factor ii (protrombina) g20210a kit
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FACTOR II (PROTROMBINA) G20210A KIT Para uso con el equipo LightCycler® 1.2 (En la UE: número de serie 2021 a 5602) REF 03 610 195 001 Kit para 32 reacciones con un máximo de 30 muestras Para diagnóstico in vitro. ESTA APLICACIÓN NO DEBERÍA UTILIZARSE EN CANADÁ PORQUE EL EQUIPO LIGHTCYCLER® 1.2 CARECE DE LA LICENCIA DE USO COMO DISPOSITIVO MÉDICO. USO PREVISTO El kit Factor II (Protrombina) G20210A permite la detección y el genotipado de una mutación en un solo punto (G por A en la posición 20210) del gen del Factor II humano a partir de ADN aislado en sangre total periférica humana. El test se realiza en el equipo LightCycler® 1.2 mediante la técnica de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para la amplificación del ADN del Factor II, extraído de muestras clínicas, y la hibridación fluorogénica específica para la detección y el genotipado del ADN del Factor II amplificado. El test de Factor II (Protrombina) G20210A es una prueba de diagnóstico in vitro para la detección y el genotipado de la mutación G20210A del Factor II (Protrombina) que se utiliza como ayuda para el diagnóstico en la evaluación de los pacientes sospechosos de trombofilia. El test está diseñado para su uso en el equipo LightCycler® 1.2 (en la UE: número de serie 2021 a 5602) y con el programa LightCycler® 3.5. La preparación de la muestra debe realizarse según el procedimiento de trabajo descrito más adelante. EXPLICACIÓN DEL ENSAYO La trombofilia heredada predispone a un individuo a padecer trastornos trombóticos tales como la trombosis venosa, enfermedad cardiovascular que ocupa un tercer lugar en cuanto a frecuencia (1). La resistencia a la proteína C activada (PCA) se considera el trastorno de la coagulación más importante asociado a la trombosis venosa (1,2). En los pacientes con resultado positivo a la resistencia a la PCA o a la mutación del Factor V de Leiden debe considerarse la realización de un análisis genético molecular de las trombofilias más habituales con fenotipos solapados, para las que existen análisis [por ejemplo, el Factor II (Protrombina) G20210A variante] (2). Está presente en el 1–2% de la población general y su participación en el tromboembolismo venoso está comprobada (2). PRINCIPIO DEL TEST / RESUMEN Preparación de la muestra La preparación de la muestra puede realizarse manualmente o de forma automática mediante High Pure PCR Template Preparation Kit o en el equipo MagNA Pure LC utilizando MagNA Pure LC DNA Isolation Kit I. Detección 1. Un fragmento 165 bp del gen de Factor II se amplifica a partir del ADN genómico humano mediante cebadores específicos. 2. El amplicón se detecta mediante fluorescencia utilizando un par específico de sondas H. Las sondas H consisten en dos oligonucleótidos diferentes que se hibridan con una secuencia interna del fragmento amplificado durante la fase de annealing del ciclo de PCR. Una sonda está marcada en el extremo 5' con LightCycler® Red 640-N-hydroxy-succinimide ester (Red 640-NHS ester) y, para evitar la extensión, modificada en el extremo 3' por fosforilación. La otra sonda está marcada en el extremo 3' con fluoresceína. 3. Sólo tras la hibridación con las plantillas de ADN se ponen en contacto las dos sondas, originándose una transferencia de energía por resonancia de fluorescencia (FRET) entre los dos fluoróforos. Durante la FRET, la fluoresceína, fluoróforo donante, se excita por la fuente de luz del equipo LightCycler® 1.2, transfiriéndose parte de la energía de excitación al LightCycler® Red 640-NHS ester, fluoróforo receptor. 4. A continuación, el equipo LightCycler® 1.2 mide la fluorescencia del LightCycler® Red 640-NHS ester. Genotipado Las sondas H también se utilizan para determinar el genotipo mediante un análisis de curva de fusión una vez finalizados los ciclos de amplificación y cuando el amplicón está presente en alta concentración. • La sonda H marcada con Red 640 se une a un segmento no mutado de la secuencia objetivo, actuando como sonda de fijación. • La sonda H marcada con fluoresceína se liga al segmento mutado (sonda de mutación). Durante el análisis de la curva de fusión, el aumento de temperatura origina un descenso de la fluorescencia debido a que la sonda más corta (sonda de mutación) se disocia primero y los dos marcadores fluorescentes ya no están en las proximidades. Si existe la mutación G20210A del Factor II (Protrombina), el desapareamiento entre bases de la sonda de mutación con las de la secuencia objetivo desestabiliza la hibridación, por lo que el descenso en la fluorescencia ocurre a una temperatura inferior. No se produce desapareamiento entre bases en el genotipo normal o salvaje por lo que el heterodúplex de ADN presenta una temperatura de fusión superior (Tm). El genotipo heterocigótico muestra una combinación específica de propiedades. 1 REACTIVOS – SOLUCIONES DE TRABAJO 1. FIIG20210A MD Mix • <0,01% FIIG20210A cebador sense y cebador antisense • Brij 35 [Mezcla de detección de la mutación G20210A del Factor II (Protrombina)] • <0,01% FIIG20210A sonda H Red 640 • MgCl2 1 × 78 µl • <0,01% FIIG20210A sonda H con fluoresceína 2. FIIG20210A R Mix [Mezcla de reacción G20210A del Factor II (Protrombina)] 1 × 78 µl • Tampón Tris-HCl • <0,01% Taq ADN polimerasa, grado GMP • <0,07% dATP, dCTP, dGTP, dUTP, dTTP • Brij 35 • MgCl2 3. FIIG20210A CT [Plantilla de control G20210A del Factor II (Protrombina)] 1 × 50 µl <0,01% plantilla de control de ADN contiene plásmido: pF2 WT y pF2 MUT 4. FIIG20210A DIL [Diluyente G20210A del Factor II (Protrombina)] 1 × 1 ml H2O, grado PCR (también utilizado como control negativo para la amplificación) PRECAUCIONES Y ADVERTENCIAS Polimorfismo En el gen del Factor II existe una mutación adicional a la mutación FIIG20210A en la posición 20218 (p. ej., la