anzahl von Streifen verwenden. 7 Vertiefungen für Leerwert und Kontrolle reservieren. 50 μl von negativer Kontrolle auf 4 Vertiefungen und 50 μl von positiver Kontrolle auf 2 Vertiefungen hinzugeben. Eine Vertiefung für das Substratsleerwert freilassen. 2. 50 µl von jeder zu analysierenden Probe auf die entsprechenden Vertiefungen überführen. 3. 50 µl des Konjugats auf jede Vertiefung hinzugeben, mit Ausnahme der Vertiefung für die Leerwertsprobe. 4. Die Platte mit einer Haftfolie abdecken, leicht schütteln und 1 Stunde lang bei 37°C inkubieren. 5. Während der letzten 5-10 Minuten dieser Inkubation die Substrat-Chromogen-Lösung zubereiten. Bei Verwendung der ganzen Platte 280 µl der TMB-Chromogen-Lösung in die Reagenzflasche mit Substratpuffer (14 ml) einfüllen und gut mischen. Wird nicht die ganze Platte benötigt, dann die erforderliche Menge gemäß Tabelle 1 zubereiten. Die endgültige Lösung muss farblos sein; bei Blaufärbung nicht mehr verwenden. TABELLE 1 Erforderliche Streifen Substratpuffer ml Chromogen (TMB) µl 1 1,0 20 2 2,0 40 4 4,0 80 6 6,0 120 8 8,0 160 10 10,0 200 12 12,0 240 HINWEIS: Das TMB ist in DMSO gelöst. Da die Schmelzpunkt von DMSO bei 18°C liegt muss das Chromogen vor Gebrauch auf eine Temperatur von 20-25°C gebracht und gut gemischt werden. Eine Gelbfärbung der Chromogenlösung ist normal. 6. Die Haftfolie abnehmen und entsorgen. Den Inhalt aus den Vertiefungen herauspipettieren und diese vollständig (ca. 350 µl) mit verdünnter Waschlösung befüllen. Den Vorgang aus Aspirierung und Auswaschen weitere 3 Mal wiederholen. Stellen sie sicher, dass jede Vertiefungsreihe mindestens 15 Sekunden einweicht, bevor ein neuer Aspirationszyklus einsetzt. Nach dem letzten Waschen die Platte umgekehrt über saugfähigem Papier ausklopfen, um alle Flüssigkeitsüberschüsse in den Vertiefungen zu beseitigen. 7. 100 µl des TMB-Substrats auf alle Vertiefungen sogar des Leerwertes hinzugeben. 8. 30 Minuten lang bei Raumtemperatur (20-25°C) inkubieren. 9. 100 µl Stopplösung in jede Vertiefung einfüllen, dabei die gleiche Reihenfolge und die gleichen Zeitabstände einhalten wie bei der Zugabe des TMB-Substrats. BIOKIT, S.A. - Can Malé s/n - 08186 Lliçà d’Amunt - Barcelona - SPAIN 17 3000-1102 R13 11.2014 ger.doc 0843 bioelisa 10. Das Messgerät anhand der Vertiefung mit der Leerwertsprobe bei 450 nm auf Null stellen und die Extinktion jeder einzelnen Vertiefung innerhalb einer Zeitspanne von maximal 30 Minuten ablesen. Empfohlen wird eine biochromatische Messung mit einem Referenzfilter von 620 - 630 nm. Qualitätskontrolle Die Ergebnisse einer Serie sind gültig, wenn folgende Kriterien erfüllt sind: 1. Substratleerwert: der Extinktionsgrad muss unterhalb oder gleich 0,100 sein. 2. Negative Kontrolle: keiner der einzelnen Extinktionswerte darf mehr als 20% vom Mittelwert der vier Werte abweichen. Der Extinktionsmittelwert muss nach dem Abzug von Leerwert bei oder höher als 0,600 liegen. 3. Positive Kontrolle: Der Extinktionsmittelwert muss nach dem Abzug von Leerwert bei oder unter 0,100 liegen. Qualitative Ergebnisse 1. Schwellenwert berechnen, indem der Extinktionsmittelwert der negativen Kontrolle und der der positiven Kontrolle addiert und das Ergebnis dieser Summe mit 0,4 multipliziert wird. Schwellenwert = (NKx + PKx) x 0,4 2. Die Extinktion der Probe durch den Schwellenwert teilen. Positiv: Negativ: Zweifelhaft: Verhältnis Extinktion/Schwellenwert ≤ 1,0 Verhältnis Extinktion/Schwellenwert > 1,1 Verhältnis Extinktion/Schwellenwert > 1,0 ≤ 1,1 Auswertung der Ergebnisse Ein positiver Befund auf Anti-HBc bedeutet, dass der Patient sich früher einmal mit Hepatitis B infiziert hat. Es ist kein Immunitätsmarker. Ein negativer Befund bedeutet, dass die analysierte Probe entweder keine Anti-HBc aufweist oder dass diese unterhalb der Nachweisgrenze des Kits liegen. Um die Situation eines Patienten im Hinblick auf Hepatitis B zu bewerten, müssen die Tests für die übrigen serologischen Marker der Hepatitis B durchgeführt werden. Begrenzung der Methode Wie auch bei anderen serologischen Untersuchungen dienen die mit bioelisa anti-HBc ermittelten Resultate als Hilfe bei der Diagnose und müssen unter Berücksichtigung des klinischen Befunds des Patienten interpretiert werden. Für eine optimale Leistung des Kits sind die beschriebenen Anweisungen genauestens zu befolgen. Irgendeine Abweichung kann zu abwegigen Ergebnissen führen. Proben mit einer Anti-HBc-Antikörperkonzentration von weniger als 1,5 E/ml (Standard PEI oder WHO) können nicht nachgewiesen werden. Alle positiven oder zweifelhaften Proben müssen wiederholt und auf andere serologische HBV-Marker überprüft werden. Erwartete Ergebnisse Der Anti-HBc-Antikörper ist der am häufigsten auftretende Marker für eine Infektion mit dem Virus der Hepatitis B und er wird sowohl bei der akuten als auch chronischen Infektion sowie einer durchgemachten Infektion mit Erholung nachgewiesen. Die Prävalenz von Anti-HBc und sonstigen Hepatitis-B-Markern schwankt weltweit sehr stark, von hoch (70-90%, z.B. Afrika, Asien und Westpazifik) über mittel (20-55%, z.B. Süd- und Osteuropa bis niedrig (4-6%, z.B. Westeuropa, Nordamerika und Teile Südamerikas). Verschiedene Studien haben bei 2,5,6 Blutspendern im Vereinigten Königreich eine Prävalenz von 0,53 bis 2,16% beschrieben. Charakteristika des Tests Analytische Sensibilität Die Nachweisgrenze des bioelisa anti-HBc beträgt 1,5 Einheit/ml, wenn das Referenz-Anti-HBc-Serum des Paul-Ehrlich-Instituts (PEI), Deutschland, benutzt wird. Nach internen Studien, 1,0 PEI-U/mL entspricht etwa 1,0 IU/mL der WHO Erste Internationalen Standard für Anti-HBc (NIBSC Code 95/522). BIOKIT, S.A. - Can Malé s/n - 08186 Lliçà d’Amunt - Barcelona - SPAIN 18 3000-1102 R13 11.2014 ger.doc 0843 bioelisa Auswertungen Die Leistungsfähigkeit von bioelisa anti-HBc wurde in Vergleichsstudien mit anderen kommerziellen Tests untersucht. - Bei einer internen Auswertung wurden 233 Proben getestet, die mit einem anderen handelsüblichen Test positiv für Anti-HBc waren (76 von ihnen waren auch positiv für HBsAg). 227 erbrachten ein positives Ergebnis (sogar die 76 positiven für HBsAg) und 6 ergaben einen negativen Befund. Die 6 abweichenden Proben wurden mit einem dritten handelsüblichen Test geprüft und die Ergebnisse waren ebenfalls negativ. - Bei einer externen Auswertung wurden im Vergleich mit einem anderen handelsüblichen Test 175 Proben getestet. 31 waren mit beiden Tests positiv und 141 negativ. Man erhielt eine Gesamtkonkordanz von 98,3% (172/175). Bei Ausschluss von 2 zweifelhaften Proben lag die relative Sensitivität bei 100% (31/31) und die relative Spezifität bei 99,2%. - Bei einer anderen externen Auswertung, wurden 251 positive HBsAg-Proben getestet. 247 (98,4%) reagierten mit dem bioelisa anti-HBc, von denen 245 ebenfalls mit der routinemäßig für Anti-HBc verwendeten Alternativmethode reagierten. 4 Proben waren mit dem bioelisa und der Routinemethode Anti-HBc negativ und 2 waren nur mit dem bioelisa positiv. Somit lag die relative Sensitivität von bioelisa bei 100% (245/245) und die Gesamtkonkordanz zwischen beiden Methoden betrug 99,2% (249/251). - Bei einer anderen externen Auswertung wurden 5058 aufeinanderfolgende Proben von gewöhnlichen Blutspendern parallel mit bioelisa und der Routinemethode getestet. Von diesen Proben reagierten 6 sowohl mit bioelisa als auch der Routinemethode, 5 davon wurden nach der Durchführung von zusätzlichen Tests für sonstige HBV-Marker als zurückliegende Infektion bestätigt, während 1 nur für Anti-HBc positiv ausfiel. Weitere 3 Proben waren wiederholt positiv mit bioelisa und negativ mit dem Routinetest, wobei 2 von ihnen nach Durchführung zusätzlicher Tests als falsch positiv und 1 als nicht eindeutiges Resultat eingestuft wurden. Wenn man die als zurückliegende Infektion bestätigten Proben als tatsächliche positive Befunde ansieht, lag die gefundene Spezifität bei 99,92% (5049/5053). - Eine weitere externe Auswertung der Sensitivität am Endpunkt und Funktionieren mit Vergleich mit anderen 3 handelsüblichen Versuchen, erscheint in der Literatur. Präzision Intra-Assay Reproduzierbarkeit: Die erhaltenen Variationskoeffizienten für die Extinktionswerte einer negativen Probe, die 48 Mal repliziert wurde, lagen bei 4,34%, 4,19% und 3,66% bei drei untersuchten Chargen. Inter-Assay Reproduzierbarkeit: Drei negative Proben unterschiedlichen Niveaus wurden in 3 verschiedenen Tests getestet. Die erhaltenen Variationskoeffizienten für das Verhältnis Extinktion/Schwellenwert der 3 Proben lagen bei 4,9%, 7,0% und 8,2%. Interferenzen Um mögliche Interferenzen zu prüfen, wurden Proben mit einem potenziellen Risiko zur Erzeugung von Kreuzreaktionen, wie etwa Seren mit positiven Rheumafaktor (RF), Anti-Nuklearen Antikörpern (ANA), heterophilen Antikörpern, IgM Anti-HAV, Anti-E. coli und von schwangeren Frauen getestet. Es wurden keine Hinweise auf Interferenzen beobachtet. BIOKIT, S.A. - Can Malé s/n - 08186 Lliçà d’Amunt - Barcelona - SPAIN 19 3000-1102 R13 11.2014 ger.doc 0843 bioelisa bioelisa: Leitfaden zur Problemlösung Problem Mögliche Ursachen 1. Kontrollen außerhalb der 1a. Temperatur, Inkubation oder Pipettieren falsch. Validierung. 1b. Unsachgemäße Vorbereitung der Reagenzien, falsche Verdünnung. Reagenzien nicht richtig durchgemischt. 1c. Kreuzkontamination zwischen Kontrollen. 1d. Falscher Lesefilter. 1e. Interferenz in der Optik. 1f. Es wurden Komponenten aus unterschiedlichen Chargen verwendet. 1g. Reagenzien abgelaufen. 2. Keine oder nur schwache 2a. Ein Reagenz oder mehrere nicht oder in der Färbung am Ende des falschen Reihenfolge Tests. hinzugefügt. 2b. Konjugat inaktiv: unsachgemäße Konservierung. 2c. Mikrotiterplatte inaktiv: unsachgemäße Konservierung. 2d. Substrat inaktiv: unsachgemäße Konservierung oder Verdünnung, der verwendete Behälter beeinträchtigt die Stabilität des Substrats, Kreuzkontamination mit der Stopplösung. Lösung Methode überprüfen. Den Test wiederholen. Methode überprüfen. Den Test wiederholen. Sorgfältig pipettieren. Die Reagenzflascheverschlüsse nicht vertauschen. Den Test wiederholen. Überprüfen, ob ein Lesefilter der Wellenlänge 450 nm eingesetzt ist. Wird kein Referenzfilter mit 620-630 nm eingesetzt, dann erhöht sich die Extinktion um ca. 0,050. Das Messgerät überprüfen. Den Grund der Vertiefungen reinigen oder trocknen. Prüfen, ob Luftblasen eingeschlossen sind. Die Ablesung wiederholen. Keine Komponenten aus unterschiedlichen Chargen mischen, da diese spezifisch für jeden Chargen zusammengestellt sind. Verfallsdatum des Kits prüfen. Ein abgelaufenes Kit nicht mehr verwenden. Methode überprüfen. Den Test wiederholen. Prüfen, ob es zu einer Kontamination gekommen ist. Methode überprüfen. Den Test wiederholen. Die nicht verwendeten Streifen sind immer im verschließbaren Folienbeutel zusammen mit dem Trockenmittel aufzubewahren. Den Test wiederholen. Immer eine neu zubereitete TMB-Lösung im Substratpuffer verwenden. Einwegbehälter verwenden oder die Behälter mit Säure oder Ethanol auswaschen und mit desionisiertem Wasser ausspülen. Methode überprüfen. Den Test wiederholen. BIOKIT, S.A. - Can Malé s/n - 08186 Lliçà d’Amunt - Barcelona - SPAIN 20 3000-1102 R13 11.2014 ger.doc 0843 bioelisa bioelisa: Leitfaden zur Problemlösung Problem Mögliche Ursachen Lösung 3. Zu starke Färbung in allen Vertiefungen der Mikrotiterplatte. 