ENCAPSULACIÓN DE EXTRACTOS POLIFENÓLICOS EN

ENCAPSULACIÓN DE EXTRACTOS POLIFENÓLICOS EN MICROESFERAS DE
ALGINATO PARA ALIMENTOS FUNCIONALES
Lupo B. *, Maestro A., Pórras M., Gutiérrez J.M y González C.
Departament d´Enginyeria Química. Facultat de Química. Universitat de Barcelona. C/Martí i
Franquès 1-11 08028, Barcelona.
[email protected]
Palabras clave:
Cocoa, emulsión, gelificación interna, diseño experimental.
RESUMEN
Polvo de cocoa liofilizado es encapsulado en microesferas de alginato a través de la técnica
de emulsificación por gelificación interna con objeto de preservar el contenido de polifenoles
para ser incorporadas en alimentos. Se realiza un diseño experimental para evaluar la
influencia de las variables de composición y preparación sobre el tamaño de las microesferas
y el porcentaje de retención de los componentes luego de ser separadas de la emulsión. Las
variables de composición estudiadas fueron la concentración de tensioactivo, cantidad de
fase dispersa y concentración de CaCl2. Mientras en las variables de preparación, la velocidad
de agitación y de centrifugación para la separación de las microesferas. El diseño factorial
compuesto mostro microesferas con diámetros medios entre 59 y 827 µm, así como
porcentajes retenidos de cocoa entre 0,64 y 83%. El análisis estadístico no señaló influencia
significativa de la concentración de tensioactivo ni del CaCl2 sobre el diámetro pero sí para la
cantidad de fase dispersa. Al ajustar el pH en la fase dispersa, se evidencia por estudios de
la viscosidad a 10 y 25ºC una influencia significativa del tiempo y la temperatura. Al realizar
un diseño experimental fraccionado se observaron cambios importantes en los resultados.
INTRODUCCIÓN
Las nuevas tendencias tecnológicas se han enfocado en la producción de alimentos
funcionales al incorporar aminoácidos, minerales e incluso de pequeñas moléculas como
células, enzimas y microorganismos probióticos beneficiosos para la salud, y por tanto, de su
conservación en los alimentos durante el procesamiento y almacenaje (Parra-Huertas, 2010).
Los antioxidantes son sustancias que retardan o inhiben el proceso de oxidación de los
lípidos y otras moléculas impidiendo reacciones de oxidación causantes de los procesos de
envejecimiento y de algunas otras enfermedades (Young y Woodside, 2001; Silva et al.,
2007), tales como el cáncer, enfermedades neurodegenerativas, inflamatorias y
cardiovasculares (Prior y Gu, 2005). Dentro del grupo de compuestos antioxidantes podemos
encontrar los fenoles y flavonoides. Los flavonoides son compuestos polifenólicos
ampliamente distribuidos entre los vegetales mayoritariamente en las semillas, frutas y en
bebidas como el té, el vino y la cerveza. A su vez, los fenoles se encuentran en la mayoría de
las plantas azulgrana o violeta, tales como la berenjena, las bayas, los arándanos, la uva,
entre otros. La actividad antioxidante de los compuestos fenólicos se debe principalmente a
sus propiedades de oxidoreducción, ya que juegan un papel importante oxidando y
neutralizando radicales libres (Goh et al., 2003). Considerando los beneficios mencionados y
las nuevas ideas de disminuir el uso de antioxidantes sintéticos comerciales, se plantea
emplear extractos naturales con alto contenido de polifenoles como principio activo que
puedan ser incorporados en alimentos con la finalidad de hacerlos funcionales. Debido a que
la adición de antioxidantes naturales puede alterar la coloración, y sabor de los alimentos,
recientes estudios proponen la aplicación de la técnica de microencapsulación con alginato
para enmascarar dichos efectos, protegerlos del medio que los rodea o para su liberación
controlada (Deladino et al., 2008).
