Procedimiento_Tecnic..

PROCEDIMIENTO DE SOLICITUD Y ENTREGA DE
TÉCNICAS HISTOQUIMICAS
PROTOCOLO DE TÉCNICAS
NOMBRE
CARGO
FECHA
Nº Resolución: 1238
26 Agosto de 2011
ELABORADO POR
REVISADO POR
APROBADO POR
TM JANNETTE AMARO
TM MAURICIO CASTRO
DRA. FANCY GAETE
TM JANNETTE AMARO
TM ANGIE CALFUMAN
TM RAUL JARA
TM FABIOLA NUÑEZ
DR JULIO MONTT VIDAL
JEFE LABORATORIO
TECNOLOGO MEDICO
2004
JEFE DE LA UNIDAD
JEFE LABORATORIO
TECNOLOGO MEDICO
TECNOLOGO MEDICO
TECNOLOGO MEDICO
ENCARGADA CALIDAD
2011
DIRECTOR
2011
FIRMA
______________________________________________________________________ 67
HOSPITAL SANTIAGO ORIENTE
DR. LUIS TISNE BROUSSE
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TÉCNICAS HISTOQUIMICAS
PROTOCOLO DE TÉCNICAS
Nº Resolución: 1238
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Control de Cambios
Versión
1
2
3
4
Descripción
Creación
Revisión
Revisión
Revisión
Fecha
AGOSTO 2004
AGOSTO 2009
OCTUBRE 2010
AGOSTO 2011
______________________________________________________________________ 68
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DR. LUIS TISNE BROUSSE
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TÉCNICAS HISTOQUIMICAS
PROTOCOLO DE TÉCNICAS
Nº Resolución: 1238
26 Agosto de 2011
PROCEDIMIENTO DE SOLICITUD Y ENTREGA DE TECNICAS
HISTOQUIMICAS
Este protocolo tiene como objetivo asegurar la correcta realización del examen
histoquímico en la biopsia diferida y complementar el diagnostico histológico por
parte del médico patólogo.
PROCEDIMIENTO.
a) El médico patólogo al momento de realizar el examen macroscópico,
indicara al TPM o al TM la técnica a realizar, quedando registrada en la hoja
de ingreso al laboratorio.
b) Si la petición de THQ (técnica histoquímica) ocurre una vez que la biopsia
diferida está en proceso de informe, el patólogo debe depositar su solicitud
en buzón ubicado en el laboratorio de UAP. Además debe adjuntar la
lámina H/E para la correcta identificación del molde de inclusión, cuando
corresponda.
c) TM de turno, anotará la petición en el libro de “Solicitud de técnicas
histoquímicas”. En este libro se indicará: N° de biopsia, N° de molde, fecha
de solicitud, nombre del médico solicitante.
d) Luego de realizada la técnica, el TM anotará la fecha de entrega de la THQ
en libro de “Solicitud de técnicas histoquímicas” e ingresará datos a
base de datos del laboratorio
e) Entregar lámina y solicitud a patólogo responsable.
CONTROL DE CALIDAD.
a) Cada tanda de THQ deberá ir acompañada de los respectivos controles
positivos externos o internos.
b) Los controles positivos son responsabilidad del TM de turno de THQ y
deberá solicitar al TM, en turno de corte, que adjunte las placas control
necesarias.
c) El TM de turno revisará al microscopio cada control positivo, para validar la
correcta ejecución de la técnica.
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d) El TM de turno deberá garantizar el stock y correcto estado de los reactivos
necesarios para todas las THQ realizadas.
e) La UAP del HSO se guiará por las técnicas histoquímicas descritas en
documento de Procedimiento de técnicas histoquímicas.
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PROTOCOLO DE TÉCNICAS
Nº Resolución: 1238
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RETICULO DE GOMORI
1. Desparafinar e hidratar hasta el agua corriente.
2. Permanganato de potasio 0.5 % por 1 minuto.
3. Lavado en agua corriente.
4. Metabisulfito de sodio 5% por 1 minuto.
5. Lavar en agua corriente.
6. Mordentar en alumbre férrico 3% por 3 minutos.
7. Lavar en agua destilada.
8. Solución de plata de Gomori por 5 minutos.
9. Lavar en agua destilada.
10. Reducir en formalina al 10% por 1 minuto.
11. Lavar en agua destilada.
12. Virar en cloruro de oro 0.5% por 1 minuto.
13. Lavar en agua destilada.
14. Hiposulfito de sodio al 3% por 1 minuto.
15. Lavado en agua corriente.
16. Si se desea contrastar con safranina al 0.5% por 1 minuto.
17. Deshidratar desde alcohol de 95%, aclarar y montar.
Solución de plata de Gomori:
A 5 ml de nitrato de plata acuoso al 10%, agregar amoniaco puro gota a
gota hasta la disolución del precipitado que se forma. Agregar 5ml de
hidróxido de sodio al 3%. Agregar amoniaco puro gota a gota hasta la
disolución del precipitado. La solución debe quedar ligeramente turbia.
