ELISA Test Procedure

Technical Information
ELISA Test Procedure
Our ELISA reagents are optimized for the DAS-ELISA (double antibody sandwich enzyme-linked immunosorbent assay), using certified Nunc-Immuno Plates MaxiSorp F96 and operating with a working volume of
200 μl per well. Our ELISA test procedure fits well with the protocol commonly carried out in certification
laboratories testing large numbers of samples per day. It is a robust procedure (providing high test security)
applicable to the testing of potatoes, fruit trees, grapevines etc. Thus, the customer can conveniently use
a single procedure for all plant/pathogen combinations. One exception is the «Poty group test» where the
indirect PTA-ELISA format is applied (procedure supplied with the kit).
1. Coating: Specific antibody adsorbed to surface of microtiter wells
Dilute IgG 1000 x in coating buffer; i.e., 20 μl in 20 ml buffer, or at equal ratio for other
volumes. Add 200 μl to each well.
Cover plates tightly and place them in a humid box.
Incubate at 30°C for 4 h or at 4-6°C overnight.
1a. Wash: Empty the wells and wash 3-4 times with washing buffer, remove any liquid
by blotting the plate on paper towels. Our EASY WASH 2000 provides a repeatable
and standardized washing. The washing procedure may need adaptation to washing
equipment available in your laboratory.
2. Antigen: Incubation of plant extract
Homogenize test sample 1:20 in extraction buffer. Different extraction buffers and/or
sample/buffer ratios are recommended for certain plant samples; refer to indications
given in the «Product Information» of reagents.
Add 200 μl per well.
Cover plates tightly and place them in a humid box.
Incubate at 4-6°C overnight.
2a. Wash as in 1a.
3. Conjugate: Incubation of enzyme-labeled antibody
Dilute enzyme conjugate 1000 x in conjugate buffer.
Add 200 μl per well.
Cover plates tightly and place them in a humid box.
Incubate at 30°C for 5 h.
3a. Wash as in 1a.
4. Substrate: Color reaction indicates infected sample
Dissolve pNPP (para-nitrophenyl-phosphate) at 1 mg/ml in substrate buffer.
Add 200 μl per well.
Incubate at room temperature (20-25°C) in the dark.
Observe reaction and read yellow color development after 30-120 min visually and/or
photometrically at 405 nm. If the reader is equipped with dual filters, read at 405/492 nm.
Reading with dual filters reduces «irregular background» compared to single filter reading at 405 nm.
1/1
Version: 3 - 08.12.2011
www.bioreba.com
BIOREBA AG
Christoph Merian-Ring 7
CH-4153 Reinach BL1
Switzerland
Your Partner in Agro-Diagnostics
phone
fax
+41 61 712 11 25
+41 61 712 11 17
[email protected]
www.bioreba.com
Information technique
Mode opératoire du test ELISA
Sauf exception, nos réactifs ELISA sont optimisés pour être utilisés dans un test en double sandwich (DAS-ELISA)
sur des microplaques de titration Nunc certifiées avec un volume utile de 200 µl par puit. Lorsque une autre
procédure est utilisée, celle-ci est clairement spécifiée à la fiche de données du réactif.
Le principe des tests ELISA de BIOREBA correspond au protocole généralement utilisé dans les laboratoires de
certification réalisant de nombreuses analyses en routine. C’est une procédure «robuste» qui a largement fait ses
preuves et qui optimise la fiabilité des résultats. Ainsi les clients utilisent un protocole identique et fiable pour
toutes les combinaisons plantes/pathogènes.
1. Coating: Sensibilisation des microplaques avec un anticorps spécifique
Diluer au 1/1000 les anticorps de coating (IgG) dans le tampon de coating ; i.e. 20 µl IgG dans 20 ml
de tampon. Ajouter 200 µl de la solution obtenue dans chaque puit de la microplaque.
Couvrir les plaques et placer les dans une étuve humide.
Incuber 4 h à 30°C ou une nuit à + 4°C.
1a. Lavage : Vider les plaques et laver les au moins 3 fois avec le tampon de lavage. Eliminer
tout le liquide en tapant les plaques sur du papier absorbant. Le laveur de microplaque
BIOREBA «EASY WASH 2000» permet un lavage optimum.
2. Echantillon: Incubation de l’extrait de plante (antigène)
Diluer l’extrait végétal au 1/20 dans le tampon d’extraction (la nature du tampon d’extraction
ainsi que le taux de dilution peut varier selon les échantillons; se reporter à la fiche
«information produit» du réactif).
Ajouter 200 µl par puit.
Couvrir les plaques et placer les dans une étuve humide.
Incuber une nuit à + 4°C.
2a. Laver comme en 1a.
