Plantas transgénicas. Aplicaciones médicas y farmacéuticas

INTRODUCCIÓN
Las vacunas orales son un beneficioso descubrimiento no solo por su facilidad de administración sino también
por su facilidad de aceptación por los pacientes al no ser inyectables. Otra ventaja es la capacidad de estimular
la producción de anticuerpos de la mucosa que son más efectivas que las vacunas inyectables. Esto es
importante porque el sistema inmune de la mucosa es la primera línea de defensa contra cualquier organismo
patógeno.
Las vacunas de diseñan para que provoquen la respuesta inmune sin causar ninguna enfermedad.
Normalmente están compuestas por organismos patógenos muertos o atenuados. Las subunidades de vacunas
recombinantes son una buena alternativa por sus menores efectos ya que no contienen ningún agente
infeccioso siendo de este modo más seguras de administrar, preparar, y las dosis además son mas uniformes.
La biología molecular ha identificado algunas proteínas y péptidos que podrían funcionar de una forma
efectiva como subunidades para vacunas.
Las vacunas recombinantes tienen suficiente potencial para ser efectivas en la prevención de enfermedades en
animales y en el hombre, pero son bastante mas caras de producir, y por eso su uso esta limitado en todo el
mundo.
Para algunos antígenos para vacunas las plantas transgénicas han proporcionado un sistema de expresión
ideal, en el cual el material de la planta transgénica puede ser dado directamente al paciente como su dosis
oral de vacuna recombinante.
PLANTAS TRANSGÉNICAS COMO SISTEMA DE PRODUCCIÓN DE PROTEÍNA
RECOMBINANTE
Existe una gran variedad de sistemas de expresión hoy en día: levaduras, cultivos de células de insectos,
mamíferos, de bacterias, animales transgénicos y plantas. El sistema más común de todos ellos podría ser el de
bacterias aunque también el de levaduras por su relativa facilidad de manejo y por su rápido crecimiento.
Las plantas transgénicas proporcionan un sistema alternativo que podría ser explotado por su alta capacidad
de producción. Una gran ventaja de producir vacunas en plantas transgénicas es la capacidad de usar
directamente el tejido vegetal comestible para una administración oral sin necesidad de purificarlo.
Si una fuente alimenticia vegetal es usada para la producción de vacunas comestibles, algunos de los
problemas asociados con los otros sistemas de producción a gran escala durante la purificación no deberían
ser considerados, como toxinas y aditivos.
El desarrollo y refinamiento de las técnicas de ingeniería genética vegetal y la mejora en el conocimiento de la
biología molecular de plantas están continuamente expandiendo el potencial de la biotecnología vegetal. La
mayoría de la investigación se basa en el conocimiento de los procesos fundamentales de expresión de
transgenes y la acumulación de proteínas recombinantes así como su estabilidad y procesamiento en plantas
EL PAPEL DE LAS DISTINTAS ESPECIES VEGETALES PARA LA PRODUCCIÓN DE
VACUNAS RECOMBINANTES
Algunas de las plantas que se han utilizado para su transformación son: Alfalfa, manzana, espárrago, plátano,
cebada, repollo, semillas de colza, zanahoria, coliflor, pepino, berenjena, lino, uva, kivi, lechuga, altramuces,
maíz, melón, papaya, pera, cacahuete, pimiento, ciruela, patata, frambuesa, fresa, arroz, soja, calabaza, caña
1
de azúcar, girasol, tomate, nuez y trigo.
Para muchos animales de granja el maíz puede ser una buena forma de vacunación ya que los cereales son el
principal componente de los piensos animales. Los animales jóvenes que no se alimentan de alimentos
sólidos, pueden ser también inmunizados pasivamente al mamar leche materna que contenga anticuerpos. En
el caso de vacunas para el hombre el plátano puede ser una buena opción porque puede ser ingerido por los
bebes, consumido sin cocinar y es indígena en muchos países en vías de desarrollo donde son necesarias las
vacunas con bajo costo.
OPTIMIZACIÓN DE LA PRODUCCIÓN DE VACUNAS RECOMBINANTES
Las plantas transgénicas son producidas generalmente mediante dos métodos:
1.Transformación por Agrobacterium tumefaciens
2. Bombardeo de partículas.
Con ambos métodos el transDNA puede ser introducido en casi todos los lugares de la planta. La posición de
la inserción tiene generalmente efectos sobre la expresión de los transgenes, por lo que muchas líneas de
plantas transformadas deben ser analizadas para encontrar la mejor línea de expresión.
Para utilizar de forma económica plantas para producción de proteínas, es esencial maximizar la expresión de
los transgenes y la acumulación de proteína recombinante.
Pueden aparecer dificultades técnicas cuando se utilizan las plantas transgénicas para producir proteínas
extrañas.
El rendimiento de las proteínas recombinantes puede ser incrementado si se aumenta la estabilidad de la
proteína, o del RNAm, su transducibilidad o se aumenta la fuerza del promotor.
Para algunas proteínas recombinantes, su acumulación se aumenta si se hace dirigir esta proteína hacia un
compartimento subcelular como el retículo endoplasmático o las vacuolas. Secuencias especificas dentro de
un RNAm pueden afectar a la estabilidad y trasducibilidad del mensaje en células vegetales.
En muchos casos, el uso de genes sintéticos en plantas optimizadas aumentan drásticamente la acumulación
de proteína recombinante. Además el uso de promotores fuertes es critico para maximizar el rendimiento de
proteínas recombinantes. Puede ser deseable utilizar promotores específicos de tejidos inducidos
sintéticamente como es el caso del LT−B (vacuna contra el cólera y el ETEC.)
