microscopia i

COLEGIO DE LOS SAGRADOS CORAZONES
PADRES FRANCESES
BIOLOGÍA
Laboratorio Nº 1 "Microscopia y niveles de organización celular"
Introducción
Todos los seres vivientes están constituidos por células, en algunos
casos una sola célula conforma un organismo completo (unicelulares), en otros
más complejos muchas células se han organizado para constituir un organismo
(pluricelulares). Lo anterior ha llevado a la especialización celular para la
realización de variadas funciones, producto de lo cual, es posible observar una
muy amplia diversidad celular. Así por ejemplo, existen múltiples formas y
tamaños celulares, como también, diferentes niveles de organización:
1)
2)
los procariontes de una organización estructural simple, no
presentan compartimentos intracelulares. El DNA se encuentra
disperso en el citoplasma ocupando una posición mas o menos
central;
los eucariontes, en cambio presentan una mayor complejidad,
poseen compartimentalizaciones y han desarrollado una multiplicidad
de estructuras membranosas adaptadas para realizar funciones
específicas denominadas organelos. El material genético se
encuentra en un compartimento denominado núcleo.
El estudio de la estructura y funciones celulares ha experimentado tres
períodos fundamentales de progreso. El primer periodo se inicia a comienzos
del siglo XVII y se caracteriza por el descubrimiento de un mundo diminuto, no
detectable por el ojo humano pero sí por lupas o lentes. Las primeras
observaciones fueron de glóbulos rojos sanguíneos por Fierre Borel en 1656.
En 1665, Robert Hooke introdujo el término célula para describir la estructura
del corcho y en 1674, Antón van Leeuwenhoek observó organismos
unicelulares vivos. Al paso de los años, los lentes se perfeccionaron y
transformaron en microscopios ópticos. En 1838-1839, Mathias Jacob
Scheiden y Theodor Schwann formularon la teoría celular, que considera a la
célula como una unidad estructural común de todos los seres vivientes, y que
una célula madre es capaz de dividirse en dos células hijas. Esto último fue un
aporte hecho por Rudolph Virchow en 1858. Ya a fines del siglo XIX se
dispuso de tinción y fijación de los tejidos que permitieron una enorme
recopilación de detalles celulares como la división celular y la fecundación
celular. Los fenómenos de evolución y herencia empezaron a tener gran
importancia. El segundo período, comienza a fines del siglo XIX y se
caracteriza por la tentativa de interpretar las estructuras celulares con respecto
a su función. El tercer período en cambio, acentúa el conocimiento de la
función de lo componentes celulares a nivel molecular.
El microscopio es sin duda el elemento más importante para el estudio
de la morfología celular. El tipo de microscopio más utilizado es el microscopio
óptico, que se sirve de la luz visible para crear una imagen aumentada del
objeto. El microscopio óptico más simple es la lente convexa doble con una
distancia focal corta. Estas lentes pueden aumentar un objeto hasta 15 veces.
Por lo general se utilizan microscopios compuestos, que disponen de varias
lentes con las que se consiguen aumentos mayores. Algunos microscopios
ópticos pueden aumentar un objeto por encima de las 2.000 veces, lo que
resulta de gran utilidad considerando, por ejemplo, que una célula animal típica
mide entre 10 y 20 μm de diámetro.
El microscopio compuesto puede dividirse en:
1) Sistema mecánico; conformado por:
a) El pie o base de sustentación.
b) El brazo o columna.
c) La platina; que consiste en una plataforma horizontal con un orificio central
por donde pasa la luz. Es aquí donde se ubica la preparación en un carro móvil
que permite desplazarla.
d) El tubo; es un cilindro metálico que lleva en el extremo próximo al
observador el ocular y el revolver en el extremo opuesto.
e) El revólver es una pieza giratoria que posee diferentes lentes objetivos,
cada uno de ellos posee un aumento distinto. Al girar esta pieza es posible
utilizar estos lentes para la observación.
f) Los tornillos de focalización; el enfoque se realiza modificado la distancia
entre la preparación y el objetivo. El ajuste se realiza con dos tornillos; el
macrométrico que se usa para los ajustes gruesos y el micrométrico para el
ajuste fino o de precisión. Este último tiene una escala graduada, en donde
cada marca representa un avance de dos micrones.