3a. Substrat kontaminiert, oxidiert oder unsachgemäß vorbereitet. Prüfen, ob das vorbereitete Substrat farblos ist; bei Blaufärbung nicht mehr verwenden. Vor Verwendung das TMB prüfen und sicherstellen, dass es vollkommen flüssig ist. Für eine vollständige Durchmischung des TMB im Substratpuffer sorgen. Einweg-Reagenzgläser oder –Behälter verwenden oder diese mit Säure oder Ethanol auswaschen. Den Test wiederholen. Auf Kontamination prüfen (Trübung). Verdünnungen prüfen. Den Test wiederholen. Die Qualität des destillierten/deionisierten Wassers zur Herstellung der Verdünnung prüfen. Den Test wiederholen. Wascher prüfen. Die Vertiefungen bis zum Rand befüllen und vollständig aspirieren. Die Anzahl der Waschzyklen und die Einweichzeit erhöhen. Die umgekehrte Platte auf saugfähigem Papier ausklopfen. Den Test wiederholen. Nur die Waschlösung von biokit verwenden. 3b. Reagenzien kontaminiert oder unsachgemäß zubereitet. 3c. Waschlösung (1x) kontaminiert. 3d. Waschen ungenügend oder nicht konsistent: Füllmenge und/oder Aspirieren ungenügend oder nicht einheitlich, Anzahl der Waschzyklen ungenügend. Wascher kontaminiert. 4. Schlechte Reproduzierbarkeit oder erhöhte Anzahl reaktiver Proben, die sich nicht wiederholen. 3e. Es wurde Waschlösung von einem anderen Hersteller verwendet. 4a. Probleme beim Waschen. 4b. Pipetten schlecht kalibriert oder Pipettenspitzen nicht richtig eingesetzt. Unsachgemäße Pipettiertechnik. 4c. Reagenzien und Seren nicht auf Raumtemperatur oder vor Gebrauch nicht richtig gemischt. 4d. Mikrotiterplatten während der Inkubationen der Zugluft ausgesetzt. 4e. Zuviel Zeit bei der Zugabe von Proben und/oder Reagenzien. Inkonsistente Zeitintervalle. Luftblasen. 4f. Interferenzen in der Optik. Siehe Abschnitte 3c, 3d, 3e. Nur kalibrierte Pipetten mit richtig eingesetzten Pipettenspitzen verwenden. Sorgfältig und ohne Blasen und Spritzer pipettieren. Den Test wiederholen. Reagenzien und Seren auf Raumtemperatur bringen und vor Gebrauch gut mischen. Die Mikrotiterplatte vor Zugluft geschützt lagern. Eine einheitliche und konsistente Technik entwickeln. Siehe 1e. BIOKIT, S.A. - Can Malé s/n - 08186 Lliçà d’Amunt - Barcelona - SPAIN 21 3000-1102 R13 11.2014 ger.doc 0843 bioelisa LIRE LES CHANGEMENTS SURLIGNÉS bioelisa anti-HBc 3000-1102 1 x 96 TESTS Test d’ELISA pour la détection des anticorps totaux contre l’antigène du core de l’hépatite B (anti-HBc) dans du sérum ou du plasma humain. Sommaire L’hépatite B est une maladie provoquée par une infection virale. Pendant le processus infectieux, plusieurs marqueurs sérologiques apparaissent, dont l’anti-HBc. L’antigène "core" de l’hépatite B (HBcAg) est un composant interne du virus de l’hépatite B antigéniquement différent de l’antigène de surface (HBsAg). Ce système antigène-anticorps HBcAg/anti-HBc a été décrit par Almeida et col. en 1971.1 L’anti-HBc est le premier anticorps détectable au cours d’une hépatite B aiguë et peut persister durant toute la vie. L’anti-HBc se détecte généralement dans le sang immédiatement après la détection du HBsAg et juste avant l’apparition des manifestations cliniques de la maladie. En cas d’hépatite B aiguë avec guérison, l’anti-HBc est le seul marqueur de l’infection détectable dans la période entre la disparition du HBsAg et l’apparition de l’anti-HBs. Le sang prélevé d’un individu durant cette période peut être infectant, c’est pourquoi il a été suggéré d’effectuer un dépistage de l’anti-HBc en plus du dépistage du HBsAg chez les donneurs pour réduire l’incidence des hépatites B posttransfusionnelles.4 Par ailleurs, la détection de l’anti-HBc est également utile lors des examens avant l’administration du vaccin, car il ne sera alors nécessaire de vacciner contre l’hépatite B que les individus négatifs à l’anti-HBc. Plusieurs études ont démontré une corrélation entre la présence d’anti-HBc dans les dons de sang avec l’apparition d’hépatite non A non B (NANBH ou hépatite C) post-transfusionnelle.7,8,9 La réalisation du dépistage de l’anti-HBc chez les donneurs de sang pourrait prévenir un grand nombre de ces cas. Principe bioelisa anti-HBc est une méthode immunoenzymatique compétitive pour la détermination d’anticorps contre le HBcAg en sérum humain. Le test se base sur la concurrence entre les anticorps humains présents dans l’échantillon et les anticorps IgG de lapin anti-HBc conjugués avec de la peroxydase quand ils sont incubés simultanément dans les puits d’une microplaque recouverte avec de l’HBcAg recombinant. Après l’incubation, il est effectué un lavage pour éliminer le matériel non fixé et ensuite, on ajoute une solution de substrat enzymatique et chromogène. Cette solution développera une couleur bleue si l’échantillon est négatif. La couleur bleue devient jaune après avoir arrêté la réaction avec de l’acide sulfurique. La présence d’anti-HBc dans l’échantillon réduit l’intensité de la couleur proportionnellement à sa concentration. Composants 1. MCPL MICROPLAQUE: 12 x 8 puits recouverts d’antigène recombinant HBcAg (E. coli). Puits séparables individuellement. 2. CONJ CONJUGUÉ: 1 x 6 ml d’anticorps IgG de lapin anti-HBc conjugués avec de la peroxydase. Contient du colorant rouge, des protéines stabilisatrices, du mertiolate de sodium à 0,02% et du sulfate de gentamicine à 0,001%. Prêt à l’emploi. 3. WASH SOLN 10x SOLUTION DE LAVAGE CONCENTRÉE: 2 x 50 ml de tampon de phosphate concentré (10x) contenant du Tween 20 à 1% et du mertiolate de sodium à 0,01%. À diluer 1/10 dans de l’eau distillée ou désionisée avant utilisation. 4. SUBS BUF TAMPON SUBSTRAT: 1 x 14 ml de tampon de citrate-acétate contenant du peroxyde d’hydrogène. 5. SOLN TMB CHROMOGÈNE: 1 x 1,5 ml de 3,3’, 5,5’-Tétraméthylbenzidine (TMB) dissout dans du diméthylsulfoxyde (DMSO). 6. CONTROL + CONTRÔLE POSITIF: 1 x 2 ml d’anticorps IgG de lapin anti-HBc dilués en tampon phosphate. Contient des protéines stabilisatrices et du sulfate de gentamicine à 0,001%. Prêt à l’emploi. 7. CONTROL – CONTRÔLE NÉGATIF: 1 x 3,5 ml de sérum humain négatif à tous les marqueurs de l’hépatite B. Contient du sulfate de gentamicine à 0,001%. Prêt à l’emploi. 8. H2SO4 1N SOLUTION D’ARRÊT: 1 x 12 ml de l’acide sulfurique 1N. Prêt à l’emploi. BIOKIT, S.A. - Can Malé s/n - 08186 Lliçà d’Amunt - Barcelona - SPAIN 22 3000-1102 R13 11.2014 fre.doc 0843 bioelisa 9. SEALS LAMELLES ADHÉSIVES: Pour couvrir la microplaque pendant les incubations. 10. BAG SAC EN PLASTIQUE: Pour conserver les barrettes non-utilisées. Précautions bioelisa anti-HBc est destiné à un usage diagnostique IN VITRO. Utisation réservée aux professionnels. ATTENTION: MATÉRIEL À RISQUE BIOLOGIQUE. Tout le matériel d’origine humaine utilisé dans le cadre de la préparation de ce produit a donné des résultats négatifs quant à la présence d’anticorps des virus HIV-1/HIV-2 et HCV, de même qu’à celle de l’antigène de surface de l’hépatite B, en utilisant une méthode commerciale autorisée. Compte tenu du fait qu’aucune méthode n’est capable d’offrir une garantie absolue de l’absence d’agents infectieux, ce produit doit être manipulé avec précaution: - - Veiller à ce que les réactifs n’entrent jamais en contact avec la peau ou les yeux; si cela était le cas, laver abondamment avec de l’eau. Porter des gants. Ne pipeter aucun réactif avec la bouche. Ne pas fumer. Déposer tout le matériel utilisé dans des récipients conçus pour le matériel biocontaminant. Les restes d’échantillons, de contrôles, de tampons et de réactifs aspirés doivent être recueillis dans un récipient destiné à cet effet et autoclavés pendant une heure à 121°C ou traités dans de l’hypochlorite de sodium à une concentration finale de 10% pendant 30 minutes. (Les restes contenant de l’acide doivent être neutralisés avant d’ajouter l’hypochlorite de sodium). Certains réactifs de ce coffret contiennent de l’azide sodique comme conservateur. L’azide sodique peut réagir au contact de tuyauteries et de bouches d’écoulement des eaux en plomb ou en cuivre. Cette réaction donne lieu à des azides métalliques hautement explosives. Lorsque vous jetez les restes de réactifs, veuillez laisser couler l’eau abondamment. Précautions de manipulation: - Adapter le laveur au type de plaque utilisé (fond plat) pour effectuer un bon lavage. Ne pas mélanger les réactifs provenant de lots différents. Ne pas utiliser de réactifs après expiration de leur date limite d’utilisation. Ne pas utiliser le réactif si on observe un changement dans l’apparence de l’un des composants de ce kit. De plus grandes précautions doivent être prises pour éviter des contaminations microbiennes et une contamination croisée entre les réactifs. Utiliser une pointe jetable neuve pour pipeter chaque échantillon ou réactif. Il est très important de préparer la solution substrat-TMB juste 5-10 minutes avant l’emploi. La conserver dans un récipient bien fermé et à l’abri de la lumière. Des restes de savons et/ou d’agents oxydants dans les récipients utilisés pour la préparation de la solution substrat-TMB peuvent interférer dans la réaction. Si on emploi de récipients en verre, il convient de les laver avec de l’acide sulfurique ou chlorhydrique 1N, de bien les rincer avec de l’eau distillée et de les sécher avant de les utiliser. Utiliser de préférence du matériel en plastique jetable. Conservation et stabilité Les composants resteront stables jusqu’à la date de péremption indiquée sur l’étiquette, à condition d’être conservés à 2-8°C. Le sachet contenant la microplaque doit être laissé à température ambiante avant d’être ouvert pour éviter toute condensation dans les puits. Après ouverture du sachet, la microplaque reste stable pendant 3 mois lorsqu’elle est conservée dans le sac en plastique bien fermé avec le petit sachet cartouche et à une température d’entre 2 et 8°C. Une fois diluée, la solution de lavage reste stable pendant 2 semaines si celle-ci est conservée à une température d’entre 2 et 8°C. Garder le chromogène à l’abri de la lumière. Une fois préparée, la solution substrat-TMB n’est pas stable, c’est pourquoi les