El alginato ha sido usado debido a sus múltiples ventajas tanto para el consumo humano
como versatilidad en aplicaciones industriales. Tales aspectos han sido compilados en la
literatura por Imeson (2010) resaltando el efecto prebiótico de los alginatos de bajo peso
molecular, los beneficios de su ingesta como fibra diaria para la reducción de los niveles de
azúcar y colesterol en sangre, así como, la capacidad para prolongar la vida útil en
productos. El alginato ha sido uno de los polímeros más empleado en la microencapsulación,
este forma una matriz altamente versátil, biocompatible y no tóxica para la protección de
componentes activos de factores como el calor y la humedad, mejorando así su estabilidad y
biodisponibilidad.
La técnica de microencapsulación ha sido descrita como un proceso en donde pequeñas
partículas o gotas son rodeadas por un recubrimiento homogéneo o heterogéneo integrado a
las cápsulas con variadas aplicaciones (Borgogna et al., 2010). Una definición general de
encapsulación dada por Desai y Park (2005) se refirió al empaquetado de materiales sólidos,
líquidos o gaseosos mediante cápsulas que liberan su contenido de forma controlada bajo
condiciones determinadas. El proceso de microencapsulación puede ocurrir por gelificación
iónica de forma externa o interna, dependiendo si el calcio se difunde desde una fuente
externa que rodea al hidrocoloide hacia la solución de alginato a pH neutro. Mientras que, la
gelificación interna consiste en la liberación controlada del ion calcio desde una fuente
interna de sal de calcio insoluble o parcialmente soluble dispersa en la solución de alginato
de sodio que permite su liberación con la acidificación del medio (Funami et al., 2009). La
técnica más empleada ha sido la microencapsulación por extrusión que consiste en la
formación de gotas de alginato con el componente a encapsular mediante un dispositivo
extrusor sobre un baño de calcio que induce la gelificación de forma externa, dependiendo su
tamaño del diámetro de boquilla (Chan et al., 2009). Mientras que, la técnica de
encapsulación en emulsión se ha definido como el proceso de dispersión de un líquido en otro
líquido inmiscible donde la fase dispersa consta de la matriz que incluye el componente a
encapsular. La adición de un tensioactivo mejora la formación y estabilidad de la emulsión,
así como la distribución de tamaño de las gotas (Poncelet, 2001; de Vos et al., 2010). En
este sentido, la preparación de microcápsulas en emulsión puede llevarse a cabo empleando
el mecanismo de gelificación externa o interna. Para el primer caso, la gelificación externa en
emulsión consta en la dispersión de una mezcla solución de alginato-componente en una fase
continua no acuosa, seguido de la adición de una fuente de calcio que al difundirse a la fase
dispersa inicie la gelificación permitiendo la encapsulación, y a su vez, la desestabilización de
la emulsión para la separación de las cápsulas formadas. Mientras que, la técnica en
emulsión por gelificación interna se fundamenta en la liberación del ión calcio desde un
complejo insoluble o parcialmente soluble en cuyo caso se adiciona un agente secuestrante,
contenido en una solución de alginato-componente el cual es dispersado en una fase
continua no acuosa generando una emulsión agua en aceite (W/O) (Gouin, 2004; Chan et
al., 2006). Trabajos previos en gelificación interna mencionan la dificultad de controlar la
polidispersidad de las esferas, con diámetros medios entre 50-1000 µm (Poncelet, 2001). Sin
embargo, no presentan conclusiones respecto a la influencia de la composición y de las
variables de preparación en el tamaño y polidispersidad de las microesferas formadas.
Investigaciones posteriores muestran, la influencia de estas variables en el proceso de
preparación de las microesferas de alginato para la encapsulación de insulina en emulsión
por gelificación interna y de extractos naturales de plantas en una matriz de alginato con
recubrimiento de quitosano al emplear el mecanismo de gelificación externa con la técnica
por extrusión (Silva et al, 2006; Deladino et al, 2008). Puesto que en muchos de
experimentos interviene el estudio de los efectos de dos o más factores. En general, los
diseños factoriales son los más eficientes para este tipo de experimentos. Entendiéndose por
diseño factorial que en cada ensayo o réplica completa del experimento se investigan todas
las combinaciones posibles de los niveles con los factores y por tanto, su efecto sobre una
respuesta (Montgomery, 2002).
