MANTENCION DE CELULAS HELA EN SUERO EQUINO

APARTADO DEL BOLETIN DEL INSTITUTO
BACTERIOLOGICO DE CHILE
VOL. I X
ASO 1956
N.os 1-4
INSTITUTO BACTERIOLOGICO DE CHILE
Departamento de Virus
Jefe: Raul Palacios
MANTENCION DE CELULAS HELA EN SUERO EQUINO
Sensibilidad de estas celulas a los virus de poliomielitis
Por
GUILLERMO CONTRERAS DA SILVA
Jefe de la Section Poliomielitis
SUMARIO: Se describe como se mantienen cultivos de celulas
Hela en presencia de suero equino, la multiplication y desarrollo de muchas generaciones sucesivas de celulas exclusivamente en un medio con este suero, la manera como se
hacen estos cultivos celulares y la mayor sensibilidad que
presentan para log virus polio en comparacion con cultivos
de celulas Hela en suero humano.
Introduccion
El uso de cultivos de tejidos humanos
para el trabajo de virus plan tea el problema de mantener e incluso multiplicar
estos tejidos en ausencia de suero humano, entre otras razones, por su posible contenido en anticuerpos neutralizantes para
virus. Precisamente en esta situacion se
encuentran los cultivos de celulas Hela
que, originadas de un carcinoma cervicouterino humano (1), han demostrado una
gran utilidad en estudios de virus humanos, particularmente, los de poliomielitis
(2).
Para solucionar este problema se propuso originalmente (2) el uso de un medio de cultivo consistente en una mezcla
de acidos, vitaminag etc., mas una pequena proporcion de suero de gallina y posteriormente, otros substitutos del suero
humano (3).
Desde que nosotros obtuvimos las celulas Hela en septiembre de 1953* pensamos
mantenerlas en presencia de suero equi* En amable respuesta a nuestra solicitud, dos
botellas de cultivos de celulas Hela nos fueron gentilmente enviadas por el Dr. J. T.
Syverton de Minneapolis, Minn., EE. UU.
no. El objeto de esta presentation es describir en detalle como se mantienen estas
celulas Hela en suero equino desde hace
mas de 24 meses y comparar su sensibilidad frente a virus-polio 1, 2 y 3 con las
celulas mantenidas en suero humano. Recientemente hemos visto publicado un trabajo similar que comprendia, sin embargo, un manor numero de subcultivos, realizado en otro laboratorio (4) y tambien
otra publication en la que se han hecho
comparaciones de su sensibilidad frente
a los virus-polio.
Materiales y Metodos
1) Cultivos de celulas Hela en suero humano.— Estas celulas se han mantenido
desde su llegada a nuestro laboratorio en
un medio nutritivo compuesto de suero
humano 30% y solucion salina de Hanks,
70%. (Para abreviar, en adelante llamaremos Hanks, a la solucion salina de
Hanks). Durante un cierto tiempo se incorporo extracto embrionario al 2% a este medio, de acuerdo con la recomendacion
original (2) ; pero luego se dejo de usar
por las razones que se veran mas adelante
y desde entonces el medio nutritivo lo forman unicamente los dos componentes nom-
brados. En adelante llamaremos. Hgla clasica a estos cultivos de celulas Hela en
suero humano.
Los repiques se hacen por raspado del
cultivo de la pared del tubo con una pipeta Pasteur acodada y luego se dispersan los agregados eelulares por aspiracion
y expulsion energica en una pipeta serologica de 1 mL El recuento celular directo
de la semilla hecho en un hemocitometro
corriente da valores cercanos a 200.000
celulas por ml. Esta suspension celular se
diluye, por lo general al 1:10, en medio
nutritivo y con ella se siembran los nuevos tubos, botellas etc. Las celulas se adhieren por" si solas al vidrio a las pocas
horas en los nuevos tubos, botellas etc.
que han sido dejados casi horizontales en
la estufa a 37". A los 3-4 dias se hace el
primer examen al microscopio (generalmente con pequeno aumento), luego se
continuan examinando y cambiando de medio nutritivo cada 3-4 dias hasta que al
cabo de 9 a 12 dias estan listos para ser
usados como fuente de nuevos cultivos o
para otro uso.
Los cultivos se hacen en varios tipos
de continentes, siendo los mas usados los
tubos de ensayo Pyrex de 16 x 150 mm.
en los que se siembfa 1 ml; en otros continentes mayores se siembra una cantidad
proporcionalmente mayor; por ejemplo, 10
ml para botellas cuadradas de lados pianos de unos 40 cm2 de superficie; 40 ml.
para placas de cultivo de unos 400 cm2 de
superficie; 5 ml. para placas de Petri de
65 mm. de diametro, etc.
