Avances en la Investigación Agrícola, Pecuaria, Forestal y Acuícola en el Trópico Mexicano 2009 EXAMEN HISTOLÓGICO DE ÓRGANOS EN RATONAS ALBINAS UTILIZADAS COMO MODELO DE INFECCIÓN POR Brucella abortus David Itzcóatl Martínez Herrera1 Olivia Padrón Tello1 Magnolia Gricel Salcedo Garduño1 Margarita Robledo Salinas2 Evelyn Pulido Camarillo1 Álvaro Enrique Peniche Cardeña1 Arturo Moreno Loyo1 Apolo Adolfo Carrasco García1 Ricardo Flores Castro3 Francisco Morales Álvarez3 RESUMEN Para evaluar el uso de ratonas albinas (Mus musculus) como modelo para identificar cambios histológicos inducidos por Brucella abortus a partir de leche artificialmente infectada con la cepa RB51 de Brucella abortus, se emplearon 12 ratonas de 30 a 50 g sexualmente maduras que fueron divididas en dos grupos de seis. El grupo I se inoculó con 0.5 ml de leche ultrapasteurizada infectada con la cepa RB51 a dosis de 100 a 120 unidades formadoras de colonias (UFC) y el grupo control, sólo con leche ultrapasteurizada. Las ratonas se mantuvieron en condiciones de bioterio (22 a 24 °C y humedad relativa 50 a 60%) en cajas de plexiglas; se inocularon intraperitonealmente y se dividieron en subgrupos de 2/6 para cada grupo. Fueron sacrificadas por dislocación cervical a los 10, 20 y 30 días postinoculación. Se extrajeron hígado, bazo, y riñón y se fijaron con formalina al 10% para procesarse por la técnica histológica de Hematoxilina y Eosina. Se observó hepatomegalia, esplenomegalia y nefromegalia en las todas las ratonas del grupo I; pero, las del grupo II, no mostraron evidencia de cambios macroscópicos. Para el grupo I, los cambios histológicos observados en el hígado de 3/6, consistieron en degeneración hepática y; en el bazo 1/6, hiperplasia linfoide y en otra (1/6), hiperemia difusa. Para el grupo II, sólo se observó cambio en 1/6 a partir de riñón consistente en atrofia glomerular. No se encontraron diferencias significativas (p>0.05) entre los cambios histológicos de ambos grupos; ni asociación entre la inoculación con leche infectada y los cambios histológicos observados (OR = 6.54; IC95: 0.68 – 63). Se concluye que el modelo de infección de ratonas albinas puede ser empleado para la identificación de cambios histológicos por Brucella abortus a partir de leche, pero éstos deben tipificarse por técnicas histológicas como inmunohistoquímica o análisis de imágenes. Palabras clave: Inoculación, cepa RB51, degeneración, hiperplasia, Brucella abortus INTRODUCCION Los microorganismos del género Brucella poseen una membrana externa (ME), que contiene al lipopolisacárido (LPS) y las proteínas propias de la membrana (OMPs: “outer membrane proteins”); los cuales representan el punto de contacto inicial entre el patógeno y el hospedador y además, le confieren su clasificación rugosa o lisa a cada especie (Robinson y Melling, 1993; Estein, 2006; Castro et al., 2005). Durante el proceso infeccioso, si la especie es de baja virulencia, entonces la respuesta celular del sistema mieloide resuelve la infección, inclusive sin que ocurra la seroconversión pues la bacteria, es fagocitada por los leucocitos mononucleares en donde no sobrevive y tampoco se multiplica (Enright, 1990). Si la cepa es de alta virulencia, aún con las defensas celulares pueden llegar a otros sitios del organismo, lo que le permite localizarse en diversos órganos, tales como el hígado, el útero, la glándula mamaria y el bazo 1 Universidad Veracruzana. Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia. [email protected] Instituto Nacional de Investigaciones Forestales Agrícolas y Pecuarias. Centro de Investigación Regional Golfo Centro. Campo Experimental La Posta 3 Instituto Nacional de Investigaciones Forestales Agrícolas y Pecuarias. Centro Nacional de Investigación Disciplinaria en Microbiología Animal 2 399 Pecuario (Crowford, 1988) pues en este caso, los propios monocitos facilitan la diseminación de las bacterias y sirven de protección frente a las actividades bactericidas de anticuerpos y complemento y además; la transportan hacia los tejidos linfoides y los órganos del sistema fagocítico mononuclear, pues los macrófagos y los neutrófilos poseen la capacidad de destruir, aunque no