2) Sistema óptico está compuesto por:
a) La fuente luminosa que se ubica bajo el condensador.
b) El condensador consiste en un sistema de lentes que concentra la luz en la
preparación. Posee un tornillo de control que permite mover este dispositivo.
c) El diafragma o iris; se localiza en el condensador y permite regular la
cantidad de luz que sale de este.
d) Anillo porta filtro; permite colocar un filtro de color anexo al condensador
para destacar alguna estructura de interés en la preparación.
e) Lentes oculares; se encuentran en la parte superior del tubo, por lo general
tienen un aumento de 8X, 10X ó 12X. Los oculares están formados
generalmente por un sistema de dos lentes plano convexas simples o
compuestas, separadas por un diafragma interno. El lente inferior se denomina
"lente de campo" y tiene por función recoger la mayor cantidad de rayos
divergentes que vienen del objetivo. Tiene su foco en el diafragma y ahí la
imagen es aumentada por el lente superior.
f) Lentes objetivos; se encuentran montadas en el revólver que permite su
intercambio durante la observación. Las diferentes lentes están marcadas con
su aumento y la apertura numérica, vale decir el lente tiene la marca 10:1:AN
0.25 significa que ese objetivo tiene un aumento de 10, siendo su apertura
numérica 0.25. La lupa u objetivo menor tiene un aumento de 4X, los otros
generalmente son 10X, 40X y 100X. En ocasiones también se habla de
"objetivos a seco" y de "objetivos de inmersión", haciendo referencia a lo que
se encuentra entre la preparación y el objetivo. Así el objetivo a seco se refiere
a que entre la preparación la lente existe aire, mientras que los objetivos de
inmersión requieren que exista entre la lente y la preparación una sustancia
conocida como aceite de inmersión.
Microscopios especiales
Varias propiedades ópticas pueden utilizarse en combinación con un
microscopio. Nos referiremos al microscopio de campo oscuro, contraste de
fases, fluorescencia y al microscopio electrónico.
Microscopio de campo oscuro
Se basa en la propiedad que tienen los objetos muy pequeños del orden
de la
longitud de onda de la luz (o el borde de algunos objetos microscópicos tales
como membranas celulares o de organelos) de dispersar la luz, o sea el rayo
de luz se “quiebra” al pasar por ellos. Si iluminamos oblicuamente el objeto en
tal forma que el rayo de luz no entre al objetivo, se observará un campo oscuro
negro. Las membranas biológicas, macromoléculas como las proteínas desvían
la luz que los ilumina, permitiendo de este modo que la luz entre al objetivo y
sea vista por el observador.
Microscopio de contraste de fases
En este caso la luz es retardada en ciertas zonas del condensador y
acelerada para compensar en las zonas correspondientes del objetivo, por lo
tanto si no hay preparación el resultado es compensado. Al haber preparación,
la luz se desvía más o menos de acuerdo a la refracción. La luz retardada por
el condensador en estas condiciones no pasa por la parte aceleradora del
objetivo y el retardo de ella se hace evidente al observador.
Además los diferentes índices de refracción de las distintas fases de la
muestra producirán diferentes desviaciones. El resultado es que la luz
proveniente de la zona límite entre dos fases llega al observador con diferentes
grados de retardo, produciendo zonas oscuras donde hay cambio de fases.
Microscopio de Fluorescencia
Un objetivo fluorescente es aquel que al recibir la luz de onda corta, la
absorbe y emite luz de onda más larga. La mayoría de los especímenes
biológicos no son fluorescentes pero puede añadirse a la preparación un
marcador fluorescente. El microscopio de fluorescencia requiere dos filtros: uno
que deje pasar la luz de onda corta, pero no la de onda larga, para iluminar el
objeto o el marcador, y el otro que bloquea el paso de la luz de onda corta,
usada para iluminar y deja pasar la luz de onda larga, emitida por el objeto.
Microscopio Electrónico
Este instrumento, permite aumentos cercanos a 1.000.000 X (mil veces
el aumento del microscopio de luz), logrando visualizar átomos y moléculas. Su
introducción en la década de los 50 abrió el campo de la Citología clásica a la
Biología Celular actual. El principio de este instrumento es simple, puesto que
la óptica usada es la misma que la del microscopio de luz (o compuesto),
usando electrones con una longitud de onda de fracciones de nanómetros. Los
electrones son fáciles de producir (basta un filamento caliente como el de una
ampolleta) y de acelerar para lograr una longitud de onda pequeña, pero no
pasan por el aire, por ello el elemento más importante de un microscopio
electrónico son sus bombas de vacío.
El microscopio electrónico de transmisión consta de una columna donde
está el cañón de electrones, condensadores, objetivo, lentes intermedias,
ocular – proyector y el portaobjetos. Como los electrones no son visibles al ojo
humano incluyen una pantalla de observación y un sistema fotográfico A
diferencia del anterior, el microscopio electrónico de barrido no posee lentes,
salvo condensadores. Estos producen un haz muy fino de electrones que
choca en la superficie de la muestra y se desprenden nubes de electrones
secundarios. Estos, son reconocidos por un detector que asociado a un
sistema generador de imágenes nos da una imagen de la superficie de la
muestra.
Instrucciones básicas
Antes de observar cualquier preparación debe tener presente que el
microscopio es un instrumento delicado. Debido a esto debe utilizarse tomando
en cuenta algunas instrucciones básicas:
a) Coloque el microscopio en una posición cómoda sobre una superficie plana.