2) Cultivos de celulas Hela mantenidas
en suero equino. Estas celulas se mantienen en un medio nutritivo que contiene
40% de suero equino y 60% de Hanks y
lo llamaremos medio C40% en adelante.
Se comenzo por hacer los repiques de esta
lmea de celulas Hela en la forma recien
descrita. Al presente, la semilla para los
nuevos cultivos se prepara como sigue:
en los continentes elegidos se reemplaza el
medio nutritivo para una solucion de tripsina ( * ) al 0,1;% en Hanks, se incuba a
*
Se trata, de tripsina Difoo al 1:250, de la cual
se prepara una soluci6n al 1% en salina
tamp6n fosfato (7), se esteriliza por filtraci6n y luego se guarda congelada por meses
a 20°. En el momento de usarla se descon-
37° por 10 minutos, se recogen los trozos
de cultivo desprendidos de la pared del
continente y se les junta en un envase de
fondo conico. Al cabo de media hora los
agregados eelulares han sedimentado totalmente; la tripsina sobrenadante se elimina; al sedimento celular se agrega un
volumen equivalente al inicial de medio
C40% fresco; el medio se agrega lentamente y con un energico pipeteo para liberar las celulas individuales de los agregados eelulares y se toma muestra para el
recuento. Este da entre 150 a 500.000 celulas por ml, (mas una pequena cantidad
de agregados eelulares en los que no se
distinguen las celulas aisladas y que se
cuentan como agregados). De acuerdo con
el valor del recuento se diluye la suspension celular de manera de tener alrededor
de unas 100.000 celulas1 por ml. para sembrar los nuevos cultivos. Estos se llevan
a la estufa como queda dicho mas arriba
y a los 3-4 dias se examinan los cultivos
y se numeran los diversos continentes
sembrados. En general, en este momento
los cultivos estan listos para el trabajo
con virus y en unos 3 a 4 dias mas
se puede hacer con ellos un nuevo repique. En adelante llamaremos Hela CA
a esta linea de celulas Hela mantenidas en
suero equino.
3) Los medios nutritivos.— Como hemos dicho mas arriba, el medio usado esta constituido por Hanks y suero. El
Hanks es una solucion salina con rojo de
fenol como indicador de pH, preparada con
8 sales de pureza analltica y dextrosa ( 6 ) .
El Hanks se esteriliza en el autoclave
a 10 libras por 10 min. ( * ) . El bicarbonagela, se centrifuga a 1.500 rpm. por 10 min.
y el sobrenadante se diluye al 1:10 en Hanks
y se agrega m&s o menos 1 ml. de bicarbonato por cada 25 ml. de mezcla.
*
Para facilitar la preparation del Hanks se
hacen dos soluciones concentradas A y B
que se mezclan y diluyen al 1:20 con agua
destilada antes de usar. En ese momento se
esteriliza a 10 lbs. por 10 min. se enfria y
se envasa. La soluci6n A tiene: los cloruros
de sodio, potasio, calcio y magnesio y el
sulfato de magnesio. La solucion B tiene:
los fosfatos de sodio y potasio, la dextrosa y
el rojo de fenol. Ambas se conservan a 5*' con
0,5 ml de CHC13 por 250 ml de solucion.
to se esteriliza aparte, ampolletado, en
una solucion al 1,4% y se agrega a razon
de 1 ml. para cada 40 ml. de Hanks solo
antes de mezclar con suero y junto con
agregar 100 unidades de penicilina y 100
microgramos de estreptomicina por ml.
(La composicion exacta del Hanks se puede consultar en numerosos libros y articulos escritos sobre cultivo de tejidos).
El agua que usamos para todo nuestro
trabajo es destilada y desmineralizada por
paso a traves de una columna de resinas
de intercambio ionico. ( * ) . Con esta agua
se preparan los medios de cultivo y se
enjuaga el material de vidrio. La casi totalidad de este material es de vidrio Pyrex y se limpia con el mayor cuidado,
dejandolo remojar durante la nochei en
un buen detergente. ( * * ) . En ocasiones
es necesario limpiarlo por accion de una
mezcla de acido sulfurico comefcial con
5% de acido nitrico. Los residuos acidos se
eliminan por paso de abundante agua caliente de la llave o hirviendo con agua
desmineralizada.
El suero humano lo obtenemos de dadores cuyo registro conservamos para uso
futuro y se separa del coagulo por dos
o mas centr'ifugaciones sucesivas a 1.700
rpm. por 10 min. No se hacen filtraciones ni calentamiento del suero.
