Enfermedad Infecciosa de la Bolsa: efecto inmunosupresor en

Rev. Cubana de Ciencia Avícola, 2002, 26: 129-135
Enfermedad Infecciosa de la Bolsa: efecto
inmunosupresor en pollos de engorde
E. BABAAHMADY Y R. JOA.
Facultad de Veterinaria
Universidad Agraria de La Habana, Cuba
E- mail: [email protected]
JULIA NODA EDISLEIDYS RODRÍGUEZ, P. ALFONSO
Y CARMEN LAURA PERERA
Grupo de Virologìa
Centro Nacional de Sanidad Agropecuaria (CENSA)
Apdo. 10, San José de las Lajas, CP. 32 7800
La Habana, Cuba
E-mail: [email protected]
RESUMEN. La enfermedad infecciosa de la bolsa (EIB) puede afectar al pollo de
engorde provocando mortalidad o inmunosupresión. Por lo que para determinar el
efecto sobre los órganos linfoides y la respuesta de anticuerpos al virus EIB y a la
vacunación con virus de la enfermedad de Newcastle (EN), se infectaron pollos de
engorde de 5 días de edad con el aislado BF8 y una cepa vacunal del virus EIB. Las
aves se evaluaron por la determinación del peso relativo de la bolsa de Fabricio
(PRBF) y del bazo (PRB) a los 4, 7, 12 y 21 días postinoculación (PI), la detección de
anticuerpos neutralizantes al virus de EIB y por Inhibición de la Hemoaglutinación al
virus EN. Los pollos no presentaron mortalidad ni evidencia de signos clínicos pero se
detectaron cambios en los parámetros morfométricos de los órganos linfoides, con
diferencias entre los pollos inoculados con el aislado BF8 respecto a la cepa vacunal
y un PRBF menor respecto a los controles no inoculados. Ambas cepas indujeron
respuesta de anticuerpos neutralizantes a los 21 y 35 días postinoculación, pero fue
superior en las aves inoculadas con el aislado comparado con la cepa vacunal. Los
títulos de anticuerpos IHA al virus EN fueron inferiores en los pollos inoculados con el
aislado BF8 lo cual revela su potencial para provocar mayor inmunosupresión en
pollos de engorde.
Palabras claves: Enfermedad de Gumboro, pollo de engorde, vacunación, enfermedad de
Newcastle, anticuerpos.
La enfemedad infecciosa de la bolsa (EIB),
es considerada una de las patologías de
mayor importancia para la avicultura mundial,
debido a las pérdidas económicas que
ocasiona, no sólo en la forma clínica con
mortalidad sino por su efecto inmunosupresor
(Lukert y Saif, 1997; Van den Berg, 2000). La
vacunación y un riguroso programa de bioseguridad son considerados los pilares fundamentales en el control de esta enfermedad.
La infección con el virus EIB en pollos de
engorde de 3-6 semanas de edad produce
morbilidad de 50 por ciento y mortalidad de 3
por ciento, pero se reportan que cepas muy
virulentas pueden provocar mortalidad hasta
25 por ciento (van den Berg et al., 1991). Sin
embargo en áreas donde la enfermedad es
endémica, los pollos de engorde con anticuerpos maternos moderados, pueden infectarse
sin síntomas clínicos y sólo se revela por la
inmunosupresión que se produce (Lasher y
Shane, 1994; Nielsen et al.,1998). También
cepas virulentas tienen mayor capacidad que
las cepas vacunales para infectar en presencia
de elevados niveles de anticuerpos maternos,
lo que sugiere un mayor riesgo de infección
130
E. Babaahmady, Julia Noda, Edisleidys Rodríguez y otros
temprana antes que se apliquen las vacunas
atenuadas (Laher y Shane, 1994).
