Ver/Abrir - Universidad Nacional de Trujillo

Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación
UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO
FACULTAD DE FARMACIA Y BIOQUÍMICA
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ESCUELA ACADÉMICO PROFESIONAL DE FARMACIA Y BIOQUÍMICA
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IA
“VALIDACIÓN DEL MÉTODO ANALÍTICO PARA DETERMINAR
PROTEÍNAS TOTALES SÉRICAS EN EL LABORATORIO
QUINTANILLA S.R.L.”
DE
INFORME DE PRÁCTICAS PRE-PROFESIONALES
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CA
PARA OPTAR EL TÍTULO PROFESIONAL
BL
I
DE
QUÍMICO FARMACÉUTICO
Br. TELLO REYNA, CYNTHIA ROXANA
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AUTORA:
ASESOR:
Dr. ALVA PLASENCIA, PEDRO MARCELO
TRUJILLO – PERÚ
2012
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Agradecimientos:
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A Dios:
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Gracias por fortalecerme y
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por iluminar cada paso
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de mi camino.
Gracias por permitirme lograr mis metas,
DE
por el inmenso amor que me regalas
queridos.
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y por bendecir a mis seres
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A mis padres Gladys Reyna y Marco Tello,
desde lo más profundo de mi corazón
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mil gracias por su apoyo, por su ayuda
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incondicional, comprensión y estar
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siempre conmigo.
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A mis amores Cristhian y Mathias,
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gracias porque son el motivo de seguir
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creciendo cada dia. Los amo.
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Un sincero agradecimiento al:
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Dr. Pedro Alva Plasencia
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Dra. Judith Castro Guzman
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por su apoyo y asesoramiento
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en la realización del
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DE
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presente trabajo.
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PRESIDENTE
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Salomón Alva Bazán
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----------------------------------------
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JURADO EVALUADOR
-----------------------------------
MIEMBRO
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DE
Anabel González Siccha
----------------------------------Pedro Alva Plasencia
MIEMBRO
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PRESENTACIÓN
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Señores miembros del jurado:
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Dando cumplimiento a las disposiciones establecidas en el Reglamento para la
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obtención de GRADOS Y TÍTULOS DE LA FACULTAD DE FARMACÍA Y
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BIOQUÍMICA DE LA UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO, presento
Y
a vuestra consideración y elevado criterio el Informe de Prácticas Pre-
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profesionales, intitulado: “VALIDACIÓN DEL MÉTODO ANALÍTICO
PARA DETERMINAR PROTEÍNAS TOTALES SÉRICAS EN EL
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LABORATORIO QUINTANILLA S.R.L.”, con el que pretendo obtener el
Título de Químico Farmacéutico.
DE
Dejo a vuestra consideración, señores miembros del jurado la calificación del
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presente Informe de Prácticas Pre profesionales.
Trujillo, Noviembre de 2012
Cynthia R. Tello Reyna
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INDICE
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RESUMEN………………………………………………. ......i
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ABSTRACT………………………………………..…….…..ii
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I. INTRODUCCIÓN ................................................................... 1
AC
IA
II. MATERIAL Y MÉTODO ..................................................... 9
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III. RESULTADOS.......................................................... ….….20
DE
IV. DISCUSIÓN ......................................................................... 23
O
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V. CONCLUSIONES ................................................................ 27
VI. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS.............................. 28
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BL
I
ANEXOS……………………………………………………31
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RESUMEN
Este informe, tuvo como objetivo general, validar el método analítico para la
cuantificación de proteínas totales séricas utilizando el kit de reactivos Wiener Lab
empleado en el laboratorio Quintanilla S.R.L, Trujillo; cumpliendo con los
parámetros de linealidad, exactitud, precisión, límite de cuantificación, recuperación
A
y robustez según la OMS. Para lo cual se utilizó suero patrón: solución de albúmina
IC
y globulinas en estado nativo con título conocido de proteínas totales (Biuret o
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Kjeldhal): 9,6 g/dL y albúmina (Unión BCF): 5,40 g/dL. En la linealidad del
estándar, la pendiente (b) fue 0.041949 y el intercepto (a) de -0.02626; el coeficiente
BI
O
de correlación fue 0,996719 y el coeficiente de determinación de 0,9934; los límites
Y
de confianza de “b” fueron 0,039909 y 0,043990; y texp = 44,4022; los límites de
IA
confianza de “a” fueron -0,015065 y 0,009812; y texp = 0,4560; obtenido con un nivel
AC
de confianza del 95 %; es preciso con coeficiente de variación igual a 0,944 % para
FA
RM
repetibilidad y con coeficiente de variación igual a 0,7833 % para precisión
intermedia; es exacto con un porcentaje de recuperación media de 99,7618 % y texp =
DE
0,407; tiene un límite de cuantificación de 0,101g/dL, y al emplear diferentes
analistas, diferentes tiempos de reacción de 5 minutos y 10 minutos y temperatura de
O
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reacción de 20 oC y 37 oC, tiene robustez; cumpliendo con los parámetros de
BL
I
validación establecidos según la OMS.
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Palabras claves: Proteínas Totales, validación, OMS.
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ABSTRACT
This report, aimed generally validate a method for the quantification of total serum
protein using the reagent kit Wiener Lab used in the laboratory Quintanilla SRL,
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Trujillo; complying with the parameters of linearity, accuracy, precision, limit of
M
quantification, recovery and robustness according to WHO. Which was used for
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standard serum: albumin and globulin solution in the native state with known titre of
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total protein (Biuret or Kjeldhal): 9.6 g / dL and albumin (Union BCF): 5.40 g / dL.
BI
In the linearity of the standard, the slope (b) was 0.041949 and the intercept (a) -
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0.02626, and the correlation coefficient was 0.996719 and 0.9934 coefficient of
AC
determination, the confidence limits of "b" were 0.039909 and 0.043990, and texp =
FA
RM
44.4022, confidence limits "a" were -0.015065 and 0.009812, and texp = 0.4560,
obtained with a confidence level of 95%; necessary with variation coefficient equal
to 0.944% for repeatability and variation coefficient equal to 0.7833% for
DE
intermediate precision, is accurate to one half percent recovery of 99.7618% and texp
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= 0.407; has a limit of quantification of 0.101 g / dL, and by using different analysts,
different reaction times of 5 minutes and 10 minutes, and reaction temperature of
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WHO.
BL
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20°C and 37°C, is robust, meeting the established validation parameters according to
Keywords: Total Protein, validation, WHO.
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I. INTRODUCCIÓN
Se entiende por aseguramiento de la calidad el conjunto de medidas que garantizan
los estándares de calidad y el correcto funcionamiento del laboratorio para promover
la excelencia de resultados en la asistencia médica. La calidad se define como “grado
en que un conjunto de características inherentes cumple con unos requisitos” [ISO
