El Dengue

Las células Natural Killer
(NK) en la respuesta contra
el Dengue
Sandra López Vergès, Ph.D.
Dpto. de Investigación en Virología y Biotecnología
ICGES
19-11-13
X Congreso Annual del Instituto Conmemorativo Gorgas en
Celebración de su 85 Aniversario: “25 años de vigilancia del
Dengue en Panamá”
El Dengue
Aedes aegypti
• 50 millones (WHO) a 100 milliones (NIH) de infecciones al año
• Es la enfermedad transmisible por mosquito más común: causada
por el virus del Dengue (DENV) de la familia Flaviviridae, Género
Flavivirus
• No hay vacunas ni medicinas específicas
• Muchas infecciones son asintomáticas.
• Algunas personas van a desarrollar dengue leve sin o con signos de
alarma: fiebre, dolor de cabeza, petequias, dolor en los muscúlos y
articulaciones.
• Pocas personas desarrollan síntomas de dengue severo:
hemorragia, fuga de plasma sanguíneo, y presión muy baja en la
sangre (síndrome de choque) que pueden llevar a la muerte.
Porqué algunas personas desarrollan
Dengue severo?
 Necesidad de comprender la patogénesis de la
enfermedad
- VIRUS: Rol de la virulencia y la transmisibilidad del virus
- HOSPEDERO: Genética e Inmunología
Necesidad de conocer mejor la respuesta inmune contra
DENV: células B, T e inmunidad innata
Ayudará a determinar biomarcadores de riesgo además
de los signos de alarma clínicos
Qué rol tienen las Células NK en el
Dengue?
Rol protector de las células NK en humanos:
• El aumento de las células NK activadas con mayor actividad
citotóxica es asociado con una enfermedad de Dengue leve,
independientemente de las infecciones previas
Azeredo et al. Clin. Exp. Immunol. 2005
• Lísis directa y actividad ADCC de las células NK contra las células
infectadas por DENV in vitro, aumenta en presencia de plasma de
pacientes
Kurane et al. J Virol 1984; Kurane et al. Immunology 1986
Escape del virus a la respuesta de las células NK:
• Las proteínas NS de DENV aumentan la expresión del HLA para
escapar la citotóxicidad de las células NK (líneas NK y clones
virales)
Hershkovitz et al. J Virol 2008
Qué rol tienen las Células NK en el
Dengue?
Rol protector de las células NK en modelos de ratón:
• Aumento del número de células NK y su activación durante la fase
aguda de la infección primaria por DENV - asociado con el control
de la carga viral
Shresta et al. Virology 2004, Shresta et al. J. Immunol. 2005
•
Reclutamiento de las NK y NKT por los mastocitos al sitio de
infección, crucial para la eliminación del virus
St John et al. PNAS 2011
Qué son las Células NK ?
NK humanas; CD3-,CD56+, (NKp46+)
3er linaje de linfocitos
~5-20% de los linfocitos de la sangre
periférica
Participan en la inmunidad innata
Protegen contra los virus, bacterias
intracelulares, parásitos
intracelulares & tumores
Producen citocinas (IFNγ) & matan
células anormales, tienen algunas
características de la imunidad
adaptativa
Cómo las Células NK reconocen las
células blanco?
Glóbulos rojos, células neuronales
Células sanas
Células infectadas, tumores
Células infectadas, tumores
Células NK y el reconocimiento de las
células blanco
Reconocimiento
directo: rol en la
respuesta contra el
dengue?
ADCC: rol en la
respuesta contra el
dengue? Eva Harris
Fc receptor
Vivier E et al, Science 2011
Cómo reconocen las células NK a las células
infectadas por DENV?
Rol del receptor activador NKG2D?
CITOTOXICIDAD
DAP10
ACTIVACIÓN
Célula NK
NKG2D Ligandos
Célula infectada
por DENV
?
