mutantes del virus de la rabia atenuados estables y vacunas vivas

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OFICINA ESPAÑOLA DE
PATENTES Y MARCAS
C12N 7/04 (2006.01)
A61K 39/205 (2006.01)
A61P 31/14 (2006.01)
ESPAÑA
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11 Número de publicación: 2 283 150
51 Int. Cl.:
TRADUCCIÓN DE PATENTE EUROPEA
T3
86 Número de solicitud europea: 99973064 .1
86 Fecha de presentación : 19.11.1999
87 Número de publicación de la solicitud: 1131414
87 Fecha de publicación de la solicitud: 12.09.2001
54 Título: Mutantes del virus de la rabia atenuados estables y vacunas vivas de los mismos.
30 Prioridad: 27.11.1998 EP 98204001
73 Titular/es: Intervet International B.V.
Wim de Körverstraat 35
5831 AN Boxmeer, NL
45 Fecha de publicación de la mención BOPI:
16.10.2007
72 Inventor/es: Mebatsion, Teshome y
Conzelmann, Karl, Klaus
45 Fecha de la publicación del folleto de la patente:
74 Agente: Ungría López, Javier
ES 2 283 150 T3
16.10.2007
Aviso: En el plazo de nueve meses a contar desde la fecha de publicación en el Boletín europeo de patentes, de
la mención de concesión de la patente europea, cualquier persona podrá oponerse ante la Oficina Europea
de Patentes a la patente concedida. La oposición deberá formularse por escrito y estar motivada; sólo se
considerará como formulada una vez que se haya realizado el pago de la tasa de oposición (art. 99.1 del
Convenio sobre concesión de Patentes Europeas).
Venta de fascículos: Oficina Española de Patentes y Marcas. Pº de la Castellana, 75 – 28071 Madrid
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DESCRIPCIÓN
Mutantes del virus de la rabia atenuados estables y vacunas vivas de los mismos.
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La presente invención se refiere a mutantes del virus de la rabia atenuados y a vacunas contra la rabia atenuadas
vivas que comprenden dichos mutantes.
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La rabia es una enfermedad que puede aparecer en todas las especies de animales de sangre caliente y se produce
por el virus de la rabia (RV). La infección por RV seguida de la aparición de los signos clínicos en casi todos los casos
produce la muerte de las especies infectadas. En Europa, los Estados Unidos y Canadá, aún existe la rabia en la vida
salvaje y es un factor importante en la causa de la mayoría de los casos de rabia humana que se producen. Por otra
parte, la rabia urbana constituye la causa principal de rabia humana en los países en desarrollo.
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El virus de la rabia (RV) es un virus de ARN de cadena negativa no segmentado de la familia Rhabdoviridae. Los
viriones de RV se componen de dos componentes estructurales principales: una nuclecápsida o ribonucleoproteína
(RNP) y una envuelta en forma de una membrana de bicapa que rodea al núcleo de RNP. El componente infeccioso
de todos los Rhabdovirus es el núcleo de RNP compuesto por el genoma de ARN encapsidado por la proteína de
la nucleocápsida (N) en combinación con dos proteínas minoritarias, es decir, la ARN polimerasa dependiente de
ARN (L) y la fosfoproteína (P). La membrana que rodea al núcleo de RNP está compuesta por dos proteínas: una
glicoproteína transmembrana (G) y una proteína de matriz (M) localizada en cara interna de la membrana.
La proteína G, también denominada proteína espicular, es responsable de la unión celular y de la fusión de membranas en RV y además es la diana principal para el sistema inmune del hospedador. Se ha identificado que la región
de aminoácidos en la posición 330 a 340 (denominada sitio antigénico III) de la proteína G es responsable de la virulencia del virus, en particular el resto de Arg en la posición 333. Todas las cepas de RV tienen este sitio antigénico
determinante de la virulencia en común.
Una manera eficaz de controlar la rabia es la vacunación con RV inactivado o con cepas de vacuna de RV atenuadas.
En general, se prefieren las vacunas contra la rabia atenuadas vivas porque a menudo inducen una respuesta inmune de
larga duración basada normalmente en reacciones tanto humorales como celulares. Las vacunas contra la rabia vivas
atenuadas disponibles actualmente están basadas en cepas de RV atenuadas incluyendo la cepa SAD Bern o la cepa
SAD B19, sin embargo, estas vacunas tienen una patogenicidad residual indeseada.