mutación A20218G), mutación adicional que abarca la sonda de mutación. Este tipo de mutación rara es la que da lugar a resultados desconocidos después de realizar el genotipado. Normas de manipulación • PARA DIAGNÓSTICO IN VITRO. El uso de este producto debe limitarse al personal con experiencia en el empleo de técnicas de PCR. • Tome las precauciones generales necesarias para la manipulación de los reactivos de laboratorio. • Este test sólo debe utilizarse con sangre humana completa tratada con los anticoagulantes EDTA o citrato. La heparina puede interferir con la PCR y no debe utilizarse en este procedimiento. • El proceso de flujo de trabajo en el laboratorio debe guiarse por las buenas prácticas de laboratorio (GLP) y, además, ser realizado de forma unidireccional (p. ej., la preparación de la muestra, la preparación de la PCR y el procesado de la PCR con el equipo LightCycler® 1.2 debe llevarse a cabo por separado). • No mezcle reactivos de diferentes lotes o de distintas botellas de un mismo lote. Cierre todas las botellas justo después de su uso para evitar derrames o cambios en la concentración o el estado del tampón. Una vez abiertos, conserve todas las botellas y viales en posición vertical. • No mezcle reactivos de lotes distintos. • No utilice los kit con posterioridad a la fecha de caducidad. • Evite el contacto del tampón de lisis/unión y el tampón de lavado I del MagNA Pure LC DNA Isolation Kit I o del tampón de unión y el tampón de lavado del inhibidor del High Pure PCR Template Preparation Kit con la piel, los ojos o las membranas mucosas. En caso de contacto, lave inmediatamente la zona afectada con abundante agua. Pueden producirse quemaduras si se deja sin tratar. Si se producen salpicaduras de reactivos, diluya las manchas con agua antes de secarlas con un paño. • No permita que el tampón de lisis/unión del MagNA Pure LC DNA Isolation Kit I, que contiene tiocianato de guanidina, entre en contacto con soluciones de hipoclorito de sodio (lejía) u otras soluciones fuertemente ácidas. Tales mezclas pueden producir gases de alta toxicidad. Procedimientos de laboratorio • Todos los materiales de origen humano y todos los desechos resultantes deben considerarse potencialmente infecciosos. Limpie y desinfecte en profundidad todas las superficies de trabajo con los desinfectantes recomendados por las autoridades locales. • No coma, beba o fume en el área de trabajo del laboratorio. • No pipetee con la boca. • Utilice guantes protectores desechables, bata de laboratorio y protección ocular cuando manipule las muestras y los kit de reactivos. • Evite la contaminación microbiana y por nucleasa de los reactivos al extraer partes alícuotas de las botellas de reactivos. Se recomienda la utilización de pipetas estériles desechables. • Lávese a conciencia las manos después de manipular las muestras y los reactivos de las pruebas. Manipulación de desechos • Elimine los reactivos no utilizados y los desechos según las normativas del país, el estado o la localidad. • Existen disponibles, bajo pedido, hojas de datos de seguridad del material (MSDS) en las oficinas locales de Roche. Preparación de la muestra • Consulte las instrucciones de seguridad del boletín técnico del MagNA Pure LC DNA Isolation Kit I o el High Pure PCR Template Preparation Kit para obtener información sobre la manipulación y eliminación de desechos. • El MagNA Pure LC DNA Isolation Kit I o el High Pure PCR Template Preparation Kit deben almacenarse a temperatura ambiente (+15°C a +25°C). Agite el tampón de lisis/unión para disolver los precipitados antes de utilizarlo con el MagNA Pure LC DNA Isolation Kit I. No almacene estas sustancias por debajo de la temperatura ambiente. • Utilice sólo el MagNA Pure LC Medium Reagent Tub 20 (nº de catálogo 03 004 058 001) o el MagNA Pure LC Reagent Tub (large) [nº de catálogo 03 004 040 001] en la posición respectiva indicada en el equipo MagNA Pure LC para este procedimiento. Amplificación y detección • Consulte el Manual de usuario del equipo LightCycler® 1.2 antes de utilizar este kit. • Cree un registro escrito relacionando el identificador del carrusel del LightCycler®. Tal registro debe incluir la posición del carrusel de muestras del LightCycler®, el número del capilar y el nombre asociado a cada muestra para asegurar una correcta identificación de las mismas. • Compare la configuración específica del equipo Factor II (G20210A) que aparece en la pantalla de programación del equipo LightCycler® 1.2 inmediatamente después de encenderlo o, como máximo, justo antes de utilizar el equipo LightCycler® 1.2, para comprobar si coincide con la configuración impresa en la última página de este boletín técnico. (Tabla 2) • No toque la superficie de los capilares. Utilice siempre guantes para manipularlos. Precauciones de manejo del equipo LightCycler® 1.2 • Cumpla todas las normas generales de seguridad que se aplican al uso de aparatos eléctricos. • No toque nunca los interruptores o el cable de alimentación con las manos húmedas. • No abra la carcasa del equipo. • No limpie nunca el equipo sin haberlo apagado ni haber desconectado el cable de alimentación. Nota: las operaciones de reparación o mantenimiento de la unidad debe realizarlas exclusivamente el personal de servicio técnico cualificado. • No abra la cámara térmica durante el funcionamiento. • La tapa de la cámara y el carrusel de muestras alcanzan elevadas temperaturas durante el funcionamiento del equipo. 