El suero equino proviene en la actualidad de un solo animal dedicado a este
unico objeto. En ocasiones se han probado
los sueros de otros caballos y tambien se
han demostrado satisfactorios en los cultivos. El suero equino se prepara en igual
forma que el suero humano y tampoco sufre filtraciones ni calentamiento. Para los
cultivos lo usamos al 40% en Hanks o
medio C40% y para las inoculaciones de
virus al 20% o medio C20%.
*
Las resinas forman parte de una unidad el
"Deeminizer" que eomo tal lo obtuvimos
de Crystalab, Alywin St. Hartford, Conn,
EE. XJU. junto con resinas de repuesto.
** El detergente que hemos usado es un compuesto que aparece en, el catalogo de A .
Thomas, 1950, Piladelfia, 5, Penna, EE.XJU.,
como "Cleaning Compound" y es un polvo
que se diluye mas o menos 100 gr. para
20 litros de agua.
4) Los virus usados.— Para los 3 tipos de virus-polio se han usado como cepas prototipo las siguientes: Brunilda para el tipo 1; Y-SK para el tipo' 2 y Leon
para el tipo 3. Todas tienen 8 o mas pasajes por cultivo de tejidos, los primeros
en diversos tipos de tejidos humanos normales y los ultimos en celulas Hela. Estas cepas de virus fueron traidas por el
autor, del Laboratorio de Medicina Preventiva de la Escuela de Medicina de la
Universidad de Yale, New Haven, Conn.,
EE.UU. Los virus cosechados en el medio
de cultivo se mantienen congelados a —20'.
Las diluciones de los virus se haoen en
Hanks, previa centrifugacion cuandoi es
necesario. Los titulos de los virus se expresan como valor recipr'oco del logaritmo por ml. de la ultima dilucion capaz
de infectar la mitad de los cultivos de
celulas usados (usando por lo menos 4 tubos por dilucion) y calculando el 50%; de
acuerdo con el conocido metodo de Reed
y Muench. En el momento de inocular los
cultivos se extrae el medio C40% usado
y se reernplaza por 1,8 ml. de medio C20%
fresco y luego se agregan 0,2 ml. del
inoculum.
Es nuestra experiencia que los virus-polio se multiplican en Hela CA produciendo
focos de alteration celular bien precisos
y delimitados. Esto se observa al haoer la
primera lectura de los cultivos inoculados
con pequenas cantidades de virus. Estos
focos de lesion los Uama.r'emos "placas"
por analogia a lo observado con bacteriofago y estan formados por unas 10 a 100
celulas alteradas, mas oscuras, mas pequenas y redondeadas que sus vecinas normales y se destacan claramente del resto
del cultivo normal. Nos imaginamos que
estas placas corresponden exactamente a
aquellas que se observan cuando se usa
la tecnica de agregar una mezcla de agaragar con medio nutritivo a los cultivos
una vez inoculados (7). Pa,ra emplear esta tecnica se usan tambien, cultivos con
una capa continua monocelular. Al agregar la mezcla de agar-agar sobre las celulas previamente infectadas1 una media
hora antes, el virus resultante de unai celula infectada queda inmovilizado y limitado a infectar solo las celulas vecinas.
Esto produce un foco de lesion que se ha-
ce visible a simple vista usando colorantes
vitales.
En nuestro caso, el movimiento del medio dentro de los tubos al hacer la primera observacion, que actua dispersando el
virus, no nos permite ver estas placas sino en la primera ocasion en que son observados, ya que en las lecturas siguientes se aprecia una generalizacion de las
lesiones a todo el cultivo.
milla bien dispersada en los 2 ml. del medio viejo (usado), con 30% de suero humano (hicimos recuento que dio 62.700
cel. por ml.), agregamos 12 ml. de medio
C40%, mezclamos bien y sembramos 14
tubos. En los dias siguientes se observo
alteracion y finalmente destruction de las
celulas.
En el segundo renglon del Cuadro 1 vetmos el primer cultivo en que tuvimos exito, cultivo CA 1 en marzo de 1954 y del
cual arranca la linea de subcultivos celulares que, hasta el presente, hemos estado usando y que llamamos Hela CA.
En esa ocasion partimos de un tubo de
cada uno de los cultivos 16 y 17 en suero
humano y que tenian 93 y 80 dias respectivamente. En este repique procedimos
tal como lo acabamos de referir para el
cultivo C 1. El buen resultado que obtuvimos en este caso se debe tal vez al hecho de que partimos de una semilla bastante rica, con 182.000 cel. por ml.
Resultados.
En el cuadro 1, presentamos en forma
muy resumida algunos datos generales' de
los cultivos con celulas Hela mantenidas
en suero equino o Hela CA. En el primer
renglon hemos colocado uno de los intentos de adaptacion, el cultivo C 1, en que
no tuvimos exito. Este cultivo lo hicimos
en un repique a partir de dos tubos del
subcultivo 19 por la tecnica de raspado
descrita. Una vez que tuvimos nuestra se-
C U A D R O
l
Datos generales sobre algunos cultivos de celulas mantenidas en suero equino.
