MÉTODOS Y TÉCNICAS AVANZADOS EN BIOLOGÍA

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MÉTODOS Y TÉCNICAS AVANZADOS EN BIOLOGÍA
MÓDULO : LABORATORIO AVANZADO DE FISIOLOGÍA VEGETAL
UNIDAD PRÁCTICA I :
PRODUCCIÓN PRIMARIA EN ECOSISTEMAS ACUÁTICOS
Profesores:
Elvira Perona (despacho B-002)
Antonio Quesada (despacho B-010a)
Introducción
La medida de la PRODUCCIÓN PRIMARIA de un sistema se realiza habitualmente
porque es un muy buen indicador de las potencialidades tróficas del ecosistema, esto es,
la capacidad de producir biomasa en un ecosistema o dicho de otra manera la
capacidad de incorporar materia orgánica (fundamentalmente carbono) al ecosistema.
Esta actividad es realizada fundamentalmente por los organismos fotosintéticos o
productores primarios, que en el caso de ecosistemas acuáticos son las algas y consiste
en la conversión de la energía luminosa en energía química que es almacenada en forma
de compuestos orgánicos, mayoritariamente compuestos de carbono.
En esta práctica realizaremos la determinación de la producción primaria de un
ecosistema acuático, en este caso de embalses, producida por el fitoplancton. El objetivo
fundamental de esta determinación es medir el valor de la síntesis de C orgánico en el
ecosistema, ya que constituye la entrada más importante de materia y energía útil para el
conjunto del ecosistema.
La forma más sencilla de medir la producción primaria en un momento determinado es
medir la fotosíntesis, ya sea medida como desprendimiento de oxígeno o como
incorporación de carbono en unas condiciones determinadas. Sin embargo, esta medida
aislada sólo es un análisis puntual y por tanto no nos permite inferir como varía la
producción primaria a lo largo del día (dado que la luz disponible varía a lo largo de
éste) ni a lo largo del año. Para poder conocer esta variación, necesitamos conocer
previamente las características fotosintéticas de un organismo o de una comunidad.
Para ello, analizamos la actividad fotosintética variando la intensidad luminosa que
alcanza a las células, en lo que se denominan curvas de fotosíntesis frente a
irradiancia (comúnmente denominadas curvas PvsI, de sus siglas en inglés) por lo que
podremos calcular la producción primaria en función de la intensidad luminosa.
Con este tipo de curvas podemos conocer las características fotosintéticas de la
comunidad: por ejemplo, saber cuanta luz necesita la comunidad fitoplanctónica para
que la fotosíntesis se sature o podemos saber cómo de eficaces son los fotosistemas en
el proceso. Además, con este tipo de aproximaciones podemos inferir cómo es la
producción primaria en la columna de agua (en la que la intensidad de luz disminuye
con la profundidad), o incluso podríamos estimar la entrada de C a lo largo del año. Por
todo esto las curvas PvI se muestran como una herramienta muy útil en ecología
acuática.
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Las características fundamentales que vamos a estudiar son:
- Ps, que es el valor máximo de fotosíntesis, y
- α , que es la pendiente de la parte lineal de la curva de respuesta a la luz, lo que nos
indica la afinidad de los fotosistemas de la comunidad por la luz. (Ver el ejemplo real de
abajo). Hay otras variables que también podemos obtener de estas curvas y que tienen
otras connotaciones, y que obviaremos en esta práctica.
Curva PvI en un cultivo de Chlorella sp.
2,5
mg C asimilado (mg cl)-1 h-1
α
2,0
Ps
1,5
datos experimentales
ajuste del modelo
1,0
-1 -1
0,5
-2
α= 0.065 mg C (mg cl) h /µE cm s
-1
Ps= 1.868 mg C (mg cl)-1 h-1
0,0
0
100
200
300
400
1600
Irradiancia (µE cm-2s-1)
Estos parámetros van a permitir comparar la potencialidad ecológica de las
comunidades, así como su estado fisiológico, ya que los valores obtenidos van a
depender, por un lado de los grupos algales dominantes (que dependerán normalmente
del estado trófico de la masa de agua), y por otro lado de la situación fisiológica del
grupo dominante de la comunidad algal.