9000:2000].1
El aseguramiento de la calidad analítica forma parte imprescindible de la
A
administración de laboratorios, que busca demostrar y evaluar de manera
M
IC
transparente, objetiva y documentada la validez de los procedimientos utilizados en
Q
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el laboratorio para generar datos confiables, mediante la participación de un tercero.
O
Éste presupone la existencia de un sistema de control de calidad (Quality Control)
BI
de las mediciones, de un sistema de evaluación de la calidad (Quality Assessment) y
Y
de un sistema de documentación que proporcione evidencia objetiva de su existencia.
IA
La ausencia de cualquiera de estos componentes compromete la validez de los
AC
resultados analíticos.2, 3
FA
RM
La importancia de estos criterios modernos en el mejoramiento del desempeño de los
laboratorios clínicos ha sido reconocida por la Organización Mundial de la Salud,
DE
para la que uno de los problemas en lograr una cobertura adecuada de las
necesidades de la población en materia de servicios de laboratorios es que la calidad
O
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de los mismos no llega a los estándares requeridos, recomendando la implementación
de sistemas de aseguramiento de calidad para mejorar el desempeño de los mismos,
BL
I
al proporcionar los laboratorios datos relevantes y creíbles, dando confianza a los
BI
médicos en los resultados reportados.4
La importancia de estas ideas para los laboratorios clínicos ha sido reconocida
ampliamente. Ya en 1986, Westgard y Klee, refiriéndose al aseguramiento de calidad
en química clínica, establecieron que este es el medio para definir objetivos de
calidad, sin los cuales no hay una manera objetiva de determinar si se está
alcanzando una calidad aceptable, de planificar estrategias efectivas para mejorar la
calidad, o de diseñar procedimientos que garanticen que un nivel especificado de
calidad ha sido alcanzado, considerando que los resultados de los análisis clínicos
son críticos para la salud de los pacientes.4
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El término control aplicado a calidad se refiere al ajuste y valoración continua y
sistemática de los procesos, subprocesos y técnicas de laboratorio empleando
procedimientos estadística y científicamente aceptados y de los cuales se derivan
múltiples indicadores que al ser comparados con sus correspondientes estándares
contribuyen a detectar, reducir y corregir las deficiencias que pueden aparecer
durante los procesos analíticos en el laboratorio. Los procedimientos de control de
calidad se engloban bajo la denominación de mejora continua y se fundamentan en la
emisión de registros de no conformidad y la realización de las pertinentes acciones
A
correctivas y preventivas.2, 5
IC
Aunque pueda resultar una obviedad, los términos documentación, certificación y
Q
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acreditación, que están estrechamente relacionados, no significan lo mismo. Suele
decirse que: ‘en todo sistema de aseguramiento de la calidad si se documenta, debe
O
hacerse; si se hace, debe documentarse. Lo que no está documentado jamás se ha
Y
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hecho’.4
IA
La certificación, además de aportar los documentos necesarios, confirma el
AC
cumplimiento de ciertas normas o requisitos de gestión, en este caso las exigidas por
FA
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un sistema de calidad, para cualquier producto, proceso, persona o servicio; la
certificación no supone una declaración sobre su perfección, calificación o
competencia técnica y diagnóstica sino más bien un visado de conformidad sobre
DE
dichos requisitos de gestión. En otras palabras, es posible certificar un producto que
O
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funciona sin la eficiencia debida; basta que esté documentado y todo el proceso tenga
adecuada trazabilidad dentro del sistema.6
Desde hace ya algunos años los procedimientos de certificación se han estandarizado
BL
I
genéricamente ateniéndose a las normas internacionales ISO 9000, desarrolladas en
BI
el seno de la Organización Internacional para la Estandarización ISO (ISO, de la
palabra griega isos, igual) que prácticamente es susceptible de regular cualquier
actividad y donde los estándares son el conjunto de normas cualitativas o
cuantitativas que actúan como medida patrón de lo evaluado. 7
El reconocimiento formal de la competencia técnica de un laboratorio en la
realización de los análisis o pruebas específicas, corresponde a la acreditación del
laboratorio. La acreditación es el resultado final de una evaluación (auditoría
analítica) realizada por un equipo de evaluador (auditores), que tienen la experiencia,
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los conocimientos científicos y técnicos suficientes para verificar que los
requerimientos establecidos en una normativa definida, se cumplan.8
Las directrices de un sistema de aseguramiento de calidad consisten básicamente en
seguir las buenas prácticas de laboratorio, las cuales pueden resumirse en la iniciativa
desarrollada en el Reino Unido para promoverlas, denominada Mediciones
Analíticas Válidas (Valid Analytical Measurements), basada en seis principios
generales, aplicables a cualquier laboratorio:
1) Las mediciones analíticas deben hacerse para satisfacer un requisito acordado
A
(esto es, un objetivo definido), 2) Las mediciones analíticas deben hacerse utilizando
IC
métodos y equipo que han sido probados para asegurar que son adecuados para el
Q
UI
M
propósito buscado, 3) El personal que realiza las mediciones debe ser calificado y
competente para realizar la tarea, 4) Debe haber una evaluación rutinaria
BI
O
independiente del desempeño del laboratorio, 5) Las mediciones realizadas en un
Y
lugar deben ser consistentes con aquellas realizadas en otra parte, 6) Las
IA
organizaciones que realizan mediciones analíticas deben tener procedimientos bien
AC
definidos de control y aseguramiento de calidad.4,7,8
FA
RM
El cumplimiento de estos principios garantiza las buenas prácticas y son acordes con
cualquier esquema que se utilice para evaluar la eficacia y eficiencia técnica del
DE
sistema de aseguramiento de calidad de un laboratorio.6
O
TE
CA
El laboratorio debe validar los métodos que no sean estandarizados, los desarrollados
por el laboratorio, los métodos estandarizados que se utilizan fuera de su ámbito de
aplicación. La validación debe ser tan extensiva como se requiera para el uso que se
BL
I
pretende. El rango y exactitud de los valores obtenidos de los métodos validados
BI
deben ser adecuados al uso y relevantes a las necesidades de los clientes.9
Los laboratorios deben, cuando sea pertinente, estimar la incertidumbre de sus
resultados. Cuando no sea posible realizar determinaciones metrológicas formales de
la incertidumbre, al menos se deberán identificar todas las fuentes de incertidumbre y
asegurarse de que no se sobrestime la precisión de los resultados.
Se debe contar con una verificación adecuada y sistemática de los datos y cálculos.
Este requisito establece la obligación de una supervisión permanente y documentada
de los resultados.9, 10
2
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Los métodos utilizados en un laboratorio de análisis químicos han de ser evaluados y
sometidos a prueba para asegurarse de que producen unos resultados válidos y
coherentes con el objetivo previsto, es decir, han de ser validados. La verificación
supone menos operaciones experimentales que la validación.
Si un método se modifica o se aplica en una situación nueva (por ejemplo, una
muestra de matriz nueva) se necesitará una revalidación o una verificación, según el
alcance de la modificación y el carácter de la nueva situación. Por ejemplo, se
necesitará una revalidación si un método diseñado para actuar con orina se utiliza
A
con sangre; se necesitará una verificación si se utiliza una columna cromatográfica
IC
de un carácter o una dimensión diferentes. No se necesitará adoptar ninguna medida
M
si la modificación es sólo pequeña, por ejemplo, si se sustituye una columna
Q
UI
cromatográfica por otra del mismo tipo.10, 11
BI
O
La validación o la verificación de un método se realizan mediante una serie de
Y
pruebas normalizadas y experimentales de las que se obtienen datos sobre su
IA
exactitud, precisión, etc. El proceso que ha de seguirse para ello debe constar por
AC
escrito como procedimiento normalizado de trabajo. Una vez validados o verificados
FA
RM
los métodos, su utilización habitual en el laboratorio debe ser autorizada
formalmente por la persona responsable, por ejemplo, el director del mismo.12
DE
Puede tratarse de métodos de análisis elaborados en el laboratorio; aunque es posible
O
TE
CA
que algunos sean métodos nuevos, lo más frecuente es que se basen en un método
oficial que se ha simplificado de algún modo para que resulte más fácil, rápido,