Effector
Cytokines
(IFN- g)
Ligandos de NKG2D:
MICA, MICB
ULBP-1,2,3,4,5,6
El receptor activador NKG2D de las células
NK y T, y el Dengue en humanos
Estudios epidemiológicos y de genoma humano (GWAS):
• Asociación de algunos alelos de MICA y MICB (ligandos del receptor
NKG2D) con la infección sintomática por DENV
García G et al. Hum Immunol 2011
• Asociación de la susceptibilidad al síndrome de choque por Dengue
con los genes MICB y PLCE1
Korr CC et al. Nat Genet 2011
Los ligandos de NKG2D en los humanos
Los ligandos de NKG2D son inducidos en células estresadas: células
infectadas por virus, bacterias intracelulares, tumores y otras
condiciones de estrés
>100 alleles!
H60c H60b
Adapted from Takaki & Lanier, "Viral and Immunological Malignancies”, 2005
Proyecto: Rol de las células NK en la
respuesta contra el Dengue
1. Qué ligandos de los receptores NKG2D y DNAM-1 son
inducidos durante la infección por dengue?
2. Cómo se comportan las células NK cultivadas con células
infectadas con dengue? Producción de citocinas e
inducción de muerte?
3. Recolección de muestras de pacientes sospechosos por
dengue, con la información clínica correspondiente
Se pueden utilzar las ligandos de NKG2D como
biomarcadores del prognóstico de la enfermedad
inducida por la infección por DENV?
Proyecto: Rol de las células NK en la
respuesta contra el Dengue
1. Qué ligandos de los receptores NKG2D y DNAM-1 son
inducidos durante la infección por dengue?
2. Cómo se comportan las células NK cultivadas con células
infectadas con dengue? Producción de citocinas e
inducción de muerte?
3. Recolección de muestras de pacientes sospechosos por
dengue, con la información clínica correspondiente
Se pueden utilzar las ligandos de NKG2D como
biomarcadores del prognóstico de la enfermedad
inducida por la infección por DENV?
Experimentos
Preparación de las reservas virales de Dengue – 4 serotipos (aislados de
Panamá) en células de mosquito C6/36:
5-8 días
Titulación de las reservas virales en células Vero – técnica de los
inmunofocos
5 días
Reservas tituladas para utilizar en los
experimentos:
DENV-1: 249474
DENV-2: 487625 y 249388
DENV-3: 246364
DENV-4: 479349
Yamilka Díaz, Davis Beltrán
Experimentos
Separación de las PBMC de la sangre en gradiente de ficoll, aislamiento de
monocitos y cultivo con citocinas (IL-4 y GM-CSF) para inducir
diferenciación en imDC
5-6 días
Verificación de la pureza de
las imDC por citometría
Infección de las imDC con DENV
24h y 48h pos-infección
Verificación del porcentage de infección de
las imDC con DENV por citometría
Detección de la expresión de los ARNm de
los ligandos por RT-PCR/qPCR
Detección de la expresión de las proteínas
ligandos por citometría
Davis Beltrán
Las imDC producidas in vitro a partir de
monocitos son puras (>90%)
•
Verificación del fenotipo de las imDC por citometría. El fenotipo
tiene que ser:
Lineage-CD1a+CD86+CD209+HLA-DR+
CD209+
Lineage-
CD1a+
CD86+
HLA-DR+
Simona Zompi, Sara Killingbeck
Porcentage de infección de las imDC por
DENV
•Varía entre cada donador y para cada aislado/serotipo
•Tiene que ser >60% para ver el efecto de la infección en la
expresión de los ligandos
Anti-NS3-PE
Inducción del ARN mensajero de los
ligandos por DENV-2
Norm alized to uninfected
Fo ld in d u ct io n - n o r m a liz e d t o u n in f e ct e d
20
18
16
14
12
OV2-172
10
DS210
8
6
4
2
0
MICA
MICB
ULBP-1
ULBP-2
ULBP-3
ULBP-4
ULBP-5
ULBP-6
•La infección de las imDC o de monocitos induce la expresión de los
ARNm de los ligandos de NKG2D: el ligando específico inducido parece
depender del donador donador – necesidad de aumentar la n≥7
donadores
•Ligandos que siempre se han detectado por ahora: MICA, ULBP-5 y
ULBP-6
Inducción de la expresión de los ligandos a
la superficie de las células infectadas por
DENV-2
Ligandos inducidos por la infección: MICA, ULBP-1, -3, -2-5-6
Anti-MICA-PE
Anti-ULBP-1-A488
Anti-ULBP-3-PE
Anti-ULBP-2-5-6-PerCP
Ligandos no inducidos por la infección: MICB y ULBP-4
Anti-ULBP-4-PerCP
Anti-MICB-APC
•La infección de las imDC o de monocitos induce la expresión de
superficie de los ligandos de NKG2D– necesidad de aumentar la n≥7
donadores
Conclusiones de la Etapa I del proyecto
•La infección por DENV aumenta la expressión de los ARNm de los
ligandos de NKG2D
 Mécanismo de indución de los ligandos?