El diagnóstico de la EIB aguda y severa con
mortalidad se realiza frecuentemente por los
signos clínicos y las lesiones severas, lo cual
se corrobora por el examen histopatológico y
la detección de virus o antígenos como diagnóstico confirmativo. Sin embargo la infección
en los primeros 10 días de edad provoca
inmunosupresión que puede ser permanente
(Velverde y Davidson, 1997; Saif, 1998), la cual
sólo se revela de forma indirecta por las
alteraciones patológicas de los órganos
linfoides y la pobre respuesta inmune a las
vacunas aplicadas como la enfermedad de
Newcastle (Sharma et al. 1989).
La enfermedad continua afectando la
avicultura mundial, aún cuando diversos
programas de control y estrategias de vacunación como la vacunación asistida por
serología fundamentalmente en pollos de
postura y en menor magnitud en pollos de
engorde (Perera, 2000; Van den Berg et al,
2000). Por lo que en este trabajo se realizó
la evaluación del efecto inmunosupresor de
un aislado cubano del virus EIB, caracterizado
como una cepa virulenta clásica, en la infección
temprana y se compara con la cepa vacunal
de tipo intermedia utilizada en el control de la
enfermedad.
MATERIALES Y MÈTODOS
Pollos. Se utilizaron pollos de engorde de una
raza pesada comercial, de 5 días de edad,
mantenidos en jaulas en una nave de experimentación con aire filtrado y alimentación según los requerimentos de la edad y la categoría zootécnica. Embriones de pollos de la
raza White Leghorn, libres de patógenos
específicos (LPE), procedentes de la unidad
de aislamiento del Centro para la Producción
de Animales de Laboratorio, se emplearon
para la titulación viral y para la obtenció de
cultivo de células de fibroblastos de embrión
de pollo (FEP) para la sueroneutralización.
Virus. Se utilizó la cepa virulenta BF8, aislada
en 1997 y caracterizada por Perera (2000) y
la cepa vacunal tipo intermedia, la vacuna
comercial Gumboro (Labiofam, S.A., Cuba).
Se empleó además la vacuna contra la
enfermedad de Newcastle cepa La Sota,
comercial de igual procedencia y la cepa de
referencia GT-1 (CVL, Weybridge). La sus-
2002
pensión viral de la cepa BF8 se obtuvo de
homogenado de bolsas de Fabricio (BF) de
pollos LPE infectados y colectadas a los 4
días postinoculación, la cual fue titulada en
embriones de pollo (LPE) de 12 días de
desarrollo y por vía de la membrana corioalantoidea (MCA). El cálculo se realizó según el
método de Spearman-Kärberg (Finney, 1964).
Las vacunas fueron reconstituídas como recomienda el productor para aplicar una dosis.
La cepa GT-1 adaptada a células de FEP se
utilizó en la prueba de sueroneutra-lización.
Patología. Indicadores morfométricos de los
órganos linfoides se evaluaron por los pesos
relativos de la Bolsa de Fabricio (BF), el bazo
(B) y el Coeficiente Bolsa-Bazo (CBB); la masa
del órgano analizada (BF o B), según la
fórmula PRBF/P. corporal x 1000 y PRB/P.
corporal x 1000 ( Lucio y Hitchner, 1979).
Las muestras de bolsa de Fabricio y el bazo
fueron fijadas con formalina al 10 %, inclusión
en parafina y coloración de hematoxilina y
eosina. Las alteraciones histopatológicas se
evaluaron por la presencia de necrosis linfoide,
atrofia de los folículos, infiltración de heterófilos, edema, hemorragias, fibrosis y formación
de vacuolas. (Yamaguchi et al., 1996).
Sueroneutralización (SN). Se realizó por el
método virus constante-suero variable en microplacas, diluciones de los sueros en Log2,
a partir de 1:20 (previamente inactivados a
560C por 30 min.) y se enfren-taron a 100 DICT/
50 de la cepa de referencia GT-1 y se
incubaron durante 2 horas a 370 C y con 5%
de atmósfera de CO2. A este tiempo se añadió
la suspensión de células de FEP en concentración de 106 células/ml y se incubaron con
iguales condiciones. La lectura fue realizada
a las 48 horas y se calcularon las medias
geométricas (MG) de los títulos de anticuerpos
(Villegas, 1998).
