PCR: Utilidad clínica. Resultados

P.C.R.
Utilidad Clínica
Resultados
Dra. Alicia Sáez
H. U. Santa Cristina. Madrid
HPV
PERSISTENCIA
Cancer Cervical
H.U. Santa Cristina
Historia Natural de la
Infección
GRAN NUMERO DE MUJERES JOVENES
SE INFECTAN
POR HPV
RESOLUCION
ESPONTANEA
SIN CONSECUENCIAS
INFECCION
PERSISTENTE
EN 10-20%
DESPUES DE LOS
35-40 ANOS
POBLACION DIANA
MAYOR RIESGO HGSIL
CA CERVICAL
H.U. Santa Cristina
Infección Genital por HPV
? ITS más frecuente.
? Problema de salud pública de creciente
importancia.
? La segunda infección con mayor coste
económico después del VIH.
? Mayoría son subclínicas.
?Sólo pueden diagnosticarse mediante la
detección del DNA viral.
H.U. Santa Cristina
Infección
Enfermedad
?Cofactores de Adquisición:
- Edad inicio de la actividad sexual
- Nº parejas sexuales propias/compañero
?Cofactores de Progresión:
- Virales
- Genéticos .
?Cofactores de Invasión:
- Factores angiogénicos
H.U. Santa Cristina
Secuelas de la
Enfermedad por HPV
Cancer cervical.
? Cancer vulvar.
? Cancer anal.
? Cancer de pene.
? Condilomas.
? Alteraciones de bajo grado citología.
?
H.U. Santa Cristina
Cancer Cervical
La infección persistente de tipos de
HPV de alto riesgo oncogénico es la
causa primaria .
? Está precedido de lesiones precancerosas sin sintomatología clínica.
? Si el virus es detectado en estos
estadíos, TEORICAMENTE podríamos
prevenir todos los casos de cáncer de
cervix.
?
H.U. Santa Cristina
Características HPV
?Familia Papillomaviridae
?Virus DNA de doble cadena
?Virus oncogénicos.
?Dificiles de propagar en cultivos celulares
?Infectan tejido epitelial altamente diferenciado
H.U. Santa Cristina
Características HPV
? Taxonomía basada homología del DNA
? >200 tipos diferentes.
? >80 se conoce su secuencia genética.
? Más de 30 tipos infectan la mucosa genital:
• Alto riesgo (AR): LGSIL, HGSIL y Ca. invasivo.
• Bajo riesgo(BR): Condilomas y LGSIL.
H.U. Santa Cristina
HPVs Oncogénicos
?
Secuencias genómicas con actividad
oncogénica, E6 y E7, y se expresan
en los cánceres.
?
Integración del VPH en el DNA celular
ocurre en la mayoría de los cánceres
?
Interrupción del control del ciclo celular
normal.
H.U. Santa Cristina
Mecanismos de
Oncogénesis
H.U. Santa Cristina
Vías de Transmisión
?
Transmisión sexual.
?
Fómites
?
Transmisión vertical.
?
No sexual (Papilomatosis respiratoria
recurrente)
H.U. Santa Cristina
P.C.R. CONSENSO
?
Amplifica una región de DNA viral altamente
conservada.(L1)
?
MY09 y MY11. Amplificado 450 bp
?
PGMY09/11
?
GP5+/GP6+.
?
Sensibilidad picogramos de DNA viral
H.U. Santa Cristina
P.C.R. ESPECIFICA
?
Basada en el diseño de “primers”
específicos para regiones diferenciales
entre los diferentes HPVs.
Permite amplificar E6 y E7 de un
determinado tipo, subtipo ó variante viral.
? Sensibilidad de femtogramo
? Especificidad próxima al 100%.
?
H.U. Santa Cristina
P.C.R.
?
Basada en el diseño de “primers” específicos para
regiones diferenciales entre los distintos HPVs.
?
Detecta 13 genotipos de Alto Riesgo:
16,18,31,33,35,39,45,51,52,56,58,59 y 68.
?