Se han realizado varias tentativas de obtener cepas de RV no patógenas para uso en una vacuna viva. La patente
europea 350398 describe un mutante de RV avirulento SAG1 derivado de la cepa SAD Bern de RV en el que la
glicoproteína tiene Ser en lugar de Arg en la posición 333. El mutante avirulento SAG1 se obtuvo bajo presión selectiva
de anticuerpos monoclonales específicos sobre la cepa SAD Bern. Se ha descubierto que SAG1 es no patógeno en
ratones adultos. Sin embargo, se produjeron revertientes patógenos del virus atenuado a una frecuencia de 1 por
10.000 (Lafay et al, Vaccine 12, páginas 317-320, 1994). La inestabilidad genética de este mutante hace que sea poco
adecuado para una vacunación segura.
La solicitud de patente europea 583998 describe otro mutante de RV atenuado, SAG2, en el que la Arg en la
posición 333 se ha sustituido por Glu en la glicoproteína. SAG2 no es patógeno para ratones adultos cuando se administra por varias vías. SAG2 actualmente se usa para vacunación oral de zorros, particularmente en Francia. Como
este mutante también puede revertir a la cepa parental patógena, la vacuna se produce en presencia de anticuerpos
monoclonales específicos para prevenir la reversión (Blancou y Meslin, 1996; en Laboratory techniques in rabies,
páginas 324-337). Como estos anticuerpos monoclonales específicos no están presentes en animales inoculados, la
vacunación con estos mutantes tiene el riesgo de que el mutante revierta produciendo virulencia en el animal inoculado y ocasionando brotes de la enfermedad en los animales inoculados y la posible extensión del patógeno a otros
animales.
Por lo tanto, sigue existiendo la necesidad de vacunas contra la rabia vivas atenuadas que no tengan patogenicidad
residual o que no puedan revertir a la variante patogénica. La presente invención proporciona estas vacunas.
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De acuerdo con la presente invención, se descubrió que podían obtenerse mutantes de RV atenuados y estables por
una mutación en el gen de la proteína G del genoma viral, comprendiendo dicha mutación la sustitución del codón
Arg333 por un triplete GAC o un triplete CAC. Para los fines de esta invención, la expresión “codón Arg333 ” se define
como el codón del gen de la proteína G del genoma viral que codifica Arg333 en la proteína G. La expresión “Arg333 ” se
define como el resto de Arg en la posición 333 de la proteína G de RV. En la cepa SAD de RV y en las cepas derivadas
de la misma, el codón Arg333 es AGA y la mutación de este codón en un codón que difiere en tres nucleótidos de dicho
codón Arg333 produjo mutantes de RV atenuados y estables. Preferiblemente, el codón Arg333 se mutó en GAC o CAC.
Pueden realizarse mutaciones similares con otras cepas de RV para obtener mutantes atenuados estables. Se descubrió
que las mutaciones de acuerdo con la invención eran estables y los mutantes de RV resultantes estaban atenuados y no
revertían hasta tener patogenicidad. Estos mutantes de RV atenuados y estables son muy adecuados para uso en una
vacuna. Otra gran ventaja de la invención es que, además, las vacunas que comprenden los mutantes de RV de acuerdo
con la invención pueden producirse sin necesidad de anticuerpos monoclonales específicos. Por lo tanto, la producción
de vacunas se vuelve más sencilla y más fácil de realizar.
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De esta manera, en un primer aspecto, la presente invención proporciona mutantes de RV recombinantes que
comprenden una mutación en el genoma viral, con lo que dicha mutación comprende al menos una sustitución del
codón Arg333 por un triplete GAC o un triplete CAC. Preferiblemente, los mutantes son mutantes de una cepa de RV
en la que el codón Arg333 es un triplete AGA. Más preferiblemente, los mutantes de acuerdo con la invención son
mutantes de la cepa de RV SAD y sus derivados, especialmente la cepa de RV SAD B19.