barato y cómodo de aplicar. Normalmente no se han sometido a ensayos entre
BL
I
laboratorios, pero muestran características de rendimiento (distintas de la
BI
reproducibilidad entre laboratorios) que son comparables a las del método oficial. Al
igual que otros métodos ordinarios, deberán coincidir perfectamente con el método
de referencia en lo que respecta a los valores próximos a un nivel utilizado en la
aplicación de normas, y si es probable que se ponga en duda un resultado, se aplicará
el método de referencia en un nuevo análisis.13
Cuando se trate de métodos cuantitativos en los que sea necesario establecer un nivel
de concentración definido (un umbral) para reflejar resultados, deben determinarse
los parámetros siguientes: Especificidad/selectividad, Límite de detección, Precisión
(en condiciones de repetibilidad y/o reproducibilidad en laboratorio), Linealidad y
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rango de trabajo, Exactitud (en condiciones de repetibilidad y/o reproducibilidad en
laboratorio), Recuperación, Incertidumbre de la medición y Estabilidad. 14, 15
Si un laboratorio está utilizando un método que ya ha sido validado, no es necesario
volver a validarlo en su totalidad aunque deba verificarse el cumplimiento de los
parámetros mínimos antes enumerados. Normalmente la verificación supone
determinar el cumplimiento de menos parámetros y hacer menos mediciones de cada
A
parámetro que si se tratara de una validación.15
determinada sustancia biológica
M
una
presente
en
el
Q
UI
cuantificación de
IC
En el campo de la medicina, y específicamente en el de los análisis clínicos, la
organismo puede ser de gran importancia para la prevención, diagnóstico y control
Y
BI
O
de enfermedades.16
IA
Las proteínas son parte básica de la estructura de la célula viviente y están
AC
indisolublemente ligadas a casi todas sus funciones. Sirven como componentes
FA
RM
estructurales de las células, enzimas, algunas hormonas, algunos receptores de
hormonas, moléculas de transporte, factores de la coagulación, etc.17
DE
Están compuestas por combinaciones de los 20 aminoácidos esenciales que se unen
O
TE
CA
entre si por uniones sustituidas de amidas (enlace peptídico) entre el grupo carboxilo
de un aminoácido (aa) y el grupo amino del (aa) siguiente.
De lo anterior se deduce que las proteínas plasmáticas son numerosas y tienen
BL
I
diferentes funciones, para mayor especificación, Ej. Albúmina o serina, proteína de
BI
transporte por antonomasia; factores de la coagulación; inmunoglobulinas;
lipoproteínas; transferrina; alfa1 antitripsina; ceruloplasmina; haptoglobina, etc.
Difieren entre sí por los tipos de aminoácidos que presente, su disposición, cantidad,
peso molecular y cambios superficiales, entre otros aspectos. Por lo tanto, el número
de proteínas es infinito, ya que la permutación de veinte posiciones posibles, con las
consecuencias que esto origina, así lo hace posible. De aquí se desprende que si las
proteínas intervienen en las defensas del organismo, es decir la inmunidad, las
posibilidades de crear estrategias defensivas específicas son realmente igual de
infinitas.16, 17
4
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La presencia de proteínas en el plasma es un reflejo dinámico de su movimiento en el
líquido extracelular, y, si bien es cierto que se espera, con razones lógicas, que se
encuentren en tal fluido, se desconoce la razón de la presencia de muchas otras,
estrictamente desde el punto de vista funcional.
Las proteínas plasmáticas son un reflejo o indicador de la absorción de aminoácidos
producto de la digestión de las proteínas de la dieta y/o de la función de síntesis de
los órganos especializados como el hígado y la integridad de la membrana filtrante
del riñón que impide que escapen por la orina en su paso por el riñón.
17, 18
A
El tipo de muestra determina el contenido de las proteínas ya que algunas de las
IC
mismas se consumen, por ejemplo durante la coagulación como sucede con el suero,
Q
UI
M
mientras que el plasma conserva los factores de la coagulación; el nivel de los
factores va disminuyendo según la labilidad de los mismos, a menos que se
BI
O
conserven a temperaturas extremadamente bajas. Es el caso del factor VIII y del
fibrinógeno. Sin embargo, aún en el suero existen cantidades de los mismos aun
IA
Y
cuando son pequeñas, como el caso de los factores XI y XII.17
AC
El primer reto de las investigaciones relacionadas con las proteínas es saber si están o
FA
RM
no presentes en una muestra. Esto es lo que se impone cuando, por lo general, estas
muestras no poseen proteínas, y su presencia implica anormalidades o la cantidad de
las proteínas es pequeña, al punto de ser indetectables con métodos comunes y por lo
DE
tanto se hace necesario el uso de técnicas especiales. Pero este caso no es el habitual
O
TE
CA
en el plasma, pues se espera encontrar muchas proteínas en el mismo. Se trata de lo
que ocurre con líquidos biológicos como la orina o el líquido cefalorraquídeo. Por lo
tanto, debemos tratar las técnicas diseñadas para saber cuánta proteína de cierto tipo
BL
I
hay en una muestra de plasma o suero.18
BI
Es decir dosificar la concentración de masa proteica en la muestra. Este término se
refiere a él conociendo de cuantos gramos o múltiplos del mismo contiene un
volumen de la muestra (un litro). Esta cuantificación de masa se debe a que muchas
proteínas son heterogéneas para su clase y dentro de una clase existen variantes, para
ejemplificar: los subtipos de Hb A, A1, A1c, A1b, As, SS, AF, las subclases de
Inmunoglobulinas (Igs) G, A, M, D, E. 17, 18
Los principales métodos empleados para la determinación de proteínas totales son los
siguientes: Método del Biuret: En solución alcalina el Cu+2 reacciona con el enlace
peptídico de las proteínas dando un color purpúreo que se cuantifica
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espectrofotométricamente
(540nm).
Método
de
Lowry:
Dependen
de
la
concentración de tirosina y triptófano de la muestra. Consiste en dos reacciones: 1.
Reacción de Biuret 2. Reacción de Folin: característica de los grupos –OH reductores
de los aminoácidos tirosina y triptófano que, junto con los complejos Cu+2, reducen
el reactivo de Folin generando un color azul. Está sujeto a muchas interferencias. Se
utiliza fundamentalmente en orina. La turbidimetría mide la radiación transmitida de
forma similar a la espectrofotometría de absorción molecular (aunque en ésta se mide
la
radiación absorbida). Se puede llevar a cabo en un espectrofotómetro
aunque
requiere ser aplicada a soluciones
suficientemente
A
convencional,
IC
concentradas que originen disminuciones importantes en la potencia de la radiación
Q
UI
M
transmitida. La nefelometría consiste en evaluar la dispersión de la radiación por las
partículas de una disolución o suspensión, midiéndose la potencia de la radiación
BI
O
dispersada en un ángulo diferente al de la radiación incidente, por lo general, en un
Y
ángulo igual o menor a 90º respecto al eje horizontal. El Proteinograma es una
IA
representación gráfica de la distribución de las distintas fracciones de las proteínas
AC
plasmáticas. Se basa en la separación de las proteínas en función de su masa y su
FA
RM
carga, tras someterlas a un campo eléctrico. Es una representación densitométrica de
las bandas obtenidas tras someter al suero a electroforesis y es complementario a la
determinación de proteínas totales en suero.18, 19.
DE
Las alteraciones que presentan el estudio de las proteínas plasmáticas se conocen con
O
TE
CA
el nombre genérico de disproteinemias. En el laboratorio bioquímico clínico el
método de elección para su estudio es el proteinograma electroforético.18
La mayoría de las proteínas plasmáticas sufren alteraciones por exceso o disminución
BL
I
de las mismas, debemos aclarar que la excepción es la albúmina, cuya única
BI
patología corresponde a una disminución, siendo los principales órganos
involucrados el hígado (por disminución de la síntesis) y el riñón (por aumento en la
eliminación).19
Para la obtención de resultados exactos y precisos con alto grado de seguridad es
indispensable realizar la validación del método analítico, que se utilizará en la
cuantificación de proteínas totales séricas, con el fin de asegurar la confiabilidad y
establecer una evidencia documentada del procedimiento.
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Conociendo la importancia del proceso de validación dentro del Sistema de Gestión
de Calidad y conociendo también que valores erróneos traen como consecuencia un
mal diagnóstico es que se decidió realizar éste trabajo de investigación; para lo cual
se planteó la siguiente interrogante:
¿Cumplirá con los criterios de validación del método para la cuantificación de
proteínas totales séricas utilizando el kit de reactivos Wiener Lab empleado en el
laboratorio Quintanilla S.R.L.?
Los objetivos a alcanzar fueron:
A
 Validar el método analítico para la cuantificación de proteínas totales
IC
séricas utilizando el kit de reactivos Wiener Lab empleado en el laboratorio
Q
UI