Completar 50ml con agua destilada.
RESULTADOS: fibras reticulares de color negro.
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Nº Resolución: 1238
26 Agosto de 2011
GROCCOTT
1.
2.
3.
4.
5.
6.
Desparafinar e hidratar hasta el agua destilada.
Acido crómico 5% por una hora.
Lavar en agua corriente.
Bisulfito de sodio al 1% por 1 minuto.
Lavar en agua corriente.
Colocar en solución de trabajo en baño termo regulado a 60°C por 1 hora
hasta que los cortes tomen un color café tabaco.
7. Lavar en agua destilada.
8. Poner en cloruro de oro al 0.5% por 1 minuto hasta que los cortes tomen un
color negro.
9. Lavar en agua destilada.
10. Hiposulfito de sodio al 2% por 1 minuto.
11. Lavar en agua corriente.
12. Si se desea, contrastar con verde luz 0.2% por 30 segundos.
13. Deshidratar, aclarar y montar.
Soluciones madres:
Metenamina 3%.
Nitrato de plata 5%.
Borato de sodio 5%.
Solución de trabajo:
A 25ml de metenamina 3%, agregar 1.25 ml de nitrato de plata al 5%,
completar 50ml con agua destilada. Adicionar 2ml de borax 5%.
RESULTADOS: Micelia e hifas de Gris claro.
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Nº Resolución: 1238
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WARTHIN-STARRY
1.
2.
3.
4.
Desparafinar e hidratar los cortes hasta el agua destilada.
Impregnar con solución de nitrato de plata al 1% en estufa a 60°C
por 20 minutos.
Sacar los cortes y sin lavar poner en solución reveladora, en baño
termoregulado a 60°C. Los cortes se tornan amarillo claro y/o café dorado
en aproximadamente 1 a 2 minutos.
5. Parar reacción sacando portas de la mezcla y lavar en agua caliente (para
sacar el exceso de gelatina)
6. Dejar secar al aire y luego montar.
Solución reveladora (mezclar al momento de usar):
10ml de nitrato de plata 2%.
25ml de gelatina 5%.
15ml de hidroquinona 0.15%.
Agua acidificada:
A 1 Lt de agua destilada agregar 0.1gr de acido cítrico.
Con esta agua se prepararan todas las soluciones de la técnica.
RESULTADOS: Espiroquetas de color negras y contraste de color caféamarillento claro.
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PROTOCOLO DE TÉCNICAS
Nº Resolución: 1238
26 Agosto de 2011
GRAM
1.
2.
3.
4.
5.
Desparafinar los cortes hasta el agua corriente.
Colocar en solución de cristal violeta por 1 minuto.
Lavar en agua corriente.
Lugol por 1 minuto.
Decolorar en alcohol isopropílico por 5 min ó en acetona al 10% en alcohol
isopropílico.
6. Lavar en agua corriente.
7. Contrastar con safranina 0.5% por 1 minuto.
8. Lavar en agua corriente.
9. Decolorar con acetona hasta que no salga mas colorante.
10. Secar al aire y montar.
Solución de cristal violeta:
Disolver 2gr de cristal violeta en 20ml de alcohol de95%.
Disolver 1gr de oxalato de amonio en 100ml de agua destilada.
Mezclar ambas soluciones.
RESULTADOS: Bacterias Gram (+) de color azul negro y Bacterias Gram () de color rojo.
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PROTOCOLO DE TÉCNICAS
Nº Resolución: 1238
26 Agosto de 2011
ALCIAN BLUE
1. Desparafinar e hidratar hasta el agua destilada.
2. Colocar en solución trabajo por 2 ciclos de microondas por 15 segundos o
por 30 min a Tº ambiente.
3. Dejar enfriar la solución.
4. Lavar agua corriente.
5. Contrastar con safranina 0.5% acuosa por 10 segundos.
6. Deshidratar, aclarar y montar.
Solución trabajo Alcian blue pH 2.5:
Alcian blue C.I 74240
Acido acético glacial 3%
1 gr
100 ml
RESULTADOS: Mucinas ácidas ricas en grupos sulfónicos carboxílicos de
color celeste.
PAS- ALCIAN BLUE
Realizar la técnica de Alcian Blue hasta punto 4 y luego continuar con
tinción PAS desde el agua destilada que sigue al alcohol de hidratación.
RESULTADOS: Mucinas ácidas ricas en grupos sulfónicos carboxílicos de
color celeste y mucinas neutras de color magenta.
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Nº Resolución: 1238
26 Agosto de 2011
AZUL TOLUIDINA
1.
2.
3.
