Análisis estadístico de microarrays de ADN

Análisis estadístico de
microarrays de ADN
Víctor Moreno
Bioestadística. Facultat Medicina. UAB
Epidemiologia i Registre del Càncer. ICO
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Varios materiales de esta presentación
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copiados y a veces modificados de otros
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autores.
Me es imposible dar crédito adecuado a los
autores originales, a quienes agradezco que
pongan sus materiales a disposición pública
Contenido
• Qué es un microarray y para qué sirve.
• Análisis estadístico:
–
–
–
–
–
–
Análisis de imágenes
Control de calidad
Diseño de experimentos
Análisis de expresión diferencial
Reducción de la dimensionalidad
Búsqueda de patrones
Fundamentos
El material genético
genoma
DNA
expresión
mRNA
proteina
mRNA
DNA to RNA
RNA to DNA
DNA to cDNA
transcriptase
reverse
transcriptase
DNA
polimerase
DNA → RNA → DNA → cDNA
T
A
T
A
A
U
A
T
C
G
C
G
G
C
G
C
Hibridación
TCGAC
AGCTG
Usos de los microarrays
• Análisis masivo del nivel de expresión de
miles de genes:
–
–
–
–
Clasificación de tumores (lympho-chip).
Respuesta a fármacos.
Asignación de función a genes (ESTs).
Inferencia de redes de regulación génica.
• Otros tipos de microarrays:
– genotipado (SNPs, mutaciones, …)
– número de copias del ADN (CGH)
–…
Tipos de microarrays de
expresión
• Filtros SAGE: serial analysis of gene expression
• De oligonucleótidos, cortos y largos
• De 2 colores
– Permiten medir la abundancia relativa de tránscritos de
RNA
– Basados en la hibridación competitiva de 2 sondas
marcadas con diferente color con un cDNA diana
• De 4 colores: APEX SNP detection
Método
El microarray de ADN
Clones de cDNA
(dianas)
Amplificación del producto por PCR
Purificación
Impresión
0.1nl/spot
microarray
Micrografia de un spot hibridado en un array de
S. cerevisiae
mRNA
DNA
(Sonda:
Probe)
cDNA microarray
(Dianas: Targets)
Lectura
excitacion
laser 2
scanning
laser 1
emision
sobreimponer imágenes y normalizar
analisis
Gene Array
1 gene/spot
Labelled Target:
cDNA sample 1
A B C D E F G
cDNA sample 2
A B
D E F G
E
A B C
D E F
G H
I
Gene Array
1 gene/spot
Labelled Target:
cDNA sample 1
A B C D E F G
cDNA sample 2
A B
D E F G
E
A B C
D E F
G H
I
Aspectos estadísticos
•
•
•
•
•
•
Análisis de imagen
Control de calidad
Diseño de experimentos
Análisis de expresión diferencial
Reducción de la dimensionalidad
Búsqueda de patrones
Datos crudos
Arrays HU4.6 de Yale
• 4.592 dianas repartidas en 4x4
matrices de 24x24 puntos
• 2 réplicas de cada diana
• 2 hibridaciones posibles por
chip
• 2 imágenes TIFF de 16 bits, 1
por color ~ 30Mb
Análisis de la imagen
• Localización de los puntos.
• Segmentación: decidir qué
pixels son señal y qué son
background.
• Cuantificación: intensidad
de la señal de cada canal, el
background y medidas de
calidad.
Segmentación
Seeded Region Growing
Spots
pequeños
Fixed Circle
Spots no
circulares
Cuantificación
• Intensidad de los spots:
– Media.
– Mediana.
• Valores de background:
– Local.