Datos de la semilla usada
N? cultivo
Cultivo N»
c
CA
CA
CA
CA
CA
CA
CA
CA
CA
CA
CA
CA
CA
CA
CA
CA
( *)
(**)
1
1
2
3
4
5
23
24
25
58
59
60
114
115
116
139
140
Tecnlca
usada
Recuento **
F a eh a
11 - I I - 5 4
18 - I l l - 5 4
2 - IV - 54
24 - IV - 54
19 - V - 5 4
1 - V I - 54
30 - x n - 54
11 - i - 5 5
24 - i - 55
31 - V I I I - 5 5
2 - IX - 55
6 - rx - 5 5
5 - i n - 56
6 - H I - 56
12 - H I - 56
29 - v - 56
4 - V I - 56
16
CA
CA
CA
CA
CA
CA
CA
CA
CA
CA
CA
CA
CA
CA
CA
19
y 17
l
2
3
4
22
23
24
54
56
57
112
113
114
137
138
Edad cultivo*
Raspado
18
93 y 80
14
+
+
+
+
+
+
+
+
+
22
25
13
15
12
13
12
6
8
9
8
7
6
7
—
•
+
—
—
—
—
—
—
Tripslna
—
—
—
—
—
—
—
—
+
—
+ •
+
+
+
+
+
Celulas
Agregados
62.7
182.7
70.1
34.4
22.2
31.0
22.2
34.4
27.7
268.8
62.2
118.3
241.1
504.4
380.0
326.6
493.8
7.7
15.0
3.9
7.7
3.3
5.0
6.1
6.6
6.1
13.3
7.1
18.3
7.2
6.1
10.5
12.2
16.6
La edad del cultivo se expresa en dias.
Las cifras del recuento "van expresadas en miles de celulas y de agregados celulares.
Dilucion
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
7
10
2.5
5
10
5
7
7
6
6
3
3.3
3
3'
2
2'
5
En seguida vemos que en los subcultivos
CA 2, CA 3, CA 4 y CA 5, hechos a partir de CA 1, todos en presencia de suero
equino y en completa ausencia de suero
humano, los recuentos celulares son bajos, entre 22.000 y poco mas de 70.000
cel. por ml.; pero de todas maneras la
dilucion experimentada por las celulas
hasta este momento a partir de la semi11a original es para la siembra CA 5 del
orden de 1.200, por lo que de las 182.000
cel. originales solo debian quedar unas 140
por ml. y en realidad vemos que hay
31.000, por lo que no cabe duda de que
hasta el cultivo CA 5 ha habido multiplication celular, por lo menos por un factor de 200.
En el cuadro 1 presentamos luego 3
etapas posteriores de este mismo traba,io, a los 9 y a los 18 meses de iniciado
v al final los subcultivos mas recientes.
Hasta los cultivos CA 50 a CA 60 seguiamos usando la tecnica de la siembra
por raspado mecanico. Desde ese momento, hasta el presente, usamos la tecnica de
siembra con tripsina al 0.25% primero
y luego al 0.1% tal como se describio en
Materiales y Metodos. Tambien se aprecia
que ahora sembramos mayores cantidades de celulas, alrededor de 100.000 por
ml. y hemos logrado, gracias a esto, acortar la observation de cada cultivo de alrededor de 15 dias a solo 7. Para mantenes este numero de celulas la dilucion de
la semilla con medio fresco en el momento
de hacer la siembra no puede ser mayor de
1:3 a 1:4, ya que este parece ser el numero de multiplicaciones de estas celulas
en una semana. Debemos hacer1 notar que
las celulas en suero humano en igualdad
de condiciones se multiplican unas 2 a 3
veces mas rapido.
En la linea CA y en la linea clasica de
celulas Hela se uso durante algurios meses extracto embrionario al 2%, preparado con embriones completos (menos los
oios) de 9 dias y de acuerdo con la tecnica de Younger (8). Despues de mantener durante varios meses cultivos paralelos con y sin extracto, nos desistimos
de su uso por encontrar que no habia
ventaja alguna en usarlo.
Tiempo despues de obtenida la linea
CA, logramos mantener otras dos lineas
en suero equino y las llamamos CL y CO.
El aspecto de los cultivos y de las celulas
de CO es muy similar al de CA, que describiremos en seguida, en cambio el aspecto de CL es algo distinto y su description como las comparaciones entre estas
3 lineas las dejaremos pendientes por el
momento. Hacemos notar que todo lo que
sigue se refiere exclusivamente a la linea CA.
