ENUMERACIÓN CELULAR

ENUMERACIÓN CELULAR
EXTRACCIÓN DE PBMCs. MÉTODO FICOL
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Mezclar sangre con solución fisiológica 10 ml/10 ml
Añadir 10ml de Ficol
Centrifugar 20´a 20ºC a 1200 rpm
Recoger banda PBMCs
Añadir al tubo donde se encuentran los PBMCs solución fisiológica hasta
50 ml
Centrifugar 5´a 4ºC a 1300 rpm
Desechar el sobrenadante
Resuspender en medio completo
Este procedimiento se realiza tanto con la sangre que tomamos como control
(2 veces) como con la sangre de nuestro paciente (JLB AR41).
MEDIO COMPLETO  45 ml RPMI 1640 + 5 ml Suero fetal bovino (10%).
CONTAJE CÉLULAS TOTALES
Preparar una dilución ½ con la suspensión celular (20 μl) y trypan blue (20
μl) e introducirlo en una cámara neubauer, a continuación realizar el contaje de
las células vivas (contamos las diagonales de los 4 cuadrantes y hacemos una
media).
N = X(media) . 16 . dilución . volumen del liquido cuadrante = [celular]
millones de celulas/ml.
Ncontrol = 31 . 16 . 2 . 10000 = 9,9 millones células/ml.
Npaciente = 18,375 . 16 . 2 . 10000 = 5,88 ≈ 5,9 millones células/ml.
PREPARACIÓN MICROPARTÍCULAS
Preparar una dilución 1/100 de calibrites en PBS con gelatina (0,005%).
Ponemos en un falcon 5 ml de PBS y 0,0025 g de gelatina, calentamos a
37ºC. Con ello conseguimos tener en el falcon 50 μl de partículas.
PREPARACIÓN DE LOS ESTÍMULOS
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IL-2  En un tubo ponemos 2 μl del stardar de IL-2 y lo llevamos hasta 5
ml con medio completo.
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TCE  En un tubo ponemos 2,5 μl TCE (madre) y llevamos hasta 50 μl
con medio completo.
PREPARACIÓN CULTIVOS Y BASAL
En una placa de 96 pocillos, queremos tener por pocillo, 200 μl de volumen
final y 50000 células. (En cada pocillo echaremos 100 μl de estímulo y 100 μl de
células).
Por lo tanto utilizando la fórmula Ci . Vi = Cf . Vf prepararemos las soluciones
tanto del paciente como del control para tener las condiciones antes
mencionadas.
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Control  9,9 millones células/ml . 0,8 ml = 0,5 millones células/ml . V f
 15,84 ml – 0,8 ml = 15 ml.
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Paciente (JBL AR41)  5,9 millones células/ml . 1,3 ml = 0,5 millones
células/ml . Vf  15,34 – 1,3 ml = 14 ml.
DISEÑO EXPERIMENTAL
BASAL
Tenemos los 8 tubos (4 control y 4 paciente) en los que hay 200 μl y 50000
células. Lo que vamos a realizar ahora es un marcaje con anticuerpos
monoclonales (añadimos 5 μl de cada anticuerpo) con el siguiente panel:
MARCAJE 1
MARCAJE 2
FL-1
CD3
CD62
FL-2
CD25
CD56
FL -3
CD4
HLADR
FL-4
CD19
CD3
Lo que hacemos es marcar 2 tubos del control con marcaje 1, 2 tubos del
control con marcaje 2, 2 tubos del paciente con marcaje 1 y 2 tubos del paciente
con marcaje 2.
Después de marcar lavamos, centrifugamos 5´ a 1300 rpm, decantamos el
sobrenadante, resuspendemos y añadimos 100 μl PBS y 100 μl solución con
micropartículas.
Seguidamente vamos a adquirir las células (2000 micropartículas en R2).
CULTIVO (4 DÍAS DESPUES)
El diseño de la placa es el siguiente:
MEDIO
TCE
CONTROL
MEDIO
IL-2
1
2
3
4
9
10
11
12
PACIENTE
MEDIO
IL-2
5
6
7
8
13
14
15
16
En la placa se echan: 100 μl células y 100 μl de IL-2 o 4 μl TCE (dependiendo
en que pocillo sea).
Se siembra la placa con este diseño y se deja en cultivo 4 días en la estufa.
Después de estos 4 días, recogemos los pocillo (resuspendiendo antes el
pellet de células) y los ponemos en 16 tubos. A continuación vamos a realizar el
marcaje con anticuerpos (5 μl): los tubos impares con el marcaje 1 y los tubos
pares con el marcaje 2. Luego lavamos: centrifugamos 5´a 1300 rpm,
decantamos el sobrenadante, resuspendemos y añadimos 100 μl PBS y 100 μl de
micropartículas. Seguidamente adquirimos (2ooo micropartículas para R2).
NOTA:
- Incidencias en el marcaje del tubo 1 (cultivo después de 4 días)  se ha
marcado con CD3 en FL-4 (extra).
- Mal contaje de la micropartículas en el tubo 3 (cultivo celular después de
4 días)