Permite la amplificación simultanea del DNA diana
(HPV) y del DNA de ß-globina (Control Celular)
H.U. Santa Cristina
P.C.R.
H.U. Santa Cristina
Sensibilidad de la técnica
Genotipo HPV
16
18
31
33
35
39
Copias/ml.
100
100
240
100
100
240
H.U. SantaCristina
Sensibilidad de la técnica
Genotipo HPV
45
51
52
56
58 y 59
68
Copias/ml.
100
100
240
100
240
100
H.U. Santa Cristina
Objetivos
?
Conocer la prevalencia de HPV en
mujeres con alguna alteración citológica
y/o colposcópica.
?
Estudiar los tipos de HPV en mujeres
positivas para ver la implicación de los
genotipos vacunales en nuestra
población.
H.U. Santa Cristina
Material y Métodos
?
Estudio prospectivo en 3256 pacientes.
?
Muestras de cervix recogidas en solución
conservante Preserv Cyt.
?
Se realiza AMPLICOR HPV en todas las
muestras y en las positivas LINEAR ARRAY
HPV Genotyping Test.
?
Las muestras se procesan sin conocer si la
paciente tiene ó no lesion.
H.U. Santa Cristina
RESULTADOS
?
La Edad media: 34,07 (13-83).
?
El 63,1% de las pacientes eran españolas y el
36,9% inmigrantes.
?
La prevalencia de HPV fue: 48,85%
?
Muestras Inhibidas: 0,4%
?
Muestra deficientes: 0,2%
?
En el 70,2% (n=2292) casos dispusimos de los
datos histológicos.
H.U. Santa Cristina
RESULTADOS HPV
60
50,2
48,8
50
40
30
20
10
0,36
0,18
0
NEG.(n=1642)
POS.(n=1594)
INHIB.(n=12)
M.defic.(n=6)
H.U. Santa Cristina
HPV - EDAD
70
60
64,2
54,5
50
40
38,6
%
30
35,3
20
10
0
<25 (n=678)
25-34(n=1209)
35-44(n=802)
>44(n=567)
Edad
H.U. Santa Cristina
EDAD Y COINFECCION
60
59,3
50
47,8
40
%
41,1
44,5
30
20
10
0
<25
25-34
35-44
>44
Coinfección
59,3
47,8
41,1
44,5
PCR positiva
n=435
n=658
n=309
n=200
Edad
H.U. Santa Cristina
Infecciones múltiples
lesión histológica
PACIENTES
CIN 2+
Infección por 1 tipo
HPV-AR
15,8%
P<0.01
Infección por 2 ó
más tipos HPV-AR
28,0%
Presencia de HPV
Lesión citológica
60
% HPV
40
20
47,2
42,0
24
22,5
0
NEG.
n=275
ASCUS
n=676
AGUS
n=40
HPV
n=214
H.U. Santa Cristina
Presencia de HPV
Lesión citológica
100
80
95,9
100
71,6
60
%
40
20
0
LGSIL
n=646
HGSIL
n=430
Ca. n=11
H.U. Santa Cristina
Paises de Origen
70
62,8
60
50
40
% HPV
53,8
44,5
P<0,01
47,5
P<0,05
30
20
10
0
Española A.Latina
P. Este
Otros
H.U. Santa Cristina
EVALUACION CLINICA
• AMPLICOR HPV
?
SENSIBILIDAD: 96.3%
?
ESPECIFICIDAD: 95.6%
?
VALOR PREDICTIVO NEGATIVO: 96.7%
H.U. Santa Cristina
LINEAR ARRAY HPV
?
Identifica 37 genotipos anogenitales:
Tipos de Alto y Bajo riesgo
– Utiliza un pool de primers
consensus y un control de ß-globina.
– Hibridación con Sondas específicas
fijadas sobre la tira.
– Detección colorimétrica.
H.U. Santa Cristina
LINEAR ARRAY HPV
Límite de detección es muy amplio:
– 120 copias/ml. HPV 16
– 300000 copias/ml. HPV 64
? Para la mayoría de los tipos: 900
copias/ml.