M
Quintanilla S.R.L.
Determinar los parámetros de validación del método analítico para la
BI
O
cuantificación de proteínas totales séricas: linealidad, exactitud, precisión,
Y
límite de cuantificación, recuperación y robustez, utilizando el kit de reactivos
AC
IA
Wiener Lab empleado en el laboratorio Quintanilla S.R.L.
O
TE
CA
 MATERIALES
DE
FA
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II. MATERIAL Y MÉTODO
 Muestra: Suero Patrón: solución de Albúmina y globulinas en
estado nativo con título conocido de Proteínas Totales (Biuret o
BI
BL
I
Kjeldhal): 9,6 g/dL y Albúmina (Unión BCF): 5,40 g/dL.
Materiales de Laboratorio
 Baño maría Tomos.
 Cronómetro
 Espectrofotómetro Stat Fax 3300.
 Gradilla de plástico
 Guantes de látex
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
Micropipetas regulables de 5 µL a 50 µL (Pipet4u) y de 100
µL – 1000 µL (TECO DIAGNOSTICS).
 Puntas para micro pipetas hasta 200 µL y hasta 1000 µL
 Tubos de ensayo.
Reactivos
 Reactivo EDTA/Cu: complejo EDTA/Cu 13mmol/l en NaOH 875
mmol/l y alquil aril poliéter (AAP).
IC
A
 MÉTODO
Q
UI
M
Cada una de las determinaciones a realizar se efectuará empleando la técnica
descrita en el inserto del kit de reactivos de la marca provista por el fabricante
AC
Fundamento de la reacción:
IA
Y
BI
O
Wiener Lab (Ver anexo)
FA
RM
Los enlaces peptídicos de las proteínas reaccionan con el ion cúprico, en medio
alcalino, para dar un complejo color violeta con máximo de absorción a 540
la muestra.
DE
nm, cuya intensidad es proporcional a la concentración de proteínas totales en
O
TE
CA
Condiciones de Reacción:
- Longitud de onda: 540 nm en espectrofotómetro o en fotocolorímetro
con filtro verde (520nm-560nm).
BL
I
- Temperatura de reacción: 37°C.
BI
- Tiempo de reacción: 15 minutos
- Volumen de muestra: 50 µL
- Volumen de Reactivo EDTA/Cu: 3,5 ml
- Volumen final de reacción: 3,55 ml
 PROCEDIMIENTO
En tres tubos de fotocolorímetro marcados B (Blanco), S (Standard) y D
(Desconocido), colocar:
8
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B
S
D
Agua destilada
50 µL
-
-
Suero Patrón
-
50 µL
-
Muestra
-
-
50 µL
Reactivo EDTA/Cu
3,5 mL
3,5 mL
3,5 mL
Mezclar con varilla. Incubar 15 minutos a 37°C .Leer en espectrofotómetro a 540 nm
o en fotocolorímetro con filtro verde (520nm-560nm) llevando a cero con el Blanco
M
IC
A
de Reactivo.
Q
UI
ESTABILIDAD DE LA MEZCLA DE REACCION FINAL:
El color de la reacción es estable durante 12 horas por lo que la absorbancia debe ser
Y
BI
O
leída dentro de ese lapso.
IA
Para determinar si el método empleado en la cuantificación de proteínas totales
AC
séricas cumple con los criterios de validación, se evaluaron los siguientes test: 14
FA
RM
Linealidad
Para evaluar la linealidad se hará uso de un estándar o suero patrón que viene con el
DE
kit de reactivos PROTI 2 de concentración para Proteínas Totales de 9,6 g/dL; con el
cual se realizará diluciones cuyas concentraciones serán de 7,2g/dL; 4,8g/dL;
O
TE
CA
3,6g/dL; 2,4 g/dL; las cuales serán analizadas cada uno por triplicado y por un
mismo analista.
BL
I
Precisión
Para determinar la precisión del método, se evaluará su repetibilidad y su
BI
reproducibilidad de la manera que se describe a continuación:
Repetibilidad:
Se realizarán un número de 10 determinaciones de la dilución de 7,2g/dL por un
mismo analista, el mismo día, con los mismos reactivos y los mismos
instrumentos.
Precisión Intermedia:
Para su determinación se empleará estándar de 7,2g/dL, el cual se analizará en
dos días diferentes, por dos analistas en un número de tres determinaciones; por
analista y por día.
9
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Exactitud
Se la evaluará a través de un análisis repetitivo de 3 concentraciones: 9,6g/dL,
7,2g/dL y 2,4 g/dL. El análisis de cada uno de estos estándares se llevará a cabo por
triplicado.
Límite de Cuantificación
Se determinará mediante el análisis repetitivo de un blanco. El blanco utilizado será
el reactivo para la determinación de proteínas totales séricas del kit de reactivo
Q
UI
M
IC
A
PROTI 2 y se llevarán a cabo 10 determinaciones.
BI
O
Robustez
Y
La robustez se determinará de acuerdo al diseño de Youden & Steiner, siendo las
IA
variables evaluadas: Temperatura de incubación, analista (2 analistas) y tiempo de
FA
RM
AC
reacción.
ANÁLISIS ESTADÍSTICO DE LOS RESULTADOS 12,14.
LINEALIDAD
DE
Cálculos para el test de Regresión
O
TE
CA
Fórmula empleada para el cálculo de la Pendiente o Coeficiente
de Regresión “b”.
BL
I
La pendiente b fue determinada empleando la fórmula siguiente:
BI
b
 xy 
x
2
 x y

