Relación entre coste, calidad y precio del análisis de

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Relación entre coste, calidad y
precio del análisis de Legionella
Míriam Monedero Boado
Responsable Microbiología
Laboratorio Dr. Oliver Rodés
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ANÁLISIS DE LEGIONELLA
El laboratorio Dr. Oliver Rodés lleva realizando
análisis de Legionella desde el año 1991 (los
primeros se realizaron para Balnearios).
El método no ha cambiado sustancialmente, los
medios de cultivo son iguales así como los
tratamientos de las muestras.
Sí que se han introducido más controles de
aseguramiento de la calidad en todo el proceso de
análisis, desde la toma de muestra hasta la emisión
del resultado final.
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LEGIONELLA - Legislación
• Real Decreto 865/2003 de 4 de julio por el que
se establecen loscriterios higiénico-sanitarios
para la prevención y control de la legionelosis.
• Decret 352/2004 de 27 de juliol, pel qual
s’estableixen les condicions
higienicosanitàries pèr a la prevenció i el
control de la legionel·losi..
Qué instalaciones tienen un mayor grado de
probabilidad e proliferación y dispersión de
Legionella.
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ANÁLISIS - Toma de muestras
Se realiza en un determinado punto de toma
de muestra, en un determinado momento,
bajo unas determinadas condiciones.
No hablamos del agua, por ejemplo, de todo
un edificio, para ello se debería realizar un
muestreo en el espacio y en el tiempo. Sí se
realiza, como se especifica en la
legislación, un control de los puntos
terminales a lo largo de todo el año.
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ANÁLISIS - Toma de muestras
Para la recogida de muestra se sigue el
punto b del Anexo 6 del RD.
Se recoge de la forma “más desfavorable”,
ya que se rasca el grifo, ducha o punto de
toma de muestra con una torunda para
recoger las incrustaciones o posible
material sedimentado que pudiera servir
de reservorio a la bacteria.
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ANÁLISIS
Transporte y Conservación de
muestras
Según se especifica en la Norma ISO 11731:
Parte 1 (1998)
Tanto la temperatura de transporte como la
de conservación tiene que ser controladas.
Márgenes especificados por la Norma:
Tª de Transporte:
Tª de conservación:
6 a 18ºC / máx. 2 días
6 a 18ºC / máx. 5 días
Como en cualquier muestra de microbiología, es preferible
que el inicio del análisis sea lo más inmediato posible.
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ANÁLISIS
Concentración de la muestra
Difícil conocer a priori si la muestra se
tiene que concentrar o no.
EL resultado se tiene que analizar y
expresar en 1 L de muestra.
La concentración se puede realizar por
centrifugación o filtración.
EL resultado que se obtenga dependerá de
la elección de uno u otro método.
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ANÁLISIS
Concentración de la muestra - Problemas
• Muestras que contienen mucho material
sedimentable. El filtro se colmata.
Posibles soluciones:
– Filtración de un volumen menor o no
concentración de la muestra.
– Utilización de mayor número de filtros.
– Utilización de mayor volumen de reactivo de
elución.
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ANÁLISIS
Concentración de la muestra - Problemas
• Muestras, aparentemente transparentes, poco turbias,
y que no contiene material sedimentable apreciable.
Se les han adicionado productos que mantienen los
sólidos en suspensión para evitar la formación de
sedimento en las instalaciones.
Estos productos crean una capa en el filtro que puede
impedir la filtración del litro de muestra.
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ANÁLISIS
Concentración de la muestra - Problemas
Posibles soluciones:
– Filtración de un volumen menor o no
concentración de la muestra.
– Utilización de mayor número de filtros.
– Utilización de mayor volumen de reactivo de
elución.
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ANÁLISIS
Concentración de la muestra - Problemas
Estas dificultades en la filtración tienen las
siguientes consecuencias:
• Mayor inversión de tiempo en la filtración; la expresión
de resultados se modifica.
• Utilización de un mayor número de filtros.
• Mayor volumen de reactivo de elución, que implica la
modificación en el límite de cuantificación de la muestra
Por tanto, de entrada, ya es difícil calcular el coste directo
en cuanto a material y tiempo de análisis.
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ANÁLISIS
Elución del concentrado - Problemas
Una vez concentrada la muestra en el filtro, se tienen
que eluir para desprender los microorganismos de los
filtros.
Factores que influyen en una “buena” elución:
• Composición de los filtros:
Los filtros de nylon y policarbonato dan mejores recuperaciones
que los de ester de celulosa (más utilizados en los laboratorios de
microbiología). Si se utiliza la Norma ISO 11731: Parte 2 los
filtros de esteres de celulosa dan recuperaciones superiores. Son
diferentes filtros para diferentes técnicas de recuento.
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ANÁLISIS
Elución del concentrado
• Forma de elución:
La Norma permite agitación por vortex o
sonicación.
Da mejores resultados la sonicación. Es más
estandarizable.
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ANÁLISIS - Cultivo
La Norma especifica tres métodos iniciales en
paralelo para analizar la muestra (tratamientos
diferentes para intentar eliminar microbiota):
– Por siembra directa.