Son particularmente preferidas las cepas mutantes recombinantes de RV SAD D29 y SAD H31, en las que el
codón Arg333 en el genoma de la cepa de RV SAD B19 se ha sustituido con un triplete GAC y un triplete CAC,
respectivamente.
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De esta manera, la presente invención proporciona mutantes de RV recombinantes, atenuados, estables en los
que la proteína G de dicho mutante comprende un aminoácido en la posición 333 que se codifica por un codón que
difiere en tres nucleótidos del codón Arg333 del virus parental. Se descubrió que los mutantes de RV recombinante de
acuerdo con la invención son no patógenos en animales inmunocompetentes y se descubrió que eran muy estables.
Sorprendentemente, incluso después de 25 experimentos de pase en cultivo celular no se observó ninguna alteración.
Todos los pases de cultivo celular se realizaron en ausencia de anticuerpos monoclonales. Además, los mutantes se
mantuvieron no patógenos para ratones adultos incluso después de un pase en ratones lactantes. Las sustituciones en
la posición 333 de la proteína G no afectaron de forma alguna a la velocidad de desarrollo del virus en células BSR y
la titulación final fue similar a la de la cepa parental. Esto hace que los mutantes de RV recombinantes de acuerdo con
la invención sean muy adecuados para uso en una vacuna viva contra la rabia.
Además de la sustitución del codón Arg en la posición de aminoácido 333 de la proteína G, los mutantes de
RV recombinantes de acuerdo con la presente invención pueden comprender otras sustituciones que afectan a los
aminoácidos del sitio antigénico III de la glicoproteína. Preferiblemente, estas sustituciones se realizan en los codones
que codifican los aminoácidos del sitio antigénico III de la glicoproteína, más preferiblemente en los codones que
corresponden a las posiciones de aminoácidos 330 y/o 336 en la proteína G. Los mutantes de RV recombinantes de
acuerdo con la presente invención además pueden comprender otras mutaciones o modificaciones incluyendo genes
heterólogos, por ejemplo, un gen que codifica una proteína G de una cepa de RV diferente.
Los mutantes de RV recombinantes de acuerdo con la invención pueden obtenerse usando la tecnología de ADN
recombinante y mutagénesis de sitio específico para introducir la mutación deseada, a diferencia de la alteración
de la técnica anterior por probabilidad usando anticuerpos monoclonales. La manipulación genética directa de RV
puede realizarse usando el sistema de genética inversa descrito en Schnell et al, 1994; EMBO J. Vol. 13, Nº 18,
páginas 4195-4203 y en la solicitud de patente europea 0 702 085, incorporándose estos dos documentos en el presente
como referencia. La mutagénesis de sitio específico puede realizarse de acuerdo con el método descrito por Kunkel,
T.A., Roberts, J.D. y Zakour, R.A. (1987): Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotipic selection.
Methods Enzymology Vol. 154, páginas 376-382. Un clon de ADNc de longitud completa de la cepa de vacuna SAD
B19 descrita en Schnell et al., supra, se usó como base para introducir codones que diferían del triplete de Arg de
la cepa de RV parental en los tres nucleótidos para la generación de mutantes de RV recombinantes de acuerdo con
la invención. Los mutantes de RV de acuerdo con la invención pueden obtenerse por medio de a) la introducción de
la mutación deseada en el clon de ADNc de longitud completa de RV, b) la expresión simultánea de un ARN de RV
antigenómico de longitud completa a partir del ADNc modificado y proteínas N, P y L de RV a partir de plásmidos
introducidos por transfección en células que expresan la ARN polimerasa de T7 y 3) el aislamiento de los virus
mutantes de RV producidos por dichas células.
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Los mutantes de RV recombinantes de acuerdo con la invención pueden cultivarse en un cultivo celular derivado
de, por ejemplo, células BHK o células diploides humanas. Los virus desarrollados de esta manera pueden recogerse
recogiendo los fluidos del cultivo de células de tejidos y/o las propias células.
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En otro aspecto, la presente invención proporciona vacunas contra la rabia atenuadas vivas que comprenden uno
o más mutantes de RV recombinantes de acuerdo con la invención. Preferiblemente, una vacuna contra la rabia viva
atenuada de acuerdo con la invención comprende un mutante de RV recombinante derivado de la cepa de RV SAD B19.