n
 x 2
n
Donde:
x= Concentración de las muestras utilizadas.
y= Absorbancias obtenidas en las lecturas de las
muestras
n= Número de determinaciones.
10
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Fórmula empleada para el Cálculo del Intercepto “a”
Su determinación se hizo mediante la siguiente fórmula:
y  b x

a
n
Ecuación de la Recta de Regresión
Con los datos obtenidos en este procedimiento se procedió a
Q
UI
M
Donde:
IC
y  bx  a
A
elaborar la recta de regresión, la cual tuvo la siguiente fórmula:
y = Absorbancias obtenidas a partir de las lecturas de
BI
O
los estándares y muestras utilizadas.
Y
x = Concentración de las muestras utilizadas.
IA
b = Pendiente de la recta de regresión.
AC
a= Intercepto de la regresión lineal con el eje de
FA
RM
ordenadas.
Cálculo del Coeficiente de Correlación “r”
O
TE
CA
DE
Para su determinación se empleó la siguiente fórmula:
BI
BL
I
r 


x2



x
 xy   n
 x    y
 
 
n
y
2
 y
 
2
2

n




Cálculo del Coeficiente de Determinación “r2”
Se determinó mediante la siguiente fórmula:
r 2  (r )2
11
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Cálculos efectuados en el Test de Linealidad de la Pendiente b
Cálculo del valor de la varianza residual “ S 2y , x ”
Se la halló a través de la siguiente fórmula:
y  ay  bxy

2
2
y,x
S
n 2
A
Donde:
M
IC
b = Pendiente de la recta de regresión.
Q
UI
a = Intercepto con el eje de ordenadas.
BI
O
n = # de determinaciones.
Y
Cálculo del valor de la varianza de la pendiente b “ S 2b ”
S 2y , x
S 
2
b
x
2

( x ) 2
n
O
TE
CA
DE
FA
RM
AC
IA
Se determinó empleando la fórmula siguiente:
Cálculo del valor de la desviación estándar de la pendiente b
“ Sb ”
BI
BL
I
Se obtuvo a partir del valor de la varianza de la pendiente b ( S 2b )
mediante la siguiente fórmula:
Sb 
S 2b
Fórmula empleada para determinar el Intervalo de Confianza
de la Pendiente “b”
Se empleó la siguiente fórmula:
Int.Conf .  b  tSb
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Donde:
b = Pendiente.
t = ttab para un nivel de significancia del 95% yn-2
grados de libertad.
Sb = Desviación estándar de la pendiente.
Cálculos efectuados en el Test de Proporcionalidad
Cálculo de la Varianza del Término Independiente “ S a2 ”
A
Se utilizó la siguiente fórmula:
IC
x

2
Q
UI
2
b
M
S S
2
a
BI
O
n
Y
Fórmula empleada para determinar la Desviación Estándar del
AC
IA
Término Independiente “Sa”
Sa 
S a2
O
TE
CA
DE
fórmula:
FA
RM
Para determinar la Desviación Estándar se utilizó la siguiente
Fórmula empleada para determinar el Intervalo de Confianza
BL
I
del Intercepto “a”
BI
Para determinarla se aplicó la siguiente fórmula:
Int.Conf.  a  tSa
Donde:
a = Intercepto.
t = ttab para un nivel de significancia del 95% y n-2
grados de libertad.
Sa =Desviación estándar del intercepto
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Cálculo del valor de texp
El valor de texp se determinó empleando la siguiente fórmula:
b
Sb
t exp 
Donde:
b = Pendiente de la recta de regresión.
Sb = Desviación estándar de la pendiente b.
A
El método será lineal si, para la pendiente (b) texp es mayor al
M
IC
ttab y para el intercepto (a) texp es menor al ttab, con el 95% de
Q
UI
confianza y n-2 grados de libertad con el 95% de confianza y n2 grados de libertad y el coeficiente de correlación (r) es igual o
Y
BI
O
mayor que 0,990.
AC
Repetibilidad
IA
PRECISIÓN
FA
RM
Determinación de las concentraciones prácticas a partir de las
absorbancias. Los valores de las concentraciones prácticas se
DE
obtuvieron al empelar la fórmula elaborada a partir de la
BI
BL
I
O
TE
CA
ecuación de la recta obtenida en la curva de calibración:
x 
ya
b
Donde:
x = Concentración práctica
y = Absorbancia
b = Pendiente de la recta de regresión.
a = Intercepto de la regresión lineal con el eje
de ordenadas.
Determinación de la Media “ x ”
Se utilizó la fórmula siguiente:
n
x 14