Tómelo siempre del brazo o columna. Si desea cambiar la posición del
instrumento levántelo y NO lo arrastre por el mesón.
b) Es conveniente chequear la limpieza de los diferentes lentes antes de
comenzar la observación
c) Encienda la lámpara, baje el condensador y abra el diafragma
completamente.
Realización de la observación
a) Aleje el objetivo de la platina y coloque la lente de aumento menor.
b) Seleccione la preparación que desea observar, revísela para asegurarse que
esta se encuentra limpia.
c) Abra la pinza del carro, coloque la preparación con el cubreobjeto hacia
arriba y cierre el carro.
d) Ajuste la posición del carro de modo que la región a observar quede justo en
el orificio de la platina.
e) Usando el macrométrico acerque la lente a la preparación. Cuando logre un
foco aproximado utilice el micrométrico (gírelo lentamente) para el ajuste de
precisión.
f) Si desea cambiar el aumento, gire el revólver y seleccione el nuevo objetivo a
utilizar. Debiera bastar un pequeño ajuste del micrométrico para llegar a foco, si
fuera necesario reajuste la iluminación usando el condensador. Si requiere usar
el lente de inmersión NUNCA lo use como objetivo seco, puede rayarlo.
Uso del objetivo de inmersión
a) La preparación debe estar enfocada a 40X (objetivo a seco), gire el revólver
de modo que el objetivo de inmersión quede en una posición intermedia (40X y
100X).
b) Coloque una gota de aceite de inmersión sobre el cubre objeto.
c) Lleve el objetivo de inmersión al eje óptico.
d) Utilizando el tornillo micrométrico lleve el objeto a foco, si lo requiere
modifique la cantidad de luz del condensador.
e) Cuando finalice la observación baje la platina, retire la preparación. Limpie
tanto el objetivo como la preparación con un paño humedecido con Xilol.
Al finalizar las observaciones el microscopio y las preparaciones deben quedar
limpios. Gire el revólver y deje la lupa como lente de observación. Apague la
lámpara y enrolle el cordón en el pie del microscopio.
Asegúrese de colocar el microscopio en una superficie plana (no al borde de la
mesa) cubierto por su funda.
Descripción de lo observado
Debe seguir una estructura, que puede variar según el observador, pero que
debe ser sistemática y ordenada. Se sugiere que considere en sus
observaciones el siguiente esquema:
a) Objetivo: referido al porque se realiza la observación (Ej. observación de
núcleo )
b) Material: es el órgano o tejido del que se obtuvo la preparación (Ej. riñón de
rata)
c) Método: se refiere a la técnica histológica usada para elaborar la
preparación (a fresco o permanente) y a la tinción utilizada. ( Ej. preparación a
fresco de células catáfilo de cebolla)
d) Aumento: la amplificación del objeto observado y depende del ocular y del
objetivo.
Aumento = aumento del objetivo x aumento del ocular.
e) Observaciones: considere describir la forma celular; relación con otros
elementos presentes, tamaño celular; forma, número y posición del núcleo y
algunas características del citoplasma.
Objetivos específicos
Partes de un microscopio óptico
- Conocer las partes del microscopio compuesto y sus funciones.
- Aprender a realizar una preparación.
- Aprender a realizar una observación utilizando el microscopio compuesto.
- Diferenciar células procariontes y eucariontes.
- Reconocer diferencias entre células animales y vegetales.
Actividades
1.- Dibuje un esquema en el que señale las diferentes partes del microscopio.
2.- Observe preparaciones que contienen letras.
3.- Realice una preparación de catáfilo de cebolla, para ello, coloque un trocito
de catáfilo en un portaobjetos, añada unas gotas de agua y cubra con un
cubreobjetos limpio. En otro portaobjetos realice el procedimiento anterior y
añada gotas de azul de metileno, deje actuar por 2 min, lave con agua cubra
con un cubreobjetos limpio. ¿Qué diferencias observa en las preparaciones?
Dibuje y anote sus observaciones. Recuerde realizar las observaciones según
las indicaciones de su guía. Señale el aumento, describir formas, estructuras y
posición de éstas.
4.- Realice una preparación de palito de fósforo, para ello, coloque un trocito de
en un portaobjetos, añada unas gotas de agua y cubra con un cubreobjetos
limpio.
5.- Realice una preparación utilizando una hoja de bisturí para cortar una
lámina muy fina de corcho. Colóquela en un porta objetos, añada unas gotas
de agua y cubra la preparación con un cubre objetos. Realice un dibujo de lo
observado y describa.
6.- Observe las imágenes de bacterias que se le presentan, seleccione una
dibuje y descríbala en forma detallada.
I
7.- Observe una preparación de neurona, teñida con azul de toluidina, indique
las diferencias estructurales con el resto de muestras e imágenes observada.
8.- Observación de microfotografías
y compárelas con el resto de las
muestras observadas.