Las vacunas contra la rabia vivas atenuadas de acuerdo con la invención que son especialmente preferidas comprenden
cepas mutantes de RV recombinantes en las que el codón Arg333 del genoma viral se ha sustituido por una triplete GAC
y un triplete CAC, respectivamente. Más específicamente, la vacuna de acuerdo con la invención comprende una cepa
mutante de RV recombinante en la que el codón Arg333 del genoma viral se ha sustituido por el triplete GAC, dando
como resultado el reemplazo de Arg por Asp en la posición 333 de la proteína G. Se prefieren particularmente vacunas
que comprenden la cepa mutante de RV recombinante SAD D29. La vacuna de acuerdo con la invención tiene la gran
ventaja de que puede producirse en ausencia de anticuerpos monoclonales específicos.
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La vacuna de acuerdo con la invención puede prepararse usando técnicas convencionales disponibles en la técnica.
En general, la vacuna se prepara mezclando el mutante de RV recombinante atenuado de acuerdo con la invención con
un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable.
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Los vehículos o diluyentes farmacéuticos aceptables que pueden usarse para formular una vacuna de acuerdo con
la invención son estériles y fisiológicamente compatibles, tales como, por ejemplo, agua estéril, solución salina, tampones acuosos tales como fosfatos de metales alcalinos (por ejemplo, PBS), alcoholes, polioles y similares. Además,
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la vacuna de acuerdo con la invención puede comprender otros aditivos tales como adyuvantes, estabilizantes, antioxidantes, conservantes y similares.
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Los adyuvantes adecuados incluyen, pero sin limitación, sales o geles de aluminio, carbómeros, copolímeros de
bloque no iónicos, tocoferoles, monofosforil lípido A, muramil dipéptido, emulsiones de aceite (agua/aceite o aceite/agua), citoquinas y saponinas tales como Quil A. La cantidad de adyuvante añadido depende de la naturaleza del
propio adyuvante.
Son estabilizantes adecuados para uso en una vacuna de acuerdo con la invención, por ejemplo, carbohidratos, incluyendo sorbitol, manitol, almidón, sacarosa, dextrina y glucosa, proteínas tales como albúmina o caseína, y tampones
tales como fosfatos alcalinos.
Los conservantes adecuados incluyen, entre otros, timerosal, metiolato y gentamicina.
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La vacuna contra la rabia viva atenuada de acuerdo con la invención puede administrarse a animales de sangre
caliente, incluyendo seres humanos, perros, zorros, mapaches y mofetas por inyección (intramuscular, intradérmica
o subcutánea), pulverización o aerosol (por vía intranasal), por vía oral. Preferiblemente, la vacuna se administra a
sujetos por vía oral, especialmente en el caso de animales salvajes o perros perdidos. Para la administración oral, la
vacuna se mezcla con un vehículo adecuado tal como, por ejemplo, proteínas o aceites de origen animal o vegetal. Para
la administración oral, la formulación de vacuna puede encapsularse adicionalmente con cebos preparados a partir de
sustancias metabolizables de origen animal o vegetal.
La dosificación útil a administrar variará dependiendo del tipo de mamífero de sangre caliente a vacunar, la edad,
el peso y la forma de administración. En general, una dosificación adecuada variará entre 102 y 108 TCID50 /mamífero.
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El siguiente ejemplo ilustrará la invención sin limitarla.
Material y método
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Construcción de clones de ADNc
Se realizó mutagénesis de localización dirigida por el método de Kunkel et al, 1987; Rapid and efficient site-specific
mutagenesis without phenotypic selection, Methods Enzymology, Vol. 154, páginas 376-382, con oligonucleótidos de
21 unidades para cambiar tres nucleótidos de pT7T-G (Conzelmann y Schnell, 1994; J. Virology, Vol. 68, Nº 2, páginas
713-719). Los plásmidos resultantes codificados modificaron la glicoproteína RV (proteína G) en la que la Arg en la
posición 333 (posición 4370-4372 de SAD B19) de la proteína G del RV maduro se reemplazó por aminoácidos
diferentes (véase la Tabla I). Para incorporar las mutaciones introducidas en un clon de ADNc de RV de longitud
completa (pSAD L16), se cambió un fragmento de ADNc StuI/PpuMI que comprendía los nucleótidos 4015-4470 de
SAD B19.