indications données pour son utilisation doivent être strictement suivies. Matériel nécessaire non fourni Eau distillée ou désionisée. Pipettes multicanal et micropipettes (50 µl, 100 µl) et cônes jetables. Incubateur à 37°C ± 1°C. Chronomètre. Lecteur de microplaques avec filtre de 450 nm. Recommandable filtre de référence de 620 ou 630 nm. Système de lavage manuel ou automatique. BIOKIT, S.A. - Can Malé s/n - 08186 Lliçà d’Amunt - Barcelona - SPAIN 23 3000-1102 R13 11.2014 fre.doc 0843 bioelisa Prélèvement de l’échantillon Utiliser du sérum frais ou du plasma (citrate/EDTA). D’autres anticoagulants doivent être évalués avant leur utilisation. Les échantillons peuvent être conservés pendant 3 jours à une température d’entre 2 et 8°C. Pour une plus longue conservation, ceux-ci doivent être congelés (-20°C). Éviter les cycles répétés de congélation/décongélation des échantillons. Des particules en suspension doivent être éliminées par centrifugation. Les sérums ou plasmas ne doivent pas être inactivés à chaud; en effet, cela pourrait donner lieu à de mauvais résultats. Ne pas utiliser échantillons que contiennent de l’azide sodique. Traitement automatique Ce test peut être utilisé de manière automatique ou semi-automatique avec divers instruments. Il est très important de valider un système automatique pour démontrer que les résultats obtenus sur les échantillons sont équivalents aux résultats d’un test manuel. Il est recommandé à l’utilisateur de valider l’instrument régulièrement. Si vous rencontrez des difficultés dans la programmation et le réglage des processeurs automatiques de Biokit, veuillez contacter votre distributeur. PROCÉDURE (Voir schéma de la procédure) Opérations préalables Tous les réactifs doivent revenir à température ambiante (20-25°C) avant le début du test. Les réactifs liquides doivent être homogénéisés doucement avant l’emploi. Diluer la solution de lavage concentrée 1/10 dans de l’eau distillée ou désionisée. Pour une plaque, mélanger 50 ml de solution de lavage concentrée à 450 ml d’eau. En cas de non utilisation d’une plaque complète, préparer le volume proportionnel de solution. Réalisation du test 1. N’utiliser que le nombre de barrettes nécessaire pour le test. Réserver 7 puits pour le blanc et les contrôles. Transférer 50 µl de contrôle négatif à 4 puits et 50 µl de contrôle positif à 2 puits. Laisser un puits vide pour le blanc du substrat. 2. Transférer 50 µl de chaque échantillon aux puits correspondants. 3. Ajouter 50 µl de conjugué dans tous les puits de la plaque, à l’exception du puits destiné au blanc de substrat. 4. Couvrir la plaque avec une lamelle adhésive, mélanger doucement et laisser incuber pendant 1 heure à 37°C. 5. Pendant les 5-10 dernières minutes de cette incubation, préparer la solution substrat-chromogène. Pour une plaque, ajouter 280 µl de la solution de chromogène (TMB) dans un flacon de tampon substrat (14 ml) et bien mélanger. Si toute la plaque n’est pas utilisée, préparer la quantité nécessaire d’après les indications du tableau 1. La solution finale doit être incolore. Si celle-ci vire au bleu, ne pas l’utiliser. TABLEAU 1 Barrettes requises Tampon substrat ml Chromogène (TMB) µl 1 1,0 20 2 2,0 40 4 4,0 80 6 6,0 120 8 8,0 160 10 10,0 200 12 12,0 240 NOTE: Le TMB est dissout dans du DMSO. Compte tenu du fait que la température de fusion du DMSO est de 18°C, le chromogène doit atteindre une température de 20-25°C. Bien agiter avant l’emploi. Le fait que le chromogène présente une couleur jaunâtre est normal. 6. Jeter la lamelle adhésive. Aspirer le contenu des puits et les remplir entièrement (environ 350 µl) de solution de lavage diluée. Répéter 3 fois plus le processus d’aspiration-lavage. S’assurer que chaque colonne de puits soit mise à tremper pendant au moins 15 secondes avant le nouveau cycle d’aspiration. Après le dernier lavage, taper la plaque inversée sur un papier buvard pour éliminer tout excès de liquide dans les puits. Jeter la lamelle adhésive. 7. Ajouter 100 µl de substrat-TMB à tous les puits y compris le blanc. 8. Laisser incuber pendant 30 minutes à température ambiante (20-25°C). 9. Ajouter 100 µl de solution d’arrêt à chaque puits en suivant la même séquence et aux mêmes intervalles que pour l’ajout du substrat-TMB. BIOKIT, S.A. - Can Malé s/n - 08186 Lliçà d’Amunt - Barcelona - SPAIN 24 3000-1102 R13 11.2014 fre.doc 0843 bioelisa 10. Mettre le lecteur à zéro avec le puits du blanc à 450 nm et lire l’absorbance de chacun des puits dans le délai maximum de 30 minutes. Il est recommandé de procéder à la lecture bi-chromatique en utilisant un filtre de référence 620 - 630 nm. Contrôle de qualité Les résultats d’un assai ne sont valables que dans le respect des critères suivants: 1. Blanc de substrat: la valeur d’absorbance doit être inférieure ou égale à 0,100. 2. Contrôle négatif: chaque valeur individuelle d’absorbance ne doit pas varier de plus de 20% par rapport à la moyenne des quatre valeurs. La moyenne doit être égale ou supérieure à 0,600 après avoir ôté le blanc. 3. Contrôle positif: la moyenne d’absorbance doit être inférieure à 0,100 après avoir ôté le blanc. Résultats 1. Calculer la valeur seuil en ajoutant la valeur moyenne d’absorbances du contrôle négatif et celle du contrôle positif et en multipliant le résultat de cette somme par 0,4. Valeur seuil = (CNx +CPx) x 0,4 2. Diviser l’absorbance de l’échantillon par la valeur seuil. Positif: Négatif: Douteux: rapport absorbance/valeur seuil ≤ 1,0 rapport absorbance/valeur seuil > 1,1 rapport absorbance/valeur seuil > 1,0 ≤ 1,1 Interprétation des résultats Un résultat positif à l’anti-HBc signifie que le patient a contracté l’hépatite B au moins une fois préalablement. Ce n’est pas un marqueur d’immunité. Un résultat négatif signifie que l’échantillon analysé ne contient pas d’anti-HBc ou en contient en dessous de la limite de détection du coffret. Pour évaluer la situation d’un patient par rapport à l’hépatite B, il faut faire les tests pour les autres marqueurs sérologiques de l’hépatite B. Limites de la procédure Comme dans d’autres tests sérologiques, les résultats obtenus grâce à bioelisa anti-HBc servent d’aide au diagnostic et doivent être interprétés en tenant compte du dossier médical du patient. Pour le bon fonctionnement du coffret, les instructions données doivent scrupuleusement être suivies. Tout écart peut donner lieu à l’obtention de résultats aberrants. Des échantillons ayant une concentration d’anticorps anti-HBc inférieure à 1,5 U/ml (Standard PEI ou de l’OMS) peuvent ne pas être détectés. Tous les échantillons positifs ou douteux devront être répétés et testés pour d’autres marqueurs sérologiques du HBV. Résultats attendus L’anticorps anti-HBc est le marqueur le plus fréquent d’infection par le virus de l’hépatite B et il est détecté aussi bien en infection aiguë, qu’en infection chronique et infection passée avec guérison. La prévalence de l’anti-HBc et d’autres marqueurs de l’hépatite B varie largement dans le monde, de haute (70-90%, par ex.: Afrique, Asie et Pacifique de l’Ouest) à moyenne (20-55%, par ex.: Europe du Sud et de l’Est) et basse (4-6%, par ex.: Europe occidentale, Amérique du Nord et parties de l’Amérique du Sud). Différentes études ont décrit une prévalence de 0,53 à 2,16% chez les donneurs de sang du Royaume Uni.2,5,6 Caractéristiques fonctionnelles Sensibilité analytique La limite de détection du bioelisa anti-HBc est de 1,5 unité/ml en utilisant le sérum de référence anti-HBc du Paul Ehrlich Institute (PEI), Allemagne. Selon des études internes, 1,0 PEI-U/mL est équivalente à environ 1,0 UI/mL du Premier Étalon International de l’OMS pour l’anti-HBc (code NIBSC 95/522). Évaluations Le fonctionnement du bioelisa anti-HBc a été évalué en le comparant à d’autres tests du commerce. - Dans une évaluation interne, 233 échantillons étant positifs à l’anti-HBc ont été testés avec un autre essai commercial (76 étant également positifs au HBsAg). 227 ont présenté un résultat positif (y compris les 76 positifs au HBsAg) et 6 ont présenté un résultat négatif. Les 6 échantillons divergents ont été testés avec un troisième essai commercial et les résultats ont également été négatifs. BIOKIT, S.A. - Can Malé s/n - 08186 Lliçà d’Amunt - Barcelona - SPAIN 25 3000-1102 R13 11.2014 fre.doc 0843 bioelisa - Dans une évaluation externe en faisant une comparaison avec un autre essai commercial, 175 échantillons ont été testés. 31 ont été positifs et 141 négatifs avec les deux tests. Ce qui a permis d’obtenir une concordance globale de 98,3% (172/175). En éliminant 2 échantillons douteux des calculs, la sensibilité relative a été de 100% (31/31) et la spécificité relative de 99,2%. - Dans une autre évaluation externe, il a été essayé 251 échantillons positifs au HBsAg. 247 (98,4%) ont été réactifs avec le bioelisa anti-HBc, dont 245 ont été également réactifs avec la méthode alternative utilisée en routine pour l’anti-HBc. 4 échantillons ont été anti-HBc négatifs avec le bioelisa et avec la méthode en routine et 2 ont été positifs uniquement avec le bioelisa. Donc, la sensibilité relative du bioelisa a été de 100% (245/245) et la concordance globale entre les deux méthodes a été de 99,2% (249/251). - Dans une autre évaluation externe, 5058 échantillons consécutifs de donneurs de sang habituels ont été testés en parallèle avec le bioelisa et avec la méthode en routine. De ces échantillons, 6 ont été réactifs avec le bioelisa et avec la méthode en routine, dont 5 ont été confirmés comme étant d’infection passée après avoir réalisé les tests supplémentaires pour d’autres marqueurs de HBV, alors que 1 n’était positif qu’à l’anti-HBc. 3 autres échantillons ont été positifs à plusieurs reprises avec le bioelisa et négatifs avec le test en routine, 2 étant considérés comme faussement positifs et 1 ayant un résultat non-concluant après avoir réalisé des tests supplémentaires. En ne considérant comme véritablement positifs que les échantillons confirmés comme d’infection passée, la spécificité trouvée a été de 99,92% (5049/5053). - Une autre évaluation externe portant sur la sensibilité à point final et le fonctionnement en comparaison à d’autres méthodes commerciales se trouve dans la bibliographie.3 Précision Reproductibilité intra-test: Les coefficients de variation obtenus pour les valeurs d’absorbance de 48 répliques d’un échantillon négatif ont été de 4,34%, de 4,19% et de 3,66% dans trois lots étudiés. Reproductibilité inter-test: Trois échantillons négatifs ont été testés dans trois tests différents. Les coefficients de variation obtenus pour les ratios absorbance/valeur seuil des 3 échantillons ont été de 4,9%, de 7,0% et de 8,2%. Interférences Pour étudier d’éventuelles interférences, les échantillons ont été testés avec un risque potentiel que se produisent des réactions croisées, tels que les sérums positifs à un facteur rhumatoïde (RF), les anticorps antinucléaires (ANA), anticorps hétérophiles, IgM anti-HAV, anti-E. coli et de femmes enceintes. Il n’a pas été observé d’évidences d’interférence. BIOKIT, S.A. - Can Malé s/n - 08186 Lliçà d’Amunt - Barcelona - SPAIN 26 3000-1102 R13 11.2014 fre.doc 0843 bioelisa bioelisa: Guide de problèmes Problème Causes éventuelles Solution 1. Contrôles hors validation. 