En este trabajo, se establecen como factores las variables de composición referidas a la
concentración de tensioactivo, cantidad de fase dispersa empleados en la emulsión y
concentración de cloruro de calcio (CaCl2) en la solución de separación de las microesferas
de alginato, así como variables de preparación tal como la velocidad de agitación y
centrifugación para la separación de las microesferas. Y el efecto de dichas variables sobre la
distribución de tamaño de las microesferas, el porcentaje de retención del polvo de cocoa y
la polidispersidad de las microcápsulas como respuesta al diseño factorial establecido.
MATERIALES Y MÉTODOS
Materiales
Alginato de sodio fue suministrado por Panreac. La solución de alginato al 2% p/p se disolvió
utilizando un Ultra-túrrax modelo T25 Basic de IKA-WERKE a temperatura ambiente. Las
sales de cloruro y citrato de calcio tetrahidratado al 96%, 99% respectivamente, la sal de
carbonato de sodio al 99%, el monolaureato de sorbitán polioxietilenado (Tween®20), el
Folin-Ciocalteau y ácido gálico fueron proporcionados por Aldrich. El ácido acético glacial y el
hidróxido de sodio 6 M fueron suministrados por Panreac. El Polirricinoleato de Poliglicerol
(PGPR) empleado como tensioactivo de alta calidad fue proporcionado Lansenor Emul, S.L.
Para la preparación de la emulsión se utilizó aceite refinado de Girasol, suministrado por
Aceites del Sur-Coosur, S.A. El polvo de cocoa con alto contenido de polifenoles fue
suministrado por la Facultat de Farmacia de la Universitat de Barcelona. Se empleó a partir
de una solución madre de cocoa al 1% p/p disuelta por sonicación utlizando el Ultrasonic
homogenize HD2070 (Sonoplus Bendelin) equipado con sonda de titanio, frecuencia 20 KHz y
una potencia de 21W durante 20 min, el pH se ajustó entre 6,5-6,8 con NaOH 6M empleando
un pH/ISE measuring instrument (ProLab 3000) y finalmente se adicionó 2% p/p de alginato
de sodio con agitación vigorosa con posterior desaireación y completa hidratación durante 24
horas bajo refrigeración. Para la separación de las microesferas se empleó una Centrífuga de
control electrónico digital Mixtasel-BL marca Selecta con velocidad regulable hasta 4200 rpm.
La caracterización de tamaño de las microesferas se realizó por difracción de rayos láser con
el Mastersizer 2000 para análisis de tamaño de partículas entre 0,02 y 2000 µm. La
dispersión de la muestra se realizó vía húmeda en una unidad de dispersión con agua
denominada Hydro 2000S de capacidad 800 ml. El equipo cuenta con un Software (SOP) que
permite crear un entorno de trabajo personalizado donde se definen las variables de control.
Se tomó como índice de refracción (IR) para el medio de dispersión el IR del agua (1,333) y
para la muestra el IR del alginato de calcio (1,336) determinado por refractometría
empleando un Refractómetro ABBE a 25ºC. Para el estudio de viscosidad se utilizó un
Reómetro Modular MARS III dotado de un baño termostático (modelo F6) y recipiente HAAKE
(modelo C25) empleando un sensor placa-placa rugoso, para evitar deslizamientos, de
diámetro 35 mm y un espaciado para la muestra de 1 mm. El análisis de viscosidad en
función del gradiente se realizó a frecuencias entre 0,01 y 100 Hz. El contenido de fenoles
totales se determinó por espectrofotometría mediante el método de Folin-Ciocalteau
empleando un Perkin Elmer UV/VIS Spectrometer Lambda 20 a una longitud de onda de 760
nm.