xi
i 1
n
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Donde:
x  Media
n = Número de determinaciones
Determinación de la Desviación Estándar “s”
S
M
i1
 x
2
i
IC
 x
n
A
Para hallarla se empleó la fórmula siguiente:
BI
O
Q
UI
n 1
Y
Determinación del Coeficiente de Variación (CV)
AC
IA
Se hizo uso de la fórmula descrita a continuación:
FA
RM
CV 
Donde:
S * 100
x
x = Media
O
TE
CA
DE
s = Desviación Estándar
Determinación de los Intervalos de Confianza Individual y de la
BI
BL
I
Media.
Se hicieron uso de las siguientes fórmulas:
Intervalos de Confianza Individual
x  t tab * S
Donde:
x
Media
ttab=
Valor de t tablas para un 95% de
confianza y n-1 grados de libertad.
s = Desviación estándar
15
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Intervalo de Confianza de la Media
s
n
x  t tab *
Donde:
A
x  Media
IC
ttab= Valor de t tablas para un 95% de confianza
Q
UI
M
y n-1 grados de libertad.
s = Desviación Estándar
IA
Precisión Intermedia:
Y
BI
O
n = Número de determinaciones.
AC
Los valores de concentraciones prácticas, de la media, de la
FA
RM
desviación estándar, del coeficiente de variación y de los
Intervalos de Confianza se obtuvieron de manera idéntica que
DE
en el test de repetibilidad.
El método será preciso si en los procedimientos de Repetibilidad
O
TE
CA
y Precisión Intermedia se obtiene un coeficiente de variación
BL
I
menor al 2%.
EXACTITUD
BI
Cálculo de las concentraciones prácticas a partir de las
absorbancias
Las concentraciones fueron obtenidas mediante la siguiente fórmula,
obtenida a partir de la curva de calibración:
x 
ya
b
Donde:
x = Concentración práctica
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y = Absorbancia
Cálculo del Porcentaje de Recuperación
En la determinación de la exactitud del método los valores de las
concentraciones se expresaron como porcentaje de recuperación de la
siguiente forma:
cc. Pr áctica
 100
cc.Teórica
% Re cuperación 
A
Cálculos efectuados en la aplicación de la Prueba t Student
IC
Para la aplicación de esta prueba fue necesaria la
O
100  % R n
CV
Y
BI
texp 
Q
UI
M
determinación del valor de texp mediante la siguiente fórmula:
IA
Donde:
AC
% R = Valor del promedio de los % de
FA
RM
recuperación.
n = Nº de determinaciones.
DE
CV = Coeficiente de variación.
O
TE
CA
El método será exacto si el valor de ttab es mayor que el texp, al
95% de confianza y n-1 grados de libertad en la aplicación de la
BL
I
t Student.
BI
LÍMITE DE CUANTIFICACIÓN
Se obtuvo mediante la aplicación de la siguiente fórmula:
CLQ 
K  Sbl
b
Donde:
CLD =Límite de detección.
CLQ =Límite de cuantificación.
K
= Constante (3 para el límite de detección y
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10 para el límite de cuantificación).
b = Pendiente obtenida en el test de linealidad.
ROBUSTEZ
Se empleó el diseño de Youden & Steiner, el cual se muestra en
8
a
IC
a
A
B
M
Factor / Prueba
1
2
3
4
5
6
A/a
A
A
A
A
a
B/b
B
B
b
b
B
b
B
C/c
C
C
C
c
C
c
C
C
Resultado
s
t
u
v
x
y
Z
Q
UI
A
7
O
el siguiente esquema:
IA
Y
BI
w
AC
Siendo:
FA
RM
 A: Temperatura de reacción: 20°C.
 a: Temperatura de reacción: 37°C.
 B: Analista 1
DE
 b: Analista 2
O
TE
CA
 C: Tiempo de Reacción: 5 minutos.
 c: Tiempo de Reacción: 10 minutos.
 s, t, u, v, w, x, y, z: concentraciones de proteínas totales
BI
BL
I
determinadas en cada prueba.
A continuación se procederá a determinar las diferencias para cada
factor, empleando la fórmula siguiente:
VA = 1/4 (s+t+u+v) - (w+x+y+z)
VB = 1/4 (s+t+w+x) - (u+v+y+z)
VC = 1/4 (s+u+w+y) - (t+v+x+z)
Vx  S 2
Donde:
VA, VB, VC =Valor de las diferencias existentes entre las variables
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estudiadas.
Si V x  S 2 y la diferencia no es significativa, el método será
robusto para esa variable. (S = desviación estándar hallada en el
BI
BL
I
O
TE
CA
DE
FA
RM
AC
IA
Y
BI
O
Q
UI
M
IC
A
test de repetibilidad).
19
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II.
RESULTADOS
Cuadro 1: Parámetro de Linealidad de la validación del método analítico para
proteínas totales séricas en el laboratorio Quintanilla S.R.L.
Estimadores estadísticos
Criterio de
Resultado
Conformidad
r > 0,990
0,996719
Conforme
r2> 0,990
0,9934
Conforme
aceptación
Coeficiente de correlación
(r)
A
Coeficiente de
Resultado
O
Criterio de
Conformidad
BI
Estimadores estadísticos
Q
UI
M
IC
determinación (r2)
IA
Y
aceptación
AC
Test de verificación de la
de LC no incluye el LS= 0,043990
DE
a. Límite
FA
RM
pendiente
O
TE
CA
confianza (LC) cero
texp>ttabla
Conforme
texp= 44,4022
ttabla= 2,160
BL
I
b. Test de t
LI= 0,039909
Test de verificación de la
BI
variable independiente
a. Límite
LS= 0,009812
de
confianza (LC) LC incluye el cero
b. Test de t
texp < ttabla
LI= -0,015065
Conforme
texp= 0,4560
ttabla= 2,160
ttabla: 2,160 para: α = 0,05 y n-2 grados de libertad
Límite inferior (LI)
Límite superior (LS)
20
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IC
A
Gráfico 1: Recta de regresión obtenida en el test de Linealidad, empleado en la cuantificación de la Proteínas Totales.
BI
O
0.450
Y
0.400
AC
IA
0.350
M
0.300
FA
R
0.250
0.200
DE
ABSORBANCIAS
y = 0.0419x - 0.0026
R² = 0.9934
Q
UI
M
LINEALIDAD
CA
0.150
0.000
0.00
2.00
BI
0.050
BL
IO
TE
0.100
4.00
6.00
8.00
10.00
CONCENTRACION TEORICA
21
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12.00
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Cuadro 2: Parámetro de precisión de la validación del método analítico para determinar
proteínas totales séricas en el laboratorio Quintanilla S.R.L.
Estimadores estadísticos
Criterio de
aceptación
Resultado
Conformidad
Repetibilidad
C.V< 2 %
0,944314 %
Conforme
Precisión Intermedia
C.V< 2 %
0,7833 %
Conforme
A
Cuadro 3: Parámetro de exactitud de la validación del método analítico para determinar
t Student
t exp< t tab
Resultado
M
Criterio de
aceptación
Q
UI
Estimadores estadísticos
IC
proteínas totales séricas en el laboratorio Quintanilla S.R.L.
Conforme
Y
BI
O
0,4079 < 2,306
Conformidad
AC
IA
Cuadro 4: Límite de cuantificación de la validación del método analítico para
FA
RM
determinar proteínas totales séricas en el laboratorio Quintanilla S.R.L.
Parámetro
0,101 g / dL
DE
Límite de cuantificación
Resultado
O
TE
CA
Cuadro 5: Parámetro de robustez de la validación del método analítico para determinar
proteínas totales séricas en el laboratorio Quintanilla S.R.L
Criterio
de
aceptación
Factores
Resultado
Conformidad
Temperatura
de reacción
0,0345 < 0,099
Conforme
Analista
-0,019 < 0,099
Tiempo de
reacción
-0,012 < 0,099
BI
BL
I
Estimadores
estadísticos
Vx
Vx  S 2
Conforme
Conforme
IV .DISCUSIÓN
22
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En el presente trabajo se desarrolló la validación del método analítico para determinar
proteínas totales séricas en el laboratorio Quintanilla S.R.L. Los test a evaluar en un
estudio de validación de un método dependerán de la naturaleza del mismo. Para
determinar si el método empleado en la cuantificación de proteínas totales séricas
cumple con los criterios de validación, se evaluaron los siguientes test: Linealidad,
Precisión, Exactitud, Límite de cuantificación y Robustez.
La linealidad es la capacidad del método analítico para obtener resultados directamente
A
proporcionales a la concentración o cantidad del analito en un rango definido. Se
IC
determina mediante el tratamiento matemático de los resultados obtenidos en el análisis
Q
UI
M
del analito a diferentes cantidades o concentraciones. La selección del rango y del
número de puntos experimentales está estrictamente relacionada con la aplicación del
BI
O
método. La curva de regresión se determinó sobre los puntos individuales sin promediar
Y
por el método de los mínimos cuadrados. En el eje de las "x" apareció la cantidad o la