1a. Température, incubation ou pipetage incorrect. 1b. Préparation incorrecte des réactifs, erreur dans les dilutions. Réactifs non mélangés correctement. 1c. Contamination croisée entre contrôles. Vérifier la procédure. Refaire le test. Vérifier la procédure. Refaire le test. 1d. 1e. 1f. 1g. 2. Incolore ou faible couleur 2a. à la fin du test. 2b. 2c. 2d. Pipeter soigneusement. Ne pas échanger les bouchons des flacons. Refaire le test. Filtre de lecture incorrect. S’assurer que le filtre de lecture soit bien de 450 nm. Si le filtre de référence de 620-630 nm n’est pas utilisé, les absorbances augmentent d’environ 50 milliunités. Interférence sur le chemin Vérifier le lecteur. Nettoyer ou optique. sécher le fond des puits. S’assurer de l’absence de bulles d’air. Répéter la lecture. Des composants de lots Ne pas utiliser de lots différents ont été utilisés. différents dans la mesure où ils sont faits pour chaque lot en particulier. Réactifs périmés. Vérifier la date d’expiration du coffret. Ne pas utiliser de coffret périmé. Un ou plusieurs réactifs Vérifier la procédure. Refaire n’ont pas été ajoutés ou le test. l’ont été dans une séquence erronée. Conjugué inactif: Vérifier s’il n’y a pas eu mauvaise conservation. contamination; vérifier la procédure. Refaire le test. Microplaque inactive: Toujours conserver les mauvaise conservation. barrettes non usagées dans un sac mini grip bien fermé, avec le desséchant à l’intérieur. Refaire le test. Substrat inactive: Toujours utiliser une dilution conservation ou dilution fraîche de TMB dans le incorrecte. tampon substrat. Utiliser des Le conteneur utilisé altère conteneurs jetables ou lavés la stabilité du substrat. avec de l’acide ou de l’éthanol Contamination croisée et rincés avec de l’eau avec la solution d’arrêt. désionisée. Vérifier la procédure. Refaire le test. BIOKIT, S.A. - Can Malé s/n - 08186 Lliçà d’Amunt - Barcelona - SPAIN 27 3000-1102 R13 11.2014 fre.doc 0843 bioelisa bioelisa: Guide de problèmes Problème Causes éventuelles 3. Trop de couleur dans tous les puits de la microplaque. 3a. Substrat contaminé, oxydé ou mal préparé. 4. Reproductibilité pauvre ou élevée nombre d’échantillons réactifs qui ne se répètent pas. Solution S’assurer que le substrat-TMB de travail soit incolore. S’il est bleu, l’écarter. S’assurer que le TMB soit entièrement liquide avant de l’utiliser. S’assurer que le TMB soit bien mélangé avec le tampon substrat. Utiliser des flacons ou des conteneurs jetables ou lavés avec de la solution acide ou de l’éthanol. Refaire le test. 3b. Réactifs contaminés ou Vérifier contamination (aspect mal préparés. trouble). Vérifier dilutions. Refaire le test. 3c. Solution de lavage (1x) Vérifier la qualité de l’eau contaminée. distillée / désionisée utilisée pour la préparation de la dilution. Refaire le test. 3d. Lavage insuffisant ou non Vérifier le lavoir. Remplir les consistant: remplissage puits jusqu’en haut et aspirer ou aspiration insuffisant complètement. Augmenter le ou non uniforme, nombre nombre de cycles de de cycles de lavage lavage. Taper la plaque insuffisant. Lavoir inversée contre le papier contaminé. buvard. Refaire le test. 3e. Une solution de lavage Utiliser la solution de lavage d’un autre fabricant a été du biokit. utilisée. 3f. Mauvaise dilution des Vérifier la procédure. Refaire échantillons. le test. 4a. Problèmes de lavage. Voir rubriques 3c, 3d, 3e. 4b. Pipettes mal calibrées ou Utiliser des pipettes calibrées cônes mal encastrés. avec des cônes bien ajustés. Technique de pipetage Pipeter soigneusement sans incorrect. faire de bulles et sans éclaboussures. Refaire le test. 4c. Réactifs et échantillons Tempérer échantillons et non placés à température réactifs et bien les agiter ambiante ou non avant usage. correctement mélangés avant l’usage. 4d. Courants d’air sur la Mettre la microplaque à l’abri microplaque pendant les des courants d’air. incubations. 4e. Trop de temps dans Développer une technique l’addition des échantillons uniforme et reproductible. et ou des réactifs. Inconsistance dans les intervalles de temps, bulles d’air. 4f. Interférence sur le chemin Voir 1e. optique. BIOKIT, S.A. - Can Malé s/n - 08186 Lliçà d’Amunt - Barcelona - SPAIN 28 3000-1102 R13 11.2014 fre.doc 0843 bioelisa VEDI CAMBI RISALTATI bioelisa anti-HBc 3000-1102 1 x 96 TESTS Test ELISA per la determinazione degli anticorpi totali dell'antigene core dell'epatite B (anti-HBc) nel siero o nel plasma umano. Sommario L'epatite B è una malattia causata da un'infezione virale, accompagnata dalla comparsa nel siero di alcuni marcatori: uno di questi è l'anti-HBc. L'Ag core dell'epatite B (HBcAg) è un componente interno del virus dell'epatite B antigenicamente distinto dall'Ag di superficie (HBsAg). Il sistema antigene/anticorpo HBcAg/anti-HBc fu descritto da Almeida e altri nel 1971.1 Gli anticorpi all'HBcAg (anti-HBc) sono i primi a svilupparsi nel corso di una infezione acuta di epatite B e possono rimanere per sempre. L'anti-HBc viene generalmente identificato nel sangue dopo l'HBsAg e prima dell'emergere di un'epatite clinicamente evidente. Nelle epatiti B acute con ricovero, l’anti-HBc è l’unico marcatore sierologico d’infezione nel periodo tra la scomparsa dell’HBsAg e la comparsa dell’anti-HBs. Donazioni di sangue in questa fase possono essere infette ed è stato suggerito che lo screening per l’anti-HBc come per l’HBsAg possa ulteriormente ridurre l’incidenza di epatite B post-trasfusioni.4 Inoltre, lo screening per l’anti-HBc deve essere fatto per ogni individuo prima della somministrazione del vaccino dell’epatite B per conoscere lo stato d’immunità per vaccinare solo gli individui negativi all’anti-HBc. Diversi studi hanno mostrato una correlazione tra la presenza dell’anti-HBc in sangue da donatore e l’incidenza, associata a trasfusioni, dell’epatite non-A non-B (NANBH o epatite C).7,8,9 Con l’introduzione dello screening anti-HBc dei donatori di sangue, molti casi di NANBH da trasfusione potranno essere evitati. Principio bioelisa anti-HBc è un metodo immunoenzimatico competitivo per la determinazione degli anticorpi all’HBcAg nel siero umano. Il test si basa sulla competizione tra gli anticorpi umani presenti nel campione e anticorpi IgG anti-HBc di coniglio coniugate a perossidasi (HRP) quando sono incubate in contemporanea in un pozzetto rivestito di HBcAg ricombinante. Dopo incubazione e lavaggio per rimuovere il materiale non legato, si aggiunge una soluzione con il substrato enzimatico contenente un cromogeno. Questa soluzione svilupperà colore blu se il campione è negativo. La colorazione blu vira al giallo dopo il blocco de la reazione con acido solforico. La presenza di anti-HBc nel campione ridurrà lo sviluppo di colore proporzionalmente alla propria concentrazione. Componenti 1. MCPL MICROPIASTRA: 12 x 8 pozzetti ricoperti con HBcAg ricombinante (E. coli). Pozzetti separabili singolarmente. 2. CONJ CONIUGATO: 1 x 6 ml di anticorpi IgG anti-HBc di coniglio coniugati con perossidasi. Contiene un colorante rosso, proteine stabilizzatrici, sodio mertiolato allo 0,02% e solfato di gentamicina allo 0,001%. Pronto all’uso. 3. WASH SOLN 10x SOLUZIONE DI LAVAGGIO CONCENTRATA: 2 x 50 ml di tampone fosfato concentrato (10x) contenente Tween 20 all’1% e sodio mertiolato allo 0,01%. Da diluire 1/10 con acqua distillata o deionizzata prima dell’uso. 4. SUBS BUF TAMPONE SUBSTRATO: 1 x 14 ml di tampone citrato-acetato contenente perossido di idrogeno. 5. SOLN TMB CROMOGENO: 1 x 1,5 ml di 3,3’, 5,5’-Tetrametilbenzidina (TMB) diluita in dimetilsulfossido (DMSO). 6. CONTROL + CONTROLLO POSITIVO: 1 x 2 ml di anticorpi IgG anti-HBc di coniglio diluiti in tampone fosfato. Contiene proteine stabilizzatrici e 0,001% di solfato di gentamicina. Pronto all’uso. 7. CONTROL – CONTROLLO NEGATIVO: 1 x 3,5 ml di siero umano negativo a tutti i marcatori HBV e contenente 0,001% di solfato di gentamicina. Pronto all’uso. 8. H2SO4 1N SOLUZIONE BLOCCANTE: 1 x 12 ml di acido solforico 1N. Pronto all’uso. BIOKIT, S.A. - Can Malé s/n - 08186 Lliçà d’Amunt - Barcelona - SPAIN 29 3000-1102 R13 11.2014 ita.doc 0843 bioelisa 9. SEALS FOGLI ADESIVI: Per coprire la micropiastra durante le incubazioni. 10. BAG SACCHETTO DI PLASTICA: Per conservare le strisce non adoperate. Precauzioni bioelisa anti-HBc è per uso diagnostico IN VITRO. Solo per uso professionale. ATTENZIONE: MATERIALE POTENZIALMENTE BIOPERICOLOSO. Tutto il materiale di origine umana utilizzato nella preparazione di questo prodotto è risultato negativo per anticorpi dei virus HIV-1/HIV-2 e HCV, come pure a quella dell'antigene di superficie dell'epatite B, secondo analisi eseguite con un metodo commerciale autorizzato. Poiché nessun metodo può offrire la totale sicurezza dell’assenza di agenti infettivi, questo prodotto deve essere manipolato con precauzione: - - Evitare che i reagenti entrino a contatto con la pelle o con gli occhi; se ciò dovesse accadere, lavare con acqua abbondante. Usare guanti. Non pipettare mai i reagenti con la bocca. Non fumare. Depositare tutti i materiali utilizzati in recipienti idonei per materiale biocontaminante. I resti di campioni, controlli, reagenti aspirati e puntali monouso devono essere raccolti in un recipiente apposito e sterilizzati in autoclave per un'ora a 121°C, oppure trattati con ipoclorito di sodio a una concentrazione finale del 10% per 30 minuti. (I resti contenenti acido devono essere neutralizzati prima di aggiungere l'ipoclorito sodico). Alcuni reagenti del kit contengono sodio azide come conservante. La sodio azide può reagire a contatto con tubature e scarichi in piombo o in rame, formando azidi metalliche altamente esplosive. Far scorrere acqua in abbondanza quando si gettano i residui di reagenti. Precauzioni durante l'uso: - Adattare il lavatore al tipo di piastra utilizzata (fondo piatto) per realizzare un buon lavaggio. Non mescolare reagenti provenienti da lotti diversi. Non usare reagenti scaduti. Non utilizzare il reagente se si osserva qualche cambio di aspetto di un qualsiasi componente del kit. Prendere le precauzioni necessarie