Cap 21

Bacterias Gram negativas exigentes: Aspectos prácticos
Soledad Mateos, Alicia Mattera
A. GENERO NEISSERIA
Dicho género pertenece conjuntamente con Kingella,
Moraxella y Acinetobacter, a la familia Neissereaceae.
Estudios genéticos recientes han demostrado que la
antigua especie Branhamella catarrhalis es un
subgénero de Moraxella, designándose a la especie más
comúnmente hallada en el ser humano como Moraxella
(Branhamella) catarrhalis.
Solamente dos especies se consideran patógenas
primarias, infectando al hombre exclusivamente, estas
son N. gonorrhoeae y N. meningitidis. Las otras especies
forman parte de la flora normal orofaríngea, nasal y
génitourinaria, pudiendo en ocasiones actuar como
oportunistas.
Se caracterizan por ser diplococos Gram negativos
arriñonados, catalasa y oxidasa positivos, aerobios
estrictos, inmóviles, que utilizan pocos carbohidratos.
IDENTIFICACION MICROBIOLOGICA
Se entregará a los alumnos del C.E.F.A. diferentes cepas
para su identificación.
Para ello seguiremos el siguiente orden:
a. morfología microscópica
b. morfología macroscópica
c. requerimientos atmosféricos
d. requerimientos nutricionales
e. pruebas bioquímicas
f- pruebas serológicas
a.
Para observar la morfología microscópica, se
deberá realizar un frotis, para lo cual se tomará un
portaobjetos de vidrio limpio, luego se flamea el asa, se
coloca una gota de suero fisiológico estéril, se pica una
colonia con el asa, emulsionándola en el suero. Se realiza
secado y fijación por calor, realizando luego la tinción de
Gram.
Dicha tinción nos permitirá además apreciar la forma y
agrupación.
Como ya fue mencionado se presentan como diplococos
Gram ne-gativos arriñonados.
En caso de que dicha cepa no provenga de un cultivo en
agar sino de una muestra fresca como puede ser un
exudado uretral, se deberá de realizar una descarga sobre
un portaobjeto con el hisopo en un sólo sentido dado que
en este caso se verán intracelularmente dentro de los
polimorfonucleares manteniéndose de esta forma la
integridad celular y la morfología bacteriana.
b.
La
morfología
macroscópica
difiere
dependiendo de la especie de Neisseria que se haya
aislado.
Neisseria gonorrhoeae presenta colonias que en agar
chocolate se pueden observar mejor con ayuda de una
lupa.
Luego de 24 horas de incubación las colonias adquieren
un tamaño de 0.5 a 1 mm de diámetro pasando del color
grisáceo al color blanco, siendo además colonias opacas,
convexas y brillantes.
Dicho microorganismo puede producir dos tipos
morfológicos de colonias dependiendo si el aislamiento
es reciente o no.
Las colonias P+ y P++ (antes T1 y T2) se ven en cultivos
primarios y se caracterizan por ser colonias pequeñas,
convexas, que reflejan la luz incidental, las colonias P(antes T3 y T4) que son más grandes, aplanadas, menos
opacas y no reflejan la luz.
Dicha variación morfológica dependería de la pérdida de
la expresión de los pili.
N. meningitidis presenta una morfología macroscópica
caracterizada por colonias de mayor tamaño que N.
gonorrhoeae, convexas, lisas, borde entero, brillantes y
grisáceas.
c.
En cuanto a los requerimientos atmosféricos
son aerobios estrictos, creciendo a una temperatura
óptima de 35 a 37°C, en presencia de 5 a 10% de CO2
que estimula su crecimiento y con una atmósfera
húmeda, dado que son muy lábiles a la desecación.
Dichos requerimientos pueden ser proporcionados en
una jarra como la que se utilizan para los anaerobios,
pero con la presencia de una generador de CO2 o en el
caso de no contar con este sistema una jarra dentro de la
cual se coloca una vela que al extinguirse proporciona el
CO2 necesario. La humedad se genera por evaporación a
punto de partida de las placas.
Las placas se incuban por un período de duración de 24 a
48 horas.
d.
Las dos especies patógenas son las que tienen
los requerimientos nutricionales más complejos, por lo
cual se denominan exigentes.