3. Conjugué: Incubation avec les anticorps conjugués à l’enzyme (conjugate)
Diluer au 1/1000 les anticorps conjugués dans le tampon de conjugué.
Ajouter 200 µl de la solution obtenue par puit.
Couvrir les plaques et placer les dans une étuve humide.
Incuber 5 h à 30°C.
3a. Laver comme en 1a.
4. Substrat: Une réaction colorée indique la présence d’un échantillon infecté
Diluer les pastilles de substrat pNPP à 1 mg/ml dans le tampon de substrat.
Ajouter 200 µl de la solution obtenue par puit.
Incuber à température ambiante (18 - 25°C) à l’obscurité.
Observez la réaction et notez le développement de la coloration entre 30 et 120 min,
soit visuellement soit avec un photomètre à 405 nm. Les photomètres à double lecture
405/492 nm permettent de réduire les effets de bruits de fond.
1/1
Version: 3 - 08.12.2011
www.bioreba.com
BIOREBA AG
Christoph Merian-Ring 7
CH-4153 Reinach BL1
Switzerland
Your Partner in Agro-Diagnostics
phone
fax
+41 61 712 11 25
+41 61 712 11 17
[email protected]
www.bioreba.com
Technische Information
ELISA Testvorschrift
Unsere ELISA Reagenzien sind optimiert für den Gebrauch im DAS-ELISA Format (double antibody sandwich
enzyme-linked immunosorbent assay) unter Verwendung von zertifizierten Nunc Maxisorp Microtiterplatten und
einem Arbeitsvolumen von 200 µl pro Vertiefung. Wenn ausnahmsweise ein anderes Testformat zur Anwendung
kommt, ist dies im Datenblatt der entsprechenden Reagenzien vermerkt.
Diese Testvorschrift ist bestens für Zertifikationslabors geeignet, welche täglich eine grosse Anzahl von Proben
verarbeiten. Diese Vorschrift bietet eine hohe Sicherheit und findet ihre Anwendung bei Tests von Kartoffeln,
Fruchtbäumen, Reben, etc. Dies gewährleistet, dass der Kunde dasselbe Verfahren für alle Pathogen/WirtspflanzenKombinationen verwenden kann.
1. Coating: Spezifischer Antikörper (IgG) wird auf die Oberfläche der Mikrotiterplatten gebunden
Verdünnen Sie das IgG 1000 x in Beschichtungspuffer (=coating buffer); d.h. 20 µl in 20 ml
Puffer, oder in einem gleichen Verhältnis bei anderen Volumina.
Geben Sie 200 µl in jede Vertiefung.
Bedecken Sie die Platten und inkubieren Sie sie in einem mit feuchten Tüchern oder Papier
ausgelegten Behälter bei 30°C während 4 h oder bei 4 °C über Nacht.
1a. Waschen: Leeren Sie die Vertiefungen und waschen Sie 3 - 4 mal mit Waschpuffer.
Entfernen Sie die verbleibende Flüssigkeit, indem Sie die Platten kurz auf saugfähigem
Papier ausklopfen. Der Mikrotiterplatten-Wascher «EASY WASH 2000» von BIOREBA
gewährleistet ein optimales Waschresultat.
2. Antigen: Inkubation des Pflanzenextraktes
Homogenisieren Sie die Proben 1:20 (w/v) in Extraktionspuffer (je nach Art der Pflanzenprobe
werden in der jeweiligen Produkteinformation der Reagenzien spezielle Extraktionspuffer
und/oder ein anderes Probe/Puffer-Verhältnis angegeben).
Geben Sie 200 µl in jede Vertiefung.
Bedecken Sie die Platten und inkubieren Sie sie in einem mit feuchten Tüchern oder Papier
ausgelegten Behälter bei 4 °C über Nacht.
2a. Waschen wie in 1a.
3. Konjugat: Inkubation mit enzym-markiertem Antikörper
Verdünnen Sie das IgG-Enzym-Konjugat 1000 x in Konjugatpuffer.
Geben Sie 200 µl in jede Vertiefung.
Bedecken Sie die Platten und inkubieren Sie sie in einem mit feuchten Tüchern oder Papier
ausgelegten Behälter bei 30°C während 5 h.
3a. Waschen wie in 1a..
4. Substrat: Farbreaktion bedeutet infizierte Probe
Lösen Sie 1 mg/ml p-nitrophenyl phosphate (pNPP) in Substratpuffer.
Geben Sie 200 µl in jede Vertiefung.
Inkubieren Sie die Platten bei Raumtemperatur (18 - 25°C) im Dunkeln.