– Constante (global)
– Morphological opening: estimación suavizada
localmente en 2D del background global
Aspectos estadísticos
•
•
•
•
•
•
Análisis de imagen
Control de calidad
Diseño de experimentos
Análisis de expresión diferencial
Reducción de la dimensionalidad
Búsqueda de patrones
Medidas de calidad
•
•
•
•
•
•
•
•
Circularidad
Área, perímetro
Razón señal / background
Variación en las intensidades de los pixels
Identificación des spots defectuosos
Correlación entre intensidades de los spots
Porcentaje de spots sin señal
Distribución del área de los spots
Spots
Array
Dificultades de la técnica
Dificultades de la técnica
Dificultades de la técnica
8
2.5
Density
6
2.0
4
2
0
Density
1.5
1.0
0.5
0.0
2
3
4
log10(Intensity)
5
6
2
3
4
log10(Intensity)
5
6
Filtrado
• Variables:
– Circularidad
– Perímetro
– Area
área > 30
Área
Réplicas
Normalización
• Objetivo: identificar y eliminar fuentes de
variación sistemática que no sean
diferencias de expresión:
–
–
–
–
Diferente eficiencia en el marcaje con color
Diferente cantidad de RNA en cy3 y cy5
Diferentes parámetros de escáner
Efectos espaciales del chip (aguja, zona …)
Normalización
• Es necesaria para asegurar que las
diferencias en intensidades se deben a
diferencias de expresión real, no a artefactos
de impresión, hibridización o escaneo …
• El ajuste es un paso previo a cualquier otro
análisis estadístico
• Se evidencia cuando se compara la misma
muestra marcada con 2 colores
Visualización gráfica de
intensidades
• Usual
– R vs G
– log2(R) vs log2(G)
• Preferible
– Gráfica MA :
• M = log2(R) - log2(G)
• A = (log2(R) + log2(G))/2
= log2(R/G)
= (R·G)0.5
Lowess/loess: regresión robusta
ponderada localmente: suavizado
Normalización
• Centrado
log2R/G← log2R/G - L
– Constante: L = media o mediana de log2(R/G)
– Adaptativa: L = función de intensidad, sector …
• Regresión ponderada localmente (lowess o loess)
• Escalado
log2R/G←(log2R/G - L)/S
• Métodos 2D
Lowess to rank invariant gene selection
Aspectos estadísticos
•
•
•
•
•
•
Análisis de imagen
Control de calidad
Diseño de experimentos
Análisis de expresión diferencial
Reducción de la dimensionalidad
Búsqueda de patrones
Microarray protocol
RNA extraction
translation to DNA
DNA labeling
hybridization
scanning
image analysis
statistical analysis
Mayor
sources of
variability
Teoría ≠ realidad
Dye effect
Cy5
SA
Cy3
tissue
RNA
Cy3
SB
Cy5
sample
dye
• Sample and array crossed
• Array aliased with dye:sample interaction
array
y = µ + αg + βd + γ s + κa +τ g:d + φg:s + λg:a + e
σ g2 : gene
σ d2 : dye
σ s2 : sample
σ a2 : array ≡ dye : sample interaction
σ g2:d : gene : dye interaction
σ g2:s : gene : sample interaction
σ g2:a : gene : array interaction ≡ gene : dye : sample
σ e2 : residual (replicates )
Normalised in 20
quintiles. Removes
dye*sample effect
Variance Component
estimate
%
% over gene
interactions
gene
dye
sample
array = dye:sample
2,686
0,000
0,000
0,000
86,1
0,0
0,0
0,0
gene:dye
gene:sample
gene:array (dye:sample)
0,000
0,252
0,162
0,0
8,1
5,2
0,0
58,1
37,3
residual
0,020
0,6
4,6
100
13,9
V1
Loop
G
R
A3
R
A1
G
V3
Reference
R
A2
R
G
V2
V0
G
G
G
V1
V2
V3
Comparison to a common control
B1
B2
B3
C
T1
C
T2
C
T3
Var(TA-TB) =4σ2
Error df = 0
Balanced incomplete blocks
B1
B2
B3
T1
T2
T2
T3
T3
T1
Var(TA-TB) =4/3σ2
Error df = 1
Aspectos estadísticos
•
•
•
•
•
•
Análisis de imagen
Control de calidad
Diseño de experimentos
Análisis de expresión diferencial
Reducción de la dimensionalidad
Búsqueda de patrones
Expresión diferencial
• Identificar los genes que cambian su
expresión en función de variables de interés
– Resultado clínico: supervivencia, respuesta al
tratamiento, tipo de tumor, tratamientos, grupo,
dosis, ...
• Estimación: cuantificar el efecto
• Test: evaluar la significación estadística
Estimación
• Cruda
R/G o log2R/G
• Suavizada: métodos bayesianos empíricos
– Se intenta reducir la variabilidad de los valores
mediante la incorporación de información
externa: distribución de probabilidad “a priori”
– Al tratarse de razones, las intensidades
pequeñas suelen tener mayor variabilidad que
las grandes
2
4
6
8
A
10
12
14
-4
-2
Normalized M
0
2
Método de Newton
• Supone que las intensidades de cada sonda
siguen una distribución Gamma con
parámetros (aR , θR) y (aG , θG)
• Modelo jerárquico Gamma-Gamma:
– Los parámetros de escala ( θR y θG) provienen de
otra distribución Gamma con parámetros (a0 ,ν)
Measurement error
Actual Expression
Expresión diferencial
• Con este modelo Gamma-Gamma, se puede
derivar la distribución “a positeriori” de la
expresión diferencial ρ=R/G:
• Y el estimador bayesiano empírico es:
Suavizado
• Los estimadores bayesianos (R+ν)/G+ν)
atenúan los estimadores crudos R/G.