Se requieren para su aislamiento medios ricos y
complejos como el agar sangre (agar con 5% de sangre
ovina) o agar chocolate (agar con 5 a 10% de sangre
ovina calentada a 80°C por 15 minutos).
N. meningitidis crece tanto en agar sangre como agar
chocolate, no así N. gonorrhoeae que crece sólo en agar
chocolate en los aislamientos primarios.
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Ambos medios se utilizan para muestras provenientes de
sitios estériles como lo son la sangre, el líquido
cefalorraquídeo, el líquido sinovial, etc.
En el caso de que las muestras provengan de sitios que
poseen flora normal como ser: orofaringe, uretra, recto o
en aquellas en la que la muestra puede contaminarse
fácilmente como la del endocérvix que se contamina con
la flora vaginal, se utilizan medios selectivos.
El más comúnmente utilizado es el medio de ThayerMartin que consiste en una base de agar chocolate a la
que se agregan: Vancomicina (inhibe a los cocos
Gram+), Colistina (inhibe las bacterias Gram-) y
Nistatina (inhibe las levaduras).
Este medio se puede modificar al agregar otro antibiótico
como es Trimetroprím que inhibe el desarrollo en
superficie producido por Proteus.
Las ventajas que proporciona este medio son: el no
desarrollo de la mayoría de neiserias no patógenas,
microorganismos que pueden ser confundidos con ellas
como Moraxella, facilitando de esta manera el
crecimiento de N. gonorrhoeae y N. meningitidis.
e.
La identificación presuntiva se realiza con
tinción de Gram (conociendo la procedencia de la
muestra y la edad del paciente), estudio de la morfología
colonial y por la prueba de oxidasa.
Reacción ésta en la que se evalúa la presencia de la
enzima citocromo oxidasa al poner en contacto a la
colonia bacteriana con un disco de papel de filtro
impregnado con el substrato de dicha enzima
(tetrametilparafenilendiamina).
Se toma una colonia de un cultivo puro, con palillo de
madera y se coloca sobre el disco ya mencionado,
humedecido previamente.
La reacción es positiva si dicha colonia se torna púrpura
oscuro o negra.
La identificación confirmatoria se realiza en primera
instancia por las pruebas bioquímicas y luego por las
pruebas serológicas.
Dentro de las pruebas bioquímicas contamos con la
degradación de los carbohidratos con la consiguiente
formación de ácido.
Para dicho objetivo de utiliza un medio de cisteínatripticasa agar, medio semisólido al que se le agrega 1%
del carbohidrato deseado filtrado estéril.
Los carbohidratos más frecuentemente usados son:
glucosa, maltosa, sacarosa, fructosa, lactosa y debe
incluirse un control (un tubo con medio sin
carbohidrato).
Debe tomarse un inóculo denso de un cultivo puro,
tratando de no utilizar aquellas provenientes de medios
selectivos, dado que estos tienen contaminantes
inhibidos y menor cantidad de colonias. Por lo tanto,
primero deben subcultivarse algunas colonias típicas en
una o dos placas de agar chocolate, incubándose en
atmósfera de CO2 por más de 18 horas. Se toma del agar
chocolate un inóculo denso depositándolo unos
milímetros por debajo de la superficie del medio,
incubándolo a 35 a 37°C durante 24 horas en ausencia de
CO2, dado que la presencia del mismo puede determinar
falsos positivos ya que el gas se disuelve en el medio
para dar ácido carbónico.
Los tubos tienen como indicador de pH rojo fenol por lo
que al ser utilizado el carbohidrato pasan del color
naranja-rosado inicial al amarillo.
Existen Kits comerciales que contienen 7 hoyos, 4 de los
cuales contienen buffer y rojo fenol que se encuentran
deshidratados más un carbohidrato (glucosa, lactosa,
sacarosa, maltosa), un hoyo control, otro contiene rojo
fenol y Penicilina para la determinación acidométrica de
la producción de ß-lactamasas.
El último hoyo contiene un test de DNAsa, la que es
positiva solamente para M. catarrhalis.
Este Kit comercial se inocula con una suspención
bacteriana correspondiente a una suspención Mc Farlan
3, se incuba 2 ho-ras a 35°C.
(Ver tabla 1 en capítulo de Bacterias Gram negativas
exigentes)
f.