MODELOS DE SISTEMAS VEGETALES
El tabaco transgénico como sistema para producir vacunas recombinantes proteicas no es un buen método
debido a sus altos niveles de alcaloides y nicotina.
Patata, tomate y maíz tiene mejores ventajas practicas y moleculares como sistemas de producción de
vacunas. Todos ellos poseen tejidos vegetales comestibles, los cuales pueden ser administrados a animales
para su alimentación.
Una estrategia a desarrollar seria la expresión especifica en tejidos para que se acumulen estas proteínas
recombinantes específicamente en el tejido que va a servir de alimento para la vacunación. El confinamiento
de la expresión de una proteína heteróloga a un órgano especifico de la planta puede ser beneficioso a la hora
de regenerar la planta transgénica así como la acumulación de proteína recombinante en altos niveles puede
2
ser nocivo para el desarrollo de la planta.
PATATA
Ventajas de usar la patata como sistema de producción de vacunas experimentales.
• Eficiencia de transformación genética por A.tumefaciens con relativa pequeña transformación y tiempos de
generación.
• Propagación clonal
• Disponibilidad de promotores específicos de tejidos y capacidad de producción de micro tubérculos .
• Potencial de almacenamiento
• Capacidad para alimentar con tubérculos tanto a animales como al hombre.
Los tubérculos son el órgano de almacenamiento en la planta de la patata y pueden ser almacenados durante
un tiempo antes de ser consumidos. Las proteínas extrañas tiene una alta capacidad de sobrevivir durante
largos periodos de tiempo en el tubérculo mientras este no sea dañado. Los beneficios de poder ser
almacenados sin haber sido sometidos a ningún proceso, hacen a las patatas muy deseables como sistema de
producción de vacunas para los animales que comen patatas crudas.
Se están desarrollando estudios sobre inmunogenicidad con tubérculos de patata en ratones y seres humanos
voluntarios.
Una desventaja de estos tubérculos es que no tienen un alto contenido en proteínas es decir, las patatas tienen
aproximadamente un 2% de proteína de su peso total por lo que, un gramo de tejido de tubérculo, contiene al
menos 20 mg de proteína. Para un gramo de tubérculo que contiene 1 mg de proteína recombinante, esta
ultima debe ser un 5% del total de proteína en el tejido del tubérculo. Para tejidos con un mayor contenido
proteico, como 10% de proteína, para producir 1mg de proteína recombinante por gramo de tejido, se requiere
un nivel de expresión de proteína de al menos un 1%.
TOMATE
Las ventajas de los tomates incluyen :
• Facilidad de transformación
• Capacidad de cruzamiento genético para combinar transgenes para la producción de múltiples subunidades
de vacunas en una planta
• producción de semillas que pueden ser almacenadas a altas temperaturas
• Son fácilmente ingeribles crudos por los humanos
Una desventaja es la necesidad de crear homocigotos para la continuación de las líneas o para el análisis de la
descendencia de cada individuo, por su contenido del transgen y también porque los tomates, al igual que las
patatas, no tienen un alto contenido en proteínas.
PLÁTANO
Los plátanos transgénicos son nuestro mejor método para la producción de vacunas orales para el hombre.
Alguna de las ventajas son:
• Comodidad de alimentación
• Capacidad de ser consumido sin ser cocinado
• Facilidad de obtención en países en vías de desarrollo, gracias al uso de la tecnología de propagación
clonal.
3
Las desventajas están en la dificultad de crear plantas transgénicas de bananas. La regeneración y el
crecimiento necesarios para la maduración y producción del fruto, puede llegar incluso a tres años. El
contenido proteico del plátano es aproximadamente del 1%. Recientes estudios en biología molecular de
plátanos, han identificado varios genes que son regulados positivamente durante la maduración del fruto, y
cuyos promotores son muy apropiados para la expresión especifica en tejidos de vacunas comestibles.
CANDIDATOS A VACUNAS
Las vacunas típicas están compuestas por organismos patógenos muertos, organismos vivos atenuados o
estirpes de organismos patógenos cuyo huésped difiere del de la especie que va a ser vacunada.
Investigaciones recientes en inmunología proponen las subunidades de vacunas como una nueva alternativa.
Una subunidad esta compuesta por una o más proteínas o componentes del organismo patógeno que inducen
al huésped a aumentar una respuesta inmune. Un ejemplo de subunidad de vacuna es el antígeno de la cápsida
del virus de la hepatitis B. Este antígeno (HbsAg) ha sido utilizado con éxito contra el virus de la hepatitis B
(HBV). Este es una proteína de la cápsida del virus y aparece de tres formas en la cápsida nativa viral,
diferenciándose en sus aminoácidos terminales. Las subunidades comerciales están compuestas por la forma
más corta, la proteína S.
La vacuna se produce en un sistema de producción en levaduras y se ensambla en partículas esféricas
llamadas VLPs (virus−like particles) que son muy similares a las cápsidas nativas del HBV. Esta fue la
primera subunidad recombinante usada como vacuna. Esta se administra en tres inyecciones que contienen de
diez a veinte microgramos de HbsAg en cada dosis.
La producción de VLPs en sistemas de cultivos celulares de insectos infectados con Baculovirus se han
descrito para los siguientes agentes patógenos:
• Virus de la enfermedad del caballo africano
• Virus de la lengua azul
• Virus de Dengue
• Hv190SV
• Virus de Hawai
• Hepatitis B
• Hepatitis E
• Virus de Norwalk
• Parvovirus
• Rubeola
• Papilomavirus
• Virus hemorrágico del conejo
Muchos de estos pueden ser candidatos para su producción en plantas como subunidades de vacunas. Si el
ensamblaje de los VLPs puede ser acompañado de un sistema in vitro su potencial estaría disponible para
ensamblarlo dentro de una célula vegetal.