Si observamos las fotografias 1 a 4,
podemos apreciar que la mantencion en
suero equino imprime a las celulas Hela
algunos cambios morfologicos. Desde luego el cultivo se hace mas apretado, estrictamente pavimentoso, las celulas crecen formando primero islotes, luego cintas y por ultimo verdaderas sabanas continuas, principalmente monocelulares, fotografias 3 y 4. Esto mismo ocurre en
mucho menor grado con las celulas en
suero humano, fotografias 1 y 2. En los
cultivos pavimentosos de la linea CA es
casi siempre posible apreciar una zona mas
oscura hacia el centro del cultivo y los
bordes son mas claros, tanto que a veces
resulta dificil verlos. Las celulas CA aparecen como algo mayores y de una forma
mas poligonal que las cultivadas en suero
humano, parece que las prolongaciones citoplasmaticas son menos frecuentes y mas
cortas que las que presentan las de suero
humano. Notar diferencia entre fotografias 1 y 3. El citoplasma de las celulas
CA es un poco mas oscuro, en el nucleo,
en cambio, no apreciamos diferencia;
siempre vemos nucleos claros que tienen
uno o mas nucleolos, siendo lo mas frecuente que sea unico. Los casos de nucleo multiple son tan frecuentes en unas
como en las otras.
Una vez lograda la mantencion de las
celulas Hela en suero de caballo era necesario averiguar cual seria su comportamiento frente a los virus-polio. Para esto
se hicieron varias titulaciones de virulencia de las cepas prototipo 1, 2 y 3 de virus-polio en diversas condiciones. Experimentos representatives de esto vemos en
el Cuadro 2. En los dos primeros experiments quisimos demostrar que en presencia de 2 sueros humanos de adultos
elegidos al azar es casi imposible trabajar con estos virus y asi vemos que cuan-
A-
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S. Ji.r
FOTOGRAFIA N<? 1
FOTOGRAFIA N? 2
Celulas Hela en suero humano que llevan pocos dias de cultivo. Se aprecia su forma de
poligonos casi fusiformes, con largas prolongaciones citoplasmaticas, su nucleo ovalado
con un nucleolo generalmente unico. Tincion.
hematcxilina-eosina. Tomada con objetivc
Leitz Pv 10 y ocular 10 x. (Aumento
aproximado 100 x).
A1 correr de los dias, el cultivo en suero humano se hace mas compacto, pero siempre
dejando ciertos espacios libres. En alguno que
otro sitio se aprecian celulas con extensas
prolongaciones citoplasmaticas. Igual tincion.
Tornado con objetivo Leitz Pv 10 y ocular 10 x.
(Aumento aproximado 100 x ) .
i.ytJSI':
FOTOGRAFIA N'-' 3
FOTOGRAFIA N<? 4
En este cultivo de celulas Hela en suero equino se aprecia que su disposicion es mas compacta, por lo tanto las celulas tienen la forma
de poligonos mas regulares y casi no presenta
prolongaciones citoplasmaticas. Igual tincion.
Tornado con objetivo Leitz Pv 10 y ocular 10 x.
Aumento aproximado 100 x.
Celulas Hela en suero equino tomada con mayor aumento permite ver nucleos, nucleolos y
una mitosis. Igual tincion. Tornado con objetivo Leitz Pv Apo 40: 1 y ocular 10 x.
Aumento aproximado 400 x.
do las diluciones de virus-polio se ponen
en contacto con celulas que estan en un
medio con 15% de este suero, el virus no
se puede re velar o, por lo menos su actividad disminuye unas 100 veces con respecto a la demostrada en los cultivos de
la sublinea en suero equino.
Es natural que una mejor comparacion
se tiene cuando las celulas que han estado
multiplicandose en suero humano se ponen
en contacto con un medio libre de este
suero en el momento de la inoculacion.
Esto es lo que se sugiere en el trabajo
original con celulas Hela (2), y lo que
nosotros estuvimos haciendo mientras no
disponiamos de la linea CA. Esto aparece en los experimentos 3 y 4 del cuadro
2; al cultivo con suero humano se cambia
este medio por otro con 20% de suero
equino el dia previo a la inoculacion. Al
dia siguiente, los cultivos que han tolerado
bien este cambio de suero humano a equino (en. ocasiones teniamos un", importante perdida de cultivos por esta razon), sufren un nuevo cambio con C20% fresco
en el momento de inocularlos. Con estos
dos cambios la cantidad de suero humano originalmente presente se diluye unas
1.000 veces, con lo que se consigue eliminar practicamente los anticuerpos de
este suero. En estas condiciones, y segun
podemos apreciar en el Cuadro 2, los titulos de viruspolio son mas de 10 veces
mayores en las Hela CA. Estas titulaciones han sido hechas simultaneamente,
usando las mismas diluciones de virus para los do3 tipos de cultivo y procurando
que estos no presentaran otra diferencia
que aquella justamente a probar.