por completo, a las brucelas fagocitadas (Spector et al., 1973; Eze et al., 2000). Los mecanismos activados para inhibir la multiplicación o destrucción de la Brucella incluyen la estimulación del estallido respiratorio y la producción de radicales oxígeno libres en los Monocitos Polimorfonucleares (Canning et al., 1988), en dependencia de la opsonización específica con Ac y/o inespecífica con C3b (Young et al., 1985). La cepa RB51 está desprovista de las cadenas laterales O del LPS; por tal carencia, no induce anticuerpos anti-O, en independencia de la edad, dosis o frecuencia de las inoculaciones; anticuerpos que podrían ser identificados por las pruebas estándares de diagnóstico para brucelosis (Casas, 2007); al ser una cepa atenuada, se elimina en un espacio de tiempo relativamente corto con capacidad abortiva pequeña o nula; aunque se ha sugerido que la cadena O es un factor esencial de este patógeno para la sobrevivencia en ratones (Godfroid et al., 1998). El aislamiento de Brucella spp es sin duda la demostración de su presencia; sin embargo, es limitado su desarrollo en medios de cultivo artificiales (Hernández et al., 1996; Ruíz, 1986). En un frotis teñido por Gram, Ziehl Neelsen modificado o Koster de muestras directas, la concentración de bacterias por ml o g de muestra, debe ser de por lo menos 1’000,000 unidades formadoras de colonias (UFC); de igual forma, para que se puedan aislar en medios de cultivo, su concentración deberá ser de 1,000 UFC por ml o g como mínimo (López et al., 1991; Yeager et al., 1967). El diagnóstico bacteriológico, limita el conocimiento a detalle del agente (Alton et al., 1976; Díaz et al., 2001; Hernández et al., 1996; OIE, 2000) así como, los cambios morfológicos; aunque, no son características de un órgano o enfermedad (Trigo, 1993) y; al ser incoloros, las células y los tejidos del organismo, impide identificarlos y diferenciarlos durante la observación microscópica (Ayala et al., 2001), pero gracias a las sustancias que los constituyen (azúcares, aminoácidos, lípidos), pueden colorearse con sustancias químicas (Junqueira y Carneiro, 2003). Bruce aisló por primera vez a Brucella melitensis a partir del bazo de un cadáver humano en 1886 (Ruiz, 1986); sin embargo, el aislamiento de Brucella spp a partir de sangre y exudados de enfermos y de productos lácteos ha tenido siempre muchas dificultades, pues depende de la fase septicémica (Alton et al., 1976; Díaz et al., 2001). La crianza de diversas especies con diferentes funciones zootécnicas; la forma de producción ganadera que incluye la tecnología y los tipos, formas y tamaños de la propiedad, puede determinar el perfil de la salud animal; por otro lado, las condiciones de comercialización de productos lácteos así como los hábitos de consumo por parte de la población, determinan la facilidad para la transmisión de la enfermedad de acuerdo al Instituto Nacional de Diagnóstico y Referencia Epidemiológicos (INDRE) y de la Secretaría de Salud (SS), que reportan aislamientos de B. melitensis y B. abortus como los más frecuentes, y en menor proporción B. suis y B. canis; situación que coincide con los informes del CENID-Microbiología Veterinaria del INIFAP quienes, además, registran aislamientos de B. ovis (Gurría, 1998). Los ratones Mus musculus se han empleado para la evaluación de daños por la infección por cepas conocidas de Brucella spp, para la evaluación de la potencia de las vacunas que se emplean en los animales (Baldwin y Parent, 2002; Nájera et al., 1980); sin embargo, se adolece de información con respecto a si la inoculación de al menos 100 UFC (Yeager et al., 1967) podría ser suficiente para infectarlos y que la bacteria pueda reproducirse en los tejidos en cantidad suficiente para que se puedan observar cambios morfológicos en los órganos blanco, en esta caso bazo, hígado y riñón. Al evaluar el modelo ratón (Mus musculus) se logró el aislamiento de B. abortus a partir de los riñones de hembras infectadas artificialmente con la cepa RB51; observándose también hepatomegalia, esplecnomegalia y nefromegalia (Lara, 2007); pero se carece de información acerca de observación microscópica de cortes histológicos referentes a Brucella spp, por lo que la observación de lesiones histológicas en órganos obtenidos de ratonas que fueron inoculadas con una vacuna comercial elaborada con la cepa RB51 de Brucella abortus en caso de que se observen, ofrecerán una ventaja para que el modelo ratón sea una alternativa de recuperación de cepas de campo a partir de leche de bovino procedente de hatos que, de acuerdo con pruebas serológicas oficiales, son considerados como afectados y demostrar infección activa. 