Objetivo
El objetivo de esta práctica es comparar las características fotosintéticas y la producción
primaria en dos ecosistemas acuáticos de distintas características, realizando curvas
PvsI.
Esta práctica se desarrollará en dos embalses con distinto estado trófico, el estado
trófico en una masa de agua está relacionado con procesos de contaminación, así un
embalse eutrófico tiene una gran cantidad de biomasa debida a la contaminación por
fertilizantes, de origen agrícola, industrial o urbano; sin embargo un embalse
oligotrófico tiene poca biomasa porque apenas presenta contaminación. Trabajaremos
en un embalse oligotrófico o mesotrófico, dada la dificultad de encontrar uno con
características oligotróficas en la CAM, y uno eutrófico. En cada uno de los embalses,
tomaremos una muestra de agua de orilla y realizaremos un estudio de las características
fotosintéticas de cada una de las comunidades del fitoplancton realizando una curva
PvsI..
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Metodología
En esta práctica vamos a utilizar como medida de la fotosíntesis la incorporación de C
inorgánico. Para este tipo de medidas normalmente se utiliza un tipo de C marcado
isotópicamente de manera que podamos saber cuanto de ese C marcado se ha
incorporado en una unidad de tiempo. Anteriormente el isótopo más utilizado era el 14C,
que es un isótopo radiactivo del C y que requería un cuidado y protección para la
radiación especialmente delicadas. En la actualidad, se puede usar otro isótopo pesado
del C, el 13C, que aún siendo un isótopo pesado no sufre descomposición radiactiva y
por lo tanto no requiere ningún cuidado especial en su manejo, lo que le hace muy
apropiado para esta práctica. El problema que presenta la utilización del 13C es que la
medida de lo que se ha incorporado requiere una instrumentación muy sofisticada, un
espectrómetro de masas, que precisa unos altos conocimientos técnicos. Nuestras
muestras se enviarán al Servicio Interdepartamental de Investigación (SIDI) de la UAM,
que las analizará.
En la práctica utilizaremos Na H13CO3 como sustrato para la asimilación fotosintética, y
lo añadiremos en nivel trazador, esto es, en concentraciones dentro del rango de las que
existen de forma natural en el ambiente que se va a analizar, para evitar artefactos
fisiológicos (cambios en las actividades biológicas debidos a las condiciones
experimentales). El Na H13CO3 será incorporado por los organismos fotosintéticos y
asimilado en sus propias moléculas, en forma de compuestos orgánicos. De esta manera,
conociendo el C inorgánico marcado que se ha añadido y el C inorgánico presente en el
medio, y sabiendo el C que se ha acumulado en las células en un tiempo determinado,
podemos saber la actividad fotosintética de estos organismos.
Posteriormente podremos calcular el C incorporado con las siguientes fórmulas:
% 13C - % AN
Vc (h ) = -----------------------------------------------------------------T
( (-------------- x 100 ) - % AN ) x tiempo (h)
(T+DIC)
-1
Rho C (µg C/l . h) = Vc x POC
Vc= tasa de aumento de isótopo
Rho C= tasa de incorporación de C por la comunidad
AN= Abundancia natural de C
T= [trazador ] (mg l-1)
DIC= [Carbono Inorgánico Disuelto] (mg l-1)
POC= Carbono orgánico particulado (µg l-1 )
Como queremos estudiar la variación de la actividad fotosintética en función de la
intensidad de luz, utilizamos filtros neutros (reducen la intensidad de la luz sin alterar
las características de ésta) para modificar la intensidad lumínica recibida. Dependiendo
del número de capas de filtros neutros que usemos, tendremos una atenuación u otra de
la intensidad luminosa, que las denominaremos como el % de transmisión, que es el %
de la luz que incide y que atraviesa los filtros.
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En esta práctica vamos a utilizar los siguientes números de capas de filtro neutros: 0, 1,
2, 3, 4, 6, 8, 10 y opaco (con papel aluminio), que nos dan los siguientes % de
transmisión: 100 (toda la luz que incide sobre la muestra le llega a las células), 50.5,
22.5, 12.7, 6.1, 1.7, 0.2, 0.1 y 0 %.