INMUNOGENICIDAD ORAL Y ADYUVANTES
Una exitosa vacuna oral sería aquella que estimulase el sistema inmune de la mucosa para producir una
respuesta protectora inmune contra el agente infeccioso.
La estimulación del sistema inmune a través de la mucosa para producir un nivel similar de anticuerpos
circulantes, comparables a los que habría con una inyección vía parenteral, normalmente requiere múltiples
dosis de antígenos, bastantes mas de lo que se necesita por vía parenteral. Una vacuna oral debe ser resistente
4
a proteasas y al bajo pH del estomago para poder alcanzar las células receptoras del intestino donde se
encuentran las células M. Estas transportan partículas y peptidos hasta tejidos linfoides subyacentes a la
membrana mucosa. Las partículas parecen ser mucho más efectivas con las células M de lo que son los
peptidos como inmunogénicos. Antígenos que forman estructuras multiméricas o heteroméricas son
probablemente mejores candidatos para ser vacunas porque estimulan mejor la mucosa que las proteínas
solubles.
Hay muchos métodos de presentar los fármacos o las vacunas orales: encapsulación en microesferas lipídicas,
precipitados fosfolípido−calcio, polímeros mucoadhesivos.
La producción de vacunas orales en plantas proporcionan un sistema de encapsulación con paredes celulares y
membranas celulares que protegen al candidato como vacuna en el estomago. La digestión del material
vegetal puede proporcionar una lenta liberación de la vacuna a lo largo del sistema digestivo que haría
despertar al sistema inmune de la mucosa.
Los adyuvantes son sustancias que aumentan la respuesta inmune, y se usan normalmente como vacunas
inyectables. Algunos se encuentran bajo estudio para uso en la mucosa, y entre ellos destacamos la
enterotoxina lábil al calor (LT) que proviene de una cepa de Escherichia coli (ETEC) y la toxina colérica (CT)
de Vibrio colera.
LT y CT son similares en estructura, función y cualidades inmunológicas. Cada molécula de holotoxina esta
compuesta por una subunidad A y cinco subunidades B de manera que forman un pentámero. Las subunidades
B cuando se ensamblan pueden unir gangliosidos GM1 en la superficie de las células M en el tracto digestivo.
Para estudios animales CT o LT pueden añadirse junto con una sustancia oral que aumente la respuesta
inmune. Los efectos tóxicos de CT y LT hacen imposible su uso en humanos, sin embargo algunos mutantes
de CT y LT se están estudiando como posibles adyuvantes de la mucosa.
Seria muy interesante el uso de vacunas comestibles de plantas sin necesidad de un adyuvante, sin embargo es
necesario para algunos antígenos. También es posible modificar la planta para que produzca el adyuvante, o si
no una forma mutante del adyuvante que no produjese efectos tóxicos. Esto posibilitaría la coadministracion
del antígeno con el coadyuvante. Normalmente la cantidad de coadyuvantes es menor que la cantidad de
antígeno cuando se presentan oralmente.
• EJEMPLO DE VACUNA CONTRA UN AGENTE BACTERIANO PATÓGENO
LT−B como vacuna contra el colera y el ETEC:
En 1995 se demostró que si se alimentaban a ratones con tubérculos transgénicos que producían la subunidad
B de la LT toxina, estos producían suero y anticuerpos de la mucosa contra la proteína LT−B. Esta proteína
LT−B recombinante ha sido sintetizada en plantas de tabaco y patata y se ha visto que siguen manteniendo su
capacidad de auto ensamblaje y formación de estructuras pentaméricas. La planta produce LT−B unida a
gangliosidos GM1 que son reconocidos por anti−LT anticuerpos, cuando se alimentaban estos ratones con
tubérculos LT−B. Esto se produce gracias a la producción de sIgA de la mucosa y IgG del suero.
Experimentos in vitro con células Y−1 adrenales comprobaron que los anticuerpos neutralizaban la toxina LT.
b) EJEMPLO DE VACUNA CONTRA UN AGENTE PATÓGENO VIRAL
Hepatitis B:
Las vacunas comerciales contra el HBV incluyen proteínas recombinantes de la cápsida del virus de la
hepatitis B como antígeno (HBsAg). Este antígeno fue la primera vacuna recombinante hecha con sólo un
transgen.
5
HbsAG se expreso en plantas de tabaco y patata y se vio que se ensamblaban como VLPs(virus−like protein)
siendo muy similares a las producidas comercialmente por levaduras. Los resultados obtenidos en tabaco
fueron comparables con los de levaduras en cuanto a su estimulación de la respuesta inmune. La única
limitación de este proyecto fue el bajo nivel de expresión de partículas en el tejido vegeta. Cerca de un 0.01%
del total de proteína soluble era proteína HbsAg recombinante, aproximadamente 1 microgramo por gramo
fresco usando el promotor especifico de la patatina de tubérculos. Recientes experimentos han logrado
aumentar mucho el nivel de expresión en tubérculos d patata. Esto permitirá futuros estudios para probar su
inmunogenicidad oral.
OTROS VLPs Y ANTIGENOS PARA VACUNAS EXPRESADOS EN PLANTAS
Un problema común en todos los experimentos que se refieren a expresión de proteínas foráneas en la planta,
es el bajo nivel de expresión de esta proteína en el material vegetal.
Normalmente una dosis oral de una vacuna requiere mucha mas cantidad de antígeno que una vacuna
administrada por vía parenteral, por lo que es necesario determinar exactamente cual es la cantidad de
antígeno de una dosis que se necesita para que sea efectiva. Avances en biotecnología como la producción de
genes sintéticos y nuevos descubrimientos sobre expresión en tejidos vegetales permitirán un mayor nivel de
expresión de las proteínas recombinantes. Además las futuras vacunas comestibles que sean producidas en
plantas también expresaran un adyuvante como el LT(o un mutante no toxico de LT).