400 Avances en la Investigación Agrícola, Pecuaria, Forestal y Acuícola en el Trópico Mexicano 2009 Por lo que evaluar histológicamente hígado, riñón y bazo de ratones albinos hembras (Mus musculus) utilizados como modelo de infección por Brucella abortus; para identificar lesiones e interpretarlas, es necesaria para aportar información acerca de los hallazgos presentes. MATERIALES Y MÉTODOS Se emplearon los órganos parenquimatosos (hígado, bazo y riñon) obtenidos de 12 ratonas albinas sexualmente maduras y con un peso corporal de entre 30 y 50 g; las cuales se dividieron en dos grupos de seis hembras cada uno para ser inoculadas por vía intraperitoneal. El grupo I, con un inoculo elaborado con la vacuna comercial de cepa RB51 de Brucella abortus con título certificado por el laboratorio Nova Litton de México, S.A. de C.V diluida con leche entera de bovino ultra pasteurizada como diluente, para obtener una concentración de 100 a 120 UFC contenidas en 0.5 ml y; el grupo II, se inoculó sólo con el diluente y se colocaron en dependencia del grupo al que pertenecían, en cajas de plexiglás en condiciones de bioterio (22 a 24 °C y humedad relativa 50 a 60%). A los días 10, 20 y 30 post-inoculación, dos ratonas de cada grupo fueron sacrificadas por dislocación cervical de acuerdo con el National Research Council, (2001); y bajo condiciones de esterilidad, se extrajeron e inspeccionaron hígado, bazo y riñón, los cuales se colocaron en formalina al 10% para su adecuada fijación (Celani et al., 1984). Los órganos obtenidos se procesaron en un histoquinete Hendrey que intercaló su inmersión en las sustancias propias para su fijación como fueron el formol al 15%; deshidratación, alcohol etílico de 96° y alcohol etílico absoluto; preparación, alcohol absoluto y xilol; inmersión en xilol para por último impregnar con parafina e impedir con ello, el paso del agua. Los órganos fueron incluidos en la unidad bloqueadora y en forma manual con ayuda del micrótomo Spencer, se cortaron los bloques a un grosor de cinco m, los cuales se depositaron en un baño de flotación con grenetina y, se colocaron en un portaobjetos identificado. Después, se desparafinaron por medio de calor a una temperatura de 55 a 60°C y posterior a ello, con xilol. Para la tinción de rutina se utilizaron, los reactivos Hematoxilina de Harris y Eosina Amarillenta; kit comercial de Hycel; la cual inició con xilol por cinco minutos, alcohol absoluto, alcohol etílico de 96°, alcohol etílico de 80°, agua destilada, hematoxilina por tres minutos, agua corriente, agua amoniacal, agua corriente, alcohol 96°, eosina por cinco minutos, en alcohol 96°, alcohol etílico absoluto, xilol y por último, las laminillas se mantuvieron en otro recipiente con xilol hasta su montaje con el cubreobjetos (Alzola, 2001). Una vez listas, se observaron al microscopio con los objetivos 10X y 40X para identificar en primera instancia el tejido al que pertenecen y posterior a ello, las lesiones o cambios histológicos. Los resultados obtenidos se analizaron para significancia por chi cuadrada y para asociación, por Odds Ratio (OR) con el programa Win Episcope 2.0 (Thrusfield et al., 2001). RESULTADOS Y DISCUSIÓN Los cambios histológicos observados en los cortes realizados en los hígados de las ratonas del grupo I, presentaron moderada degeneración; en bazo moderada hiperplasia linfoide un una ratona e hiperemia difusa en otra; y no se encontraron cambios en los cortes histológicos de los riñones. En los órganos de las ratonas del grupo II, solo se observó atrofia glomerular en un corte. A pesar de que no se encontraron diferencias significativas entre las ratonas del grupo I y II (p>0.05); sin embargo, sí se observa asociación