Nº
Filtros
%
Trans.
0
1
2
3
4
6
8
10
opaco
100
50.5
22.5
12.7
6.1
1.7
0.2
0.1
0
Desarrollo de la práctica
Para realizar esta práctica es necesario llevar a cabo:
- la determinación de la asimilación fotosintética del DIC (Carbono Inorgánico
Disuelto)
- la estimación de la biomasa algal (como clorofila y el carbono particulado).
- con los datos anteriores construiremos la curva Pvs I
- mediremos las características químicas del agua
- la composición fitoplanctónica de los ecosistemas analizados.
1) Curvas PvI. Las curvas PvI las realizaremos de la siguiente manera: en primer lugar
tomaremos la muestra de agua del embalse e incubaremos in situ, con Na H13CO3 a
diferentes intensidades luminosas durante 2 horas. Tras la incubación se parará la
actividad fotosintética y se filtrarán las muestras para separar las células del Na H13CO3
no asimilado. Posteriormente eliminaremos los restos que puedan quedar de Na H13CO3
mediante acidificación y se enviarán las muestras al SIDI para su análisis.
2) Determinación de las características químicas del agua
3) Estimación de la Biomasa por medio de la clorofila. Mediremos la abundancia de
organismos fitoplanctónicos por la extracción y la cuantificación de la clorofila.
4) Estimación de la Biomasa por medio del análisis del POC. Mediremos la
abundancia de organismos planctónicos mediante el análisis del C particulado presente
en las masas de agua
5) Determinación de la abundancia natural de 13C. Determinaremos la abundancia
natural de este isótopo pesado enviando una muestra filtrada al SIDI.
6) Identificación de los organismos fitoplanctónicos por microscopía.
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Procedimiento
En el campo
1- Tomamos una muestra de agua 4-5 litros y la distribuimos en 9 botellas planas (250
ml por botella) por cada curva PvI
2- Conservamos el agua sobrante, en 2 botes de 1 litro, para realizar una serie de
determinaciones químicas necesarias, y para determinar la concentración de clorofila y
la de C orgánico particulado que existe en la masa de agua
3- una vez que tenemos las 9 botellas llenas, los filtros neutros y el papel de aluminio
preparados añadimos el volumen que se indicará (1 ml) del trazador de Na H13CO3
4- cerramos las botellas las introducimos en las bolsas de los filtros neutros y las
dejamos incubar en la orilla (dentro del agua) durante al menos 2 horas.
5- durante toda la incubación anotaremos cada 10 minutos la intensidad de luz incidente
y la temperatura del agua en la zona de la incubación
6- Pasado el tiempo de incubación detendremos la actividad fotosintética introduciendo
las botellas en bolsas negras, que no permiten el paso de la luz, y con hielo.
7- durante la incubación realizaremos la determinación de P soluble y las diferentes
formas de N existentes en el agua, para comparar los nutrientes disponibles y el estado
trófico de la masa de agua.
8- determinaremos, asimismo, la concentración de C inorgánico disuelto en el agua por
una valoración sobre 500 ml de agua.
Primera sesión de laboratorio
a) Preparación de las muestras de fotosíntesis
- por medio de filtración sobre filtros GFF, rápidamente y en semi-oscuridad, retiramos
del agua de incubación las células. De esta manera, éstas quedarán retenidas en los
filtros (1 por botella de incubación). Ponemos los filtros hacia arriba en un papel
absorbente para secarlos
- acidificamos los filtros con gas de HCl, para eliminar todo el Na H13CO3 que no haya
sido incorporado pero que se haya adsorbido a las estructuras externas de las células.