Inhibición de la hemoaglutinación (IH). Se
determinó el título de anticuerpos por el
método virus constante-suero variable y
microplacas, las diluciones en Log2, se
enfrentaron a 4 unidades hemoaglutinantes
(HA) del antígeno comercial (Laboratorios
LABIOFAM S.A.). Se calcularon las medias
geométricas (MG) de los títulos de anticuerpos
(Villegas, 1998).
Vol. 26
Enfermedad Infecciosa de la Bolsa
Diseño experimental. Los pollos a los 5 días
de edad se dividieron en tres grupos de 75
pollos, a los que se inoculó la cepa virulenta
BF8 con 100 µl de la suspensión viral que
contenía 103 DIEP/50 en 100 µl y la vacuna
Gumboro con una dosis ambas por la vía
óculo-nasal y al grupo control se le inoculó
un placebo. Se realizó una observación diaria
para revelar signos clínicos y mortalidad, a
los 4, 7, 12 y 21 días postinoculación, fueron
sacrificados 5 inoculados y 5 controles, se
les realizó el examen anatomopatológico y
se determinó el PRBF, PRB y las muestras
de BF y B se obtuvieron para análisis
histopatológico.
A los 13 días de edad los pollos inoculados y
los controles se dividieron en dos grupos y
se inocularon con la vacuna comercial de EN
con una dosis de campo, por la vía intranasal.
Se les extrajo la sangre al día de edad y a los
7, 21 y 35 días postinoculación con la cepa
virulenta de EIB, para determinar el título de
anticuerpos neutralizantes a este virus y para
revelar anticuerpos al virus EN por Inhibición
de la Hemoaglutinación (IHA), se obtuvieron
muestras antes de vacunar y a los 14 y 28
días posterior a la vacunación .
Análisis estadístico
Los datos relacionados con los índices de
los pesos relativos de la Bolsa de Fabricio y
el bazo respecto al peso corporal y el índice
bolsa/bazo (PBF/PC, PB/PC y CBB) fueron
analizados por el método estadístico T de
Student para comparar los inoculados
respecto al control no inoculado y los cálculos
se realizaron por el programa computarizado
SAS (Sistema de análisis estadístico,1987).
Para el análisis de la respuesta de anticuerpos neutralizantes a EIB y de anticuerpos
por IHA a ENC, se aplicó el Test de Rangos
Múltiples de Dunkan (1955) (SLD), con un
nivel de significación de p< 0.005.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
La infección temprana con el virus EIB, tanto
en los pollos de raza ligera como de engorde
se manifiesta de forma subclínica y sólo se
evidencia su efecto inmunosupresor (Nielsen
et al, 1998). En este trabajo los pollos de en-
131
gorde inoculados a los 5 días de edad con la
cepa autóctona BF8, caracterizada por Perera
(2000) como clásica virulenta al producir
mortalidad en pollos LPE de tres semanas
de edad, no presentaron signos clínicos ni
mortalidad en el tiempo de observación.
Resultados similares fueron obtenidos también por Velverde y Davidson (1997), cuando
inocularon pollos de engorde a dife-rentes
edades y determinaron que la aparición de la
forma clínica se relacionaba con la edad de
las aves. El grupo de aves que se les aplicó
la cepa vacunal (tipo intermedia), no presentó
manifestaciones. Sin embargo, el examen
anatomopatológico reveló a los 4 y 7 días PI
en los pollos inoculados con la cepa BF8
hemorragias, congestión y atrofia de la BF, lo
que se corresponde con las lesiones prominentes producidas por el virus EIB donde
se producen cambios inflamatorios seguidos
de atrofia (Müller et al., 1979). Similares
alteraciones son referidas en la infección por
cepas virulentas de este virus produciendo una
atrofia más temprana (Tanimura y Sharma,
1998) pero diferente de las cepas variantes
que sólo producen atrofia. En el timo se observaron también hemorragias discretas y en
masas musculares con signos de nefrosis,
lo cual evidencia la virulencia de esta cepa.
