Toxicidad y Respuesta Histopatológica en Aequidens portalegrensis

Toxicidad y Respuesta Histopatológica en Aequidens portalegrensis (Pisces, Cichlidae)
Expuestos a Bicloruro de Mercurio en Ensayos de Toxicidad Aguda y Subletales
Hirt, Lourdes M. - Domitrovic, Hugo A.
Instituto de Ictiología del Nordeste, Facultad de Ciencias Veterinarias (UNNE)
Sargento Cabral 2139 - C.C. 180 - (3400) Corrientes - Argentina
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ANTECEDENTES
Los metales pesados como el aluminio, cadmio, cobre, cromo, mercurio, plomo, y zinc, entre otros,
constituyen los mayores contaminantes químicos tanto en países desarrollados como en subdesarrollados.
Estos elementos no desaparecen del ambiente, sino que solamente pueden ser transferidos a otros lugares.
Algunos metales pesados pueden permanecer en solución, una proporción de ellos se acumulan en los
sedimentos y otros en las aguas de los ríos, estuarios, o mares (Lloyd, 1992). Los efectos biológicos de los
metales poluentes descriptos en organismos expuestos incluyen alteraciones en parámetros hemáticos,
metabólicos, inmunitarios, desarrollo embrionario, e incluso en un incremento de la incidencia de neoplasias
(Zelikoff et al., 1995). Si bien, los metales pesados en su conjunto pueden ser contaminantes del ambiente,
cada uno actúa independientemente causando diferentes problemas (Lloyd, 1992). Los disueltos en las aguas,
producen generalmente sofocamiento en los peces, debido a los precipitados o coagulados de mucoproteinas
sobre el epitelio branquial, esto constituye un bloqueo del intercambio de gases, la excreción de productos de
desecho y la osmorregulación (Jones, 1973). El mercurio, que es el más tóxico y no-escencial de los metales
pesados, está ampliamente distribuido en la corteza terrestre y en el medio ambiente acuático. Con su uso
extensivo en varias industrias para la preparación de medicinas, fungicidas, insecticidas y bactericidas, su
concentración en el ecosistema acuático se incrementó. Numerosos estudios demostraron la distribución y
acumulación del mercurio en el agua, sedimentos, zooplancton y peces (Pandey et al., 1994).
En el presente trabajo se determinaron, mediante ensayos de toxicidad aguda, los valores de CL50 para
bicloruro de mercurio en Aequidens portalegrensis, y se analizaron biomarcadores externos y alteraciones
histopatológicas producidas en ensayos de toxicidad aguda con recuperación y en ensayos subletales.
MATERIALES Y MÉTODOS
En los ensayos de toxicidad se utilizaron ejemplares de Aequidens portalegrensis capturados en ambientes
leníticos de la cuenca del Riachuelo (Corrientes), que fueron mantenidos en adaptación durante 15 días.
Para el ensayo agudo se empleó el modelo de test estático, con acuarios de vidrio de 5 litros y aireación
continua, y se utilizaron 3 réplicas compuestas por 5 acuarios con concentraciones de 200, 360, 640, 1120 y
2000 µg.L-1 de bicloruro de mercurio (HgCl2), y uno control, y en cada acuario se colocaron lotes
homogéneos de 10 ejemplares de ambos sexos. Mediante observaciones del comportamiento y del aspecto de
los peces, se determinaron las modificaciones en los siguientes biomarcadores externos: cambios en la
pigmentación, alteraciones en el tegumento (p.e. aumento secreción mucosa, erosión de aletas o escamas),
cambios en la natación y alteraciones del equilibrio, alteraciones en los movimientos operculares respiratorios,
movimientos y posición de aletas, y distrofias respiratorias. Los valores de CL50, y los correspondientes
límites de confianza del 95%, fueron obtenidos mediante el análisis probit a partir del registro de peces
muertos en cada tiempo. Para los estudios histopatológicos se tomaron muestras de los peces moribundos.
Transcurridas 96 horas, se realizó un muestreo del 30 % de los peces sobrevivientes en cada acuario. Luego
los peces fueron lavados y colocados en acuarios con agua nueva, para recuperación durante 168 horas (7
días). En este periodo se realizaron muestreos para histopatología a las 72 horas (20 % de los sobrevivientes),
120 horas (20 %) y 168 horas (30 %). Las muestras fijadas en Bouin se incluyeron en parafina, y los cortes
histológicos de 5 µm se colorearon con hematoxilina y eosina.
El ensayo subletal con bicloruro de mercurio se realizó durante 28 días, se utilizaron 2 réplicas compuestas
por 2 acuarios con concentraciones finales de 150 y 300 µg.L-1 y un acuario control, donde se colocaron lotes
homogéneos de 10 ejemplares. Cada 72 horas se renovó el agua con las concentraciones del producto
ensayado. Para estudios histopatológicos se tomaron muestras de tejidos del 20 % de los peces a los 7, 14, 21
y 28 días del ensayo respectivamente. Luego los peces fueron lavados y colocados en acuarios con agua
solamente para recuperación durante 7 días, al finalizar este período se hizo un muestreo del 20 % restante.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
En los ensayos realizados con Aequidens portalegrensis no se hallaron mayores efectos letales con las
concentraciones más bajas de bicloruro de mercurio (200 y 360 µg.L-1), pero se registró un número elevado de
muertes con 1120 y 2000 µg.L-1. En la Tabla 1 se consignan los valores de CL50 de bicloruro de mercurio
para los diferentes tiempos de exposición. La CL50-96Hs de bicloruro de mercurio para Aequidens
portalegrensis se encuentra dentro de los rangos obtenidos para otras especies (Tabla 2).