entre la inoculación con leche infectada y los cambios histológicos (OR = 6.54; IC95: 0.68 – 63). Lo que significa que los cambios observados pudieran estar relacionados por la inoculación de la leche infectada por las bacterias, pero el tamaño de la muestra, no es suficiente para establecer diferencias estadísticas significativas, como puede observarse en Cuadro 1. Cuadro 1. Diferencia de cambios histológicos observados entre ratonas de los grupos I y II Ratonas Con cambios Sin cambios Total Grupo I 5ª 13a 18 Grupo II 1a 17ª 18 Total 6 30 36 *Letras iguales entre filas no difieren para P>0.05; sin embargo, OR = 6.54 (IC95: 0.68 – 63) 401 Pecuario La primera especie del género Brucella fue aislada a partir del hígado y bazo de pacientes que murieron como consecuencia de las complicaciones de la brucelosis (Bruce, 1924) entre ellas, su presentación nerviosa, lo cual se explica debido a la presencia de las células del sistema fagocítico mononuclear presentes en el hígado (células de Kuppfer) y bazo; incluso en el riñón que también cuenta con este tipo células, como son las del Mesangio (Tizard, 2004) explican el aumento del tamaño de los órganos y los cambios celulares que se presentan en ellos. Así también, la utilización de animales de laboratorio como ratones, cuyes o conejos para demostrar la presencia de Brucella spp (Alton et al., 1976) en muestras de tejidos animales o sus subproductos, se ha empleado con resultados variables; sin embargo, de estas especies son el hígado, el bazo y el riñón los órganos de elección para los estudios bacteriológicos e histopatológicos. La utilización de la cepa mutante rugosa de Brucella abortus, tiene una deficiencia en las cadenas laterales del antígeno “O”, factor esencial que permite la sobrevivencia en ratones (Godfroid et al.,1998); razón por la que es rápidamente controlada por la respuesta celular del sistema mieloide (Enright, 1990) alrededor de las cuatro semanas postinoculación (Baldwin y Parent, 2002). F r e c u e n c i a Hígado Figura 1. Diferencias de cambios histologicos en Higado de ratonas de Grupo I y Grupo II La mayoría de los cambios histológicos observados en las ratonas que pertenecen al grupo I, se encontraron en el hígado (Figura 1), en donde además de identificarse la hepatomegalia señalada por Bruce (1924) y Ruíz, (1986), el aumento del tamaño del órgano es debido a la infiltración de macrófagos tisulares y degeneración hidrópica ocurrida en esas células, ya que el daño causado por un agente patógeno como Brucella abortus, es restituido gracias a la regeneración de células, y los macrófagos que desempeñan un papel determinante, pero si además, se trata de parásitos intracelulares facultativos (Montaraz, 1997), los linfocitos T cooperadores de la clase Th1, son los encargados de liberar substancias quimiotácticas para macrófagos como lo son los interferones y el factor de necrosis tumoral para eliminar el agente causal y por tanto, promueven la migración de una mayor cantidad de estos tipos celulares, para reabsorber en su caso el exudado y por último, regenerar los tejidos destruidos. Este último proceso, no siempre se lleva a cabo de manera adecuada, pues es necesario contar con un microambiente favorable y los estímulos físicoquímicos óptimos, pues si esto no se logra, el proceso de reparación termina con una cicatriz que en algunos casos es un granuloma o bien una lesión granulomatoide (Trigo, 1993). Las cepas de campo de Brucella abortus, inducen la formación de lesiones granulomatoides, en cambio, la cepas vacunales conocidas, son procesadas por los macrófagos del sistema mieloide en poco tiempo como lo señalan Baldwin y Parent (2002). Las diferencias en la celularidad que se observaron en el bazo de las ratonas inoculadas con la cepa RB51 (Figura 2) están ligadas a las características anatomofuncionales del órgano, debido a que puede experimentar cambios patológicos, porque es el blanco primario de muchos procesos morbosos (Junqueira et al., 2003), cumple múltiples funciones como la hematopoyesis, como lo es la filtración sanguínea y, es el sitio principal donde se desarrollan las respuestas inmunes contra los patógenos que alcanzan la circulación sanguínea (Trigo, 1993). 