Dentro de las pruebas serológicas para
confirmación diagnóstica:
N. gonorrhoeae, puede realizarse
aglutinación de partículas de látex, coaglutinación, test
inmunoenzimáticos, o inmunofluorescencia dirigidos
contra diferentes proteínas de membrana externa de
dicho microorganismo.
Para N. meningitidis, existen kits
comerciales con aglutinación de partículas de latex o
coaglutinación, estos reactivos reconocen antígenos
capsulares de N. meningitidis de los grupos más
frecuentes.
B. GENERO HAEMOPHILUS
Género este constituido por parásitos obligados que
forman parte de la flora normal del tracto respiratorio en
humanos, existiendo además varias especies animales.
Algunas de las especies humanas se comportan como
patógenos primarios. Ejemplo de ello lo son H.
influenzae, H. ducreyi, agentes de infección respiratoria,
meningitis el primero y ETS el segundo.
La especie tipo es H. influenzae que puede ser capsulado
o no. Basaremos el practico en esta especie.
IDENTIFICACIÓN MICROBIOLÓGICA
a.
Respecto a la morfología microscópica ya sea a
punto de partida de una muestra clínica como líquido
cefalorraquídeo o de un cultivo, con la tinción de Gram
se observan microorganismos Gram- pleomórficos
predominantemente cocobacilares pequeños, muy finos,
pudiendo presentarse también como bastones cortos,
largos y formas filamentosas.
En la preparación de la tinción de Gram se debe tener
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sumo cuidado en el paso de decoloración dado que la
forma cocobacilar es fácilmente confundible con S.
pneumoniae ya sea que la muestra provenga de un
esputo o del líquido cefalorraquídeo.
b.
En cuanto a la morfología macroscópica luego
de 18 a 24 horas de incubación en agar chocolate se
observan colonias pequeñas, convexas, de aspecto
áspero o rugoso, con diámetro de 0.5 a 1mm en el caso
de ser no capsuladas, dado que las capsuladas se
presentan como colonias brillantes, mucoides, pudiendo
alcanzar 3 a 4mm en medio enriquecido.
c.
La temperatura óptima es de 37°C y el pH es de
7.4-7.8 en condiciones aerobias, pero crecen mejor con
el agregado de atmósfera de CO2 al 10%.
dSon muy exigentes en sus requerimientos
nutricionales necesitan dos factores para su crecimiento
que son hemina (X) y NAD (V). No desarrollan en
placas de agar sangre ya que dichos factores se
encuentran incluidos en los glóbulos rojos, no así en el
agar chocolate donde por calentamiento se produce la
ruptura de los hematíes con liberación de dichos factores.
Otra forma de proveer los factores ya mencionados es el
cultivo conjunto de H. influenzae con S. aureus
productor de ß-lisina. Esta prueba se realiza en una placa
de agar sangre en la que se siembra H. influenzae para
que tenga un crecimiento uniforme en toda la placa,
luego se realiza una estría con la cepa de S. aureus ya
mencionada, se incuba a 37°C durante 24 horas.
Se observa un crecimiento predominante de H.
influenzae alrededor de la estría de S. aureus, fenómeno
éste denominado satelitismo.
La separación de las cepas de H. influenzae en biotipos
(biovariedades I al VI) se logra por una serie de pruebas
bioquímicas basadas en las características fenotípicas de
la bacteria.
Estas pruebas son: las pruebas de indol, ureasa, ornitina
descarboxilasa, producción de ácido a partir de glucosa y
reducción de nitratos.
Los aislamientos a partir de LCR. frecuentementem
pertenecen a la biovariedad I que es poco frecuente en el
tracto respiratorio superior.
Las cepas no capsuladas a menudo implicadas en
conjuntivitis, sinusitis y otitis media habitualmente
pertenecen a la biovariedad II y III que son las mismas
que colonizan la nasofaringe de personas sanas.
f.
Los métodos serológicos para la detección de
los diferentes tipos de H. influenzae están dirigidos
contra los antígenos capsulares; pudiendo utilizarse
partículas de látex, técnicas de coaglutinación con S.
aureus e inmunofluorescencia.
Siendo muy importante el completar la identificación
con la serotipificación, sobre todo desde que en Uruguay
se vacuna en forma sistemática a todos los niños
pequeños con vacuna anti H. influenzae tipo b.
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