2 Seguridad eléctrica para el equipo LightCycler® 1.2 • El equipo LightCycler® 1.2 se ha diseñado de conformidad con la Clase de protección I (CEI). • Si el cable de alimentación presenta grietas, zonas peladas, roturas u otro tipo de desgaste, debe sustituirse inmediatamente por otro equivalente de Roche Diagnostics. Mantenimiento del equipo LightCycler® 1.2 Mantenimiento general Consulte el Manual de usuario del equipo LightCycler® 1.2. Instrucciones de limpieza • No vierta fluidos en la cámara térmica. • La manipulación y eliminación de material infeccioso debe realizarse de acuerdo con las normativas de seguridad locales. • Limpie la carcasa del equipo con un detergente comercial suave. Si es preciso, utilice etanol al 70% para desinfectar la carcasa del equipo. • En caso de ruptura de capilares, limpie el carrusel de muestras del LightCycler® con los cepillos suministrados para eliminar los fragmentos restantes. Mantenimiento preventivo Revise la zona alrededor del equipo con regularidad para asegurar que el flujo de aire alrededor del mismo no está limitado y que no hay libros, papeles u otros accesorios que obstaculicen el flujo de aire. Estación de trabajo del LightCycler® La configuración de la estación de trabajo puede variar de un país a otro y cambiar según la disponibilidad de los componentes y los avances técnicos. Para confirmar la configuración exacta del ordenador y solicitar asistencia técnica, póngase en contacto con su representante local de Roche. MANIPULACIÓN DE REACTIVOS 1. FIIG20210A MD Mix (tapón amarillo, vial 1), listo para utilizar 2. FIIG20210A R Mix (tapón rojo, vial 2), listo para utilizar 3. FIIG20210A CT (tapón púrpura, vial 3), listo para utilizar 4. FIIG20210A DIL (tapón incoloro, vial 4), listo para utilizar Conservar entre -15°C y -25°C Mantener protegido de la luz Conservar entre -15°C y -25°C Conservar entre -15°C y -25°C Conservar entre -15°C y -25°C • • • • • CONSERVACIÓN / ESTABILIDAD (REACTIVOS) • El kit sin abrir debe conservarse entre -15°C y -25°C hasta la fecha de caducidad impresa en la etiqueta. • Mantenga el FIIG20210A MD Mix (vial 1, tapón amarillo) protegido de la luz solar. • Descongele los componentes del kit Factor II (Protrombina) G20210A, mézclelos suavemente y consérvelos en hielo. • Congele los componentes justo después de su uso. • Los reactivos del kit pueden congelarse y descongelarse hasta cinco veces. RECOGIDA DE MUESTRAS / PREPARACIÓN Y ESTABILIDAD Para la preparación de ADN genómico a partir de sangre humana, realice una purificación del ácido nucleico mediante el High Pure PCR Template Preparation Kit (nº de catálogo 11 796 828 001) o el MagNA Pure LC DNA Isolation Kit I (nº de catálogo 03 003 990 001) en combinación con el equipo MagNA Pure LC (nº de catálogo 12 236 931 001) como se describe más adelante. • La sangre periférica humana tratada con anticoagulantes como EDTA o citrato es estable durante 7 días como mínimo a una temperatura de +2°C a +8°C. Puede conservarse congelada a -20°C durante un máximo de 12 meses y descongelarse una vez. • El ADN eluído puede conservarse en un frasco de muestras cerrado o en tubos Sarstedt de tapón de rosca entre +2°C y +8°C durante 7 días como máximo. Puede conservarse estable (durante 3 semanas aproximadamente) entre -15°C y -25°C. El ADN eluído puede congelarse y descongelarse hasta tres veces. MATERIALES SUMINISTRADOS Consulte la sección “Reactivos – soluciones de trabajo” en la página 2. MATERIALES Y DISPOSITIVOS NECESARIOS PERO NO SUMINISTRADOS • Equipo MagNA Pure LC (nº de catálogo 12 236 931 001) • Equipo LightCycler® 1.2 (UE: número de serie 2021 a 5602 nº de catálogo 12 011 468 001) • Programa MagNA Pure 3.011 o posterior (nº de catálogo 03 322 025 001) • MagNA Pure LC DNA Isolation Kit I (nº de catálogo 03 003 990 001) Nota: para EE.UU. se pueden utilizar números de catálogo distintos. Póngase en contacto con la oficina de ventas en EE.UU. para • Centrífuga del carrusel del LC [nº de catálogo 12 189 682 001 (230 V) conocer más detalles. ó 03 030 512 001 (115 V)]. Para realizar nuevas compras, solicite la ® • Programa LightCycler 3.5 (nº de catálogo 11 909 304 001) centrífuga del carrusel del LightCycler 2.0 [nº de catálogo • Capilares del LightCycler® (20 µl) (nº de catálogo 11 909 339 001) 03 709 582 001 (230 V) ó 03 709 507 001 (115 V)]. En este caso, • High Pure PCR Template Preparation Kit (nº de catálogo 11 796 828 001) la centrífuga del carrusel del LightCycler 2.0 con la versión 2.1 del cubo (nº de catálogo 03 724 689 001)* también es necesaria. • Tubos de microcentrífuga de 1,5 ml, estériles y libres de nucleasa • Tubos Sarstedt con tapón de rosca, estériles de 1,5 ml • Etanol p.a. *Consulte el Manual de usuario del equipo LightCycler® 1.2, o póngase en contacto con el servicio técnico para obtener especificaciones de • Isopropanol p.a. • H2O, bidestilada, estéril, sin nucleasa centrífugas equivalentes si la centrífuga del carrusel del LightCycler no estuviera disponible. En este caso, también se requieren adaptadores para capilares LightCycler® (nº de catálogo 11 909 312 001). MATERIAL OPCIONAL • CD de protocolos de post-elución Thrombophilia Post-Elution Protocols CD (nº de catálogo 04 378 784 001) • Lector de códigos de barras MagNA Pure LC Quick Scan 1000 (nº de catálogo 03 186 580 001) • Impresora de códigos de barras MagNA Pure LC TLP 2844 (nº de catálogo 03 576 094 001) • Etiquetas de códigos de barras de MagNA Pure LC (nº de catálogo 03 531 520 001) • Cinta de impresora de códigos de barras MagNA Pure LC (nº de catálogo 03 531 538 001) • Bloque de refrigeración MagNA Pure LC, carrusel de muestras del LightCycler (nº de catálogo 12 189 704 001) • Dispositivo para taponar capilares (Capping Tool) del LightCycler® (nº de catálogo 03 357 317 001) • Equipo general de laboratorio 3 PROCEDIMIENTO DEL ENSAYO ➀ Procedimiento automático para la preparación de 15 a 30 muestras mediante el MagNA Pure LC DNA Isolation Kit I (nº de catálogo 03 003 990 001) junto con el equipo MagNA Pure LC (nº de catálogo 12 236 931 001) A. PURIFICACIÓN Antes de empezar Comience preenfriando el bloque de refrigeración MagNA Pure LC, el carrusel de muestras del LightCycler (nº de catálogo 12 189 704 001) en un refrigerador entre +2°C y +8°C (durante 2 horas como mínimo). Puesta en marcha del equipo y el programa MagNA Pure LC 1. Encienda el equipo MagNA Pure LC y, a continuación, el ordenador. 