LUCHA CONTRA LA AUTOINMUNIDAD
Aunque el suministro oral de los antígenos derivados de agentes infecciosos estimula a menudo el sistema
inmunitario, la ingesta de auto antígenos ( proteínas procedentes de tejidos sin infectar en in individuo que no
ha recibido tratamiento) puede en ocasiones suprimir la actividad inmunitaria, fenómeno este que se observa
con frecuencia en los animales de experimentación. Nadie sabe dar la razón de esa diferencia.
Algunas de las pruebas de que la ingestión de autoantigenos podría suprimir la autoinmunidad se han obtenido
investigando la diabetes tipo I, resultado de la destrucción inmunitaria de las células del páncreas productoras
de insulina (células beta).Esa labor destructora progresa calladamente conduciendo a una perdida de células
beta que conduce a una grave deficiencia de insulina.(hormona que se necesita para que las células capten la
glucosa de la sangre y obtener energía).Por culpa de esta perdida suben los niveles de azúcar en sangre. Las
inyecciones de insulina ayudan a controlar la diabetes, pero no la curan. Los diabéticos se hallan expuestos a
un riesgo elevado de complicaciones graves.
A lo largo de los últimos 15 años se han identificado varias proteínas de la célula beta capaces de despertar
autoinmunidad en personas predispuestas a la diabetes tipo I.
Los principales culpables, sin embargo, son la insulina y la ácido glutámico descarboxilasa(GAD). Se ha
progresado también en la detección del momento de incubación de la diabetes. El próximo paso a dar será
encontrar el camino para detener las bases del proceso antes de que aparezcan los síntomas.
Con este propósito se ha trabajado en vacunas contra la diabetes basadas en plantas que, como la patata,
contengan insulina o GAD ligadas a la subunidad B inocua de la toxina del V. Cholerae (para potenciar la
captación de los antígenos por las células M).
La administración de las vacunas a unas capas de ratones en los que se había inducido la diabetes contribuyo a
suprimir el ataque inmunitario y prevenir o retrasar la elevación del azúcar en sangre.
No se han conseguido todavía plantas transgénicas que produzcan las cantidades de autoantigenos necesarias
para una vacuna viable contra la diabetes humana u otras enfermedades autoinmunitarias. Pero se están
explorando diversos esquemas prometedores para vencer esta y otros retos, igual que se avanza en el terreno
6
de las enfermedades infecciosas.
A las vacunas comestibles para combatir la autoinmunidad y las enfermedades infecciosas les quede un largo
camino por delante antes de que estén listas para las pruebas a gran escala con humanos. Los obstáculos
técnicos, no obstante, parecen superables. Nada seria más satisfactorio que proteger la salud de millones de
niños, ahora indefensos.
OTROS PRODUCTOS
Estos comprenden una gran variedad de productos que pueden ser manufacturados en plantas transgénicas, y
que tienen un común denominador: tienen un relativo alto valor y su producción en plantas transgénicas es
más barata que los procedimientos clásicos. Podríamos incluir:
−oligopéptidos y proteínas como terapéuticos y para investigación biomédica.
−Oligómeros y polímeros de azúcar
−Alcaloides y fenoles
−Enzimas para humanos y animales
.
No se puede negar que los productos manufacturados están en auge, pero todavía no se tiene todo el acceso al
publico mas que nada por consideraciones de propiedad, ya que debemos tener en cuenta que hasta llegar al
publico un producto debe pasar por varias etapas de licencia y aceptación por parte de las autoridades y del
propio publico.
OLIGOPEPTIDOS Y PROTEINAS
Un ejemplo que los investigadores intentan producir son las leuencefalinas es semillas de plantas transgénicas.
Estos son unos neuropéptidos que comprenden cinco aminoácidos(Try−Gly−Gly−Phe−Leu) con propiedades
opiáceas.
La estrategia a seguir es la de insertar este pentapéptido en la albumina 2S de semillas.
Se eligieron estas albúminas porque son solubles en soluciones con baja concentración salina y porque son
muy abundantes entre las proteínas de almacenamiento en semillas. Es muy importante elegir correctamente
el sitio de inserción para que el plegamiento en cuerpos proteicos, no se dañe.
Se construyeron cDNAs para genes quiméricos de albumina 2S en los cuales el código para los 5 aminoácidos
de las leuencefalinas se reemplazaron por los de una albumina modificada. Estos genes quiméricos de
insertaron en cassettes de transformación que contenían también elementos cis reguladores y marcadores
seleccionables.
La transformación fue hecha en A. thaliana y Brassica napus mediante A. tumefaciens.
Las semillas se cosecharon y se extrajo la albúmina, se purifico y se comprobó la presencia de leuencefalinas
en las semillas transgénicas de A.Thaliana y B.napus.
El rendimiento fue aproximadamente de 200 nmol/g semilla en A. Thaliana y 10−50 nmol/g semilla en B.
Napus.
7
Otro hecho importante realizado en plantas transgénicas fue la producción de seroalbúmina (HSA),
concretamente en plantas de tabaco y patata.
En el hombre la HSA se sintetiza en el hígado como prepro−albumina, pero en plantas se ha intentado
modificar su gen para que se produzca directamente la albumina madura en la planta.
Se observo que era importante el péptido señal Asp−Ala−His−Lys en ambas plantas. Para patata se usaron
discos de tubérculos, se transformo con A. Tumefaciens y se seleccionaron en un medio con kanamicina. Los
niveles de HSA se evaluaron por inmunoblot. Las hojas contenían un 0.02 % de HSA del total de proteína
soluble. Resultados muy parecidos se observaron en tabaco, y se observo además que el procesamiento de la
proteína precursora era dependiente del tipo de secuencia señal.