Para ello, simplemente disponemos los filtros en posiciones conocidas dentro de un
recipiente en el que ponemos un vaso con HCl al 10%.
b) Preparación de la muestra para la medida de clorofila a
- para determinar la concentración de clorofila filtramos un volumen conocido (entre
100 y 250 ml) del agua del embalse en 1 filtro GFF (lo hacemos por duplicado)
- extraeremos la clorofila de la comunidad algal, introduciendo estos filtros en 5 ml de
acetona al 90%, tapando y agitando el tubo y dejándolo el fin de semana a –20ºC
c) Preparación de la muestra para la medida de POC y AN
- para determinar la concentración de carbono orgánico particulado (POC) y
Abundancia Natural de 13C (AN) filtramos un volumen conocido de agua del embalse
en 2 filtros GFF, uno para cada determinación.
d) fijación de las muestras de fitoplancton para su posterior observación
- 40 y 15 ml de la muestra se introducen en tubos en forma de cono (Falcon) que los
fijaremos por dos procedimientos distintos: lugol y formol (aproximadamente 1 ml)
e) dejaremos el resto del material recogido encima de las encimeras sin fijar para su
posterior observación microscópica.
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Segunda sesión de laboratorio
a) Preparación de las muestras de fotosíntesis
- una vez acidificadas las muestras durante el fin de semana se sacan del recipiente, se
mantienen al aire 1 hora
- guardamos los filtros en bolsitas de papel de aluminio previamente etiquetados y se
envían al espectrómetro de masas.
b) Determinación de clorofila a de la comunidad fitoplanctónica
- se extrae el tubo de ensayo con el filtro y la acetona del congelador
- se agita con agitatubos durante 1 minuto
- se centrifuga para eliminar las partículas y se separa el sobrenadante
- en espectrofotómetro se determina la absorbancia del sobrenadante a 665 y 750 nm
frente a un blanco de acetona
- los valores de absorbancia se incluyen en la siguiente fórmula para obtener los valores
de concentración:
[clorofila a en el extracto] (µg ml-1) = 13.14 (ABS665-ABS750)
(conc. extracto x vol. extracto x 1000)
[Clorofila columna de agua] (µg l ) =---------------------------------------------------vol. filtrado (ml)
-1
c) determinación de AN y POC
- ambos filtros se llevan al SIDI para su determinación por espectrometría de masas y
por análisis elemental
d) Observación de las muestras de fitoplancton fijadas
- los tubos se desplazan con mucho cuidado intentado evitar su movimiento
- El lugol habrá hecho que la mayor parte del fitoplancton pese más y se haya
depositado en el fondo del tubo, así que se retira con pipeta pasteur de plástico la mayor
parte del sobrenadante, dejando únicamente la parte cónica del tubo con líquido
- se toma la muestra del fondo y se mira al microscopio, se dibujan e identifican los
grupos principales de organismos que aparecen en el fitoplancton
- Se procede de la misma manera con el tubo con formol.
Tercera sesión en aula de informática (análisis de los resultados)
- Una vez las muestras estén analizadas del SIDI nos enviarán las proporciones de 13C
que tenían las muestras mandadas a analizar. El análisis de isótopos estables no nos da
concentraciones, si no proporciones relativas de estos isótopos, por lo que necesitamos
convertir estos valores en una tasa de incorporación, mediante la siguiente formulación:
% 13C - % AN
Vc (h ) = ------------------------------------------------------------T
( --------------------- X100) - %AN x tiempo (h)
(T+DIC)
-1
Rho C (µg C/l . h) = Vc x POC
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Vc= tasa de aumento de isótopo
Rho C= tasa de incorporación de C por la comunidad
AN= Abundancia natural
T= trazador (mg l-1)
DIC= Carbono Inorgánico Disuelto (mg l-1)
POC= Carbono orgánico particulado (µg l-1 )
Si dividimos el valor de Rho C por la concentración de clorofila podemos estimar la
producción primaria por unidad de clorofila, que es una medida habitual para poder
comparar la producción primaria de los organismos en diferentes sistemas
relacionándolo con la cantidad de biomasa (expresada como concentración de clorofila)
- También representaremos los valores de fotosíntesis para cada una de las intensidades
luminosas utilizadas y obtendremos seguramente una hipérbola cuadrática que podemos
modelizar, por medio de una hoja de Excel, a la siguiente función para obtener los
parámetros fotosintéticos de cada una de las comunidades:
Pr=Ps x (1 - exp(-α*I/Ps))
Así obtendremos los valores de Ps y α que son los parámetros que buscábamos y así
podremos comparar las características fotosintéticas de ambos cuerpos de agua.