Tabla 1. Valores de CL50 (µg.L-1 ) de bicloruro de mercurio para Aequidens portalegrensis a los diferentes
tiempos de exposición (los límites de confianza del 95% se expresan entre paréntesis).
24 Hs.
48 Hs.
72 Hs.
96 Hs.
740
(670-830)
670
(600-750)
660
(590-730)
660
(590-730)
Tabla 2. Toxicidad de bicloruro de mercurio (como CL50-96Hs en µg.L-1 ) en diferentes especies de peces.
Concentración
710-770
52,62 a
16,75 a
1000 b
112
33-687
a: Expresado como Hg/L
Especie
Cyprinus carpio
Gambusia affinis
Notemigonus crysoleucas
-Pimephales promelas
--
Referencia
Alam y Maughan (1995)
McCrary y Heagler (1997)
McCrary y Heagler (1997)
Post (1987)
Snarki y Olson (1982)
Spry y Wiener (1991)
b: Expresado como Límite de Tolerancia media (TLm), tiempo no especificado.
Las modificaciones en los biomarcadores externos en las primeras horas del ensayo, con concentraciones de
1120 y 2000 µg.L-1, consistieron en natación errática, pérdida de equilibrio, bocanadas de aire en la superficie,
oscurecimiento de piel, congestión en aletas y tegumento, e hipersecreción mucosa. En la concentración de
640 µg.L-1 se observó pérdida de equilibrio, elevación hacia la superficie, y disminución de la motilidad. En la
concentración de 360 µg.L-1, los movimientos natatorios eran más lentos y con mayor motilidad de las aletas
pectorales. A las 20 horas los cambios observados persistían en las concentraciones de 640 y 360 µg.L-1. A
las 72 horas, en las concentraciones de 640 µg.L-1, los movimientos de aletas pectorales eran rápidos,
movimientos de natación lentos, apertura bucal, sin presencia de mucus.
Histopatológicamente se observó, con las concentraciones mayores, que a partir de la primer hora de
exposición había: branquias con necrosis intensa en laminillas y filamentos, congestión, hemorragia, fusión
total y pérdida de la estructura laminillar, y necrosis del epitelio superficial del arco branquial con distintos
grados de intensidad; intestino con pérdida de epitelio por necrosis limitada al extremo de las vellosidades;
hígado con congestión venosa y capilar, tumefacción y necrosis perivascular de hepatocitos, y ovario con
intensa proliferación de células foliculares, vacuolización, y licuefacción de ovocitos II y III.
Con la concentración de 640 µg.L-1, a las 12 horas de exposición había necrosis y congestión de laminillas
branquiales y de epitelio de arco branquial, como así también en hígado, intestino y ovarios. A las 32 horas la
necrosis en branquias e intestino fue más intensa y acompañada de hemorragias. A las 96 horas la parte basal
del epitelio del arco branquial presentaba renovación mientras que la parte expuesta aún se observaba
necrosis, en las laminillas secundarias había fusión total en los extremos.
Con la concentración de 360 µg.L-1, a las 96 horas de exposición en branquias había congestión laminillar y
telangiectasia, y se observaron células hipertróficas e hiperplásicas tanto en laminillas como en el arco
branquial; zonas parciales del epitelio branquial estaban conservadas, y otras presentaban regeneración,
aunque persistía la fusión laminillar en los extremos terminales del filamento.
Con concentraciones de 200 µg.L-1, a las 96 horas de exposición, en las branquias había leve fusión de
laminillas en los extremos de los filamentos, con regeneración e hipertrofia epitelial, e hiperplasia del epitelio
del arco branquial; regeneración del epitelio intestinal; congestión y degeneración vacuolar hepática.
Durante el período de recuperación, con la concentración de 640 µg.L-1 a las 72 horas las branquias
presentaban una estructura general normal, pero se observaban células hipertróficas en laminillas, y
telangiectasias ocupando laminillas primarias completas; en el hígado había tumefacción de hepatocitos; y en
el intestino había leve hiperplasia epitelial. A las 120 horas aún se observaban laminillas branquiales
fusionadas en los extremos y algunas con fusión completa; y a las 168 horas había laminillas branquiales
redondeadas en los extremos con telangiectasia, y el hígado tenía degeneración vacuolar.