C U A D R O
2
Comparacion de la sensibilidad a los virus-polio de las tineas clasica y CA de celulas Hela.
N1? experiment
Tipo de
cultivo
Medio usado para
la multiplicacion
de! cultivo
j
|
[
Tftulos
Medio usado
para la
inoculacion
i
H-la clasica
1
2
40%
SE
Hola clasica
30%
SH
40%
S E
(1)
(3)
15%
SH
20%
SE
15%
SH
20%
S E
(2)
(4)
4.7 ( 5 )
6.2
4.4
20%
SE
6.2
Hela C A
40%
S E
20%
S E
7 . 7
Hela C A
40%
SH
SE
20%
20%
SE
S E
5.9
6.9
2
<
1
1
1
I
1
j
1
SH
los
i
[
|
30%
30%
i
|
6.4
Hela clasica
Hela clasica
4
SH
Hela C A .
Hela C A
3
30%
de
j
1
1
|
1
|
<
virus
i
1
3
2.7
< 1.7
5.2
4.7
2.7
< 2.7
5.2
4.2
5.2
< 5.2
6.7
6.4
3.6
42
6.1
6.1
1
(1)
(2)
(3)
(4)
(5)
30% S H - Suero Humano 30%, Hanks 70%
15% S H = Suero Humano 15%, Hanks 85%
40% S E - Suero Equino 40%, Hanks 60%
20% S E = Suero Equino 20%, Hanks 80%
Los titulos de los virus se expresan por el valor reciproco del logaritmo de la
dilucion que provoca la destruccion celular en la mitad de los cultivos inoculados.
En los 4 experimentos citados es llamativa la diferencia enttfe los titulos del virus-polio tipo 1 y de los tipos 2 y 3 en Hela clasica. Esta misma diferencia tiende
a favorecer el tipo 1 en Hela CA como se
aprecia en el Cuadro 2, por un margen que
creemos carece de importancia.
Debemos hacer notar que hay otras 2
impc.i'tantes diferencias a favor de Hela
CA. 1) En estos cultivos en los cuales las
celulas tienen una gran tendencia a multiplicarse formando apretado epitelio pavimentoso dispuesto como una cinta o faja en la parte mas en declive del tubo, las
placas iniciales de destruccion celular son
mucho mas faciles de observar que en los
cultivos mas dispersos de Hela clasica. Esta diferencia adquiere su ver'dadero valor
cuando se trabaja con pequenas cantidades de virus. Por ejemplo, en el experimento 3 reproducido en el Cuadro 2, ya
a las 24 horas pudimos contar placas en
las diluciones 5 y 6 para Brunilda y 45 para Y-SK y Leon. Tales placas no pudimos verlas en los cultivos de Hela clasica.
2) Las lesiones aparecen y se desarTollan
con mayor rapidez en Hela CA. Por ejemplo, en el experimento 4, las1 lesiones en
Leon en la dilucion 4.5 y 5.5 ya habian
aparecido casi todas a las 48 horas; en
tanto que en Hela clasica en las diluciones
con 100 y 1.000 veces mas virus las lesiones no aparecieron hasta el 5- y T- dias.
Usando estas celulas Hela se hicieron
varias titulaciones de uno o mas viruspolio en cultivos que recibian diversas concentraciones, entre 10 y 40% de suero
cquino en el medio al momento de inocuC
U
A
D
lar. Estas titulaciones dieron valores muy
similares entre si, por lo que no creemos
que se justifique una presentacion mas
detallada.
Un punto que investigamos con atencion
fue aquel de si hay o no necesidad de calentar previamente el suero del caballo que
estamos usando para los cultivos y las inoculaciones de virus. El resultado de una
experiencia tipica a este r'especto aparece
expuesto en el Cuadro 3, donde vemos el
efecto de calentar el suero a 609 por 20
minutos sobre los titulos del virus Y-SK.
Partimos con dos lotes. iguales de mas de
30 tubos cada uno de cultivos Hela CA.
En el momento de hacer el primer cambio
despues de sembrados, uno recibio suero
fresco y el otro suero calentado, incorporados en el medio C40% habitual. Esto
se repitio por 3 cambios de medio consecutivos. Luego en el momento de inocular las
diluciones de virus cada lote se dividio
cn mitades, una recibio suero fresco
y la otra tsuero calentado en el medio
C20% que se usa para las inoculaciones.