Aun así, tendremos que esperar mucho hasta comercializar a gran escala estas patatas transgénicas.
POLIMEROS Y OLIGOMEROS DE AZUCAR
Los tubérculos de patata transgénica se han usado como productos manufacturados por la presencia de un
oligosacárido cíclico; las ciclodextrinas (CDs).
Estos oligosacáridos poseen unidades de glucopiranosa unidos con enlaces alfa, beta y gamma (1−4) y forman
complejos de inclusión con sustancias hidrofóbicas que les hacen más estables. Estas CDs tienen aplicaciones
farmacéuticas además de otros usos.
Se trabajo con el gen de la ciclodextrina glicosil−transferasa de la bacteria Klebsiella pneumoniae y se unió a
un promotor de la patatina especifico de tubérculo.
La transformación se hizo con A. Tumefaciens y aunque el RNAm de la enzima no se pudo detectar y los
niveles de CD en los tubérculos no pudieran ser precisados los investigadores estiman que cuando la
producción de CD alcance al menos un 10% en el almidón del tubérculo, este podrá ser comercializado.
ALCALOIDES Y FENOLES
Los alcaloides propanos, hiosciamina (forma racémica de la atropina ) y escopolamina son de uso
farmacéutico y actúan como agentes anticolinérgicos en el sistema nervioso parasimpático.
La planta con la que se trabajo, que sintetizaba hiosciamina es una solanácea , Atropa belladona.
Teniendo en cuenta la ruta metabólica desde la hiosciamina a la sopolamina los estudios se centraron en la
enzima hiosciamina −6−ß−hidrolasa (H6H).
Esta enzima convierte la hiosciamina en 6−ß−hidroxihiosciamina para mas tarde sufrir una epoxidación para
dar escopolamina. La estrategia a seguir fue el aislamiento del DNA que contenía la H6H de Hyoscymun niger
y expresarlo en la A. belladona transgénica. Se incluyo junto al gen un promotor 35S, un terminador Nos, y la
transformación se hizo con A. tumefaciens. Se selecciono en un medio con kanamicina y se hizo un western
para comprobar los niveles de H6H. Se autopolinizaron las To obteniendo la descendencia T1 .
Esta generación T1 se observo que contenían altos niveles de escopolamina en sus hojas, pero
no−hiosciamina, además se vio que los alcaloides se sintetizaban en las raíces y eran transferidos a las partes
altas de la planta. Concretamente se observo hasta un 1.2% de escopolamina en hojas. Posiblemente la
combinación de métodos de reproducción convencionales y expresión de H6H por transformación genética
podrán incrementar y estabilizar en el futuro la producción de escopolamina.
8
ENZIMAS PARA EL HOMBRE Y OTROS ANIMALES
Los animales monogástricos has perdido las capacidad de utilizar el fósforo contenido como fitato en semillas
de plantas cultivadas.
En los estudios realizados se intento introducir la fitasa de Aspergillus niger en semillas de tabaco. Esto hacia
que no se tuviera que añadir fósforo o fitasa fúngica a este cultivo. Pero además los autores de este
experimento se plantean el insertar este gen que codifica para la fitasa en cosechas que normalmente se usen
como alimento. Un ejemplo par el hombre podría ser la producción de proteínas biorreactivas.
En este sentido hay muchas limitaciones por la dificultad de producir proteínas humanas en cultivo de tejidos
humanos, y también en bacterias por los procesos de glicosilación que requieren las proteínas humanas y cuya
capacidad no poseen estas bacterias.
Existen tres características que se requieren para los productos modificados genéticamente:
−Seguridad medica
−Pureza e identidad con la proteína natural
−Bajo coste de producción
Estas características son indispensables a la hora de tratar con expresión heteróloga de proteína humana para
tratamientos médicos.
Las plantas no son huéspedes de agentes patógenos del hombre, y sin embargo tienen la capacidad de
modificaciones post−transcripcionales, además d no haber opiniones negativas contra la experimentación con
plantas, no así con los animales, por eso se pueden explotar para el beneficio del hombre.
Aquí se intento utilizar una planta transgénica como sistema bioproductor para la expresión heteróloga de
genes humanos.
Concretamente se uso la planta de tabaco para expresar una proteína C humana (hPC) que es un complejo
serina proteasa que tiene una potente actividad anticoagulante y un valor significativo como proteína para
usos terapéuticos.
Esta hPC es una protesa dependiente de la vitamina K importante en la cascada coagulación / anticoagulación.
Esta es segregada desde el hígado ala sangre como cimógeno para luego sufrir complejas modificaciones co y
post−transcripcionales.
El gen de la hPC se introdujo en plantas de tabaco con un promotor 35S y la transformación fue llevada a
cabo por A.tumefaciens. Los resultados obtenidos no fueron muy satisfactorios ya que solo se logro alcanzar
un 0.002% de hPC del total de proteína soluble en la planta transgénica de tabaco.
Se hicieron otros estudios para expresar otra proteína glucocerebrosidasa (hGC) de importancia en el hombre
ya que causa la enfermedad de Gancher cuyos enfermos lo que hacen es acumular glucosiceramidas en el
hígado, bazo, huesos largos como los de las rodillas y en células reticuloendoteliales lo que requiere
administraciones intravenosas de glucocerebrosidasas humanas modificadas ( como la cerdaza), cuyo coste es
muy alto siendo comercialmente atractiva si producción en plantas transgénicas.
Se introdujo el DNA que contenía hGC en un cassette de transformación de A.tumefaciens pero en vez de
utilizar un promotor 35S se uso un promotor MeGA (propietery inducible plant promoter).