per evitare la contaminazione microbica e la contaminazione incrociata tra i reagenti. Utilizzare un nuovo puntale monouso per pipettare ogni singolo campione o reagente. È molto importante preparare la soluzione di substrato-TMB soltanto 5-10 minuti prima dell'uso. Mantenerla in un recipiente ben chiuso e al riparo dalla luce. Eventuali resti di saponi e/o agenti ossidanti nei recipienti utilizzati per la preparazione della soluzione substrato-TMB possono interferire nella reazione. Se si adoperano contenitori di vetro, è perciò conveniente lavare i recipienti da utilizzare con acido solforico o cloridrico 1N, risciacquarli accuratamente con acqua distillata e asciugarli prima dell’uso. Usare preferibilmente materiale plastico monouso. Conservazione e stabilità I componenti sono stabili fino alla data di scadenza indicata sull'etichetta, se conservati a 2-8°C. Il sacchetto che contiene la micropiastra deve essere portato a temperatura ambiente prima dell'apertura per evitare la formazione di condensa nei pozzetti. Dopo l'apertura del sacchetto, la micropiastra rimane stabile per 3 mesi se conservata a 2-8°C nel sacchetto di plastica ben chiuso, con la bustina di gel di silice dentro. La soluzione di lavaggio, una volta diluita, rimane stabile per due settimane se conservata a 2-8°C. Conservare il cromogeno al riparo dalla luce. Una volta preparata, la soluzione substrato-TMB non rimane stabile, quindi è necessario seguire scrupolosamente le istruzioni per l'uso. Materiale necessario non incluso Acqua distillata o deionizzata. Pipette multicanale e micropipette (50 µl, 100 µl) e puntali monouso. Incubatrice a 37°C ± 1°C. Cronometro. Lettore di micropiastre con filtro da 450 nm. Raccomandabile un filtro di riferimento da 620 o 630 nm. Sistema di lavaggio manuale o automatico. BIOKIT, S.A. - Can Malé s/n - 08186 Lliçà d’Amunt - Barcelona - SPAIN 30 3000-1102 R13 11.2014 ita.doc 0843 bioelisa Raccolta dei campioni Usare siero fresco o plasma (citrato/EDTA). Altri anticoagulanti devono essere valutati prima dell'uso. I campioni possono essere conservati per 3 giorni a 2-8°C. Per tempi più lunghi i campioni vanno congelati (-20°C). Non procedere a ripetuti congelamenti e scongelamenti. Eventuali particelle in sospensione vanno eliminate mediante centrifugazione. Il siero o plasma non deve essere inattivato a caldo per evitare risultati erronei. Non utilizzare campioni qui contengono sodio azide. Trattamento automatico Questo test è utilizzabile in modo automatico o semiautomatico con vari strumenti. È molto importante validare qualsiasi sistema automatico per dimostrare che i risultati ottenuti con i campioni sono equivalenti a quelli del test manuale. È raccomandabile validare periodicamente lo strumento. In caso di difficoltà nella programmazione e regolazione dei processori automatici Biokit, contattare il proprio distributore. PROCEDURA (Vedere schema del procedimiento) Operazioni preliminari Tutti i reagenti devono essere a temperatura ambiente (20-25°C) prima di cominciare il test. I reagenti liquidi devono essere omogeneizzati delicatamente prima dell'uso. Diluire la soluzione di lavaggio concentrata 1/10 con acqua distillata o deionizzata. Per una piastra mescolare 50 ml di soluzione di lavaggio concentrata con 450 ml d'acqua. Se non si utilizza una piastra completa, preparare il volume proporzionale di soluzione. Esecuzione del test 1. Utilizzare solo il numero di strisce necessarie per il test. Prevedere 7 pozzetti per bianco e controlli. Dispensare 50 µl di controllo negativo in 4 pozzetti e positivo in 2 pozzetti. Lasciare il pozzetto del bianco vuoto. 2. Dispensare 50 µl di ogni campione da analizzare nei pozzetti corrispondenti. 3. Aggiungere 50 µl di coniugato in ogni pozzetto, ad eccezione del pozzetto per il bianco del substrato. 4. Coprire la piastra con un foglio adesivo, agitarla delicatamente e incubare per 1 ora 37°C. 5. Durante gli ultimi 5-10 minuti di questa incubazione, preparare la soluzione di substrato-cromogeno. Per una piastra aggiungere 280 µl della soluzione di cromogeno (TMB) in un flacone di tampone substrato (14 ml) e mescolare bene. Se non si adopera tutta la piastra, preparare la quantità necessaria come indicato nella tabella 1. La soluzione finale deve essere incolore: scartarla se diventa azzurra. TABELLA 1 Strisce occorrenti Tampone substrato ml Cromogeno (TMB) µl 1 1,0 20 2 2,0 40 4 4,0 80 6 6,0 120 8 8,0 160 10 10,0 200 12 12,0 240 NOTA: Il TMB è diluito in DMSO. Dato che la temperatura di fusione del DMSO è di 18°C, il cromogeno deve raggiungere una temperatura di 20-25°C ed essere agitato bene prima dell'uso. È normale che il cromogeno presenti un colore giallastro. 6. Scartare il foglio adesivo. Aspirare il contenuto dei pozzetti e riempirli completamente (circa 350 µl) con soluzione di lavaggio diluita. Ripetere il processo di aspirazione e lavaggio altre 3 volte. Verificare che ogni colonna di pozzetti stia a bagno per almeno 15 secondi prima del nuovo ciclo di aspirazione. Dopo l'ultimo lavaggio battere sulla piastra, capovolta su una carta assorbente, per rimuovere dai pozzetti il liquido in eccesso. 7. Aggiungere 100 µl di substrato-TMB in tutti i pozzetti, compreso il bianco. 8. Incubare senza coprire per 30 minuti a temperatura ambiente (20-25°C). 9. Aggiungere 100 µl di soluzione bloccante in ogni pozzetto, mantenendo la stessa sequenza e con gli stessi intervalli osservati nell'aggiunta del substrato-TMB. BIOKIT, S.A. - Can Malé s/n - 08186 Lliçà d’Amunt - Barcelona - SPAIN 31 3000-1102 R13 11.2014 ita.doc 0843 bioelisa 10. Regolare lo zero del lettore con il pozzetto del bianco a 450 nm e leggere l'assorbanza di ogni pozzetto entro 30 minuti al massimo. Si raccomanda di eseguire la lettura bicromatica utilizzando un filtro di riferimento di 620 - 630 nm. Controllo di qualità I risultati di una prova sono validi se vengono rispettati i seguenti criteri: 1. Bianco del substrato: il valore di assorbanza deve essere inferiore o uguale a 0,100. 2. Controllo negativo: ogni singolo valore ottenuto non deve presentare variazioni superiori al 20% della media dei quattro valori. L'assorbanza media deve essere uguale o superiore a 0,600 una volta sottratto il bianco. 3. Controllo positivo: la media di assorbanza deve essere uguale o inferiore a 0,100 una volta sottratto il bianco. Risultati 1. Calcolare il valore di soglia aggiungendo l'assorbanza media del controllo negativo all'assorbanza media del controllo positivo e moltiplicando il risultato per 0,4. Valore di soglia = (CNx + CPx) x 0,4 2. Dividere l'assorbanza del campione per il valore di soglia. Positivo: Negativo: Dubbio: rapporto assorbanza/valore di soglia ≤ 1,0 rapporto assorbanza/valore di soglia > 1,1 rapporto assorbanza/valore di soglia > 1,0 ≤ 1,1 Interpretazione dei risultati Un risultato positivo per l'anti-HBc significa che un individuo è stato infettato dal virus dell'epatite B. Non è un marcatore di immunità. Un risultato negativo indica che il campione analizzato non contiene anti-HBc o ne contiene in una concentrazione inferiore del limite di misura del kit. Si suggerisce di ripetere ogni risultato positivo. Per valutare lo stato generale di un paziente per l'epatite B, provare gli altri marcatori sierologici. Limitazioni della procedura Come per altri test sierologici, i risultati ottenuti con il bioelisa anti-HBc sono soltanto un aiuto per la diagnosi e devono essere interpretati alla luce della storia clinica del paziente. Per il corretto funzionamento del kit, seguire scrupolosamente le istruzioni indicate. Ogni deviazione può dare origine ad aberrazioni dei risultati. Campioni con concentrazione di anti-HBc inferiore a 1,5 U /ml (Standard PEI o WHO) possono non essere rilevati. Tutti i campioni positivi o incerti dovrebbero essere ripetuti e testati per altri marcatori sierologici dell'HBV. Risultati attesi L'anticorpo anti-HBc è il marcatore più frequente di infezione da virus dell'epatite B e viene rilevato sia nell'infezione acuta, sia in quella cronica e nell'infezione superata con guarigione. La prevalenza di anti-HBc e di altri marcatori dell'epatite B varia notevolmente nel mondo: può essere alta (70-90%, per esempio Africa, Asia e Pacifico Ovest), media (20-55%, per esempio in Europa meridionale e orientale) o bassa (4-6%, per esempio in Europa occidentale, America settentrionale e alcune regioni dell'America meridionale). Diversi studi hanno descritto una prevalenza compresa tra lo 0,53 e il 2,16% in donatori di sangue del Regno Unito.2,5,6 Caratteristiche di funzionalità Sensibilità analitica Il limite di rilevamento del bioelisa anti-HBc è 1,5 unità/ml usando il siero di riferimento anti-HBc del Paul Ehrlich Institut (PEI), Germania. Secondo studi interni, 1,0 PEI-U/mL è equivalente a circa 1,0 UI/mL del Primo Standard Internazionale WHO per l’anti-HBc (codice NIBSC 95/522). Valutazioni Il funzionamento del bioelisa anti-HBc è stato valutato mediante studi comparativi con altri test in commercio. - In una valutazione interna sono stati testati 233 campioni anti-HBc positivi con un altro test in commercio (di questi, 76 erano anche HBsAg positivi). 227 hanno dato risultato positivo (compresi i 76 HBsAg positivi) e 6 hanno dato risultato negativo. I 6 campioni discordanti sono stati testati con un terzo test in commercio, e i risultati sono stati anche questa volta negativi. BIOKIT, S.A. - Can Malé s/n - 08186 Lliçà d’Amunt - Barcelona - SPAIN 32 3000-1102 R13 11.2014 ita.doc 0843 bioelisa - In una valutazione esterna di comparazione con un altro test in commercio, sono stati testati 175 campioni. 31 sono risultati positivi e 141 negativi con entrambi i test. È stata ottenuta una concordanza globale del 98,3% (172/175). Se non si calcolano i 2 campioni dubbi, la sensibilità relativa è stata del 100% (31/31) e la specificità relativa del 99,2%. - In un'altra valutazione esterna, sono stati testati 251 campioni HBsAg positivi. 247 (98,4%) sono stati reattivi con il bioelisa anti-HBc; di questi 245 sono stati reattivi anche con il metodo alternativo anti-HBc utilizzato di routine. 