? Detecta coinfecciones.
?
H.U. Santa Cristina
LINEAR ARRAY HPV
H.U. Santa Cristina
Genotipos HPV
TIPO6
TIPO11
TIPO16
TIPO16
18%
TIPO18
TIPO26
TIPO31
TIPO33
TIPO35
TIPO39
TIPO58
5%
TIPO31
7%
TIPO40
TIPO42
TIPO45
TIPO53
6%
TIPO51
TIPO52
TIPO51
7%
TIPO53
TIPO54
H.U. Santa Cristina
Genotipos vacunales
HPV 11(1%)
HPV 6 (2%)
HPV16 (18%)
HPV18 (4%)
OTROS HPV (75%)
H.U. Santa Cristina
Genotipos en CIN 2+
TIPO HPV
DISTRIBUCION
HPV 16
44,0%
HPV 31
HPV 51
12,7%
10,2%
HPV 58
9,8%
HPV 52
HPV 33
8,4%
8,2%
HPV 18
HPV 45
6,1%
2,5%
H.U. Santa Cristina
CONCLUSIONES
?
Atendiendo al pais de origen:
– Españolas la prevalencia de HPV : 44.5%.
– Otras nacionalidades la prevalencia : 58.3%.
?
El 48.8% de las pacientes con alguna
alteración citológica y/o colposcópica
tenían HPV.
?
El 42% de las mujeres con ASCUS tienen
HPV de Alto riesgo en cervix.
H.U. Santa Cristina
CONCLUSIONES II
? El HPV tipo 16 fue significativamente más
frecuente (p<0.001) que el resto de los
genotipos encontrados.
? Cuando el HPV tipo 16 estaba presente el
96.8% de las pacientes presentaban alguna
alteracíon en la citología.
? En el 100% de los carcinomas y en más del
95.9% de los HGSIL el HPV estaba presente
H.U. Santa Cristina
Utilidad Clínica del HPV
P.C.R.
?
Identificación de la población diana.
?
Orienta la conducta terapeútica en
mujeres con alteración en la citología.
?
Seguimiento post-tratamiento.
?
Valor predictivo negativo cercano al 100
H.U. Santa Cristina
Futuro
?
Nuevos marcadores moleculares.
- Enfermedad significativa
- Persistencia de infección
- Potencial de progresión.
?
Líneas de estudio definidas como de
“alta prioridad” por el C.D.C.
H.U. Santa Cristina
Necesitamos mantener el cribado
de HPV en la era de la vacunación?
?
Prevalencia de los genotipos vacunales en
nuestra serie: 25%.
?
Lesiones CIN 2+ (Tipos 16/18): 50%.
?
Necesitaríamos disponer de más datos de
protección cruzada vacunas actuales
frente a otros tipos no incluidos.
H.U. Santa Cristina
Cambios en la Prevencion
del Cancer Cervical
?
Vacunacion general en la poblacion
adolescente.
?
Deteccion sistematica de HPV en mujeres
>30 años.
?
POBLACION : HPV negativo y Citología
negativa que podran espaciar sus
controles hasta cinco años.
H.U. Santa Cristina
Cambios en la Prevencion
del Cancer Cervical
?
EN MUY POCOS AÑOS PODEMOS DISPONER DE
MULTIPLES HERRAMIENTAS:
– MEJORAR EL CRIBADO DEL CANCER CERVICAL.
– RESTRINGIR LA DISEMINACION DEL VIRUS.
?
EL CANCER CERVICAL TIENE UNA ALTA
PRIORIDAD DENTRO DE LOS ESFUERZOS
GLOBALES PARA PREVENIR EL CANCER.
H.U. Santa Cristina
AGRADECIMIENTOS
?
SERVICIO DE GINECOLOGIA.
?
ANATOMIA PATOLOGICA.
?
DOCUMENTACION CLINICA.
?
UNIDAD DE BIOLOGIA MOLECULAR.
H.U. Santa Cristina