2. Inicie el programa MagNA Pure LC. En la pantalla Main Menu, haga clic en el botón Sample Ordering. 3. En la pantalla Sample Ordering, seleccione el protocolo DNA I Blood Cells Fast y, a continuación, introduzca los números de lote del MagNA Pure LC DNA Isolation Kit I (nº de catálogo 03 003 990 001) y del kit Factor II (Protrombina) G20210A. Después, introduzca el identificador del carrusel del LightCycler® (no cambie ningún otro parámetro). 4. Introduzca el control negativo (FIIG20210A DIL, vial 4, tapón incoloro) en la fila 1 de la tabla de orden de muestras (posición A1) escribiendo “Negative Control”. Introduzca 50 µl como valor para el volumen de muestras y 0 µl como valor para el volumen de dilución (valor predeterminado). El volumen de elución viene predeterminado con un valor de 100 µl. 5. Comenzando por la fila 1 (posición B1), escriba los nombres de las muestras o utilice el lector de códigos de barras de MagNA Pure LC (opcional). Introduzca 50 µl como valor para el volumen de muestras y 0 µl como valor para el volumen de dilución (valor predeterminado). El volumen de elución viene predeterminado con un valor de 100 µl. 6. Guarde e imprima la información del archivo de orden de muestras. 7. Utilice la función Print Sample Names para imprimir una copia con los nombres de las muestras y su posición correcta en el cartucho de la muestra. (Opcional) 8. Imprima las etiquetas de código de barras de los cartuchos (Cartridge Barcode) por triplicado. (Opcional) 9. Coloque las etiquetas de códigos de barras en los cartuchos de muestras (para la elución) y las impresiones. (Opcional) 10. Haga clic en Stage Setup. Preparación de la solución de Proteinasa K (suficiente para 32 muestras) 1. Añada 3 ml de tampón de elución (botella 6, tapón amarillo) en un vial de proteinasa K, liofilizada (vial 4, tapón rosa). Una vez completada la disolución de la proteinasa K, añada 2 ml adicionales de tampón de elución hasta alcanzar un volumen final de 5 ml. 2. Cierre el vial y mézclelo bien. Nota: si la solución reconstituida no va a utilizarse en el mismo día, consérvela entre +2°C y +8°C en el vial 4 (hasta 4 semanas). El resto de los reactivos están listos para ser utilizados. Carga de reactivos y material plástico desechable Nota: • no utilice MagNA Pure LC Tub 30. Utilice sólo MagNA Pure LC Medium Reagent Tub 20 (nº de catálogo 03 004 058 001) o MagNA Pure LC Reagent Tub (large) [nº de catálogo 03 004 040 001] en sus posiciones respectivas indicadas en el equipo MagNA Pure LC para este procedimiento. • El estado de la unidad de calentamiento Heat Unit y las de enfriamiento Cool Units 1 & 2 debe mostrar el valor PASS antes de poder llenar los tubos de reactivos respectivos con las partículas magnéticas de cristal (MGP). 1. Rellene manualmente los tubos de reactivos (fuera del equipo MagNA Pure LC) con los volúmenes indicados en la pantalla Start Information (según el gráfico Stage Layout), y a continuación ciérrelos con los tapones para tubos de reactivos y precintos correspondientes. Coloque los tubos de reactivos en la bandeja de reserva de reactivos en la posición indicada en la pantalla Start Information [excepto la suspensión de MGP, consulte el paso 4]. 2. Sitúe los materiales plásticos desechables adicionales necesarios (según se indica) y la bandeja de reserva de reactivos preparada en la fase de reactivo/muestra siguiendo la información de la pantalla Start Information. 3. Transfiera manualmente 50 µl de sangre total periférica humana, anticoagulada con EDTA o citrato, resuspendida directamente en las muestras al cartucho de muestra (fuera del equipo MagNA Pure LC) según la lista de orden de muestras. 4. Inmediatamente antes de iniciar el procesado, agite bien el vial con las partículas magnéticas, llene un tubo de reactivos con las partículas MGP, ciérrelo con la correspondiente tapa de los tubos de reactivos y colóquelo en la bandeja de reactivos/muestras del equipo en la posición especificada en la pantalla Start Information. 5. Coloque el cartucho de muestras en el equipo MagNA Pure LC. Proceso de purificación 1. Confirme todas las posiciones cargadas en el equipo MagNA Pure LC haciendo clic con el ratón en la pantalla (pantalla Start Information). Una vez confirmados todos los elementos aparecerá el botón OK. 2. Retire los precintos de las tapas de los tubos, cierre la barra de bloqueo y la puerta del equipo MagNA Pure LC. 3. Haga clic en el botón OK para iniciar el proceso. Aparece la pantalla Batch Status y una línea púrpura que se desplaza de izquierda a derecha para indicar el progreso real del proceso de aislamiento. 4. Una vez finalizado el proceso aparecerá la pantalla Result. 5. Guarde e imprima la pantalla Result. 6. También puede seleccionar la función Open Post-Elution en el menú Action. En caso contrario, continúe con el paso B del capítulo 2 (preparación manual de muestras) de este boletín técnico. 7. Si la extracción de MagNA Pure no se realiza correctamente para una muestra concreta (lo que se indica en la pantalla Result), deberá volver a extraer la muestra correspondiente. Si no puede realizar la función posterior a la elución, continúe con el paso B del capítulo 2 (preparación manual de muestras) de este boletín técnico y utilice las muestras que se extrajeron o reextrajeron inicialmente de forma correcta. 4 B. POST-ELUCIÓN (Opcional) Antes de empezar En el equipo LightCycler® 1.2: introduzca los ajustes específicos para el equipo Factor II (Protrombina) G20210A en la pantalla Programming del equipo LightCycler® 1.2 según las instrucciones de la tabla 2 que figura en la última página de este boletín técnico. Procedimiento posterior a la elución (Opcional) 1. Compruebe que el bloque de refrigeración MagNA Pure LC y el carrusel de muestras del LightCycler están en su lugar y se han enfriado previamente (es decir, refrigerados entre +2°C y +8°C durante 2 horas como mínimo). 