4 campioni si sono rivelati anti-HBc negativi con il bioelisa e con il metodo di routine e 2 sono risultati positivi soltanto con il bioelisa. Quindi, la sensibilità relativa del bioelisa è stata del 100% (245/245) e la concordanza globale fra entrambi i metodi è stata del 99,2% (249/251). - In un'altra valutazione esterna, 5058 campioni consecutivi di donatori di sangue abituali sono stati testati in parallelo con il bioelisa e con il metodo di routine. Di questi campioni, 6 sono stati reattivi sia con il bioelisa sia con il metodo di routine; in 5 di questi è stata confermata l'esistenza di un'infezione superata dopo la realizzazione di ulteriori tests per altri marcatori di HBV, mentre 1 era positivo solo per anti-HBc. Altri 3 campioni si sono rivelati ripetutamente positivi con il bioelisa e negativi con il test di routine: 2 sono stati considerati falsi positivi e 1 ha dato un risultato inconcludente dopo la realizzazione di ulteriori tests. Considerando come veri positivi solo i campioni per i quali è stata confermata la presenza di un'infezione superata, la specificità rilevata è stata del 99,92% (5049/5053). - Un’altra valutazione esterna di sensibilità al punto finale e funzionamento in comparazione con altri tests in 3 commercio si trova nella bibliografia. Precisione Riproducibilità intra-test: I coefficienti di variazione ottenuti per i valori di assorbanza di un campione negativo testato in 48 repliche sono stati del 4,34%, 4,19% e 3,66% in tre lotti esaminati. Riproducibilità inter-test: Sono stati testati tre campioni negativi in tre test diversi. I coefficienti di variazione ottenuti per i rapporti assorbanza/valore di soglia dei 3 campioni sono stati del 4,9%, 7,0% e 8,2%. Interferenze Per studiare possibili interferenze, sono stati testati campioni che presentavano il rischio potenziale di produrre reazioni crociate, come sieri positivi al fattore reumatoide (RF), anticorpi anti-nucleari (ANA), anticorpi eterofili, IgM anti-HAV, anti-E. coli e di donne in gravidanza. Non sono stati rilevati segni evidenti di interferenza. BIOKIT, S.A. - Can Malé s/n - 08186 Lliçà d’Amunt - Barcelona - SPAIN 33 3000-1102 R13 11.2014 ita.doc 0843 bioelisa bioelisa: Guida alla soluzione dei problemi Problema Possibili cause Soluzione 1. Controlli non convalidanti. 1a. Temperatura, incubazione o pipettaggio erronei. 1b. Preparazione erronea dei reagenti, errore nelle diluizioni. Reagenti non correttamente mescolati. 1c. Inquinamento incrociato dei controlli. Verificare procedimento. Ripetere il test. 1d. 1e. 1f. 1g. 2. Senza colore o con poco colore alla fine della prova. 2a. 2b. 2c. 2d. Verificare procedimento. Ripetere il test. Pipettare con attenzione. Non scambiare i tappi delle fiale. Ripetere il test. Filtro di lettura erroneo. Controllare che il filtro di lettura sia di 450 nm. Se non si usa un filtro di riferimento di 620-630 nm, le assorbanze aumentano di circa 50 milliunità. Interferenza nella via Controllare il lettore. Pulire o ottica. asciugare il fondo dei pozzetti. Verificare l'assenza di bolle d'aria. Ripetere la lettura. Sono stati usati Non utilizzare componenti di componenti di lotti diversi. lotti diversi dato che sono dosati per ogni singolo lotto. Reagenti scaduti. Controllare la scadenza del kit e dei suoi componenti. Non usare kit scaduti. Uno o più reagenti non Controllare il procedimento. sono stati aggiunti, o Ripetere la prova. sono stati aggiunti in una sequenza sbagliata. Coniugato inattivo: Controllare se vi è stato conservazione erronea. inquinamento, verificare il procedimento. Ripetere il test. Micropiastra inattiva: Conservare sempre le strisce conservazione erronea. non utilizzate nel sacchetto minigrip, ben chiuso, con il deumidificante dentro. Ripetere il test. Substrato inattivo: errore Utilizzare sempre una di conservazione o di diluizione fresca di TMB nel diluizione, il contenitore tampone substrato. Usare utilizzato influisce sulla contenitori monouso oppure stabilità del substrato, lavati con acido o etanolo e inquinamento incrociato sciacquati con acqua con la soluzione deionizzata. Verificare il bloccante. procedimento. Ripetere il test. BIOKIT, S.A. - Can Malé s/n - 08186 Lliçà d’Amunt - Barcelona - SPAIN 34 3000-1102 R13 11.2014 ita.doc 0843 bioelisa bioelisa: Guida alla soluzione dei problemi Problema Possibili cause 3. Troppo colore in tutti i pozzetti della micropiastra. 3a. Substrato inquinato, ossidato o preparato in modo sbagliato. 3b. 3c. 3d. 3e. 4a. 4. Riproducibilità scarsa o elevato numero di 4b. campioni reattivi che non si ripetono. 4c. 4d. 4e. 4f. Soluzione Controllare che il substrato preparato sia incolore, scartarlo se è azzurro. Verificare che il TMB sia completamente liquido prima di usarlo. Controllare la corretta miscelazione del TMB nel tampone substrato. Utilizzare fiale o contenitori monouso o lavati con soluzione acida o etanolo. Ripetere il test. Reagenti inquinati o Controllare inquinamento preparati in modo (aspetto torbido). Controllare sbagliato. diluizioni. Ripetere il test. Soluzione di lavaggio (1x) Controllare la qualità inquinata. dell'acqua distillata/deionizzata utilizzata per preparare la diluizione. Ripetere il test. Lavaggio insufficiente o Controllare il lavatore. impreciso: Riempimento o Riempire i pozzetti fino all'orlo aspirazione insufficiente o e aspirare completamente. non uniformi, numero di Incrementare il numero di cicli di lavaggio cicli di lavaggio. Battere insufficiente. Lavatore sulla piastra capovolta su inquinato. carta assorbente. Ripetere il test. È stata adoperata una Utilizzare solo la soluzione di soluzione di lavaggio di lavaggio biokit. marca diversa. Problemi di lavaggio. Vedere punti 3c, 3d, 3e. Pipette calibrate male o Utilizzare pipette calibrate con puntali incastrati male. puntali ben fissati. Pipettare Tecnica di pipettaggio accuratamente senza fare erronea. bolle né schizzi. Ripetere il test. Reagenti e campione non Portare a temperatura a temperatura ambiente o ambiente i campioni e i non correttamente reagenti e mescolarli bene mescolati prima dell'uso. prima dell'uso. Correnti d'aria sulla Mantenere la micropiastra al micropiastra durante le riparo dalle correnti d'aria. incubazioni. Tempi troppo lunghi La tecnica deve essere nell'aggiunta di campioni uniforme e precisa. e/o reagenti. Imprecisione negli intervalli di tempo, bolle d'aria. Interferenza nella via Vedere 1e. ottica. BIOKIT, S.A. - Can Malé s/n - 08186 Lliçà d’Amunt - Barcelona - SPAIN 35 3000-1102 R13 11.2014 ita.doc 0843 bioelisa bioelisa anti-HBc LER ALTERAÇÕES DESTACADAS 3000-1102 1 x 96 TESTS Teste de ELISA para a detecção de anticorpos totais contra o antígeno core da hepatite B (anti-HBc) em soro ou plasma humano. Sumário A hepatite B é uma enfermidade causada por uma infecção viral. Durante o período de infecção aparecem vários marcadores sorológicos, entre os quais está o anticorpo anti-HBc. O antígeno “core” da hepatite B (HBcAg) é um componente interno do vírus da hepatite B antigenicamente diferente do antígeno de superfície (HBsAg). Este sistema antígeno-anticorpo HBcAg / anti-HBc foi descrito por Almeida e col. 1971.1 O anti-HBc é o primeiro anticorpo detectável no curso da hepatite B aguda e pode persistir durante toda a vida. O anti-HBc é detectado no sangue imediatamente após a detecção de HBsAg e logo antes da aparição das manifestações clínicas da doença. Nos casos de hepatite B aguda em recuperação, o anti-HBc é o único marcador da infecção detectável no período compreendido entre o desaparecimento de HBsAg e o aparecimento de anti-HBs. O sangue extraído de um indivíduo durante este período pode ser infeccioso e tem-se sugerido que a triagem para anti-HBc além da triagem para HBsAg em doações de sangue, permitiria uma maior redução na incidência de hepatite B pós-transfusão.4 Por outro lado, a determinação de anti-HBc deveria ser realizada antes de administrar a vacina de hepatite B em qualquer indivíduo com a finalidade de vacinar somente aqueles indivíduos negativos para anti-HBc. Vários estudos demonstraram uma correlação entre a presença de anti-HBc em doadores de sangue e a incidência de hepatite não A, não B (NANBH ou hepatite C) pós-transfusão.7,8,9 A implementação do teste para anti-HBc em doadores de sangue poderia prevenir muitos destes casos. Princípio bioelisa anti-HBc é um método imunoenzimático competitivo para a determinação de anticorpos contra o HBcAg no soro humano. O ensaio está baseado na competição entre os anticorpos anti-HBc humanos presentes na amostra e os anticorpos anti-HBc de coelho conjugados com peroxidase, quando são incubados simultaneamente nos pocinhos de uma microplaca recoberta com HBcAg recombinante. Após a incubação, lava-se para eliminar o material não fixado e em seguida adiciona-se uma solução de substrato enzimático e cromógeno. Esta solução desenvolverá cor azul quando a amostra for negativa. A cor azul passará a amarelo depois do bloqueio da reação com ácido sulfúrico. A presença de anti-HBc na amostra reduz o desenvolvimento de cor de forma proporcional a sua concentração. Componentes 1. MCPL MICROPLACA: 12 x 8 pocinhos recobertos com antígeno HBcAg recombinante (E. coli). Pocinhos separáveis individualmente. 2. CONJ CONJUGADO: 1 x 6 ml de anticorpos IgG de coelho anti-HBc conjugados com peroxidase. Contém corante vermelho, proteínas estabilizantes, mertiolato sódico a 0,02% e sulfato de gentamicina a 0,001%. Pronto para usar. 3. WASH SOLN 10x SOLUÇÃO DE LAVAGEM CONCENTRADA: 2 x 50 ml de tampão fosfato concentrado (10x) que contém Tween 20 a 1% e mertiolato sódico a 0,01%. Diluir 1/10 com água destilada ou deionizada antes de usar. 4. SUBS BUF TAMPÃO SUBSTRATO: 1 x 14 ml de tampão citrato-acetato que contém peróxido de hidrogênio. 5. SOLN TMB CROMÓGENO: 1 x 1,5 ml de 3,3’, 5,5’- Tetrametilbenzina (TMB) dissolvida em dimetilsulfóxido (DMSO). 6. CONTROL + CONTROLE POSITIVO: 1 x 2 ml de anticorpos IgG de coelho anti-HBc diluídos em tampão fosfato. Contém proteínas estabilizantes e sulfato de gentamicina a 0,001%. Pronto para usar. 7. CONTROL – CONTROLE NEGATIVO: 1 x 3,5 ml de soro humano negativo para todos os marcadores da hepatite B. Contém sulfato de gentamicina a 0,001%. Pronto para usar. 8. H2SO4 1N SOLUÇÃO DE BLOQUEIO: 1 x 12 ml de ácido sulfúrico 1N. Pronto para usar. BIOKIT, S.A. - Can Malé s/n - 08186 Lliçà d’Amunt - Barcelona - SPAIN 36 3000-1102 R13 11.2014 por.doc 0843 bioelisa 9. SEALS FOLHAS ADESIVAS: Para cobrir a placa durante as incubações. 