– Con adición de ácido (pH= 2,2)
– Con tratamiento por calor (Tª 50ºC)
De una muestra hemos pasado a tres muestras.
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ANÁLISIS
Cultivo – incubación / Lecturas
Se inician a partir del cuarto día de incubación y se
prosigue cada dos días hasta el día 10. Esto
implica un grado de atención y control del análisis
superior a otras técnicas microbiológicas.
El realizar tantas lecturas permite detectar la
presencia de colonias sospechosas antes de que la
posible flora acompañante enmascare las
morfologías o el número de colonias sea tan
elevado que el recuento sea prácticamente
imposible.
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ANÁLISIS
Cultivo – incubación / Lecturas
Presencia de microbiota acompañante:
• Puede crecer con anterioridad a la colonia
de Legionella.
• No permite la visualización de las colonias
de Legionella o su correcto aislamiento.
Las
morfologías
coloniales
están
mezcladas o superpuestas.
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ANÁLISIS
Cultivo – incubación / Lecturas
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ANÁLISIS
Cultivo – incubación / Lecturas
Posibilidades:
• Se podría emitir un resultado de No detectado.
• Los diferentes tratamientos me darán algún resultado?
• En el caso de querer conocer el recuento se tienen que
realizar más diluciones, que implica: necesidad de más
tiempo para la emisión de un resultado y un aumento
del consumo de medios de cultivo. Hay que volver a
sembrar placas con los tres tratamientos o en su
defecto con aquellos en los que la flora acompañante
no permita la diferenciación o aislamiento
morfológico.
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ANÁLISIS
Cultivo – incubación / Lecturas
– Por ejemplo, el tratamiento por calor suele eliminar
mucha microbiota acompañante pero los recuentos para
Legionella son notablemente más bajos que con los
otros dos tratamientos.
– Se realizarán diluciones con los otros dos tratamientos.
• Análisis de la muestra directa realizando también los
tres tratamientos (a posteriori?).
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S.O.S
Como puede verse, esta
técnica es de todo
menos “poco
compleja”!!!!.
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ANÁLISIS
Confirmación de morfologías
La confirmación de las colonias sospechosas
de ser Legionella se tiene que hacer de
cada morfología, de cada tratamiento y de
un número representativo de colonias
(para Legionella spp. la Norma ISO indica
3 colonias como mínimo).
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ANÁLISIS
Confirmación de morfologías
Técnico: es importante que el técnico que realiza la analítica esté
familiarizado con las morfologías coloniales de Legionella, así
seleccionará solamente aquellas colonias sospechosas de ser
Legionella y sobre las que haremos las pruebas de
confirmación.
La morfología colonial de Legionella puede ser tan específica
que, dentro de una misma especie, la diferencia de serogrupo
puede dar lugar al crecimiento de una morfología diferenciada,
pero no siempre.
Sólo la experiencia del técnico puede dar con estas diferencias,
“sutiles” muchas veces, para evitar así confirmaciones
innecesarias o, lo que sería peor, confirmaciones no realizadas.
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ANÁLISIS
Confirmación de morfologías
• La confirmación para determinar la presencia o
no de Legionella spp, se realiza por crecimiento
de las colonias sospechosas en medio BCYE
(Cys+) y un medio sin cisteina ( BCYEcys-,agar
sangre, agar nutritivo).
• La confirmación de la presencia de Legionella
pneumophila se realiza por técnicas de
inmunofluorescencia o aglutinación en latex.
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ANÁLISIS
Confirmación de morfologías – Norma ISO
La última frase de la Norma ISO11731:1 en el punto de expresión de
resultados dice: “El propósito de esta Norma es demostrar la presencia
o ausencia de organismos confirmados como Legionella en la
muestra. Expresar la confirmación de la presencia (o ausencia) de L.
pneumophila y la presuntiva presencia (o ausencia) de otras especies
de Legionella.” (traducción)
Que se puede interpretar como la obligación de confirmar todas las
colonias sospechosas de ser Legionella spp. como Legionella
pneumophila, y no solo un número determinado de colonias. Esto
obligaría a confirmar, en muchos casos cientos de colonias y la
realización del análisis sería inviable.
Muchos laboratorios optan por validar rangos de confirmación (rangos de
recuento y cuántas colonias se tienen que confirmar de cada rango);
pero no deja de ser diferente de lo que se puede interpretar en esta
frase.
Por lo tanto cada laboratorio gastará más o menos tiempo y material de
confirmación cuantas más o menos colonias confirme.
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CALIDAD
No hay que olvidar que a toda técnica hay que
añadir los controles de calidad de los medios
de cultivo y reactivos, y de la propia técnica
analítica, que sirven para garantizar los
resultados y que siempre implican un coste
adicional; pero, sin los que no se podría dar un
resultado fiable.
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Porqué hablar de costes
Excusa para hablar de los problemas de esta
técnica:
Empezando por que siempre se recupera menos de lo
que hay en la muestra: hay pérdidas en la
concentración, hay pérdidas en la elución, hay
pérdidas en los tratamientos.