2. Cargue el protocolo de post-elución denominado Thrombophilia 15 or 30 samples desde el CD Thrombophilia Post-Elution Protocols (nº de catálogo 04 378 784 001). 3. Preparación de la mezcla principal (únicamente para el procedimiento posterior a la elución) • Prepare sólo la cantidad requerida inmediatamente antes de utilizarla. • Descongele los componentes del kit Factor II (Protrombina) G20210A, mézclelos suavemente y consérvelos en hielo. • Coloque un capilar LightCycler® por muestra de ADN y uno adicional para cada control en el carrusel del LightCycler®, es decir, 17 capilares para 15 muestras o 32 capilares para 30 muestras, respectivamente. • Prepare la mezcla principal: Paso Acción 1 En un tubo Sarstedt con tapón de rosca de 1,5 ml en hielo, añada los siguientes componentes en el orden indicado a continuación (ejemplos para 15 ó 30 muestras): Reactivos – soluciones de trabajo Volumen* / 15 muestras Volumen* / 30 muestras FIIG20210A DIL, vial 4 209 µl 396 µl FIIG20210A MD Mix, vial 1 38 µl 72 µl FIIG20210A R Mix, vial 2 38 µl 72 µl Volumen total 285 µl 540 µl * estos volúmenes incluyen márgenes de controles y pipeteo 2 • Mezcle suavemente. • Compruebe que no queden burbujas de aire en la punta del tubo. 3 Coloque el tubo que contiene la mezcla principal en el bloque de refrigeración MagNA Pure LC, en la posición 1. Después, retire la tapa del tubo. C. 4. Sitúe el carrusel del LightCycler®, con los capilares indicados en el protocolo de post-elución, en el bloque de refrigeración y coloque la cantidad necesaria de puntas de pipeta tal como se indica en la pantalla del equipo MagNA Pure LC. 5. Abra el FIIG20210A CT (vial 3, tapón púrpura), pipetee 25 µl en un nuevo tubo Sarstedt con tapón de rosca de 1,5 ml y sitúelo en el bloque de refrigeración MagNA Pure LC, en la posición 16, tal como se indica en el protocolo de post-elución. Nota: • centrifugue el vial que contiene el FIIG20210A CT para sedimentar su contenido antes de abrirlo. • Compruebe que no queden burbujas de aire en la punta del tubo. • Cámbiese de guantes tras manipular la plantilla de control. 6. Cierre el equipo y haga clic en Start y OK para iniciar el pipeteo automático. Una vez finalizada la post-elución, aparece la pantalla Post-Elution Result. 7. Imprima el código de barras del bloque de refrigeración por triplicado. (Opcional) 8. Guarde e imprima la tabla de resultados de post-elución (Save and Print Post-Elution) e identifique la copia impresa con una etiqueta de código de barras del bloque de refrigeración. (Opcional) 9. Etiquete un disquete vacío con el nombre de la serie de purificación o un código de barras del bloque de refrigeración. Cree un archivo LightCycler® SAM (Sample Pattern File) en el disquete. 10. Cierre cada capilar con el dispositivo para taponar capilares (Capping Tool) del LigthCycler (nº de catálogo 03 357 317 001). 11. Identifique el carrusel del LightCycler® con un código de barras del bloque de refrigeración. (Opcional) 12. Coloque el carrusel del LightCycler® en el cubo del rotor de la centrífuga del carrusel del LightCycler. 13. Introduzca el cubo del rotor, incluido el carrusel del LightCycler®, en la centrífuga del carrusel del LightCycler. Nota: si no dispone de una centrífuga del carrusel del LightCycler, utilice una centrífuga de mesa de trabajo con adaptadores para capilares LightCycler® y centrifugue a 735 × g como máximo durante 30 segundos. 14. Pulse Start para iniciar el proceso de la centrífuga del carrusel del LightCycler. 15. Después de la centrifugación, introduzca el carrusel del LightCycler® en el equipo LightCycler® 1.2. Nota: conserve el ADN eluído entre +2°C y +8°C durante un período máximo de siete días o entre -15°C y - 25°C para almacenarlo durante períodos más largos (aproximadamente 3 semanas). Si no utiliza el protocolo de post-elución con MagNAPure LC, continúe con el paso B del capítulo 2 (Preparación manual de muestras) para realizar la preparación de la mezcla principal mediante PCR. 16. Si no va a realizar más series con MagNA Pure, apague el ordenador para el MagNA Pure LC y el equipo MagNA Pure LC. AMPLIFICACIÓN Y DETECCIÓN Equipo LightCycler® 1.2 1. Si se ha etiquetado (paso B.11), retire la etiqueta de código de barras del carrusel del LightCycler®. (Opcional) 2. Coloque el carrusel en el equipo LightCycler® 1.2. 3. Haga clic en Open Experiment File. Elija el experimento con los Ajustes del equipo que se describen en la página 9. Configure la opción Display Mode en el canal de detección F2. 4. Haga clic en el botón Edit Samples de la pantalla Programming para entrar en la pantalla Sample Loading. 5. Haga clic en Run. 6. Si se utiliza un archivo SAM creado anteriormente (paso B.9), inserte el disquete que contiene el archivo SAM en el equipo LightCycler® 1.2. (Opcional) 7. En la barra de menús de la pantalla Loading, seleccione la lista File/Load MagNA Pure LC. Seleccione el archivo de patrones de muestra (archivo SAM) de MagNA Pure LC y haga clic en Open para cargar los datos. (Opcional) 8. Introduzca un tipo de muestra negativo escribiendo negative como tipo de muestra para la posición nº 1 del carrusel. 9. Introduzca un tipo de muestra positivo escribiendo positive como tipo de muestra para la posición nº 2 del carrusel. 10. Haga clic en Done para volver a la pantalla Programming. 11. Haga clic en Save Experiment File. 12. Haga clic en Run para iniciar el proceso. 13. Una vez que el proceso haya finalizado, realice el análisis de la curva de fusión (Melting Curve) para obtener el genotipo del ADN genómico humano. 