10. BAG BOLSA DE PLÁSTICO: Para guardar as tiras não utilizadas. Precauções bioelisa anti-HBc é para o diagnóstico IN VITRO. Para uso exclusivamente por profissionais. ATENÇÃO: MATERIAL DE RISCO BIOLÓGICO. Todos os materiais de origem humana utilizados na preparação deste produto foram testados e apresentaram resultado negativo em relação à presença de anticorpos contra os vírus HIV-1/HIV-2 e HCV, assim como para o antígeno de superfície da hepatite B, utilizando um método comercial autorizado. No entanto, dado que nenhum método pode oferecer a total segurança da ausência de agentes infecciosos, este produto deve ser manipulado com precaução: - - Não permitir que os reagentes entrem em contato com a pele e os olhos. Se isto ocorrer, lavá-los com abundante quantidade de água. Usar luvas. Não pipetar nenhum reativo com a boca. Não fumar. Descartar todos os materiais usados em recipientes adequados para material bio-contaminante. Os restos de amostras, controles, reativos aspirados e ponteiras descartáveis, devem ser recolhidos em um recipiente destinado a este fim, que deverá ser autoclavado a 121°C, ou tratar-se com hipoclorito de sódio a uma concentração de 10%, durante 30 minutos. (Os restos que contém ácido devem ser neutralizados antes de adicionar hipoclorito de sódio). Alguns reativos deste kit contêm azida sódica. A azida sódica pode reagir com os encanamentos e ralos de chumbo ou cobre, originando azidas metálicas altamente explosivas. Ao descartar os restos de reativos, fazê-lo em abundante volume de água. Cuidados de manipulação: - Ajustar o lavador ao tipo de placa utilizada (fundo plano), para conseguir uma boa lavagem. Não utilizar reativos procedentes de lotes diferentes. Não utilizar os reativos após sua data de validade. Não use o reagente se se observar qualquer alteração na aparência dos componentes incluídos no kit. Tomar as devidas precauções para evitar contaminação microbiana e contaminação cruzada entre reativos. Utilizar ponteiras descartáveis para pipetar as amostras e os reativos. É muito importante preparar a solução de substrato-TMB 5 a 10 minutos antes de ser utilizada. Mantê-la em um recipiente bem vedado e ao abrigo da luz direta. Restos de sabões e detergentes, ou agentes oxidantes nos recipientes utilizados para a preparação da solução de substrato-TMB, podem interferir na reação. Por essa razão, caso se utilizem recipientes de vidro é recomendável que sejam previamente lavados com ácido sulfúrico ou clorídrico 1N, enxaguados abundantemente com água destilada ou deionizada e secos. Usar de preferência material plástico descartável. Conservação e estabilidade Os componentes permanecem estáveis até a data de validade indicada nos rótulos se forem conservados entre 2 e 8°C. A bolsa que contém a microplaca deve estar a temperatura ambiente antes de abri-la, para evitar a condensação nos pocinhos. Uma vez aberta a bolsa, as tiras são estáveis por 3 meses guardadas a 2-8°C na bolsa de plástico bem fechada, com a bolsinha de silicagel. A solução de lavagem, uma vez diluída, é estável durante 2 semanas, se conservada entre 2 e 8°C. Guardar o cromógeno ao abrigo da luz. A solução substrato-TMB uma vez preparada não é estável, por isso, devem-se seguir estritamente as indicações para sua utilização. Material necessário não incluído Água destilada ou deionizada. Pipeta multicanal e micropipetas (50 µl, 100 µl) e ponteiras descartáveis. Incubador a 37°C ± 1°C. Cronômetro. Leitor de microplacas com filtro de 450 nm. Recomendável filtro de referência de 620 ou 630 nm. Sistema de lavagem manual ou automático. BIOKIT, S.A. - Can Malé s/n - 08186 Lliçà d’Amunt - Barcelona - SPAIN 37 3000-1102 R13 11.2014 por.doc 0843 bioelisa Coleta da amostra Usar soro fresco ou plasma (citrato/EDTA). Outros anticoagulantes devem ser avaliados antes de serem utilizados. As amostras podem ser conservadas por 3 dias entre 2-8°C. Para guardar por um período de tempo mais longo as amostras devem ser congeladas (-20°C). Evitar congelar e descongelar as amostras repetidamente. Partículas em suspensão devem ser eliminadas por centrifugação. As amostras não devem ser inativadas pelo calor, pois podem produzir-se resultados incorretos. Não utilizar amostras que contenham azida sódica. Processamento automático Esta prova pode ser utilizada de modo automático ou semi-automático com diferentes instrumentos. É muito importante validar qualquer sistema automático para demonstrar que os resultados obtidos para as amostras são equivalentes aos obtidos empregando-se o ensaio manual. É recomendado que o usuário valide periodicamente o instrumento. Se encontrar qualquer dificuldade na programação e ajuste dos processadores automáticos de Biokit, por favor, contate seu distribuidor. PROCEDIMENTO (Ver esquema do procedimiento) Operações prévias Todos os reativos devem estar a temperatura ambiente (20-25°C) antes de iniciar-se o ensaio. Os reativos líquidos devem ser homogeneizados suavemente antes do seu uso. Diluir 1/10 a solução de lavagem concentrada com água destilada ou deionizada. Para uma placa completa, misturar 50 ml de solução de lavagem concentrada com 450 ml de água. No caso de não se utilizar uma placa completa, preparar o volume proporcional de solução. Realização da prova 1. Utilizar somente o número de tiras necessárias para o teste. Reservar 7 pocinhos para o branco e controles. Transferir 50 µl de controle negativo a 4 pocinhos e 50 µl de controle positivo a 2 pocinhos. Deixar vazio um pocinho para o branco do substrato. 2. Transferir 50 µl de cada uma das amostras aos pocinhos correspondentes. 3. Adicionar 50 µl de conjugado em cada pocinho, com exceção do pocinho do branco do substrato. 4. Cobrir a placa com uma folha adesiva, agitá-la ligeiramente e incubar por uma hora a 37°C. 5. Durante os últimos 5-10 minutos desta incubação, preparar a solução de substrato-cromógeno. Se for utilizar toda a placa colocar 280 µl de solução de cromógeno (TMB) diretamente no frasco de tampão substrato (14 ml) e homogeneizar bem. Se não for utilizar toda a placa, preparar a quantidade necessária indicada na tabela 1. A solução para uso deve ser incolor; descartar caso se torne azul. TABELA 1 Tiras requeridas Tampão substrato ml Cromógeno (TMB) µl 1 1,0 20 2 2,0 40 4 4,0 80 6 6,0 120 8 8,0 160 10 10,0 200 12 12,0 240 NOTA: O TMB está dissolvido em DMSO. Dado que a temperatura de fusão do DMSO é de 18°C, deixar que o cromógeno alcance a temperatura de 20-25°C para que se descongele completamente e homogeneizar bem antes de usar. É normal que o cromógeno apresente cor amarelada. 6. Retirar a folha adesiva. Aspirar o conteúdo dos pocinhos e enchê-los completamente (aproximadamente 350 µl), com a solução de lavagem. Repetir o processo de aspiração e lavagem 3 vezes mais. Assegurar que cada coluna de pocinhos esteja em remolho ao menos 15 segundos antes do novo ciclo de aspiração. Após a última lavagem golpear a placa invertida sobre um papel absorvente para eliminar qualquer excesso de líquido nos pocinhos. 7. Adicionar 100 µl de substrato-TMB em todos os pocinhos, inclusive o branco. 8. Incubar sem cobrir durante 30 minutos a temperatura ambiente (20-25°C). 9. Parar a reação pipetando 100 µl de solução de bloqueio em cada pocinho, guardando a mesma seqüência e com os mesmos intervalos observados na adição do substrato-TMB. BIOKIT, S.A. - Can Malé s/n - 08186 Lliçà d’Amunt - Barcelona - SPAIN 38 3000-1102 R13 11.2014 por.doc 0843 bioelisa 10. Ajustar o zero do leitor com o pocinho do branco a 450 nm e ler a absorbância de cada um dos pocinhos, no prazo máximo de 30 minutos. É recomendável fazer leitura bicromática, utilizando filtro de referência de 620 - 630 nm. Controle de qualidade Os resultados de um ensaio são válidos se são cumpridos os seguintes critérios: 1. Branco do substrato: o valor de absorbância deve ser inferior ou igual a 0,100. 2. Controle negativo: cada um dos valores individuais obtidos não deve variar mais de 20% da média dos quatro valores. A média das absorbâncias deve ser igual ou maior que 0,600 depois de subtrair o branco. 3. Controle positivo: a média das absorbâncias deve ser igual ou menor que 0,100 depois de subtrair o branco. Resultados 1. Calcular o valor cut-off somando a média das absorbâncias do controle negativo e do controle positivo e multiplicando o resultado da soma por 0,4. Cut-off = (CNx + CPx) x 0,4 2. Dividir a absorbância da amostra pelo cut-off. Positivo: Negativo: Duvidoso: relação absorbância/cut-off ≤ 1,0 relação absorbância/cut-off > 1,1 relação absorbância/cut-off > 1,0 ≤ 1,1 Interpretação dos resultados Um resultado positivo para anti-HBc significa que o paciente contraiu a hepatite B alguma vez. Não é um marcador de imunidade. Um resultado negativo significa que a amostra analisada não contém anti-HBc, ou o contém abaixo do limite de detecção deste kit. Para avaliar a situação de um paciente com relação à hepatite B devem ser analisados outros marcadores sorológicos desta doença. Limitações do procedimento Tal como ocorre com outras provas sorológicas, os resultados obtidos com o bioelisa anti-HBc servem somente como ajuda ao diagnóstico e devem ser interpretados tendo em conta a história clínica do paciente. Para o correto funcionamento do kit as instruções para uso devem ser seguidas estritamente. Qualquer desvio pode dar origem a resultados aberrantes. Amostras com uma concentração de anticorpos anti-HBc inferior a 1,5 Unidade /ml (Padrão PEI ou OMS) podem não ser detectadas. Todas as amostras que apresentarem um resultado positivo ou duvidoso deveriam ser repetidas e testadas para outros marcadores sorológicos do HBV. Resultados esperados O anticorpo anti-HBc é o marcador mais freqüente de infecção pelo vírus da hepatite B e é detectado tanto na infecção aguda como na crônica e em infecção passada com recuperação. A prevalência de anti-HBc e de outros marcadores da hepatite B varia amplamente no mundo, de alta (70-90%, ex., África, Ásia e Pacifico Oeste) a intermediaria (20-55%, ex., sul e leste Europeu) e baixa (4-6%, ex., Europa ocidental, América do Norte e partes da América do Sul). Diferentes estudos descreveram uma prevalência de 0,53 a 2,16% em doadores de sangue do Reino Unido.2,5,6 Características funcionais Sensibilidade analítica O limite de detecção do bioelisa anti-HBc é 1,5 unidade/ml utilizando o soro de referência anti-HBc do Instituto Paul Ehrlich (PEI). De acordo com estudos internos, 1,0 PEI-U/mL é equivalente a cerca de 1,0 UI/mL do Primeiro Padrão Internacional para anti-HBc (código NIBSC 95/522). Avaliações O funcionamento do bioelisa anti-HBc foi avaliado em estudos comparativos com outros ensaios comerciais. - Em uma avaliação interna foram testadas 233 amostras que eram positivas de anti-HBc com outro ensaio comercial (76 delas eram também HBsAg positivas). 227 apresentaram resultado positivo (inclusive as 76 positivas de HBsAg) e 6 resultado negativo. As 6 amostras discrepantes foram provadas com um terceiro ensaio comercial e os resultados obtidos foram também negativos. BIOKIT, S.A. - Can Malé s/n - 08186 Lliçà d’Amunt - Barcelona - SPAIN 39 3000-1102 R13 11.2014 por.doc 0843 bioelisa - Em uma avaliação externa em comparação com outro ensaio comercial, foram provadas 175 amostras. 31 foram positivas e 141 foram negativas com ambos ensaios. Foi obtida uma concordância global de 98,3% (172/175). Eliminando dos cálculos 2 amostras duvidosas, a sensibilidade relativa foi de 100% (31/31) e a especificidade relativa foi de 99,2%. - Em outra avaliação externa, foram testadas 251 amostras positivas de HBsAg. 