Métodos
Preparación de Microesferas
Se empleó el protocolo de preparación de las microesferas de alginato en emulsión por
gelificación interna propuesto por (Poncelet, 2001). El procedimiento estándar para todas las
variables de formulación se estableció a 25 ºC, velocidad de agitación de 250 rpm y
centrifugación 4000 rpm durante 10 min para la separación de las microesferas. Mientras
que, para las variables de preparación se consideraron las condiciones de composición dadas
para el punto central. La emulsión se preparó en un reactor encamisado de 100 ml de
capacidad y especificaciones variables de velocidad de agitación entre 100 y 700 rpm.
Previamente, se adicionó 1 ml de suspensión de citrato de calcio a 0,05 M a la fase acuosa
constituida por alginato al 2% p/p y cocoa al 1% p/p bajo agitación constante durante 5 min.
La mezcla acuosa es dispersada (27,5%) en 40 ml de aceite vegetal con 9,5% de PGPR. La
emulsión W/O es preparada bajo agitación constante durante 15 min. La gelificación de las
gotas se inicia al agregar los 10 ml restantes de aceite vegetal junto con 80 µl de acético
glacial disueltos en el mismo por 15 min más. Las microesferas pregelificadas son separadas
de la fase oleosa adicionando 100 ml de solución de CaCl2 con 10% p/p de Tween®20 con
agitación vigorosa durante 15 min con la finalidad de continuar el proceso de gelificación,
mejorar la retención de cocoa y favorecer la separación de las fases, finalmente las
microesferas son separadas por centrifugación donde la fase oleosa es descarta y las
microesferas de alginato con cocoa redispersas en agua para su análisis de distribución de
tamaño.
Determinación del contenido de polifenoles totales
El contenido total de fenoles fue analizado por el método espectrofotométrico de FolinCiocalteau siguiendo el procedimiento propuesto por Erkan et al., (2008) usando ácido gálico
como material de referencia. Para determinar la cantidad de fenoles totales en la fase
dispersa se tomó 1 ml (diluido 1:1000), enseguida se adicionaron 6,25 ml de carbonato de
sodio al 20%, 1,25 ml de Folin 1N y resto de agua miliQ hasta completar 10 ml, se agitó
vigorosamente y dejó en reposo durante 2 horas a temperatura ambiente. Pasado este
tiempo se midió la absorbancia a 765 nm. Procedimiento que se realizó para cada uno de los
ensayos señalados por el diseño experimental tanto para las variables de formulación como
preparación, con el objetivo de determinar el porcentaje de fenoles totales retenidos por
diferencia de concentración entre la cantidad presente en la fase dispersa y el sobrenadante
acuoso producto de la separación de las microesferas. En este sentido, se aplicó el mismo
procedimiento de análisis al sobrenadante. La preparación de los blancos fueron
considerados para cada caso con la finalidad de eliminar cualquier interferencia. La cantidad
de fenoles totales se expresaron como mg equivalentes de ácido gálico (mg ácido gálico/g
polvo de cocoa seco).
Distribución de Tamaño de las Microeesferas
Las microesferas de alginato con cocoa fueron caracterizadas por la técnica de difracción
láser dispersando las mismas en agua bajo continua agitación, el software del equipo genera
el diámetro medio del volumen equivalente referido como D(4,3) en micras, así como una
representación de la distribución de porcentajes volumen frente a los diámetros de las
microesferas. Asimismo, el software reporta otra variable respuesta denominada SPAN o
factor de polidispersidad referido a la variabilidad del tamaño de las partículas presentes en
la muestra.
Análisis de viscosidad de la fase dispersa
La fase dispersa formada por 2% p/p de alginato de sodio, 1% p/p de cocoa y 1 ml de
suspensión de citrato de calcio fue estudiada aplicando un análisis de viscosidad en función
del gradiente a temperatura controla y en función del tiempo. Primeramente, se observó el
comportamiento de la fase dispersa empleada para el diseño experimental propuesto. Los
resultados mostraron una influencia importante del tiempo en el aumento de la viscosidad.