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Instrucciones para el cálculo de los parámetros fotosintéticos
1.- calcular la cantidad de fotones recibidos durante el periodo de incubación (mol
fotones m-2 en 2 horas) :
- hacer la media de la irradiancia instantánea (µmol fotones m-2s-1 = µE m-2s-1)
entre la medida inicial y final de cada periodo de medida
- multiplicar por los segundos de dicho periodo de medida
- sumar todos los fotones por metro cuadrado obtenidos durante todo el periodo
de incubación
- transformar los datos a moles fotones m-2
2.- Calcular los fotones recibidos por cada una de las botellas de incubación en función
del % de transmisión (ver tabla en el guión)
3.- Transformar los valores de la tabla (que están en unidades de δ, y se refieren a la
proporción de 13C sobre 12C que hay en la muestra) en valores de mg C asimilado por
cada mg de clorofila y por cada hora de la siguiente manera:
3.1- convertir los valores de δ en % de 13C sobre 12C, usando:
% 13C = 1.11122 +(0.0010985 * δ) (obtenido de forma empírica)
3.2 - Calcular el Carbono inorgánico disuelto (DIC) de embalse en mg C l-1 :
dividir por 5 los dígitos obtenidos en la bureta digital y multiplicar por 0.12 el
valor obtenido
3.3 - el trazador añadido fue 0.6 mg C l-1 en el Atazar y 0.9 mg C l-1 en
Santillana.
3.4- calcular Vc (según esta fórmula, la del guión es errónea).
% 13C - % AN
Vc (h ) = ------------------------------------------------------------------T
(( -------------- x 100) - % AN ) x tiempo en horas
T+DIC
-1
3.5- calcular RhoC
Rho C (µg C/l . h) = Vc x POC
Vc= tasa de aumento de isótopo (h-1)
Rho C= tasa de incorporación de C por la comunidad (µg C l-1 h-1)
AN= Abundancia natural (% 13C)
T= [trazador] (mg C l-1)
DIC= [Carbono Inorgánico Disuelto] (mg C l-1)
POC= Carbono orgánico particulado (µg l-1 )
3.6- Calcular la fotosíntesis específica
Fs (mg C asimilado (mg C l –1 h –1 ) = Rho C / [cl]
4.- Representar los valores obtenidos de fotosíntesis específica frente a moles de fotones
por metro cuadrado en el periodo de incubación, generando la curva P versus I.
5.- Estimar con la curva anterior los siguientes parámetros fotosintéticos:
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- la fotosíntesis máxima (PS) anotando la Fs máxima medida,
- α (afinidad de los fotosistemas) calculando la pendiente de la recta en la parte
ascendente de la curva. Se calcula dividiendo para cada valor de esta parte de la curva
obtenido de Fs entre su irradiancia y calculando posteriormente la media de todos los
valores.
- la pendiente de fotoinhibición β. Cuando los organismos fotosintéticos reciben
irradiancias muy superiores a las que sus fotosistemas pueden admitir, se produce el
efecto de fotoinhibición que consiste en una disminución de la actividad fotosintética
debida al daño en los fotosistemas por el exceso de fotones. La fotoinhibición se
percibe en las curvas PvsI como una caída de la asimilación de C al aumentar la
irradiancia. Se calcula dividiendo para cada valor de Fs de la región descendente de la
curva entre la irradiancia y calculando posteriormente la media de todos los valores.
6.- Comparar los parámetros fotosintéticos obtenidos en las comunidades del Atazar y
de Santillana en cada día de muestreo.
7.- Interpretar y discutir los datos obtenidos utilizando los parámetros fotosintéticos, las
características físico-químicas del agua y la estructura de la comunidad fitoplanctónica
en cada embalse.
8.- Para los que deseen profundizar más en estos datos pueden estimar la entrada de C
en cada uno de los ecosistemas en el día de muestreo, considerando la penetración de la
luz en la columna de agua y la irradiancia diaria ( los perfiles de penetración de luz y las
irradiancias diarias estarán disponibles en el espacio virtual).