Figura 1. Lesiones observadas en pollos
inoculados con la cepa BF8 a los 5 días
de edad, muestreo a los 7 días Postinoculación. Bolsas de Fabricio y bazos
de pollos controles (izquierda), en los
inoculados (derecha) la BF presenta una
atrofia y el bazo aumento de volumen.
Los indicadores morfométricos muestran una
disminución del PRBF a los 4 y 7 días PI
respecto al control (Tabla 1), este resultado a
este tiempo de inoculación fue observado por
(Nakamura et al., 1992) cuando evaluaron el
efecto inmunosupresor de las cepas muy vi-
132
E. Babaahmady, Julia Noda, Edisleidys Rodríguez y otros
2002
TABLA 1. Resultados de la valoración de los pesos relativos de la bolsa y el bazo en pollos de
engorde inoculados a los 5 días de edad.
T I EMPOS POST I NOCULA CI ÓN
PRBF
PRB
CONT ROL
BF8
VA CUNA DOS
CONT ROL
BF8
4 d PI
2.00a
1.95a
1.98
7 d PI
2.46a
2.17ab
12 d PI
2.59a
21 d PI
2.48a
VA CUNA DOS
a
0.88a
1.01a
0.796
a
2.60
a
0.97a
1.22ab
0.709
a
2.24a
2.45
a
0.98a
1.09a
0.943
a
2.04b
2.54
a
0.81b
1.06a
1.053
a
Peso relativo de la bolsa de Fabricio (g), PRBF/ peso corporal (g) x 1000
Peso relativo del bazo (g), PRB/ peso corporal (g) x 1000
3
CBB, cociente del PRBF y PRB (Morales y Boclair, 1993)
Las letras desiguales dentro de la misma fila difieren en p< 0.005
1
2
rulentas aisladas en Japón lo que sugiere
que el PRB se incrementa indicando esplenomegalia lo cual se relaciona con el efecto
producido por cepas virulentas del virus EIB (van
den Berg, 2000). La cepa vacunal produjo
menores cambios como refieren Masariegos
et al. (1990) para las cepas tipo intermedias de
este virus.
Al examen histopatológico aunque se observó
edema y hemorragias en la BF a los 7 días PI
y la presencia de vacuolas, la depleción de
linfocitos y necrosis a los 12 y 21 días PI
(Fig. 1), fue mayor como evidencia de atrofia
con la cepa BF8, lo cual indica el daño que
puede provocar esta cepa, también descrito
por Noda et al. (2002) pero en pollos ligeros.
Sin embargo, sólo produjo lesiones menores
en bazo y timo como se señalan para las
cepas virulentas clásica del serotipo 1 y
diferente de las cepas altamente virulentas
que provocan lesiones severas en estos
órganos linfoides (Nunoya et al, 1992,
Tanimura et al., 1995). Estas lesiones no se
observaron en las aves a las que se le aplicó
la vacuna tipo intermedia, aspecto señalado
por Coletti et al. (2001) en la evaluación del
efecto de las cepas atenuadas del virus EIB
en pollos.
Figura 2. Lesiones en la bolsa de Fabricio. A) hemorragias y edema 4 días PI
B) Necrosis folicular, vacuolas, infiltración de heterófilos 21 días PI
El efecto de la infección producida por el
virus EIB sobre la respuesta a la vacunaciòn
con EN es uno de los elementos para valorar
el efecto inmunosupresor (Faranger et al.
1974) por lo que en este trabajo la respuesta
de anticuerpos hemoaglutinantes fue muy
inferior en los grupos inoculados tanto con la
cepa BF8 como con la vacuna con MG de
1.5 y 3.5 respectivamente, comparado con
los controles (17,4), lo cual refleja la inmunosupresión provocada por la infección con
ambas cepas, aunque mayor con la cepa BF8
y que el grado de este efecto está en
dependencia de la patogenicidad de la cepa
(Mazariegos et al 1990; Van den Berg, 2000),
además de la edad de aplicación.