Asi se formaron los cuatro grupos
cuyos titulos vemos en el Cuadro 3,' y
que son muy semejantes entre si; el unico
que difiere por un logaritmo es aquel cuyas celulas se multiplicaron en suero fresco y que recibio suero calentado al inocular. Este fenomeno parece coincidir con
la noto.r'ia alteracion que sufrieron las celulas con este cambio. Hecha esta salvedad, nos parece que esta experiencia tiende a demostrar que hay sueros equinos en
los cuales el calentamiento previo no parece necesario para el trabajo con viruspolio.
R
O
3
Efecto del calentamiento del suero equino sobre los titulos del virus Y - S K
Medio usado para
multiplicar el cultivo
Medio usado para
la inoculacion
Tttulo
del virus
Suero fresco
Suero fresco
6.1
Suero fresco
Suero calentado
5.3
Suero calentado
Suero fresco
6.2
Suero calentado
6.2
. Suero calentado
Discusion.
Los resultados de este trabajo demuestran que es posible mantener en serie cultivos de celulas Hela en suero equino. Durante los 2 anos y fraccion transcurridos
se han producido centenares de generaciones de celulas en un medio de cultivo
en el cual este suero ha sido su unica
base de material nutritivo.
Es indudable que esta es una buena solueion para poder utilizar tejidos humanos en estudios de virus, trabajos para los
cuales pueden ocasionar dificultades los
eventuales anticuerpos presentes en sueros humanos. Como deciamos en la introduction, para lograr este mismo objetivo
se han propuesto medios parcialmente sinteticos (2 y 3), ya que siempre lie van
una cier'ta proportion de sueros animales
que se usan, ya sea en el momento de la
inoculation con virus (2) o para mantener en serie los cultivos celulares ( 3 ) .
La presencia, justamente, de cualquier
cantidad de isuero, nos parece que invalida la intention de usar solo materiales
quimicos conocidos, amino acidos, vitaminas etc. como unico arbitrio para prescindir del suero humano. Las celulas He
la CA, en cambio, luego de sus muchas
generaciones en un medio tan simple,
con solo 4Q% de suero de caballo y el
resto de Hanks, son totalmente aptas para aquellos usos en que es recomendable
prescindir de los sueros humanos.
A este respecto queremos destacar que
en un trabajo reciente ( 9 ) se describe
la multiplication de celulas de rinon de
mono, seguida de una activa multiplicacion de viruspolio en un medio nutritivo
comDuesto solo por los ingredientes del
Hanks mas dos amino acidos (1-cisteina e
isoleucina), una azucar (d-ribosa) e in
dicios de sales metalicas. Pensamos que
con est© medio nutritivo se lleva a una
simplicidad necesaria para una multitud
de aplicaciones de los cultivos de tejidos
que hasta el momento parecian muy dificiles.
De la forma descrita de como hemos
obtenido el paso de las celulas de un suero
al otro, podemos concluir que se trata de
un hecho facil de realizar. Esta es en efecto nuestra idea y en realidad no creemos
que haya nada sorprendente en conseguir
que estas celulas humanas ptisdan obtener su material nutritivo de suero equino
en lugar de suero humano, o para el caso,
de otros sueros animales, conejo, cuy, etc.
Fue este convencimiento lo que ha motivado esta presentation un tanto tardia sobre el exito conseguido en mantener celulas Hela en suero de caballo. La relativa facilidad en mantener estas celulas
en este suero aparece corroborada por el
hecho de que de 5 veces que lo intentamos, en 3 tuvimos exito.
Sobre nuestra experiencia negativa con
el extracto embrionario es poco lo que
podemos agregar. En todo caso nos parecio que usando el extracto en la forma y cantidad recomendada originalmente ( 2 ) , no habia beneficio alguno para los
cultivos, tanto los de suero humano, como para Hela CA de crecimiento mas lento. En vista de lo anterior y teniendo pre3ente que es isin duda ventajosa la mayor
simplicidad que se pueda alcanzar en los
;ultivos, con el men or' numero posible de
'adores variables, nos decidimos a dejar
de lado el uso del extracto embrionario.
De las diferencias entre la linea CA y
'a clasica, msrace especial atencion la
nultiplicacion mas lenta de la primera.
Domo deciamos, las celulais en suero hunano en igualdad de condiciones ce muliplican 2 a 3 veces mas rapido. La ex)licacion de esto podria ser que, aun cuanlo podemos presumir que las celulas Hela
)oseen un equipo enzimatico versatil, ca>az do aprovechar materiales metabolicos
lisimiles, lo que explicaria su multiplication en este suero; habria que considerar,
oor otro lado, que el equipo metabolico de
as celulas enfrentado a un material hete'ologo resulta deficiente. Podria ssr el caso de que uno o varios enzimos que solo
son necesarios en pequena cantidad para
metabolizar suero equino y por ende se
transformaran en el factor limiiante de
toda una cadena de acciones enzimaticas
que en otras condiciones podria funcionar a mayor velocidad.