9
Las plantas transgénicas obtenidas expresaron un alto nivel de transcritos de hGC bajo inducción. Además las
plantas transgénicas de tabaco inducidas producían una glicoproteína de 69 KD que reaccionaba de forma
contraria con los anticuerpos monoclonales anti−hGC y que es aparentemente activa enzimaticamente. Esto
indica que al menos una parte de la proteína heteróloga es correctamente glicosilada y plegada.
Los investigadores demostraron la co−expresión de la alfa y beta globina de la hemoglobina humana HbA en
plantas transgénicas de tabaco. Mostraron que la Hb recombinante, un complejo proteico multimérico, puede
obtenerse de una planta.
Obviamente hay todavía un largo camino por recorrer −de la expresión hPC y hGC en plantas de tabaco−
hasta que puedan ser productos aceptables terapéuticamente y que serán adecuados para el tratamiento
médico.
Sin embargo la producción de proteína humana para uso terapéutico en plantas transgénicas parece ser una
atractiva tentativa.
TAXOL
Este diterpeno, ha sido establecido como un potente agente quimioterapéutico, produciendo una excelente
actividad contra una amplia variedad de cánceres, incluyendo el de ovarios y mama.
Este compuesto es extraído de la corteza del tejo, Taxus brevifolia , y aunque se han hecho muchos intentos
para desarrollar su producción en cultivos celulares, la síntesis total no es todavía comercialmente viable.
Lo que sí se ha logrado es la síntesis de unos análogos, taxotere y el bacatín III , aunque se esta trabajando
mucho en conocer la ruta de biosíntesis del taxol, tanto las enzimas implicadas, como los genes que las
codifican.
EPITOPOS
Son pequeños peptidos que tienen una considerable importancia recientemente por ser una fuente potencial
para la producción de nuevas vacunas. Aunque estos peptidos libre, a menudo, pueden estimular la producción
de anticuerpos, su inmunogenicidad puede ser incrementada presentándolos en múltiples copias en la
superficie de proteínas portadoras.
Por esto, han sido desarrollados varios sistemas en los cuales los epitopos son fusionados junto con una
macromolécula con poder de autoensamblaje que a menudo son partículas víricas.
El uso de virus vegetales para esta aplicación tiene una serie de ventajas:
• Los virus vegetales crecen extremadamente bien en sus huéspedes y se obtiene un alto nivel de
partículas víricas.
• La purificación de estas partículas además es sencilla.
• Muchos virus vegetales son termoestables llegando alcanzar con ello la esperanza de producir
vacunas en las que no se requiera refrigeración.
• El reactor usado para el crecimiento del material es la planta, que es barata y fácil de mantener.
Un ejemplo muy estudiado es el desarrollo de un sistema con epitopos basados en el CPMV ( cowpea mosaic
virus) que infecta a Vigna unguiculata, en el que mediante la expresión de secuencias heterólogas en la
superficie del virión se producen las CVPs ( chimaeric virus particles). Estos CVPs tienen propiedades
inmunológicas ya que llevan un inserto, es decir, el epitomo, que es el que verdaderamente posee las
características inmunológicas.
10
Epitopos que están siendo investigados derivan del rhinovirus humano (HRV), del virus VYH, virus de la
enfermedad del pie y de la boca (FDMV), parvovirus canino, virus del sarampión, Staphylococus aureus,
Pseudomonas aeruginosa, Plasmodium falciparum y otros agentes no patógenos como las hormonas,
antígenos de células tumorales, proteínas estructurales y RGD ( que contienen peptidos).
Los estudios mas avanzados en este campo han utilizado el CPMV. Tras el análisis de su estructura
tridimensional se ha comprobado que los bucles existentes entre sus cadenas son los sitios mas adecuados
para la inserción de estos epitopos, concretamente en la hélice B− C de la proteína S, aunque estudios
mucho mas recientes demuestran que la inserción de secuencias heterólogas en otras hélices de las proteínas
de la cápsida del virus. Esta inserción de secuencias heterólogas no afectan a la replicación del virus en el
vegetal.
Como la viabilidad y conformación del epítopo son muy importantes por su uso terapéutico en la respuesta
inmune, el conocimiento de la configuración exacta de un epítopo expresado seria un gran beneficio para la
ingeniería de vacunas potenciales.
El desarrollo de productos farmacéuticos mediante el uso de ingeniería de virus vegetales debe aplicar todos
los criterios regulados existentes para poder acceder a los ensayos clínicos en humanos. Esto requiere un
estudio completo pre−clínico en tejidos aislados y en animales que puedan generar datos que sirvan para los
posteriores ensayos clínicos. Estos estudios incluyen la validación de productos específicos y procesos
tecnológicos, estudios de seguridad, resistencias en animales de experimentación, estudios de formulación y
estabilidad, junto con precisos controles de calidad.
El proceso entero esta estrictamente regulado por las autoridades, FDA(The Food and Drug Administration)
en los Estados Unidos y en el MCA (Medicines Control Agency) en el Reino Unido.
Se necesita el desarrollo de una formulación apropiada de CVPs purificadas, en conjunción con un adyuvante
apropiado para la administración parenteral, para facilitar la respuesta inmune. Por ello son necesarios los
controles de calidad para demostrar la consistencia y calidad del producto.
Los CVPs ofrecen distintas ventajas como vacunas. La particular naturaleza de los CVPs las hace apropiadas
para la producción de una respuesta mucosal y sistémica inmune. El uso de plantas como vehículos de
producción ofrece ventajas en términos de seguridad ya que la mayoría de agentes patógenos de cultivos
celulares de mamíferos no los son de plantas. De momento no se ha encontrado, de todos los que se conocen,
ningún agente patógeno viral de plantas que lo pueda ser del hombre. Resultados de estudios in vitro e in vivo
indican que el CPMV no infecta a mamíferos y no evidencia efectos patológicos. Se espera que como
resultado de los esfuerzos realizados por desarrollar esas técnicas en las que participan proteinas de la cápsida
de los virus, pronto podamos contar con nuevos producto comercial y terapéuticamente viables para su uso en
humanos.