4.
5.
Desparafinar e hidratar hasta agua destilada.
Colocar azul toluidina 0.5% acuoso por 1 segundo.
Diferencia en alcohol 100º.
Secar al aire
Aclarar y montar.
RESULTADOS: mastocitos de color rojo y presentan metacromasia.
CRISTAL VIOLETA
1.
2.
3.
4.
5.
Preparar cortes de 4 µm.
Desparafinar e hidratar hasta agua destilada.
Colocar en cristal violeta por 5 min.
Lavar en agua corriente
Diferenciar en ácido acético 3% hasta que el amiloide en control se observe
violeta.
6. Secar al aire y montar.
Solución de Cristal Violeta:
Cristal violeta
0.1 gr
Agua destilada
97.5 ml
Ac. Acético glacial 2.5 ml
RESULTADOS: amiloide de color violeta
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GIEMSA
1. Desparafinar e hidratar hasta agua destilada.
2. Colocar en solución concentrada “Eosin Methilene blue, according Giemsa”
mínimo 30 minutos.
3. Sin lavar, sumergir cortes enérgicamente en agua acetificada (50ml H2O
dest + 3 gotas ac. Acético glacial) por no más de 2 seg.
4. Lavar en agua destilada.
5. Diferenciar en alcohol de 95º enérgicamente por 2 a 3 seg.
6. Lavar en 2 baños de isopropanol (I y II)
7. Aclarar y Montar.
RESULTADOS: bacterias de color azul oscuro
NEGRO SUDAN
1. Corte fresco en congelación sin fijar.
2. Colocar en etanol 50º y 70º dos minutos c/u.
3. Teñir en solución saturada de negro sudán preparada en alcohol de 70%
durante 3 minutos
4. Lavar en alcohol de 70%, 50% por 30 seg. c/u
5. Montar con medio hidrófilo.
RESULTADOS: Grasas neutras de color negro
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PAS (SCHIFF)
a. Se usará el reactivo Schiff marca Merck catálogo 1.09033.0500.
b. En caso de emergencia se usará el preparado según AFIP.
c. Se cambia el reactivo cuando la tinción se observe con fondo excesivo.
(cada 3 meses aprox.)
Tinción:
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
Desparafinar e hidratar
Poner 10 min en Acido peryódico 0.5%
Lavar en agua corriente y luego destilada
Poner 20 min en reactivo de Schiff
Lavar
Contrastar con Hematoxilina de Harris por 5 min
Diferenciar en alcochol ácido
Deshidratar, aclarar y montar
RESULTADOS: Membranas basales color magenta.
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PAS AMILASA
1.
2.
3.
4.
5.
Desparafinar e hidratar
Diluir 2 ml de saliva (amilasa) en 48 ml de agua destilada.
Incubar por 30 min a 60ºC
Lavar con agua corriente.
Continuar con técnica PAS desde paso 2.
RESULTADOS: Membranas basales color magenta y ausencia de
glicógeno en tejido.
SCHMORL (Melanina)
1.
2.
3.
4.
5.
6.
Desparafinar e hidratar hasta agua destilada
Solución de trabajo 3 cambios de 7 min cada una.
Lavar en agua
Contrastar con picro ponceau por 5 segundos.
Lavar en agua destilada.
Aclarar y montar
Solución de trabajo (mezclar al momento de usar):
Cloruro Férrico al 1%
Ferricianuro de K al 0,1%
150 mls
50 mls
RESULTADOS: Melanina de color verde
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26 Agosto de 2011
PERLS (hemosiderina)
1.
2.
3.
4.
5.
Desparafinar e hidratar hasta agua destilada.
Colocar los cortes en solución trabajo 15 a 30 minutos.
Lavar cuidadosamente en agua destilada.
Contraste nuclear con safranina por 1 min.
Aclarar y montar.
Solución de trabajo:
Ferrocianuro de potasio 2% (recién preparado)
(0,5 grs. en 25 ml de agua destilada)
Ácido clorhídrico 2%
(0,5 ml en 25 ml de agua destilada)
1 volumen
1 volumen
RESULTADOS: Hemosiderina de color azul.