Relación del precio del análisis con la experiencia de
los laboratorios y también de los medios de cultivo
utilizados.
Dificultad de establecer un precio a priori, porque
dependerá de la muestra.
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MEDIOS DE CULTIVO
GVPC
Estudio realizado con cuatro casas
comerciales (A, B, C y D).
Se especifican los resultados obtenidos para
cada casa comercial y una de ellas está
repetida ya que después del primer estudio
revisaron su formulación, y se volvió a
estudiar su medio de cultivo (C).
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MEDIOS DE CULTIVO
GVPC
Directo
(ufc / placa)
A
C
239
54
232
33
>200
11
190
37
>200
48
175
60
>200
56
163
48
231
43
123
53
Ácido
(ufc / placa)
A
C
118
21
180
22
(235)
2
125
19
(272)
22
121
36
173
23
90
19
144
9
117
14
Calor
(ufc / placa)
A
C
18
1
46
2
12
0
25
0
15
0
37
1
17
0
13
0
5
0
2
0
Recuento
(ufc / L)
A
C
2,4e+05 5,4e+04
2,3e+05 3,3e+04
>2,2e+05 1,1e+04
1,9e+05 3,7e+04
>2,2e+05 4,8e+04
1,8e+05 6,0e+04
2,0e+05 5,6e+04
1,6e+05 4,8e+04
2,3e+05 4,3e+04
1,3e+05 5,3e+04
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MEDIOS DE CULTIVO
GVPC
6
5
4
3
A
C
2
1
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
30
MEDIOS DE CULTIVO
GVPC
Directo
(ufc / placa)
Ácido
(ufc / placa)
Calor
(ufc / placa)
Recuento
(ufc / L)
A
D
A
D
A
D
A
D
>200
94
174
37
11
5
>2,0e+05 9,4e+04
54
17
64
5
9
0
7,1e+05
1,7e+04
72
41
77
36
2
1
3,4e+05
1,6e+04
95
22
91
18
4
0
2,0e+05
4,4e+04
31
MEDIOS DE CULTIVO
GVPC
6
5
4
3
A
D
2
1
0
1
2
3
4
32
MEDIOS DE CULTIVO
GVPC
Directo
(ufc / placa)
Recuento
(ufc / L)
A
B
C*
A
B
C*
71
49
155
7,1e+03
4,9e+03
1,6e+04
38
41
33
3,8e+03
4,1e+03
3,3e+03
86
74
195
8,6e+03
7,4e+03
2,0e+04
66
54
109
6,6e+03
5,4e+03
1,1e+04
57
73
86
5,7e+03
7,3e+03
8,6e+03
60
1,0e+03
10
6,0e+03
36
11
67
3,6e+03
1,1e+03
6,7e+03
19
7
43
1,9e+03
7,0e+02
4,3e+03
85
58
161
8,5e+03
5,8e+03
1,6e+04
117
91
175
1,2e+04
9,1e+03
1,8e+04
33
MEDIOS DE CULTIVO
GVPC
5
4
3
A
B
2
C*
1
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
34
MEDIOS DE CULTIVO
Los precios de tarifa del medio de cultivo
dependiendo de la casa comercial son:
MEDIO
Nº Placas
A
B
C*
D
GVPC
20
34,55
35,06
34.80
25.97
BCYE
(cys+)
10
16,50 (15,73) (15,20) (13,12)
20
(33,00) 31,46
30,40
26,24
35
MEDIOS DE CULTIVO
Conclusiones
1. El medio A es el que da los recuentos más
elevados.
2. El medio B se acerca a los resultados
obtenidos por el medio A, pero las
morfologías coloniales que crecen son de un
mayor diámetro y su descripción no es tan
clara.
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MEDIOS DE CULTIVO
GVPC
3. Una vez modificado el medio C, éste pasa a dar
el mejor recuento. Sin embargo, el tiempo de
incubación que se necesita para el medio A es
menor que para el medio C. Las colonias del
medio C son más pequeñas y tardan entre 2 y 4
días más que el medio A en poder diferenciarse
morfológicamente. Si existe mucha microbiota
acompañante, ésta suele crecer antes que
Legionella y podría enmascarar su presencia.
37
MEDIOS DE CULTIVO
Conclusiones
4. No todos los medios de cultivo podrían
utilizarse para todas las muestras. El medio
de cultivo C* funcionaría bien para muestras
con poca microbiota acompañante, pero el
medio A funciona mejor en muestras con
más microbiota acompañante.
5. Los precios de los medios de cultivo son
muy variables. Clara influencia en el coste
del análisis.
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CONCLUSIONES
Hay una dificultad evidente en establecer un
precio para el análisis de Legionella. Este
depende claramente del tipo de muestra y del
grado de contaminación que tiene.
La diferencia del precio de los medios de cultivo
que se utilizan representan una dificultad
adicional.
Comprobar las recuperaciones que se obtienen
con los medios de cultivo comercializados.
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Agradecer al personal de
la Unidad de
Microbiología el
trabajo que han
realizado.