Otra de las dif erencias que merece atenta consideracion es la menor sensibilidad
de la linea clasica a los virus-polio. Los
dos cambios con medio C2Q% antes de
inocular rebajan la concentration de suero humano a menos de 1:1000, dilucion
que esta unas 10 a 30 veces por encima
del nivel habitual de extincion de los anticuerpos polio en los sueros humanos.
Creemos que esta menor sensibilidad se
podria deber a restos de suero humano
adsorbidos a las celulas que no han podido ser eliminados con los cambios de medio senaladoss.
Llama la atencion que la mayor sensibilidad de la linea CA es mucho mas acetituada por los virus 2 y 3 y solo discreta
para el virus 1. Los titulos considerablemente mas altos que presenta el virus tipo 1 en suero humano (ver Cuadro 2)
se pueden explicar por el hecho observado
de que en general los sueros humanos contienen menor cantidad de anticuerpos para este tipo de virus. Es decir, que si
los sueros humanos tienen un nivel mas
alto de anticuerpos para virus 2 y 3, restos de estas anticuerpos adsorbidos a las
celulas podrian haber neutralizado parcialmente los virus y por lo tanto explicar los bajos titulos observados. La explication de los titulos algo mayores que
presenta el virus 1 en Hela CA, nos parece,
reside en una caracteristica propia de esta
cepa; es un hecho de observation general que distintas cepas presentan distinta
actividad, que a su vez se manifiesta por
distintos titulos de virulencia.
Queremos destacar otras diferencias a
favor de Hela CA. Una de ellas es que
usando una fuente de suero abundante y
uniforme podemo® obtener gran cantidad
de cultivos de una calidad y condiciones
constantes. El hecho de no> usar suero humano nos pone a cubierto de eventuales
contaminaciones por otros virus: hepatitis, por ejemplo. Y por ultimo el hecho
muy afortunado de que en las condiciones
aqui descritas los cultivos de Hela CA
tienen una gran tendencia a disponerse como una cinta larga, delgada y continua en
la parte mas baja del tubo, lo que facilita
enormemente la observation de las placas de lesion celular producidas por la
multiplication de los virus-polio y otros
afines.
Resumen.
1) Se ha conseguido mantener 3 lineas
de celulas Hela en suero equino. La primera de ellas, linea C A lleva mas de 2
anos multiplicandose en presencia de este suero. Las otras 2 lineas han estado
un tiempo cercano a los 2 anos tambien
en suero de caballo. El medio nutritivo
para estas celulas esta compuesto por
40,% de suero equino y 60% de Hanks.
2) La multiplication de las celulas Hela
de la linea CA esi 2 a 3 veces mas lenta
que la de las celulas Hela en suero humano.
3) Las celulas y los cultivos de la linea CA presentan diferencias morfologicas
con los cultivos y las celulas en suero humano.
4) La linea CA es mas sensible a los
3 tipos de virus-polio que la linea en suero
humano.
RESUME
1.— On a reussi & maintenir 3 lignees de cellules Hela dans du serum de cheval. La premiere de ces lignees —la CA— continue & se
multiplier dans ce serum depuis plus de deux
ans. Les deux autres ont ete maintenues a.ussi
pr£s de deux ans dans du serum de cheval.
Le milieu nutritif pour ces cellules se compose
de 40%', de serum de cheval et 60% de Hanks.
2) La multiplication des cellules Hela de la
lig-nee CA est de 2 & 3 fois plus lente que celle
des cellules Hela dans du serum humain.
3) Les cellules et les cultures de la lignee
CA montrent des differences morphologiques avec
les cultures et les cellules maintenues dans du
serum humain.
4) La lignee CA est plus sensible aux 3
types de virus polio que les cellules Hela maintenues dans de serum humain.
SUMMARY
1) The author has succeeded in maintaining
3 lines of Hela cells in horse serum. The first
one of these, the line CA, has continued to grow
in this kind of serum for more than 2 years.
The other 2 lines have also been multiplying in
horse serum for nearly 2 years. The nutrient medium for these cells is a mixture of 40% of
horse serum and 60% of Hanks,
2) The multiplication of Hela cells of the line
CA is from 2 to 3 times slower that of Hela
cells in human serum.
3) The cells and cultures of line CA show mor-
phologic differences with the cultures and celle
grown in human serum.
4) The linei CA is more sensitive to the 3
types of poliomyelitis virus than the line grown
in human serum.
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