IA
concentración del analito y en el eje "y", la respuesta analítica (absorbancia), así como
AC
también la variable independiente (b) y la dependiente (a) 20.
Nº 01) demuestra el intervalo de
FA
RM
La linealidad del método evaluado (cuadro
concentración teórica comprendido entre 2,4-9,6 g/dL con un coeficiente de correlación
de 0,996719 y un coeficiente de determinación de 0,9934 (cercanos a la unidad) que
DE
indica la existencia de una proporcionalidad lineal entre las concentraciones de
O
TE
CA
proteínas totales respecto a la absorbancia, con un grado de probabilidad del 95%.
Además de obtener la ordenada al origen que pasa por cero con un α de 0,05;
de varianza.
BL
I
obteniéndose una diferencia altamente significativa de la regresión lineal en el análisis
BI
Según AEFI, Bioanalytical Methods Validation e ICH establecen para el test de
Linealidad, que el coeficiente de correlación debe ser mayor o igual r > 0,990. Los
valores obtenidos suponen una correlación aceptable con una probabilidad superior al
99,90%.14
Para confirmar que dicha regresión era lineal se aplicaron diferentes test de linealidad,
considerando el t Student, tal como se muestra en la cuadro Nº 1, para que cumpla con
los criterios de aceptabilidad según los organismos internacionales: texp> ttab, y valor del
texp (44,402211) obtenido es mucho mayor al ttab (2,16) (n-2= 13 grados de libertad) con
23
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un nivel de confianza del 95 %, con esto nos demuestra que el método cumple con el
test de linealidad.
También se observa en la ecuación resultante del test de linealidad para hallar las
concentraciones, la pendiente “b” indica la sensibilidad de calibración o del método y se
expresa en unidades de respuesta sobre unidades de concentración o cantidad del
analito. La sensibilidad analítica relaciona la aleatoriedad de la respuesta con la
aleatoriedad debida a la variación de la concentración, es inversamente proporcional a la
capacidad de detectar pequeñas diferencias en la concentración del analito, y se obtiene
IC
A
dividiendo la pendiente de la curva de calibración por la desviación estándar de las
M
respuestas en cada punto o concentración. Se considera que a mayor pendiente, mayor
Q
UI
sensibilidad y que mientras más pequeño sea el coeficiente de variación de la pendiente
O
mayor será la linealidad (coeficientes de variación de la pendiente mayores que el 5,0 %
Y
BI
indican falta de linealidad).14, 20
IA
El término “a” independiente u ordenada en el origen, Es el estimador que se relaciona
AC
con la presencia de interferencias o errores sistemáticos. El intervalo de confianza del
FA
RM
intercepto debe incluir al cero para cumplir con el requisito de proporcionalidad (como
se exige para el cumplimiento de la ley de Lambert-Beer en los métodos
DE
espectrofotométricos). 20
O
TE
CA
También podemos apreciar que en la concentración 9,6 g/dL los puntos están fuera de la
recta debido a que su concentración es amplia y hubo diluciones, si bien esta alejado
del promedio se considera que hubo error humano.
BL
I
En lo que respecta al test de precisión, expresa el grado de dispersión entre una serie de
BI
medidas de tomas múltiples a partir de una misma muestra homogénea en las
condiciones prescritas. El objetivo es conocer la variabilidad del método de ensayo, esta
variabilidad es debida a errores aleatorios inherentes a todo el método de ensayo. Como
consecuencia los análisis efectuados sobre muestras idénticas, en las mismas
circunstancias, no conducen generalmente a resultados idénticos. Los factores
susceptibles de influir sobre los resultados de un ensayo no pueden ser siempre
controlados (analista, equipo instrumental, reactivos, tiempo, etc.), de aquí la
importancia del estudio de la precisión.14
24
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La precisión se expresa matemáticamente por el coeficiente de variación, AEFI
establece que el coeficiente de variación sea menor que 2 %. En el caso de la
determinación de la repetibilidad, tal como se muestra en el cuadro Nº 2 se obtuvo un
coeficiente de variación igual a 0,944 %, siendo menor al valor máximo del criterio de
aceptación. 21
Referente a la precisión intermedia, estudia la variabilidad del método efectuando una
serie de análisis sobre la misma muestra pero en condiciones operativas diferentes
(diferentes analistas, aparatos, días, etc.) y en un mismo laboratorio. El cual se realizó
A
en diferentes días, en el cuadro Nº 02, se presenta un C.V.= 0,7833 % y lo establecido
Q
UI
M
IC
por la AEFI que sea menor al 2%.20
La exactitud indica la capacidad del método analítico para obtener resultados lo más
BI
O
próximos posibles al valor verdadero. A diferencia de la precisión, que refleja el error
Y
aleatorio, la exactitud refleja el error sistemático o la tendencia a él. Cuando existen
IA
interferencias en el método por falta de selectividad (desviación por exceso en los
AC
resultados), o cuando se trata de métodos analíticos muy laboriosos (desviación por
FA
RM
defecto en los resultados), el método se considera no exacto o biasado. Para asegurar
una buena exactitud, es necesario eliminar los errores que no están sujetos a tratamiento
estadístico (calibración o control incorrectos de equipos), los errores inherentes a
DE
blancos (errores constantes) y los que dependen de la cantidad del analito presente
O
TE
CA
(errores proporcionales). Ellos opinan que la mejor manera de identificar estos errores
será realizando una prueba interlaboratorio. 14,20
BL
I
Para determinar la exactitud, se obtuvo el porcentaje de recuperación media el cual fue
BI
de 99,7618 %, no existiendo diferencia significativa con el 100 %. En el cuadro Nº 03
se observa un texp = 0,41 que es menor al ttab = 2,306, teniendo como criterio de
aceptación que el ttab debe de ser mayor al texp, con esto el método cumple con el test
de exactitud.14
Límite de cuantificación es la mínima cantidad de un analito presente en la muestra que
podemos determinar con una precisión y exactitud adecuadas, se expresan
como
concentración del analito. En el cuadro Nº 04 se observa el Límite de cuantificación de
0,101 g/dL, siendo resultados óptimos y muy aceptados. 20
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Finalmente, la robustez, es la medida de su capacidad para permanecer inalterado ante
pequeñas pero deliberadas variaciones en ciertos parámetros, proporcionando idea de su
fiabilidad o estabilidad durante su empleo en rutina.
En el estudio, los cambios a los que fue sometido el método analítico, en concentración
de 9,6 g/dL fueron: la variación de analistas, tiempo de reacción (5 minutos y 10
minutos) y temperatura de reacción (20oC y 37oC). Se consideran como aceptables
aquellos valores absolutos de las diferencias obtenidas de acuerdo al diseño de Youden
& Steiner que sean menores o iguales al valor del producto de su desviación estándar
A
multiplicado por 2, en el cuadro Nº 05 se observa que el valor del producto de su
IC
desviación estándar multiplicado por 2 es 0,099, y los resultados obtenidos en cada
Q
UI
M
operación son de 0,0345; -0,019 y -0,012, siendo estos valores menores a 0,109.
Tomando en cuenta esto, se aprecia en los resultados que el método es robusto a las
O
variaciones de analistas, tiempo de reacción (5 minutos y 10 minutos) y temperatura de
Y
BI
reacción (20 oC y 37 oC). Al haberse comprobado experimentalmente que no hay
AC
BI
BL
I
O
TE
CA
DE
FA
RM
límites de temperatura establecidos.14, 21
IA
influencia de los factores estudiados recomienda la realización de este test dentro de los
26
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V .CONCLUSIONES