Asimismo, se realizó el estudio para la fase dispersa neutralizada a pH entre 6,5 y 6,8 con
unas gotas de NaOH 6M bajo continua agitación y control del pH. Las viscosidades obtenidas
reflejan una disminución de casi un 95% en el valor de la viscosidad estacionaria para el
tiempo inicial de 6 min respecto a la fase dispersa neutralizada a 10 ºC. Por otra parte, el
comportamiento de la viscosidad frente al gradiente a 25 ºC muestra valores de viscosidad
con menores variaciones en el tiempo, así como la influencia de la temperatura sobre el
sistema. Tal como se aprecia en la Figura 1.
t1 = 6 ; t2 = 32 ; t3 = 58 ; t4 = 84 (min). *Fase dispersa sin neutralizar
Figura1. Viscosidad Fase dispersa
Análisis Estadístico
Tanto la construcción del diseño experimental como el análisis de los resultados se
procesaron usando el software STATGRAPHICS PLUS (Versión 5.1, Statistical Graphics
Corporation, Rockville, USA, 2000). Todos los datos se analizaron mediante ANOVA, donde
se consideraron significativos las respuestas con valores de p < 0,05. Los valores fueron
expresados como media±D.S.
RESULTADOS Y DISCUCIÓN
Diseño Experimental
Se estableció para la construcción del modelo un diseño experimental de tipo factorial 2k,
compuesto y rotable con tres réplicas en el punto central. Para las variables de composición
se plantearon tres factores: concentración de tensioactivo, concentración de CaCl2, y
cantidad de fase dispersa donde los niveles inferiores y superiores fueron 4-15%, 0,03-0,1 M
y 15-40% respectivamente. El diseño obtenido se muestra en la tabla 1.
Tabla 1. Diseño Experimental 23 factorial.
9,5*
Fase
Dispersa
%
27,5
0,065
273,95±9,36
5,59±0,92
28,44±9,16
9,5
6,48
0,065
448,87±67,57
7,86±1,08
0,64±0,32
0,25
27,5
0,065
486,86±16,28
1,89±0,04
63,02±0,88
9,5
48,52
0,065
101,93±85,17
3,35±5,42
64,40±0,33
Tensioactivo
%
CaCl2
(M)
µm D(4,3)
SPAN
%Ret
9,5
27,5
0,124
827,11±152,65
1,69±0,18
47,46±0,07
9,5*
27,5
0,065
157,06±30,84
2,42±0,74
42,64±4,24
15
40
0,03
59,2±13,62
6,29±7,52
82,81±1,16
4
15
0,1
301,71±56,56
3,55±0,49
1,96±2,91
15
15
0,1
241,13±108,15
4,21±0,94
30,15±4,71
9,5
27,5
0,006
171,87±13,76
1,42±0,16
44,32±2,67
4
40
0,1
152,62±32,76
2,51±0,47
62,77±0,02
4
15
0,03
332,38±43,71
3,76±1,02
1,93±0,66
9,5*
27,5
0,065
236,81±31,78
2,26±0,64
57,91±0,87
18,7
27,5
0,065
113,23±44,89
3,33±2,75
76,41±2,80
15
15
0,03
187,94±62,36
4,07±1,06
40,56±1,04
4
40
0,03
171,74±25,73
4,8±1,02
80,65±0,23
15
40
0,1
101,72±67,47
5,02±5,77
76,38±4,21
*Réplica: Puntos centrales. Ret.: retención cocoa en microesferas
El análisis estadístico mediante ANOVA muestra que las variables de composición no tienen
influencia significativa sobre el diámetro medio de las microesferas ni el factor de
polidispersidad de la muestra. Sin embargo, se observa un valor de p < 0,05 como efecto de
la cantidad de la fase dispersa sobre el porcentaje de retención de la cocoa en las
microesferas de alginato. Lo que indica que mencionado factor tiene un efecto significativo
sobre esta variable respuesta. Cabe resaltar, que los valores dados por los puntos centrales
muestran diferencias entre ellos, lo cual indica la existencia de variables no controladas en el
sistema. Para las variables de preparación se plantearon dos factores definidos como
velocidad de agitación y centrifugación con máximos y mínimos de 250-600 rpm y 20003800 rpm respectivamente. El diseño obtenido se muestra en la tabla 2.