247 (98,4%) foram reativas com o bioelisa anti-HBc, das quais 245 foram reativas também com o método alternativo utilizado de rotina para anti-HBc. 4 amostras foram anti-HBc negativas com o bioelisa e com o método de rotina e 2 amostras foram positivas somente com o bioelisa. Portanto, a sensibilidade relativa do bioelisa foi de 100% (245/245) e a concordância global entre ambos métodos foi de 99,2% (249/251). - Em uma outra avaliação externa, 5058 amostras consecutivas de doadores de sangue habituais foram testadas em paralelo com o bioelisa e com o método utilizado de rotina. Destas amostras, 6 foram reativas tanto com o bioelisa como com o método de rotina, 5 das quais se confirmaram como de infecção passada depois de realizar testes adicionais para outros marcadores de HBV enquanto que 1 era positiva somente para anti-HBc. Outras 3 amostras foram repetidamente positivas com o bioelisa e negativas com o teste de rotina sendo 2 delas consideradas como falsamente positivas e 1 de resultado inconclusivo depois de realizar testes adicionais. Considerando como positivas verdadeiras somente as amostras confirmadas como de infecção passada, a especificidade encontrada foi de 99,92% (5049/5053). - Uma outra avaliação externa de sensibilidade a ponto final e funcionamento comparando com outros ensaios 3 comerciais se encontra na bibliografia. Precisão Reprodutibilidade intra-ensaio: Os coeficientes de variação obtidos para os valores de absorbância de 48 replicados de uma amostra negativa foram de 4,34%, 4,19% e 3,66% em três lotes estudados. Reprodutibilidade inter-ensaio: Três amostras negativas foram analisadas em 3 ensaios diferentes. Os coeficientes de variação obtidos para os índices absorbância/cut-off das 3 amostras foram 4,9%, 7,0% e 8,2%, respectivamente. Interferências Para estudar possíveis interferências, foram testadas amostras com um risco potencial de produzir reações cruzadas, tais como soros positivos de fator reumatóide (RF), anticorpos antinucleares (ANA), anticorpos heterófilos, IgM anti-HAV, anti-E. coli e de mulheres grávidas. Não se observaram evidencias de interferência. BIOKIT, S.A. - Can Malé s/n - 08186 Lliçà d’Amunt - Barcelona - SPAIN 40 3000-1102 R13 11.2014 por.doc 0843 bioelisa bioelisa: Guia de problemas Problema Possíveis causas Solução 1. Controles fora de validação. 1a. Temperatura, incubação ou pipetagem incorreta. 1b. Preparação incorreta de reativos, erro de diluição. Reativos não homogeneizados. 1c. Contaminação cruzada entre controles. Verificar o procedimento. Repetir o ensaio. Verificar o procedimento. Repetir o ensaio. 1d. Filtro de leitura incorreto. 1e. Interferência no caminho ótico. 1f. Foram utilizados componentes de lotes diferentes. 1g. Reativos vencidos. 2. Sem cor ou pouca cor ao 2a. Um ou mais reativos não adicionados ou final do ensaio. adicionados em seqüência incorreta. 2b. Conjugado inativo: conservação incorreta. Pipetar cuidadosamente. Não intercambiar as tampas dos frascos. Repetir o ensaio. Comprovar que o filtro de leitura seja de 450 nm. Se não se usa filtro de referência de 620-630 nm, as absorbâncias aumentam aproximadamente 50 miliunidades. Verificar o leitor. Limpar ou secar o fundo dos pocinhos. Comprovar que não hajam bolhas de ar. Repetir a leitura. Não utilizar componentes de lotes diferentes já que os mesmos são ajustados para cada lote. Verificar a data de validade do kit. Não utilizar kits vencidos. Verificar o procedimento. Repetir o ensaio. Verificar se há contaminação visível. Verificar o procedimento. Repetir o ensaio. 2c. Microplaca inativa: Manter sempre as tiras não conservação incorreta. utilizadas na bolsa de plástico, bem fechada, com o dessecante dentro. Repetir o ensaio. 2d. Substrato inativo: Utilizar sempre uma diluição conservação ou diluição recém preparada de TMB em incorreta, o recipiente tampão substrato. Utilizar utilizado afeta a recipientes descartáveis ou estabilidade do substrato, lavados com ácido ou etanol contaminação cruzada e enxaguados com água com a solução de deionizada. Verificar o bloqueio. procedimento. Repetir o ensaio. BIOKIT, S.A. - Can Malé s/n - 08186 Lliçà d’Amunt - Barcelona - SPAIN 41 3000-1102 R13 11.2014 por.doc 0843 bioelisa bioelisa: Guia de problemas Problema Possíveis causas Solução 3. Demasiada cor em todos os pocinhos da microplaca. 3a. Substrato contaminado, oxidado ou preparado incorretamente. Comprovar que o substrato preparado seja incolor, descarte-o caso se torne azul. Assegurar-se de que o TMB esteja completamente líquido antes de utilizá-lo. Misturar bem o TMB com o tampão substrato. Utilizar frascos ou recipientes descartáveis de plástico ou de vidro lavados com ácido ou etanol. Repetir o ensaio. Verificar se há contaminação (aspecto turvo). Comprovar as diluições. Repetir o ensaio. Verificar a qualidade da água destilada/deionizada utilizada para preparar a diluição. Repetir o ensaio. Verificar o lavador. Encher totalmente e aspirar completamente os pocinhos. Aumentar o número de ciclos de lavagem. Bater a placa invertida sobre papel absorvente. Repetir o ensaio. 3b. Reativos contaminados ou preparados incorretamente. 3c. Solução de lavagem (1x) contaminada. 4. Reprodutibilidade pobre ou elevado Número de amostras reativas que não se repetem. 3d. Lavagem insuficiente ou não uniforme: volume dispensado ou aspiração insuficiente ou não uniforme, número de ciclos de lavagem insuficiente. Lavador contaminado. 3e. Foi utilizada solução de lavagem de outro fabricante. 4a. Problemas de lavagem. 4b. Pipetas mal calibradas ou ponteiras mal encaixadas. Técnica de pipetagem incorreta. 4c. Reativos e/ou amostras muito frios ou não homogeneizados antes de usar. 4d. Correntes de ar sobre a microplaca durante as incubações. 4e. Demasiada demora na adição de amostras e/ou reativos. Inconsistência nos intervalos de tempo, bolhas de ar. 4f. Interferência no caminho ótico. Utilizar somente a solução de lavagem de biokit. Ver itens 3c, 3d, 3e. Utilizar pipetas calibradas, com ponteiras bem encaixadas. Pipetar cuidadosamente sem fazer bolhas nem salpicar. Repetir o ensaio. Deixar os reativos e amostras alcançarem a temperatura ambiente e misturá-los bem antes de usar. Manter a microplaca protegida de correntes de ar. Desenvolver uma técnica uniforme e reprodutível. Ver 1e. BIOKIT, S.A. - Can Malé s/n - 08186 Lliçà d’Amunt - Barcelona - SPAIN 42 3000-1102 R13 11.2014 por.doc 0843 bioelisa READ HIGHLIGHTED CHANGES bioelisa anti-HBc 3000-1102 1 x 96 TESTS Procedural flow chart / Esquema del procedimiento / Schematischer Ablauf / Schéma de la procédure / Schema del procedimento / Esquema do procedimento Pipette Samples and Controls: 50 µl/well Dispensar Muestras y Controles: 50 µl/pocillo Proben und Kontrollen verteilen: 50 µl/Vertiefung Dispenser Échantillons et Contrôles: 50 µl/puits Dispensare Campioni e Controlli: 50 µl/pozzetto Pipetar Amostras e Controles: 50 µl/pocinho Ð Add Conjugate: 50 µl/well Añadir el Conjugado: 50 µl/pocillo Konjugat hinzugeben: 50 µl/Vertiefung Ajouter le Conjugué: 50 µl/puits Aggiungere il Coniugato: 50 µl/pozzetto Adicionar o Conjugado: 50 µl/pocinho Ð Incubate 1 hour at 37°C Incubar 1 hora a 37°C 1 Stunde bei 37°C inkubieren Incuber 1 heure à 37°C Incubare 1 ora a 37°C Incubar 1 hora a 37°C Ð Wash 4x / Lavar 4x Waschen 4x / Laver 4x Lavare 4x / Lavar 4x Ð Pipette Substrate: 100 µl/well Dispensar el Sustrato: 100 µl/pocillo Substrat pipettieren: 100 µl/Vertiefung Dispenser le Substrat: 100 µl/puits Dispensare il Substrato: 100 µl/pozzetto Pipetar o Substrato: 100 µl/pocinho Ð Incubate 30 minutes at RT Incubar 30 minutos a TA 30 Minuten bei RT inkubieren Incuber 30 minutes à TA Incubare 30 minuti a TA Incubar 30 minutos a TA Ð Pipette Stopping Solution: 100 µl/well Dispensar la Solución de Parada: 100 µl/pocillo Stopplösung zufügen: 100 µl/Vertiefung Dispenser la Solution d’Arrêt: 100 µl/puits Dispensare la Soluzione Bloccante: 100 µl/pozzetto Pipetar a Solução de Bloqueio: 100 µl/pocinho Ð Cut-off: (NCx + PCx) x 0.4 Valor umbral: (CNx + CPx) x 0,4 Schwellenwert: (NKx + PKx) x 0,4 Valeur seuil: (CNx + CPx) x 0,4 Valore di soglia: (CNx + CPx) x 0,4 Cut-off: (CNx + CPx) x 0,4 Read at 450 nm Leer a 450 nm Bei 450 nm ablesen Lire à 450 nm Leggere a 450 nm Ler a 450 nm BIOKIT, S.A. - Can Malé s/n - 08186 Lliçà d’Amunt - Barcelona - SPAIN 43 3000-1102 R13 11.2014 procedural flow chart.doc 0843 bioelisa READ HIGHLIGHTED CHANGES bioelisa anti-HBc 3000-1102 1 x 96 TESTS Bibliography - Bibliografía - Literatur - Bibliographie - Bibliografia - Bibliografia 1. Almeida JD, Rubenstein D and Stott EJ. New antigen antibody system in Australia antigen positive hepatitis. Lancet 2: 1225-1227, 1971. 2. Anderson NAB, Raafat A et al. U.K. multicentre study on blood donors for surrogate markers of non-A non-B hepatitis. Part I: Alanine transferase and anti-HBc testing. Transf Med 2: 301-303, 1992. 3. Bailey MH, Howel DR and Barbara JAJ. Anti-HBc assays: evaluation of end-point sensitivity and performance. British Journal of biomedical Science 51: 341-344, 1994. 4. Hoofnagle JH, Seeff LB, Bales ZB, Zimmerman HJ and the Veterans Administration Hepatitis Cooperative Study Group. Type B hepatitis after transfusion with blood containing antibody to hepatitis B core antigen. New England Journal of Medicine 298 (25): 1379-1383, 1978. 5. Hughes W, Barr A, Dow BC, Follett EAC, and Barbara JAJ. A multicentre assessment of the specificity of ten anti-HBc screening tests. Transfusion Medicine 5: 225-230, 1995. 6. Kitchen AD, Harrison TJ et al. Incidence and significance of hepatitis B core antibody in a healthy blood donor population. J Med Virol 25: 69-75, 1988. 7. Koziol DE, Holland PV, Alling DW, Melpolder JC, Solomon RE, Purcell RH, Hudson LM, Shoup FJ, Krakauer H and Alter HJ. Antibody to hepatitis B core antigen as a paradoxical marker for non-A, non-B hepatitis agents in donated blood. Annals of Internal Medicine 104 (4): 488-495, 1986. 8. Stevens CE, Aach RD, Hollinger FB, Mosley JW, Szmuness W, Kahn R, Werch J and Edwards V. Hepatitis B virus antibody in blood donors and the occurrence of non-A, non-B hepatitis in transfusion recipients: An analysis of the transfusion transmitted viruses study. Annals of Internal Medicine 101 (6): 733-738, 1984. 9. Vyas GN and Perkins HA. Non-B post transfusion hepatitis associated with hepatitis B core antibodies in donor blood. New England Journal of Medicine 306 (12): 749-750, 1982. BIOKIT, S.A. - Can Malé s/n - 08186 Lliçà d’Amunt - Barcelona - SPAIN 44 3000-1102 R13 11.2014 bibliography.doc 0843 ·T3800-0158 R13