•La infección por DENV aumenta la expressión de superficie de
algunos ligandos de NKG2D
El DENV trata de escapar a la respuesta NK inhibiendo la expressión
a la superficie de algunas proteínas ligando de NKG2D?
Se observa el aumento de ligandos de otros receptores activadores
de las células NK?
La expresión de los ligandos de NKG2D permite el reconocimiento de
las células infectadas por las células NK?
Qué induce esta interacción? Citotoxicidad y/o citocinas?
Proyecto: Rol de las células NK en la
respuesta contra el Dengue
1. Qué ligandos de los receptores NKG2D y DNAM-1 son
inducidos durante la infección por dengue?
2. Cómo se comportan las células NK cultivadas con células
infectadas con dengue? Producción de citocinas e
inducción de muerte?
3. Recolección de muestras de pacientes sospechosos por
dengue, con la información clínica correspondiente
Se pueden utilzar las ligandos de NKG2D como
biomarcadores del prognóstico de la enfermedad
inducida por la infección por DENV?
Avances de las etapas siguientes
Etapa 3 de recolección de muestras de pacientes
•Aprobación del protocolo del proyecto por el Comité de Bioética de la
Investigación del Hospital del Niño (HdN), aval del CEI del ICGES. Aval de la
Dirección general de salud del MINSA. En espera de la respuesta de Docencia
del HST y la CSS
•Instalaciones de salud que esperamos puedan participar:
Región Metropolitana
Región de San
Miguelito
Región de Panamá
Oeste
Hospital del Niño
CS de San Isidro
Hospital Nicolás Solano
Hospital Santo Tomás
CS del Valle Urracá
Policlínica de Arraiján
Hospital RD 24 de dic
Policlínica de San
Miguelito
Policlínica de la Chorrera
Centro de Salud (CS) de
Tocumen
Policentro de Parque
Lefevre
Policlínicas de San
Francisco y de Juan Diaz
Gracias!
ICGES-Panamá
TODO el Dpto. de Investigación
en Virología
Davis Beltrán, Yamilka Díaz,
Brechla Moreno, Julio Cisneros,
Alex Castillo, Marlene Castillo,
José Valenzuela
Estudiantes: Stanley Chen, Mario
Quijada, Yenesis Jordan
Administración: Ruth Helleby
Dpto. de Investigación en
Genómica:
Juan M. Pascale, Yamitzel
Záldivar
Gracias!
UCSF- USA
Lewis Lanier
Courtney Crane
Janice Arakawa-Hyot
UCBerkeley- USA
Eva Harris
Simona Zompi
Sarah Killingbeck
Banco de Sangre del
HST
Rolando Bonilla
Hospital del Niño
Dora Estripeaut
Ofelina Vergara
José Racine
Financiamiento:
UCSF Sandler Center for Drug Research in Tropical Diseases
Convocatoria de Captación de Talentos del SENACYT 2011: CAP11-003
1. Qué ligandos de los receptores activadores de las
NK son inducidos durante la infeción por DENV in
vitro?