• La atenuación es mayor en los valores
menores
• El orden de las intensidades puede variar
Los cambios ¿Son significativos?
• Métodos sin réplicas (con 1 único array)
– |log2 R/G |> k
• Normalmente k = 2
• Justificación: “Porque todo el mundo lo hace así”
– Si se tiene información sobre la variabilidad
esperada por azar, se pueden calcular un valor
de k que asegure un tasas de falsos positivos
dada (Sabatti, UCLA tr304, Math Biosci)
Método de Sabatti
• Sin réplicas
• Si se supone que yi ~N(θi,σ) y que hay
“pocos” θi ≠ 0, entonces
• los límites k = σ[2log(n)]1/2 son adecuados
para detectar los valores de interés
• σ se puede obtener de un experimento en el
que se comparen 2 muestras idénticas
(normal-normal)
Sabatti (II)
• Si se desea una tasa de falsos positivos dada
(α), se puede mejorar el cálculo de k de
manera adaptativa para considerar que
normalmente el número de valores θi ≠ 0 es
desconocido
• Basado en el método de Benhamini &
Hochberg (JRSS-B 1995)
• Depende de σ, α y n
Método de Sabatti
σ
2 log(n)
Método de Newton (2)
• El modelo bayesiano empírico GammaGamma se puede mejorar con una mixtura
para modelar la suposición de que una
proporción de los genes no modifican su
expresión:
Modelo Gamma-Gamma-Bernoulli
• Se puede estimar con el algoritmo EM
• Perimite calcular para cada gen la odds de
haber cambiado de expresión
2
0
-4
-2
M
2
4
6
8
A
10
12
14
Test de hipótesis
• Para cada gen podemos hacer un test sobre
la H0 de que no hay expresión diferencial:
t-test / ANOVA
• Posibles errores
– Tipo I o falso positivo
– Tipo II o falso negativo
• Problema de multiplicidad
– miles de hipótesis se prueban simultáneamente
– Gran aumento de la probabilidad de error tipo I
Tests de hipótesis múltiples
• Definir una tasa de error de tipo I adecuada
• Emplear un procedimiento que
– Asegure un control estricto del error de tipo I
– Sea potente (pocos falsos negativos)
– Tenga en cuenta la distribución conjunta de los
múltiples tests de hipótesis
• Reportar un p-valor ajustado para cada gen
que refleje la tasa global de error de tipo I
Métodos basados en réplicas
Modelos jerárquicos Tseng (2001)
• Serie de experimentos en las mismas
condiciones
• Réplicas de hibridaciones y de spots
• Asume log-normalidad de las intensidades
• Estima los hiperparámetros (Bayesiano
empírico)
• Calcula la distribución a posteriori con
métodos MCMC
Modelos jerárquicos
• Interesante:
– Captura la dependencia entre genes
• Problemas:
– Basado en log-normalidad - cuestionable
– Ignora las comparaciones múltiples
Métodos no paramétricos
• Dudoit 2002, Tusher 2001
• Diseño:
– nC hibridaciones control-control
– nD hibridaciones control-test
• Test:
• Permutaciones para evaluar la significación
Permutaciones
• Se intercambian las etiquetas entre control y
test al azar
• Se calcula el test (Ti) para cada gen con el
nuevo orden
• Se calcula el p-valor para cada gen según la
fórmula
Web resources
•
•
•
•
Bioconductor: www.bioconductor.org
Microarrays: www.microarrays.org
Berkeley:
www.stat.berkeley.edu
Stanford:
genome-www.stanford.edu
Acknowledgments
•
•
•
•
•
•
•
Miguel A. Peinado
Gabriel Capellá
Mónica Grau
Elisenda Vendrell
Gemma Tarafa
Antonia Obrador
Xavier Solé
• Institut Català
d’Oncologia
(ICO)
• Institut de Recerca
Oncològica
(IRO)