402 Avances en la Investigación Agrícola, Pecuaria, Forestal y Acuícola en el Trópico Mexicano 2009 F r e c u e n c i a Bazo Figura 2. Diferencias de cambios histologicos en Bazo de ratonas de Grupo I y Grupo II Los folículos esplénicos contienen linfocitos B, que proliferan en una intensa respuesta inmunitaria, pero deben ser activados por los linfocitos T CD4+ de la clase Th2 (Montaraz, 1997; Tizard, 2004) frente a la presentación de antígenos por parte de monocitos y células dendríticas que son macrófagos; por lo que la hiperplasia se debe a que el número de células aumenta, en consecuencia a los procesos infecciosos subagudos o crónicos como la brucelosis. Así, los antígenos son captados por los macrófagos que se ubican en la zona marginal y tapizan los sinusoides de la pulpa roja, transportan los antígenos a los folículos primarios de la pulpa blanca y es a partir de estos, donde después de unos días, emigran las células productoras de anticuerpos y, al igual que en la respuesta inmune primaria, las células productoras de anticuerpos emigran desde esos folículos hacia la pulpa roja y hacia la zona marginal, donde se efectúa la mayor parte de la producción de anticuerpos, aunque, algunos pueden producirse en el interior de los folículos ya hiperplásicos (Tizard, 2004). La hiperemia se relacionada a un curso agudo de alteraciones en el flujo sanguíneo y estímulo de sustancias vasodilatadoras liberadas en el tejido; como suele ocurrir en la fiebre (González, 2005); signo común de la brucelosis, por tratarse de un patógeno intracelular facultativo y por ello, se activan los linfocitos Th1 para la secreción de interferones y el factor de necrosis tumoral α que sirven como activadores de macrófagos para destruir a los microorganismos intracelulares por un mecanismo distinto al del sistema inmuno – peroxidasa, el de óxido nitroso (Montaraz, 1997). El único cambio histológico en riñón fue atrofia glomerular y fue observado en una ratona perteneciente al grupo control (Figura 3); condición que no se atribuye a Brucella abortus, pues ésta es capaz de causar pielonefritis que se relaciona con la cronicidad (Borts, 1960). 403 Pecuario F r e c u e n c i a Riñón Figura 3. Diferencias de cambios histologicos en Riñon de ratonas de los Grupos I y II Los modelos de infecciones experimentales son útiles para el entendimiento de la multiplicación de las bacterias dentro de los tejidos animales; así también, otros trabajos han mencionado que si Brucella spp se encuentran por debajo de la dosis mínima necesaria para manifestarse en medios de cultivo artificiales (Dietelleux et al., 1988; Ruíz, 1986), las pruebas biológicas son una opción; sin embargo, las ratonas inoculadas con la cepa RB51 de Brucella abortus pertenecientes al grupo I, presentaron cambios histológicos en bazo e hígado, aunque no en significancia (p>0.05) estadística suficiente, para sugerir que a la dosis empleada, se obtengan cambios importantes que caractericen lesiones específicas, pero, también se observó que los cambios histológicos encontrados, sí están asociados con la inoculación de la cepa RB51 (OR = 6.54 ;IC95: 0.68 – 63). CONCLUSIONES Se encontró asociación entre los cambios histológicos de los órganos de las ratonas inoculadas con leche de bovino infectada con cepa RB51 de Brucella abortus (OR = 6.54;IC95: 0.68 – 63); sin embargo, no son significativos (p>0.05). Los cambios encontrados en las ratonas inoculadas con cepa RB51 en el hígado, corresponden a degeneración hepática y en el bazo a hiperplasia linfoide e hiperemia difusa, por lo que tampoco es posible establecer una característica específica de daño por infección causada por Brucella abortus. No se observó pielonefritis en los riñones de las ratonas inoculadas con la cepa RB51. AGRADECIMIENTOS La investigación fue financiada por el proyecto “Estudio comparativo de la eficacia de la cepa RB51 y cepa S19 para prevenir la brucelosis en hatos con diferentes condiciones sanitarias”, del Instituto Nacional de Investigaciones Forestales, Agrícolas y Pecuarias (INIFAP) para la Convocatoria SAGARPA-CONACYT 2004 Fondo Sectorial 23. 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