Fo ld in d u ct io n - n o r m a liz e d t o u n in f e ct e d
18
16
14
12
24h D2S10
10
48h D2S10
24h DV2 172
8
48h DV2 172
6
4
2
0
MICA
MICB
ULBP1
ULBP2
ULBP3
ULBP5
ULBP6
Inducción: 24h: ULBP5 y ULBP6
48h: ULBP2 y ULBP-6
1. Qué ligandos de los receptores activadores de las
NK son inducidos durante la infeción por DENV in
vitro?
Norm alized to uninfected
Fo ld in d u ct io n - n o r m a liz e d t o u n in f e ct e d
20
18
16
14
12
OV2-172
10
DS210
8
6
4
2
0
MICA
MICB
ULBP-1
ULBP-2
ULBP-3
ULBP-4
ULBP-5
ULBP-6
Fo l d i n d u ct i o n - n o r m a l iz e d U V i n a ct iv a t e d
Norm alized to UV inactivated
20
18
16
14
12
OV2-172
10
D2S10
8
6
4
2
0
MICA
MICB
ULBP-1
ULBP-2
ULBP-3
ULBP-4
ULBP-5
ULBP-6
Las células NK y los virus de los
trópicos
- Las células NK responden en el tracto respiratorio durante la
infección aguda por Hantavirus y el nivel de NK en la sangre sigue alta
meses después de la infección Linderholm M, Scand J infect Dis 1993; Björkström NK, J Exp
Med 2011
- Las células NK responden y están activadas en pacientes con
infección aguda por CHIKV Petitmange C, PLoS Pathog 2011
- Las células NK combaten la infección por WNV mediante ADCC y
producción de IFNg. Las NK pueden reconocer directamente las
células infectadas con WNV o DENV por su receptor NKp44. Zhang M, BMC
Immunol 2010; Hershkovitz O, JI 2009
- La activación de las NK es importante en la protección contra la
infección letal en el CNS por VEEV en un modelo de ratón Huprikar J, J
Neurol Sci 1990
NKG2D - an activating NK receptor
NKG2D
– C-type lectin-like superfamily
– 1 gene, non-polymorphic, conserved
mice - humans
– Homodimer expressed on all NK
cells, gd T cells, and CD8+ T cells
– R in transmembrane associates with
D in DAP10 transmembrane
DAP10
– 10 kd homodimer
– Cytoplasmic YINM recruits Grb2 &
p85 PI3-kinase
Activation
Cytotoxicity
Proliferation
Producción y titulación de virus del dengue
Células
Serotipo
Aislado
Copias
ARNv/mL
PFU/mL
Vero
DENV-2
487625
8.9x10^7
1x10^6
C6/36
DENV-2
487625
8.9x10^6*
2.9x10^6*
C6/36
DENV-2
249388
1.42x10^7
8.5x10^4
C6/36
DENV-2
487625
NA
~10^3 Bajo
C6/36
DENV-2 UV
inactivado
487625
0
0
C6/36
DENV-1
249474
8x10^6*
2x10^6*
C6/36
DENV-3
241538
NA
~10^3 Bajo
Vero
DENV-3
241538
NA
~10^3 Bajo
Vero
DENV-3
246364
NA
9x10^5
C6/36
DENV-4
479349
5.9x10^6
9x10^5
Protective effect of NK cells in mice
• Increased NK cell numbers and activation
(CD69) during acute phase of primary dengue
infection
Shresta et al. Virology 2004
Escape of NK cell control by DENV
• Increased HLA I expression by DENV NS
proteins decreases NK cell cytotoxicity
Using NK cell lines and clones
Hershkovitz et al. J Virol 2008