VENTAJAS E INCONVENIENTES DE LAS VACUNAS COMESTIBLES.
Las plantas y los árboles podrían cultivarse in situ, sin excesivo coste, con los métodos tradicionales del lugar.
Y como muchos cultivos se regeneran fácilmente, habría siempre cosecha sin q los campesinos tuvieran que
comprar las semillas o las plantas año tras año. Las vacunas cultivadas in situ ahorrarían los inconvenientes
logísticos y económicos del transporte de las preparaciones tradicionales con su obligada conservación a bajas
temperaturas hasta llevar a sus lejanos puntos de distribución. Al tomarse por vía oral, se prescindiría de las
jeringuillas, que, costes a parte, constituyen una fuente de infecciones si se contaminan.
Pero la investigación realizada en los últimos diez años con animales, y algunas pruebas restringidas con
personas, levantan una fundada esperanza en torno a la viabilidad de las vacunas comestibles. Parece, a sí
mismo, verosímil que ciertas vacunas comestibles puedan suprimir la autoimunidad, fenómeno en cuya virtud
11
las defensas del organismo atacan por error los tejidos normales, sin infectar. Entre las enfermedades
autoinmunitarias que se podrían prevenir o aliviar se encuentran la diabetes tipo I, la esclerosis múltiple y la
artritis reumatoide.
Las vacunas clásicas presentan su riesgo: aunque pequeño no deja de ser preocupante. Los microorganismos
de la vacuna pueden despertar provocando la enfermedad contra la que se pretendía defender. Por ese motivo
los laboratorios prefieren las preparaciones de subunidades, compuestas fundamentalmente por proteínas
antigénicas, separadas de los genes del agente infeccioso. Ocurre, sin embargo, que las vacunas de
subunidades son caras, hay que purificarlas y deben conservarse refrigeradas.
Las vacunas comestibles se parecen a las preparaciones de subunidades en las que de han manipulado para
que contengan los antígenos pero no los genes que posibilitarían la formación del patógeno entero. Pero antes
de abordar los efectos de las vacunas comestibles en las personas, había que despejar numerosas incógnitas.
¿Se lograrían transformar las plantas para que aportaran genes que produjeran copias funcionales de las
proteínas especificadas?. Cuándo las plantas comestibles se administraran a los animales de experimentación,
¿se degradarían los antígenos en el estomago antes de ejercer el efecto buscado?(para evitar precisamente
dicha degradación, se administrarían por vía parenteral las vacunas habituales de subunidades.) Si los
antígenos superaran ese obstáculo, ¿Atraerían la atención del sistema inmunitario? ¿Seria la respuesta lo
suficientemente potente como para defender los animales frente a la infección?
Había que determinar, además, si las vacunas comestibles promoverían la inmunidad mucosal. Muchos
patógenos penetran en el organismo a través de la nariz, boca y otros resquicios. Por eso las primeras barreras
que se encuentran se hallan en las membranas mucosas que tapizan las vías respiratorias, el tubo digestivo y el
tracto reproductor. Tales membranas constituyen el mayor obstáculo disuasor contra la invasión del patógeno.
Si la respuesta inmunitaria mucosal es eficaz, genera anticuerpos secretores, moléculas que se lanzan a las
cavidades de esos conductos, neutralizando cualquier agente infeccioso que le salga al paso. Una reacción
eficaz activa también una respuesta sistémica; en ella, las células circulantes del sistema inmunitario
contribuyen a la destrucción de invasores en lugares remotos. Las vacunas inyectadas orillan las membranas
mucosas y apenas estimulan las respuestas inmunitarias de las mucosas. Pero las vacunas comestibles entran
en contacto con el revestimiento del tubo digestivo. En teoría, pues, activarían ambos tipos de inmunidad, la
mucosal y la sistémica. Doble efecto que contribuiría a mejorar la protección contra muchos microorganismos
incluidos los causantes de la diarrea.
Además la alimentación de los animales de experimentación con tubérculos o frutos portadores de antígenos
pueden evocar respuestas inmunitaria sistémicas o de mucosa que los protegen, total o parcialmente, ante la
exposición subsiguiente de patógenos reales o frente a toxinas microbianas. Las vacunas comestibles les han
proporcionado cierta protección frente al virus de la rabia, Helicobacter pylori y el virus entérico del visón.
No es del todo sorprendente que los antígenos administrados a través de la planta persistan tras su curso por el
estomago y alcancen y activen el sistema inmunitario. La dura pared externa de las células vegetales sirve al
parecer de armadura temporal para los antígenos, conservándolos mas o menos salvo de las secreciones
gastricas. Cuando esa pared termina por romperse en el intestino, las células liberan gradualmente su
cargamento de antigenos.
La cuestión clave estriba en la viabilidad de las vacunas comestibles para el hombre.
En 1997 los voluntarios que ingirieron trozos de patatas crudas peladas que contenian un segmento benigno de
la toxina de E. coli (la subunidad B), presentaron respuestas inmunitarias mucosales y sistemicas. Si las
vacunas comestibles pueden realmente proteger al ombre contra las infecciones es, sin embargo, una cuestion
todavía por determinar.