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26 Agosto de 2011
RETICULO
1. Desparafinar e hidratar hasta agua destilada.
2. Permanganato de potasio al 0,5 % acidificado por 3 minutos (a 95 mls de
permanganato de potasio al 0,5% agregar 5mls de ácido sulfúrico al 3%)
3. Lavar en agua corriente seguida de agua destilada
4. Acido oxálico hasta decolorar, más o menos 1 minuto.
5. Lavar en agua corriente seguida de agua destilada
6. Mordentar en alumbre férrico al 2,5% por 1 hora a 60°C
7. Lavar en agua destilada
8. Solución de Plata hasta que los cortes se pongan transparentes + ó – 1
minuto (si es solución recién preparada)
9. Lavar en agua destilada
10. Reducir en formalina al 10% por 30 segundos
11. Lavar en agua corriente seguida de agua destilada
12. Virar en Cloruro de oro al 0,2% por 1 minuto
13. Enjuagar en agua destilada
14. Fijación en Hiposulfito de sodio al 2,5% por 5 minutos
15. Lavado completo en agua corriente
16. Si se desea contrastar en safranina 0.5% acuosa.
17. Aclarar y montar.
Solución de plata:
A 5 mls de nitrato de plata acuoso al 10%, agregar amoniaco puro gota a
gota hasta disolución del precipitado que se forma. Agregar 5 mls de
hidróxido de sodio al 3%. Agregar amoniaco gota a gota hasta disolución
del precipitado. La solución debe quedar ligeramente turbia. Completar 50
mls con agua destilada.
RESULTADOS: Fibras retículo de color negro
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ROJO CONGO PARA AMILOIDE
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
Preparar cortes de 10 µm
Desparafinar e hidratar hasta agua destilada.
Sobre teñir con Hematoxilina de Harris por 3 min.
Lavar en agua
Sol. Trabajo 1 por 20 min.
PASAR DIRECTO A SOL. 2
Sol. Trabajo 2 por 20 min.
Lavar
Aclarar y montar.
Sol. Trabajo 1:
Sol. Alcohol 80º saturada de NaCl 50 ml
Sol. Acuosa al 1% NaOH
0.5 ml
Utilizar menos de 15 min después de preparada.
Sol. Trabajo 2:
Alcohol 80º saturada con NaCl y luego se satura con rojo congo. Al
momento de usar se le debe agregar 0.5 ml de NaOH 1%.
Filtrar antes de usar.
RESULTADOS: Amiloide de color rojo y núcleos de color azules
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VAN GIESON PARA FIBRAS COLAGENOS
1.
2.
3.
4.
5.
6.
Desparafinar e hidratar hasta agua destilada.
Hematoxilina Verhoeff por 10 min.
Lavar agua corriente.
Picro- ponceau por 2 minutos.
Lavar en alcohol absoluto.
Aclarar y montar.
Hematoxilina Verhoeff:
Hematoxilina C.I 75290 (3% alcohol absoluto)
FeCl3 2.5%
Lugol
Picro-Ponceau:
Solución acuosa 2% de Ponceau S
Solución acuosa saturada de ácido pícrico
Ácido acético glacial 2%
3 partes
2 partes
1 parte
5 ml
95 ml
1 ml
RESULTADOS: Fibras colágenas de color rojo y núcleos de color negro
VAN GIESON PARA FIBRAS ELÁSTICAS
1. Utilizar Técnica Van Gieson para fibras colágenas, pero la Hematoxilina
DEBE estar recién preparada.
RESULTADOS: Fibras elásticas de color negro y núcleos de color negro
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26 Agosto de 2011
ZIELH –NIELSEN
1. Desparafinar e hidratar hasta el agua destilada.
2. Colocar 1 hora a 65ºC o 30 segundos por 30 ml a potencia máxima en
microondas (portaobjetos con carga) en solución ZN.
3. Alcohol ácido 1 % hasta decolorar.
4. Agua corriente.
5. Azul metileno 0.2% acuosa por 1 segundo.
6. Eliminar exceso con alcohol 100º.
7. Lavar agua corriente.
8. Aclarar y montar.
Solución ZN:
Fucsina básica C.I 42510
Alcohol absoluto
Agua fenicada al 5%
1gr
10 mls
90 mls
Mezclar y filtrar.
RESULTADOS: microorganismos de color rojo-rosado y núcleos de color
azul.
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HEMATOXILINA-EOSINA
1. Desparafinar e hidratar hasta agua destilada.
2. Tinción nuclear con Hematoxilina de Harris: 14 min
3. Lavar en agua corriente
4. Alcohol acido 0.5%: 1 -3 segundos.
5. Lavar en agua corriente
6. Borato de sodio: 1 min
7. Lavar en agua corriente
8. Eosina 0.5% acuosa: 3 min (0.5%)
9. Lavar en agua corriente
10. Deshidratar, aclarar y montar
Preparación hematoxilina Thermo Cat: 6765015:
Disolver contenidos de frascos A Y B de Hematoxilina en polvo marco
Thermos en 1200 ml de agua bidestilada. Dejar reposar por al menos 24
horas antes de su uso.
Cambiar cada 15 días
Preparación eosina:
Utilizar Eosina Y comercial de marca Thermo lista para usar o en su
defecto preparar eosina descrita a continuación:
• Eosina C.I 45380 0.5%: en solución 1:1 agua destilada/etanol
absoluto y agregar 10 gotas de ácido acético glacial por litro.
Cambiar una vez al mes
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