Tabla 2. Diseño Experimental 22 factorial.
Cent.
(rpm)
D (4,3)
µm
425*
2900
600
3800
675
V.A
(rpm)
SPAN
%Ret
90,02±17,63
1,81±0,098
70,68±0,14
73,02±0,96
1,59±0,007
21,66±0,16
2900
59,66±9,24
1,65±0,059
73,37±0,10
425*
2900
75,27±4,74
1,63±0,031
75,04±0,02
250
2000
157,23±11,67 2,05±0,113
74,61±0,07
425*
2900
80,98±20,51
1,65±0,106
84,22±0,03
425
1630
79,16±8,81
1,63±0,067
54,68±0,05
250
3800
127,13±7,23
1,89±0,04
75,97±0,07
175
2900
148,06±5,89
2,28±0,038
77,28±0,01
600
2000
84,01±12,26
1,53±0,074
26,73±0,19
425
4170
61,3±0,23
1,75±0,009
52,92±3,05
*Réplica: Puntos centrales. Ret.: retención cocoa en microesferas
Cent.: centrifugación. V.A.: velocidad de agitación
Con valores de p < 0,05 se establecen diferencias significativas de la variable agitación sobre
el diámetro medio y el SPAN. Mientras que el factor de centrifugación no afecta a ninguna de
las variables respuestas. Debido a la variabilidad de los puntos centrales y evidencia del
efecto del cambio de viscosidad en función del tiempo y pH de la fase dispersa, se consideró
estudiar por medio de un diseño factorial fraccionado la influencia de este aspecto sobre las
variables de composición establecidas. Los resultados se muestran en la tabla 3.
Tabla 3. Diseño Experimental Fraccionado 23 factorial.
Tensioactivo
%
Fase
dispersa %
CaCl2
(M)
D (4,3)
µm
9,5*
27,5
0,065
9,5*
27,5
0,065
4
40
0,03
15
40
0,1
15
15
0,03
143,93±9,19
2,37±0,1
47,76±0,02
4
15
0,1
321,14±23,42
3,9±0,19
53,61±0,03
Span
%Ret
85,48±0,41
1,81±0,01
58,97±0,05
87,35±1,86
1,86±0,03 59,93±0,07
136,34±10,02 1,77±0,04 78,45±0,01
39,6±2,43
1,88±0,02
80,92±0,3
*Réplica: Puntos centrales. Ret.: retención de cocoa en microesferas
Puede observarse, que una vez controlado el pH de la fase dispersa se facilita el control de la
viscosidad de la mezcla en emulsión, al apreciarse que la influencia de las variables de
composición sobre el diámetro medio muestra resultados con una menor variabilidad en
contraste con los obtenidos previamente (tabla 1). Por otro lado, las réplicas del punto
central señalan reproducibilidad en los resultados.
CONCLUSIONES
El estudio muestra la posibilidad de encapsular compuestos naturales con alto contenido de
fenoles en microesferas de alginato empleando la técnica en emulsión por gelificación interna
ya que se observan valores de retención de la cocoa por encima del 50% a mayor cantidad
de fase dispersa. El estudio reológico de la fase dispersa con cocoa manifiesta la importancia
de controlar el pH, la temperatura y los tiempos de preparación de las microesferas.
Asimismo, la importancia de plantear un diseño experimental fraccionado preliminar con la
finalidad de establecer si las variables propuestas ejercen una influencia significativa sobre el
sistema en estudio.
AGRADECIMIENTOS
Se agradece al Programa de Becas para intercambio académico Ánimo-Chévere! dentro del
Proyecto Erasmus Mundus. A la Asesora CYCYTCTQ2011-29336-C03-02 por el financiamiento
del proyecto. Y a la Universidad Centrooccidental Lisandro Alvarado, Venezuela como
Institución Socia del Proyecto Ánimo-Chévere!.
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