Se validó el método analítico para la cuantificación de proteínas totales séricas
utilizando el kit de reactivos Wiener Lab en el laboratorio Quintanilla S.R.L.

Se determinó los parámetros de validación del método analítico para la
cuantificación de proteínas totales sérica en el laboratorio Quintanilla S.R.L, siendo :
- Lineal, con un “r” = 0,996719 con valor del texp = 44,402211 obtenido
IC
A
un nivel de confianza del 95 %.
con
Q
UI
M
- Preciso, con coeficiente de variación igual a 0,944 % para repetibilidad y con
O
coeficiente de variación igual a 0,7833 % para precisión intermedia.
BI
- Exacto, con un porcentaje de recuperación media de 99,7618 % y texp = 0,407;
IA
Y
tiene un límite de cuantificación de 0,101g/dL.
AC
- Robusto, al emplear diferentes analistas, diferentes tiempos de reacción de 5 y
FA
RM
10 minutos y temperatura de reacción de 20oC y 37oC, cumpliendo con los
BI
BL
I
O
TE
CA
DE
parámetros de validación establecidos.
27
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UI
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BL
I
O
TE
CA
DE
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BI
O
Q
UI
M
IC
A
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BI
BL
I
O
TE
CA
DE
FA
RM
AC
IA
Y
ANEXOS
31
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Anexo Nº 1: Información sobre reactivos usados en el ensayo de Validación
Proti 2. Proteínas Totales
Lote
1105068760
Exp. /Venc.
05/2013
Estándar
Lote
Exp. /Venc.
068760
05/2013
3
1
2
BL
I
3
BI
Muestra
5
1
2
3
0.378
3.63
92
9.60
4.07
92
0.295
2.12
52
0.301
2.17
52
7.20
0.304
2.19
52
4.80
0.195
0.94
23
4.80
0.198
0.95
23
4.80
0.202
0.97
23
3.60
0.150
0.54
13
3.60
0.147
0.53
13
3.60
0.151
0.54
13
2.40
0.100
0.24
6
2.40
0.095
0.23
6
2.40
0.097
0.23
6
A
9.60
0.424
IA
AC
DE
1
O
TE
CA
Muestra
4
92
FA
RM
1
3
3.81
7.20
3
2
0.397
7.20
2
Muestra
3
9.60
BI
Muestra
2
X2
IC
2
XY
M
1
Absorbancia (Y)
Y
Muestra
1
g/dL (X)
O
Nº Repeticiones
Q
UI
Anexo Nº 2: Datos experimentales obtenidos en el test de Linealidad
32
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Anexo Nº 3: Datos experimentales de regresión lineal obtenidos en el test de
Linealidad, para la determinación cuantitativa de Proteínas Totales.
Parámetros de Regresión
Pendiente b
Intercepto a
Ecuación de la Recta
Coeficiente de Determinación (r2)
Resultado
0.041949
-0.02626
y = 0.0419x - 0.0026
0.9934
Anexo Nº 4: Datos experimentales para Linealidad de la Pendiente (b), obtenidos en el
IC
A
test de Linealidad, para la determinación cuantitativa de Proteínas Totales.
Resultado
Q
UI
M
Parámetros del Test de Linealidad de la
Pendiente
Varianza Residual ( s 2y , x )
O
0.000089
2
BI
Varianza de la Pendiente ( S b )
IA
Y
Desviación Estándar de la Pendiente ( Sb )
0.000945
Superior  0.043990
Inferior  0.039909
FA
RM
AC
Intervalo de Confianza de la Pendiente
8.92563E-07
Anexo Nº 5: Datos experimentales del Test de Proporcionalidad, obtenidos en ensayo
3.31605E-05
Desviación Estándar del Intercepto ( Sa )
0.005759
Intervalo de Confianza del Intercepto
Superior  0.009812
Inferior  -0.015065
BL
I
O
TE
CA
Parámetros del Test de Proporcionalidad
2
Varianza del Intercepto ( Sa )
BI
DE
de Linealidad, para la determinación cuantitativa de Proteínas Totales.
Resultado
33
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Anexo Nº 6: Datos experimentales obtenidos en el test de Repetibilidad
Absorbancias
Concentración
Teórica
Concentración
Práctica
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
0.318
0.311
0.307
0.311
0.307
0.310
0.309
0.312
0.311
0.312
7.2000
7.2000
7.2000
7.2000
7.2000
7.2000
7.2000
7.2000
7.2000
7.2000
7.64
7.48
7.38
7.48
7.38
7.45
7.43
7.50
7.48
7.50
O
Q
UI
M
IC
A
Muestra
Y
BI
Cuadro 7: Datos experimentales obtenidos en el test de Repetibilidad de Proteínas Totales.
FA
A
Superior  7.6311
Inferior  7.3119
BI
BL
IO
TE
CA
DE
Intervalos de
confianza
de la media
10
7.47
0.070555
Superior  8.1868
Inferior  6.7562
AC
I
RM
Nº de análisis
Media
Desviación Estándar
Intervalos de
confianza individual
1
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Anexo Nº 8: Datos experimentales obtenidos en el test de Precisión Intermedia
0.299
0.301
0.304
0.305
0.301
0.306
0.304
0.301
0.306
0.307
0.303
0.305
7.2000
7.2000
7.2000
7.2000
7.2000
7.2000
7.2000
7.2000
7.2000
7.2000
7.2000
7.2000
7.19
7.24
7.31
7.33
7.24
7.36
7.31
7.24
7.36
7.38
7.29
7.33
UI
M
IC
A
1
2
3
1
2
3
1
2
3
1
2
3
A
Y
Analista
2
Concentración
Práctica
Q
Analista
1
Concentración
Teórica
O
Analista
2
Absorbancias
BI
Analista
1
Muestra
BI
BL
IO
Muestra
3
Concentración
Práctica
0.295
0.301
0.304
0.195
0.198
0.202
0.100
0.095
0.097
7.20
7.20
7.20
4.80
4.80
4.80
2.40
2.40
2.40
7.09
7.24
7.31
4.71
4.78
4.88
2.45
2.33
2.37
FA
RM
Concentración
Teórica
DE
Muestra
2
Absorbancias
TE
CA
Muestra
1
Nº de
ensayo
1
2
3
1
2
3
1
2
3
AC
I
Anexo Nº 9: Datos experimentales obtenidos en el test de Exactitud
2
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Anexo Nº 10: Datos experimentales obtenidos en los test de Límite de detección y Límite
de cuantificación
Absorbancia
0.0000
0.0000
0.0000
0.0000
0.0000
0.0000
0.0000
0.0000
0.0000
0.0000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.001
0.000
0.000
0.001
0.000
M
IC
UI
O
Q
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
A
Concentración
4
A
3
5
6
7
8
Int.
Suli Irigoin
Int.
Cynthia Tello
Int.
Cynthia Tello
10
Minutos
05
Minutos
10
Minutos
20 º C
Int.
Suli Irigoin
05
Minutos
20 º C
Int.
Cynthia Tello
10
Minutos
20 º C
Int.
Cynthia Tello
05
Minutos
Tiempo de
Reacción
20 º C
Suli Irigoin
0.205
0.28
0.192
0.186
0.193
0.197
0.198
BI
BL
05
IOSuliInt.
Minutos
TEIrigoin
10
Int.CA
Analista
Minutos
DE
37 º C
F37Aº C
RM
AC
I
2
37 º C
Temperatura
de
Reacción
1
37 º C
Factor /
Ensayo
Y
BI
Anexo Nº 11: Datos experimentales obtenidos en el test de Robustez
Absorbancia
0.198
3
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Anexo Nº 12: Variables utilizadas en el test de Robustez
37 º C
20 º C
Int. Suli Irigoin
Int. Cynthia Tello
05 Minutos
25 Minutos
BI
BL
IO
TE
CA
DE
FA
RM
AC
I
A
Y
BI
O
Q
UI
M
IC
A
Temperatura de Reacción 1
Temperatura de Reacción 2
Analista 1
Analista 2
Tiempo de Reacción 1
Tiempo de Reacción 2
4
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