Vol. 26
Enfermedad Infecciosa de la Bolsa
133
TABLA 2. Respuesta de anticuerpos IHA a EN en pollos inoculados a los 5 días de edad
con la cepa BF8 del virus de la EIB
VA C + EN
BF8 + EN
CONT ROL+EN
DÍ A S PV 1
LOG. 2
A NT I LOG. 2*
I Día de edad
4.9
29.9
A nt es de Vac.
2.3
4.9
14 días PV
28 días PV
LOG. 2
A NT I LOG. 2*
4.9
29.9
a
2.3
4.9
0.6
1.5a
0.3
1.8
3.5 b
0.6
a
LOG. 2
A NT I LOG. 2*
4.9
29.9
a
2.0
4.0
1.0
b
0.3
1.0b
1.5
b
4.1
17.1
a
a
a
a
* Medias geométricas de los títulos de anticuerpos.
1
Días postvacunación con EN.
La evaluación de la respuesta de anticuerpos
neutralizantes al virus EIB reveló altos títulos
de los anticuerpos maternos al día de edad
(1:2251) y su descenso característico en los
controles (Gráfico 1), mientras que los
inoculados a los 21 y 35 días PI, presentaron
un incremento con MG de 113 y 394 respec-tivamente y los vacunados de 70 y 106, lo
cual demuestra que se produjo la infección
por el virus EIB y que este incremento es
debido al estímulo producido por el virus en el
sistema inmune en las aves infectadas, con
diferencias significativas respecto al grupo
control. Resultados similares fueron referidos
por Kelemen et al. (2000) al evaluar la respuesta inmune a cepas altamente virulen-tas
en pollos con títulos altos de anticuerpos maternos neutralizantes al virus de la EIB.
De te r m inación de anticue r pos ne utr aliz ante s
1600
(M G)
1400
1200
Controles
1000
800
V ac una
600
BF8
400
200
0
1d
edad
7 d (PI)21 d (PI)35 d (PI)
Días pos t - inoculación
Estos resultados sugieren que el aislado BF8
puede causar infección sin signos clínicos
pero con efecto inmunosupresor en pollos de
engorde comerciales y confirma su carácter
patogénico determinado en pollos SPF de
raza Leghorn (Perera, 2000). Además,
evidencia que puede ser capaz de producir
por tanto la forma subclínica de la enfermedad
en esta categoría de pollos, lo que en condiciones de producción representa un compro-
miso de la efectividad del programa de control
que se aplica, problema actual en la presentación de la EIB a nivel mundial (van den
Berg, 2000). Todo lo cual revela la necesidad
de continuar las investigaciones relacionadas
con la detección de la forma subclínica de la
enfermedad, que aún cuando no produce
mortalidad y síntomas clínicos manifiestos
puede causar grandes pérdidas económicas
además del compromiso ambiental.
134
E. Babaahmady, Julia Noda, Edisleidys Rodríguez y otros
Infectious Bursal Disease: inmunosuppressive
effect in broilers
ABSTRACT. Bag infectious disease affects broilers causing mortality and
inmunosuppression. Thereby, in order to determinate the effect on linfoid organs and
the response of antibodies to the BID virus and vaccination with Newcastle disease, 5day broilers were infected with the isolate BFS and a vaccine strain of EIB virus. Poultry
were evaluated by determination of the relative bag weight (BRW) and the relative
spleen weight (SRW) at 4, 7, 12 and 21 days after inoculation, detection of neutralizing
antibodies to the EIB virus and inhibition of the hemoaglutination to the NE virus. No
mortality or clinical signals were observed in chicken, although changes in morfometric
parameters of lymphoid organs, with differences between chicken inoculated with de
isolate BF8 in respect to the vaccine strain and a minor PRBF in respect to non-inoculated
controls were observed. Both strains induced neutralizing antibodies response at 21
and 35 days after inoculation, although that response was higher in poultry inoculated
with the isolate, compared with the vaccine strain. Titles of IHA antibodies to the ND
virus were lower in chicken inoculated with the isolate BF8, which reveals their potential
to provoke a higher inmunosuppression in broilers.
Key words: broiler, Infectious bursal disease, inmunosuppression, vaccination.
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