5 ➁ A. Procedimiento de preparación manual de muestras para una muestra utilizando el High Pure PCR Template Preparation Kit (nº de catálogo 11 796 828 001) PURIFICACIÓN Antes de empezar Enfríe previamente los adaptadores para capilares LightCycler® en un refrigerador entre +2°C y +8°C (durante 2 horas como mínimo). Preparación de las soluciones de trabajo Reactivo Reconstitución/preparación de la solución de trabajo Proteinasa K (vial 3, tapón rosa) Tampón de lavado del inhibidor (vial 4a, tapón negro) Tampón de lavado (vial 4, tapón azul) Disuelva la proteinasa K en 4,5 ml de agua bidestilada y alicuote la solución. Añada 20 ml de etanol al tampón de lavado del inhibidor. Nota: marque y feche la botella después de añadir el etanol. Almacenamiento y estabilidad de la solución de trabajo Conservar entre -15°C y -25°C. Estable durante 12 meses. Conservar entre +15°C y +25°C. Estable hasta la fecha de caducidad impresa en la etiqueta del kit. Añada 80 ml de etanol al tampón de lavado. Nota: marque y feche la botella después de añadir el etanol. Conservar entre +15°C y +25°C. Estable hasta la fecha de caducidad impresa en la etiqueta del kit. Procedimiento de purificación Nota: asegúrese de seguir rigurosamente el procedimiento descrito a continuación y no el procedimiento que figura en el boletín técnico del High Pure PCR Template Preparation Kit. 1. Vierta una parte alícuota de 200 µl de tampón de elución por muestra en tubos de ensayo estériles de 1,5 ml, cierre los tubos y realice un precalentamiento a +70°C. 2. A 200 µl de sangre total periférica humana resuspendida tratada con anticoagulante EDTA o citrato se añaden: • 200 µl de tampón de unión (tapón verde) • 40 µl de proteinasa K (reconstituida) • Mezcle inmediatamente la solución con vórtex e incúbela a +70°C durante 10 minutos. 3. Añada 100 µl de isopropanol y mezcle bien mediante vórtex. 4. Pipetee la mezcla de la muestra en el depósito superior de un conjunto de filtro de tubo High Pure y tubo de recogida. 5. Centrifugue durante 1 minuto a 6.000 × g en una centrífuga de mesa de trabajo estándar. 6. Deseche el líquido obtenido y el tubo de recogida. 7. Inserte el filtro de tubo en un nuevo tubo de recogida. 8. Añada 500 µl del tampón de lavado del inhibidor (tapón negro) al depósito superior. 9. Centrifugue durante 1 minuto a 6.000 × g. 10. Deseche el líquido obtenido y el tubo de recogida. 11. Inserte el filtro de tubo en un nuevo tubo de recogida. 12. Añada 500 µl de tampón de lavado (tapón azul) al depósito superior. 13. Centrifugue durante 1 minuto a 6.000 × g. 14. Deseche el líquido obtenido y el tubo de recogida. 15. Inserte el filtro de tubo en un nuevo tubo de recogida. 16. Añada 500 µl de tampón de lavado (tapón azul) al depósito superior. 17. Centrifugue durante 1 minuto a 6.000 × g. 18. Deseche el líquido. 19. Inserte el filtro de tubo en el mismo tubo de recogida. 20. Centrifugue durante 10 segundos a velocidad máxima (13.000 × g o superior) para extraer el tampón de lavado residual. 21. Deseche el tubo de recogida. 22. Inserte el filtro de tubo en un tubo de ensayo limpio de 1,5 ml. 23. Añada los 200 µl del tampón de elución precalentado (+70°C) al filtro de tubo. 24. Centrifugue durante 1 minuto a 6.000 × g. El tubo de microcentrifugado contiene ahora el ADN eluído. B. PREPARACIÓN DE LA MEZCLA PRINCIPAL Antes de empezar Introduzca los ajustes específicos para el equipo Factor II (Protrombina) G20210A en la pantalla Programming del equipo LightCycler® 1.2 según las instrucciones de la tabla que figura en la última página de este boletín técnico. Preparación de la mezcla principal 1. Descongele los componentes del kit Factor II (Protrombina) G20210A, mézclelos suavemente y consérvelos en hielo. 2. Coloque un capilar LightCycler® por muestra de ADN y uno adicional para cada control en los adaptadores para capilares LightCycler® refrigerados previamente. 3. Prepare la mezcla principal multiplicando la cantidad que aparece en la columna “Volumen/reacción” por el número de reacciones que se procesarán (es decir, muestras de ADN y controles positivos y negativos), más una reacción adicional. Proceda como se describe a continuación para una reacción estándar de 20 µl. 6 Paso Acción 1 En un tubo de ensayo de 1,5 ml en hielo, añada los siguientes componentes en el orden indicado a continuación: Reactivos – soluciones de trabajo Volumen/reacción FIIG20210A DIL, vial 4 11 µl FIIG20210A MD Mix, vial 1 2 µl FIIG20210A R Mix, vial 2 2 µl Volumen total 15 µl 2 3 4 5 6 7 8 9 C. • Mezcle suavemente. • Pipetee 15 µl de la mezcla principal en cada capilar LightCycler® preenfriado. • Compruebe la identidad de la lista de muestras (capítulo 1, A7, impresión) con el cartucho de muestras correspondiente comparando los números de código de barras (opcional). • Añada 5 µl de muestra de ADN aislado o 5 µl de FIIG20210A CT (vial 3, tapón púrpura) como control positivo o 5 µl de FIIG20210A DIL (vial 4, tapón incoloro) como control negativo. Cierre cada capilar con el dispositivo para taponar capilares (Capping Tool) del LightCycler (nº de catálogo 03 357 317 001). Si utiliza la centrífuga del carrusel del LightCycler, siga con el paso 5. Si utiliza una centrífuga de mesa de trabajo equivalente (como la Biofuge 13 de Heraeus Instruments o la de Kendro Laboratory Products), coloque cada capilar en los adaptadores para capilares LightCycler® correspondientes previamente enfriados y lleve a cabo los siguientes pasos: • Coloque los adaptadores en la centrífuga de mesa de trabajo. • Centrifugue a una velocidad máx. de 735 × g durante 30 segundos. • Continúe con el paso 5. Coloque el capilar que contiene el control negativo en la posición 1 y el capilar con el control positivo en la posición 2 del carrusel del LightCycler®. Empezando por la posición 3, coloque los capilares que contienen las muestras de ADN en el carrusel del LightCycler®. Introduzca el cubo del rotor, incluido el carrusel del LightCycler®, en la centrífuga del carrusel del LightCycler. Pulse Start para iniciar el proceso de la centrífuga del carrusel del LightCycler. Después de la centrifugación, introduzca el carrusel del LightCycler® en el equipo LightCycler® 1.2. AMPLIFICACIÓN Y DETECCIÓN Equipo LightCycler®1.2 1. Coloque el carrusel en el equipo LightCycler® 1.2. 