Con la concentración de 360 µg.L-1, a las 72 horas en las branquias había zonas con hipertrofia epitelial en
los extremos, fusión de laminillas y telangiectasia; con zonas de hiperplasia y fusión total en algunos
filamentos. En el hígado se halló ligera tumefacción; el intestino tenía leve hiperplasia del tejido epitelial, y en
el ovario había degeneración de ovocitos II y licuefacción. A las 120 horas las branquias tenían leve
hipertrofia epitelial, y fusión de laminillas primarias en el extremo del filamento; en hígado, intestino y
ovarios no se observaron lesiones. A las 168 horas la recuperación branquial era notable aunque los
filamentos branquiales aún presentan hipertrofia epitelial.
Con la concentración de 200 µg.L-1, a las 72 horas ciertas laminillas branquiales se presentaban con estructura
normal mientras que en otras había leve hiperplasia epitelial con fusión en los extremos terminales; y éstas
lesiones persistieron hasta las 168 horas. Hígado e intestino se observaron normales.
En los ensayos subletales, los peces expuestos a las dos concentraciones utilizadas presentaron a partir de los
14 días de exposición intensa descamación en la zona dorsal y cercana a la cabeza; a los 21 días la
descamación se extendía a toda la superficie corporal (las escamas se desprendían fácilmente); y a los 28 días
desprendimiento de las aletas pectorales y caudal durante la manipulación. El aumento en la pigmentación del
cuerpo también fue gradual (hasta un negro intenso al finalizar el ensayo). En cuanto a los órganos internos,
se observó un agrandamiento progresivo del bazo e hígado, con colores oscuros para el primero y muy pálido
para el segundo. Histopatológicamente en las branquias se observó leve hiperplasia e hipertrofia epitelial en
las laminillas y filamentos branquiales a los 7 días de exposición; a partir de los 21 días hubo un aumento de
estas lesiones con fusión completa de laminillas y formación de microquistes intraepiteliales, y degeneración
vacuolar en hepatocitos; la recuperación fue muy escasa en el periodo posterior a la exposición.
En los peces en general, la toxicidad del cloruro de mercurio, como CL50-96Hs, está en el rango entre los 33
y 687 µg.L-1 ( Spry y Wiener, 1991), mientras que para Pimephales promelas es de 112 µg.L-1 (Snarki y
Olson, 1982), el límite de tolerancia media para Salmo gairdneri está entre 220 y 400 µg.L-1 ( Macleod y
Pessah, 1973). Especímenes de Channa punctatus expuestos a 0,248 ppm de mercurio durante siete días
mostraron un aumento en la actividad de la fosfatasa ácida en los macrófagos del bazo y del hígado (Datta
Munshi et al., 1990). Cuando ejemplares de Heteropneustes fossilis fueron expuestos a una solución de
cloruro de mercurio, mostraron movimientos erráticos y subían a la superficie varias veces a tomar bocanadas
de aire; y se observó una copiosa producción de mucus, constituyendo una gruesa capa sobre toda la
superficie del cuerpo (Rajan y Banerjee, 1991). Entre las 4 y las 96 horas de tratamiento, los peces empezaron
a ponerse lentos, menos activos, exhibiendo movimientos de tipo vertical, en algunos casos ocurrió la muerte;
a los 4-5 días de tratamiento con mercurio, los peces sufrieron hemorragias y úlceras en diferentes sitios del
cuerpo, por ejemplo en la base de las aletas, a veces se observó la pérdida de la aleta caudal después de los
seis días de exposición (Rajan y Banerjee, 1991). También se hallaron cambios histopatológicos en los
órganos respiratorios de Heteropneustes fossilis expuestos a mercurio (Rajan y Banerjee, 1993). Uno de los
efectos más importantes observados en los riñones de peces expuestos a concentraciones tóxicas de mercurio
fue la inducción a una mayor salida del K y mayor entrada de Na, lo cual produce a su vez un cambio en el
volumen celular y una dilatación en el retículo endoplasmático. Los efectos sobre las mitocondrias se traducen
en una inhibición de la respiración celular (Trump et al., 1975). Alteraciones histopatológicas producidas por
la intoxicación con cloruro de mercurio fueron demostradas en el hígado, intestino y en los centros
hipotálamo-neurosecretorios de Liza parsia (Pandey, 1994; Pandey et al., 1994). Weis et al. (1986) hallaron
cambios hepatocelulares inducidos por mercurio y cobre en Fundulus heteroclitus.
CONCLUSIONES
La CL50-96Hs. de bicloruro de mercurio para Aequidens portalegrensis fue de 660 µg.L-1. Las
modificaciones más importantes en los biomarcadores externos fueron: secreción de mucus, cambios en la
pigmentación del tegumento, movimientos erráticos y sofocación. Las lesiones branquiales letales fueron
primariamente necróticas, hemorrágicas y congestivas; y a partir de las 72 horas había hiperplasia e hipertrofia
epitelial, y fusión laminillar y de filamentos. A las 96 horas, la fusión laminillar y la hipertrofia epitelial eran
muy notables. En el período de recuperación las branquias recobraron su morfología normal, aunque se
mantuvieron lesiones hipertróficas e hiperplásicas. En el ensayo subletal las branquias tenían hiperplasia e
hipertrofia epitelial, con fusión laminillar en los tiempos más prolongados, y en el hígado degeneración
vacuolar en los hepatocitos.
BIBLIOGRAFÍA
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