En resumen, los estudios realizados en animales y personas proporcionan una prueba de principio. Respaldan
la estrategia. Pero quedan muchas cuestiones pendientes que deben abordarse. La primera: la escasa cantidad
12
de vacuna que una planta produce. Puede incrementarse dicha producción de varias maneras; por ejemplo,
ligando los genes con elementos reguladores que aviven la actividad de los genes. Resuelto ese problema,
habrá que establecer que cantidad de alimento con vacuna comestible proporciona una dosis predecible de
anfígeno.
En segundo lugar, tendría que potenciaarse la posibilidad de que los antigenos activaran el sistema
inmunitario sin que se degradara antes en el organismo. El uso de estimuladores generales ( adyuvantes) y una
mejora dirección de la selectividad para el sistema inmunitario podrían compensar en parte una producción
baja de antigenos.
Una de las estrategias para incrementar la selectividad implica la unión de los antígenos a moléculas que se
engarcen bien en las células M, componentes del sistema inmunitario que se encuentran en el forro interno del
intestino. Las células M captan muestras materiales que han entrado en el intestino delgado ( incluido los
agentes infecciosos) y las pasan a otras células del sistema inmunitario, como las células presentadoras de
antígeno. Los macrofagos y otras celulas presentadoras de antigenos trituran las adquisiciones de ese tipo y
exponen los fragmentos proteicos sobre la superficie celular. Si los leucocitos de la sangre llamados linfocitos
T coadyuvantes reconocen los fragmentos como extraños, promueven que los linfocitos B ( celulas B)
segreguen anticuerpos neutralizantes y contribuyen a iniciar un ataque mas amplio sobre el enemigo
descubierto.
La investigación trabaja también en otros frentes. Las plantas muestran, a veces, un crecimiento pobre cuando
se les exige producir grandes cantidades de una proteína foránea. Problema que se acabaria si se lograra
equipar a las plantas con elementos reguladores que indujeran la activacion de los genes de antigenos en el
instante deseado o en las partes comestibles.
Por si fuera poco, cada tipo de planta presenta sus propios problemas, como ya hemos descrito en apartados
anteriores.
Importa a si mismo asegurar que las vacunas deben potenciar la respuesta inmunitaria no inviertan el sentido
de su accion y supriman la inmunidad. La ingestión de ciertas proteinas pude provocar que el organismo
bloquee su respuesta a las mismas. Para determinar las dosis seguras y eficaces y el calendario de la
administracion de las vacunas comestibles la industria necesita mejorar sus instrumentos de manipulación que
influyan sobre la accion del antigeno suministrado y saber si estimulara o bloqueara la inmunidad.
Un punto final digno de estudio concierne a la posibilidad de que las vacunas ingeridas por la madre protegan
indirectamente a los hijos. En teoría una madre podría comer un plátano o dos y disparar a si la producción de
anticuerpos que pasarían al feto a través de la placenta o al recién nacido durante la lactación.
Hay otros retos vinculados a las dificultades técnicas. No abundan los laboratorios farmacéuticos proclives a
financiar la investigación de productos dirigidos fundamentalmente a mercados situados fuera de los países
ricos.
Además, las vacunas comestibles caen bajo la rubrica de plantas modificadas genéticamente, sometidas a un
creciente rechazo popular. Cabe, sin embargo, esperar que nuestras vacunas queden fuera de semejante
rechazo, toda vez que se trata de salvar vidas y, además, se cultivaran en espacios restringidos. Igual que otros
fármacos estarán sujetas a examen riguroso de los organismos reguladores.
LA BATALLA CONTRA LA DESNUTRICIÓN.
No solo progresa la investigación sobre las vacunas comestibles si no que sigue adelante la búsqueda de
alimentos mas nutritivos. Famoso a este respecto es el arroz dorado con el que se pretende suplir la deficiencia
en vitamina A que sufren numerosas zonas de Asia, África e Iberoamérica. La carencia produce ceguera y
13
trastornos inmunitarios, que contribuyen a la muerte de mas de un millón de niños al año.
El arroz constituye un medio optimo para aportar la vitamina requerida. No se olvide que esa gramínea
alimenta a un tercio o más de la población mundial. Pero las variedades naturales carecen de vitamina A. El
arroz dorado, sin embargo, modificado genéticamente, sintetiza −carotenos, un pigmento que el organismo
convierte en vitamina A. El equipo dirigido por Ingo Potrykus del Instituto Federal Suizo de Técnica, y Peter
Beyer de la Universidad alemana de Friburgo dio a conocer sus éxitos el pasado enero en Science. En mayo
una empresa con intereses en los productos agrícolas −Zéneca− compro los derechos y acordó permitir que se
donase el arroz a las instituciones que introdujeran los
−carotenos en especies de arroz populares en zonas deprimidas y distribuyeran los productos resultantes
entre los agricultores, sin cargo alguno. (Zéneca espera sacar beneficios de las ventas del arroz mejorado a los
países ricos donde es probable que interese las propiedades antioxidantes del −caroteno.)
Pero el arroz no esta todavía listo para su comercialización. Quedan pendientes muchas pruebas, incluidos los
análisis para comprobar si el organismo humano absorbe bien el caroteno de la planta. Se espera que las
pruebas duren hasta el 2003 por lo menos.
Mientras tanto, se intenta enriquecer el arroz con una abundancia mayor de caroteno y con otras vitaminas y
minerales. El año pasado Potrykus anuncio el éxito conseguido con el hierro. Mas de dos mil millones de
personas padecen déficit de hierro.
Se investiga también en el refuerzo de otros alimentos. En junio, por ejemplo, se informo de la creación de un
tomate que contiene un gen capaz de triplicar la cantidad de caroteno habitual. No se minusvaloran los
métodos tradicionales de cultivo; hay un proyecto internacional centrado en el incremento del contenido de
vitaminas y minerales en el arroz y en otros cuatro vegetales, el trigo, maíz, alubias y mandioca.
14