2. Haga clic en Open Experiment File. Elija el experimento con los Ajustes del equipo que se describen en la página 9. Configure la opción Display Mode en el canal de detección F2. 3. Haga clic en el botón Edit Samples para entrar en la pantalla Sample Loading. 4. Haga clic en Run. 5. Introduzca los nombres de las muestras y el tipo de muestra en la pantalla Sample Loading, según el esquema real de carga de muestras. 6. En la barra de menús de la pantalla Loading, seleccione File/Save As/ y escriba un nombre para el archivo de patrones de muestra. La información de la muestra se guarda en un archivo independiente que se ubica en la carpeta User/Protocol. 7. Haga clic en Done para volver a la pantalla Programming. 8. Haga clic en Save Experiment File. 9. Haga clic en Run para iniciar el proceso. 10. Una vez que el proceso haya finalizado, realice el análisis de la curva de fusión (Melting Curve) para obtener el genotipo del ADN genómico humano. CALIBRACIÓN DEL EQUIPO No es necesario realizar ninguna calibración. CONTROL DE CALIDAD Para realizar un genotipado inequívoco, se deben analizar con cada lote de muestras el control negativo FIIG20210A (FIIG20210A DIL, vial 4, tapón incoloro) en la posición 1 y el control positivo FIIG20210A (FIIG20210A CT, vial 3, tapón púrpura) en la posición 2 del carrusel del LightCycler®. Nota: el valor recomendado para el Crossing Point (cp) de umbral es 31; cualquier resultado de genotipado por encima de este valor debe considerarse erróneo. Los Crossing Point pueden visualizarse después de completar los ciclos de amplificación haciendo clic en el botón Quantification de la pantalla Data Analysis Front, que permite pasar a la pantalla Quantification. Esto se aplica únicamente a muestras mutantes salvajes y heterocigóticas. Debido al diseño del ensayo, las muestras mutantes homocigóticas no muestran un valor cp. Para la identificación positiva de un mutante homocigótico, compruebe detenidamente que el control negativo no muestra un perfil de curva de fusión. Control negativo: El análisis de la curva de fusión del control negativo debe mostrar siempre un resultado negativo. De lo contrario, el proceso no será válido y se deberá repetir por completo (preparación de la muestra, amplificación y detección). Si el control negativo siempre obtiene un resultado no negativo, póngase en contacto con su representante local de Roche para solicitar asistencia técnica. Control positivo: El análisis de la curva de fusión del control positivo FIIG20210A (FIIG20210A CT, vial 3, tapón púrpura) debe mostrar siempre dos picos de fusión: el primer pico con una TM de 49°C ± 2,5°C y el segundo pico con una TM de 59°C ± 2,5°C. El ΔT entre estos dos picos de fusión es 10°C ± 1,5°C. En caso contrario, el proceso no será válido y se deberá repetir todo el procedimiento (preparación de la muestra, amplificación y detección). Si el control positivo siempre genera un resultado no positivo (no heterocigótico), póngase en contacto con su representante local de Roche para solicitar asistencia técnica. 7 Resultado de la muestra: El resultado del ensayo para la muestra de ADN siempre debe mostrar un perfil de curva de fusión para los genotipos normal homocigótico, mutante homocigótico o heterocigótico. Este perfil debe ajustarse a los criterios de aceptación descritos anteriormente en el apartado “Control positivo”. En caso contrario, el resultado de esta muestra no será válido y se deberá repetir todo el procedimiento (preparación de la muestra, amplificación y detección). Si el resultado de muestra genera siempre un resultado negativo para cualquier genotipo, póngase en contacto con su representante local de Roche para solicitar asistencia técnica. LIMITACIONES E INTERFERENCIAS El FIIG20210A MD Mix (vial 1, tapón amarillo) es específico para la secuencia del gen humano del Factor II. Unas concentraciones elevadas de heparina pueden interferir en la reacción en cadena de la polimerasa. No se conocen otras posibles interferencias. VALORES ESPERADOS / INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS Programa de curva de fusión Los picos de fusión resultantes permiten la discriminación entre el genotipo homocigótico (tipo salvaje o mutante) y el genotipo heterocigótico. Fig. 1: Análisis de la curva de fusión de los tres posibles genotipos de la secuencia Factor II (Protrombina) G20210A. La primera derivada negativa del gráfico de relación entre fluorescencia y temperatura [–d(F2)/dT] muestra picos con diferente TM. Los picos de fusión indican que la secuencia homóloga completa (genotipo salvaje) tiene una TM superior que la secuencia no coincidente con la sonda de mutación (genotipo mutante). Las muestras que contienen ambas secuencias (genotipo heterocigótico) muestran dos picos a exactamente las mismas temperaturas que las muestras homocigóticas respectivas. Como control negativo, la plantilla de ADN se ha sustituido por FIIG20210A DIL. Interpretación El genotipo salvaje y la sonda H marcada con fluoresceína se ajustan perfectamente, con una TM resultante que puede variar ± 2,5°C de la TM del segundo pico de fusión del control positivo FIIG20210A (FIIG20210A CT, vial 3, tapón púrpura) a 59°C. Si está presente el genotipo mutante, se produce un desapareamiento y una TM resultante que puede variar ± 2,5°C de la TM del primer pico de fusión del control positivo FIIG20210A (FIIG20210A CT, vial 3, tapón púrpura) a 49°C. Los genotipos heterocigóticos muestran dos picos de fusión con las TMs adecuadas a 49°C