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(Tabla pasa a página siguiente)
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TABLA I
Clones de ADNc de RV y los codones que codifican los restos aminoacídicos en el sitio antigénico III de la
glicoproteína de los virus mutantes de RV recombinantes resultantes
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ejemplos comparativos: clones de ADNc de RV en los que el codón difiere sólo en dos nucleótidos del
codón de Arg
Recuperación y propagación de mutantes del sitio antigénico III
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Se realizaron experimentos de transfección como se ha descrito anteriormente (Conzelmann y Schnell, 1994; J.
Virology, Vol. 68, Nº 2, páginas 713-719). Se infectaron aproximadamente 106 células BSR con el virus vaccinia
vTF7-3 recombinante (Fuerst et al., 1986) y después se transfectaron con una mezcla de plásmido que contenía 5 µg
de pT7T-N, 2,5 µg de pT7T-P, 2,5 µg de pT7T-L y con 4 µg de un plásmido que codificaba el ARN antigenómico de
longitud completa usando el kit de transfección de mamífero Stratagene (protocolo CaPO4 ). El aislamiento del virus
transfectante y la eliminación del virus vaccinia se realizó como se describe en Schnell et al., supra. La infección de
las células se controló por inmunofluorescencia directa con un conjugado de nucleoproteína anti-RV (Centrocor) y los
RV recombinantes se sometieron a pases adicionales hasta que se consiguió la infección de la monocapa entera. Las
soluciones de reserva de virus resultantes se titularon por dilución de punto final. Se realizaron veinticinco pases en
serie en cultivos de células BSR a una multiplicidad de infección (moi) de 0,01.
RT-PCR y análisis de la secuencia
Para determinar la estabilidad de los virus recombinantes, se realizaron 25 pases sucesivos en células BSR. La
RT-PCR se realizó en 1 µg de ARN total aislado a partir de las células infectadas usando el “Titan One Tube RTPCR System” de acuerdo con las instrucciones de los proveedores (Boehringer Mannheim). Los productos de PCR se
analizaron en geles de agarosa al 1% y se usaron directamente para la secuenciación.
Inoculación de ratones y neutralización de virus
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Se inocularon grupos de ratones NMRI de 3 semanas de edad por vía intracerebral (ic) con 0,03 ml de una suspensión de virus (de 3.000 a 9.000.000 ffu/ratón) y se observaron los síntomas de la rabia. Para determinar si aparecían
revertientes patógenos después del pase en ratones lactantes, se inocularon virus recombinantes ic en ratones de dos
días de edad. Se preparó una suspensión cerebral al 20% a partir de ratones muertos y se inoculó en ratones de 3
semanas. Se recogieron muestras de suero a partir de los ratones supervivientes 21 días después de la infección. Para
determinar la actividad neutralizadora de los sueros de ratón, se incubaron 5 diluciones en serie de los sueros con 40
ffu de la cepa CVS. Después de 1 hora, se añadieron células BHK a la mezcla de virus-suero, se incubaron durante 24
horas y se examinaron por fluorescencia directa. Véanse los datos en la tabla II.
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REIVINDICACIONES
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1. Mutante del virus de la rabia recombinante que comprende una mutación del gen de la proteína G del genoma
viral, comprendiendo dicha mutación al menos una sustitución del codón en el gen de la proteína G del genoma viral
que codifica Arg333 en la proteína G con un triplete GAC o un triplete CAC.
2. Un mutante de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado porque dicho mutante es un mutante de la cepa
SAD.
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3. Un mutante de acuerdo con la reivindicación 2, caracterizado porque el mutante es un mutante del virus de la
rabia recombinante de la cepa SAD D29.
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4. Mutante del virus de la rabia recombinante de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-3 para uso como
un agente terapéutico o profiláctico.
5. Mutante del virus de la rabia recombinante de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-3 para uso en
una vacuna.
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6. Vacuna contra la rabia atenuada viva caracterizada porque dicha vacuna comprende un mutante del virus de la
rabia recombinante de acuerdo con las reivindicaciones 1-3 y un vehículo farmacéutico aceptable.
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