Beobachten Sie die Farbreaktion und schätzen Sie die Intensität der gelben Färbung nach
30-120 min entweder visuell oder messen Sie mit einem Photometer bei 405 nm. Beste
Ergebnisse werden erzielt, indem neben 405 nm zusätzlich mit einer Referenzwellennlänge
von 492 nm gemessen wird und Platten-Unregelmässigkeiten dabei kompensiert werden
1/1
Version: 3 - 08.12.2011
www.bioreba.com
BIOREBA AG
Christoph Merian-Ring 7
CH-4153 Reinach BL1
Switzerland
Your Partner in Agro-Diagnostics
phone
fax
+41 61 712 11 25
+41 61 712 11 17
[email protected]
www.bioreba.com
Información técnica
Procedimiento del test ELISA
(ELISA es un acrónimo de «enzyme-linked immunosorbent assay»)
Nuestros reactivos ELISA se han optimizado para su uso en el procedimiento denominado de doble anticuerpo
ó «sandwich» (DAS-ELISA), utilizando placas para microtitulación «Nunc Certified Maxisorp microtiter plates» y
operando con un volumen de 200 microlitros por celda. Si se usan otros procedimientos (excepcionalmente), Usted
encontrará una indicación en la hoja informativa del reactivo.
Nuestro procedimiento es adecuado para ser usado en los protocolos de laboratorios orientados a la certificación que
usualmente testan un amplio numero de muestras por día. Es un procedimiento altamente seguro (provee alta seguridad
en el test) para su aplicación en análisis de papas (patatas), árboles frutales, vid, etc.; de esta manera, el cliente que utiliza
nuestros reactivos usa un solo procedimiento, para la mayoría de las combinaciones de patógeno/hospedero..
1. Recubrimiento (vestido): Un anticuerpo especifico es adherido a la superficie de
las celdas de la placa de microtitulación
Diluir la IgG 1000x en el buffer de vestido (Coating buffer); por ejemplo, 20 microlitros en
20 mililitros de buffer, ó bien la misma dilución con otros volúmenes.
Adicionar 200 microlitros de la dilución a cada celda (hoyo).
Tapar la placa logrando un buen sellado, y colocarla en caja húmeda.
Incubar a 30ºC por 4 horas ó a 4ºC durante toda la noche.
1º Lavado: Vaciar las celdas (hoyos) y lavar 3 - 4 veces con el buffer de lavado (Washing Buffer).
Remover completamente el liquido golpeando enérgicamente la placa sobre una toalla de papel.
El procedimiento de lavado se adaptará al equipo de lavado, disponible en su laboratorio.
2. Antígeno: Incubación del extracto de macerado de la muestra (tejidos de la planta)
Macerar la muestra y homogeneizar diluyendo 1 : 20 (u otras diluciones tal como se recomienda
en la hoja informativa del reactivo) en buffer de muestra (extraction buffer). Se recomiendan
diferentes buffers para diluir muestras de ciertas especies de plantas ó ciertos tejidos, ver hoja
informativa del reactivo.
Adicionar 200 microlitros de la dilución a cada celda (hoyo).
Tapar la placa logrando un buen sellado y colocarla en caja húmeda.
Incubar la placa a 4 ºC durante toda la noche.
2º Lavado: Repetir el procedimiento indicado para 1º Lavado.
3. Conjugado: Incubación de la IgG conjugada con la enzima
Diluir la IgG conjugada con la enzima 1000x en buffer de conjugado (Conjugate Buffer).
Adicionar 200 microlitros de la dilución por celda (hoyo).
Tapar la placa logrando un buen sellado y colocarla en caja húmeda.
Incubar a 30ºC por 5 horas.
3º Lavado: Repetir el procedimiento indicado para 1º Lavado.
4. Sustrato de la enzima : una reacción de color indica una muestra con infección
Diluir el sustrato de la enzima (p-nitrophenyl phosphate) utilizando 1 mg/ml en buffer de sustrato
(substrate buffer).
Adicionar 200 microlitros de la dilución por celda (hoyo).
Incubar a temperatura ambiente (18 - 25°C) en oscuridad.
Luego de 30 - 120 minutos observar el desarrollo de la reacción de color amarillo; registrar los resultados
visualmente y/o mediante la medición de la absorbancia (OD) a 405 nm. Si el equipo de lectura está
equipado con filtros duales, leer a 405/492 nm. La lectura mediante la utilización de doble filtro reduce
el «fondo irregular de la placa», si se la compara con la lectura utilizando un solo filtro a 405 nm
1/1
Version: 3 - 08.12.2011
www.bioreba.com
BIOREBA AG
Christoph Merian-Ring 7
CH-4153 Reinach BL1
Switzerland
Your Partner in Agro-Diagnostics
phone
fax
+41 61 712 11 25
+41 61 712 11 17
[email protected]
www.bioreba.com