y 59°C, respectivamente. Plantilla de ADN con… Genotipo homocigótico y salvaje Genotipo heterocigótico Genotipo homocigótico mutante Número de picos de fusión 1 2 1 TM de los picos de fusión 59°C ± 2,5°C 59°C ± 2,5°C 49°C ± 2,5°C 49°C ± 2,5°C ΔT entre los picos de fusión — 10°C ± 1,5°C — Nota: la precisión total se determinó de acuerdo con las recomendaciones de NCCLS (3) en tres laboratorios externos diferentes utilizando una preparación de ADN heterocigótico humano. Se obtuvieron una media de las temperaturas de fusión de 49,51°C y 58,89°C y una media de CV del 0,36%. Análisis secuencial DATOS ESPECÍFICOS DE FUNCIONAMIENTO Especificidad analítica Al aplicar el análisis secuencial se demostró que los oligonucleótidos sintéticos seleccionados que se utilizaron como cebadores amplifican específicamente un fragmento de 165 bp del gen del Factor II que contiene la secuencia Factor II (Protrombina) G20210A. Además, el análisis secuencial reveló que durante el análisis de la curva de fusión, los oligonucleótidos sintéticos seleccionados que se utilizaron como sondas H identifican inequívocamente la mutación Factor II (Protrombina) G20210A en la posición 20210. No obstante, el análisis de la curva de fusión conducirá a un resultado desconocido para la mutación conocida, aunque muy poco frecuente, que se produce en la posición 20218. Sensibilidad analítica Se realizó una dilución seriada en cuatro pasos de ADN humano heterocigótico para la mutación Factor II (Protrombina) G20210A. Cada dilución se analizó en seis replicados y se realizó una interpretación estadística de los resultados. Se calculó un nivel de detección mínimo de 50 copias por reacción para el kit Factor II (Protrombina) G20210A. Sensibilidad y especificidad diagnósticas En un estudio prospectivo de muestras de ADN humano recién tomadas se analizaron 572 muestras de pacientes caucasianos con sospecha de padecer trombofilia con el kit Factor II (Protrombina) G20210A y análisis de cadena sencilla o doble en un sistema secuenciador MegaBACE 500 Sequencing System con el programa Cimarron Base Caller SW 3.12. Ambos paneles representan una rutina completa en colectivos de pacientes con trombofilia del laboratorio de un hospital universitario y se recogieron a lo largo de un período de tiempo concreto. El nivel de concordancia entre el kit Factor II (Protrombina) G20210A y el análisis secuencial fue del 99,5% (569/572). En la tabla siguiente se muestran los datos detallados. Tabla 1: Kit Factor II (Protrombina) G20210A frente al análisis secuencial wt het mut Kit Factor II (Protrombina) G20210A tipo salvaje (wt) heterocigótico (het) 519 0 0 50 0 0 mutante (mut) 0 0 0 Nota: el 40,7% de las muestras de ADN humano se obtuvieron de pacientes con sospecha de padecer procesos tromboembólicos arteriales según los acuerdos de consenso del American College of Medical Genetics (ACMG) o del College of American Pathologists (CAP) (2,4); el 37,9% de los pacientes con trastornos trombóticos arteriales (por ej., ictus), el 18,9% de pacientes con sospecha de padecer trombofilia por otras razones y el 2,4% por razones no documentadas. No se pudieron obtener los genotipos de las tres muestras con el kit Factor II (Protrombina) G20210A. 8 Tabla 2: Ajustes del equipo 1: Denaturation 2: Amplification 1 None 45 Quantification Cycle Program Data Cycles Analysis Mode Temperature Targets Target Temperature (°C) Incubation Time (sec) Temperature Transition Rate (°C/s) Second Target Temperature (°C) Step Size (°C) Step Delay (cycles) Acquisition Mode 1 95 30 20.0 0 0.0 0 None 1 95 0 20.0 0 0.0 0 None 2 55 10 20.0 0 0.0 0 Single 3 72 5 20.0 0 0.0 0 None 3: Melting Curve Analysis Value 1 Melting Curves Segment 1 2 3 4 95 55 45 40 60 30 30 120 20.0 20.0 20.0 20.0 0 0 0 0 0.0 0.0 0.0 0.0 0 0 0 0 None None None None 4: Cooling 1 None 5 70 0 0.1 0 0.0 0 Cont. 1 40 30 20.0 0 0.0 0 None AVISO PARA EL COMPRADOR La compra de este producto permite al comprador utilizarlo para la amplificación y detección de secuencias de ácidos nucleicos como ayuda en el diagnóstico in vitro en humanos. No se garantiza por la presente ninguna patente general u otra licencia de cualquier tipo excepto el derecho específico de uso del comprador. BIBLIOGRAFÍA 1 Ridker, PM, et al. (1997) Ethnic Distribution of Factor V Leiden in 4047 Men and Women: Implications for Venous Thromboembolism screening. JAMA, 277, 1305-1307. 2 Grody, WW. et al. (2001) American College of Medical Genetics Consensus Statement on Factor V Leiden Mutation Testing. Genetics in Medicine, 3, Vol.2,139-148. 3 Evaluation of Precision Performance of Clinical Chemistry Devices; Approved Guideline. NCCLS document EP5-A (ISBN 1-56238-368-X). NCCLS 940 West Valley Road, Suite 1400, Wayne, Pa 19087-1898, USA (1999). 4 Press, RD, et al. (2003) Clinical Utility of Factor V Leiden (R506Q) Testing for the Diagnosis and Management of Thromboembolic Disorders. CAP Consensus Conference XXXVI: Diagnostic Issues in Thrombophilia. ©2012 Roche Molecular Systems, Inc. La tecnología utilizada para el sistema LightCycler dispone de licencia de Idaho Technology Inc., Salt Lake City, UT, EE.UU. ROCHE, LIGHTCYCLER, MAGNA PURE, LC, HYBPROBE y HIGH PURE son marcas registradas de Roche. Biofuge es una marca comercial de Heraeus Instruments GmbH. Brij es una marca comercial registrada por ICI Americas, Inc., PA, EE.UU. MegaBACE es una marca comercial de Amersham Biosciences Ltd., Buckinghamshire, R.U. Cimarron es una marca comercial de Cimarron Software, Inc., Salt Lake City, UT, EE.UU. Fabricado en Alemania Roche Molecular Systems, Inc. 1080 US Highway 202 South Branchburg, NJ 08876 EE.UU. Roche Diagnostics GmbH, Sandhofer Str. 116, 68305 Mannheim, Alemania Para EE.UU.: Distribución en EE.UU.: Roche Diagnostics, Indianapolis, IN, EE.UU. Soporte técnico a clientes en EE.UU.: 1-800-526-1247 09/2012 03708594001-07 9
